修飾的可變結構域分子及其產生和使用方法b的製作方法

2023-06-09 00:30:06 4

修飾的可變結構域分子及其產生和使用方法b的製作方法
【專利摘要】本公開提供了一種包含抗體輕鏈可變結構域(VL)的分離蛋白，所述可變結構域在根據Kabat編號系統的殘基49至56之間的位置包含至少一個帶負電的胺基酸，所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
【專利說明】修飾的可變結構域分子及其產生和使用方法B
[0001]相關申請
[0002]本申請要求於2011年4月21日提交的名稱為「Modified variable domainmolecules and methods for producing same3」 的澳大利亞專利申請第 2011901522 號以及於 2011 年 11 月 21 日提交的名稱為 「Modified variable domain molecules andmethods for producing same4」的澳大利亞專利申請第2011904856號的優先權。這些申請的整個內容據此以引用方式併入。
[0003]序列表
[0004]本申請與電子形式的序列表一起提交。該序列表的整個內容據此以引用方式併入。
【技術領域】
[0005]本公開涉及包含抗聚集抗體可變結構域的蛋白及其用途。
[0006]發明背景
[0007]目前包含抗原結合結構域的抗體和蛋白廣泛地用作研究試劑、診斷/預測試劑、工業試劑以及治療劑。這種寬範圍的可應用性是由於包含其抗原結合結構域的抗體和蛋白以高度特異性和親和力結合到抗原的能力。因此，包含其抗原結合結構域的抗體和蛋白能夠特異性結合到樣品中的抗原上並且允許檢測、定量，或殺死表達該抗原的細胞，或遞送治療性有效載荷。然而，儘管它們具有通用性，但是僅有一小組的抗體具有適合診斷/預測/工業/治療性應用的生物物理特性。例如，治療性或體內診斷抗體/蛋白需要在受試者中具有較長的血清半衰期以便在所需的靶標處累積，因此它們必須是抗聚集的(Willuda等人，1999)。工業應用通常需要具有較長半衰期或在暴露於苛刻條件(例如高溫)之後能夠正常發揮作用而無聚集的抗體/蛋白(Harris, 1999)。包含抗體可變結構域的蛋白的聚集會導致在表達和/或純化、免疫原性、毒性、降解、親合力受損、或儲存之後失去活性方面的困難。
[0008]蛋白聚集是與摺疊途徑競爭的一個過程或可以起因於摺疊途徑中的中間體，並且通常涉及未摺疊蛋白或部分摺疊蛋白的締合。通過使天然狀態穩定化(即，抗去摺疊)或通過降低蛋白的未摺疊或部分摺疊狀態聚集的傾向，可以實現聚集抗性。使天然狀態穩定化的一個缺點在於這些蛋白將有可能暴露於它們將去摺疊的環境中。通常，當蛋白變性或去摺疊時，在蛋白內部通常介導分子內接觸的胺基酸殘基被暴露出來。這種暴露通常使蛋白易於形成分子間接觸並且聚集。與抗去摺疊的蛋白相反，在暴露於這樣的環境之後，在去摺疊時具有降低的聚集傾向的蛋白將簡單地重新摺疊成具有生物活性的非聚集狀態。
[0009]包含其抗原結合結構域的抗體和蛋白的聚集抗性或聚集傾向通常受其中包含的最大聚集傾向結構域限制並且受它與周圍結構域(如果存在的話)的相互作用的強度的限制。這是因為一旦該結構域去摺疊，如果它不能再摺疊，則它可以與同一種蛋白中或其他蛋白中的其他結構域相互作用並且形成聚集體。抗體的恆定結構域通常不聚集並且在序列上不明顯變化(如通過它們的名稱表明)。因此，抗體的最弱結構域通常被認為是從一種抗體到下一種抗體變化的那些區域，即可變結構域(例如，重鏈可變結構域(Vh)和/或輕鏈可變結構域(vj) (Ewert等人,2003)。就這一點而言,將易於聚集的scFv分子結合到其他穩定的重組抗體產物中通常會將這些一般不期望的性狀賦予給新的重組體設計。如Ewert等人，2008所述，「為了通過合理的工程改造改進任何次優的抗體構建體，必須鑑定並改善「最弱的連接」。Ewert等人還強調了可變結構域通常是抗體或抗體相關分子中的「最弱連接」。因此，使可變結構域具有聚集抗性的工程改造最可能使包含該可變結構域的整個蛋白具有聚集抗性。
[0010]為了降低可變結構域的聚集，已經提出了不同的策略，例如合理設計聚集抗性蛋白、互補決定區(CDR)接枝、或將二硫鍵引入可變結構域。
[0011]合理設計聚集抗性蛋白通常涉及使用計算機(insilico)分析來預測點突變對蛋白的聚集傾向的影響。然而，對於這種方法存在許多困難。例如，僅鑑定可能減少去摺疊蛋白的聚集的突變是不夠的。相反，該突變還必須不增加摺疊蛋白的聚集或影響摺疊蛋白的功能。此外，合理設計需要對進行改善的特定蛋白進行詳細的結構分析，並因此難以與尚未徹底表徵的蛋白一起使用並且不易應用於多種不同蛋白。
[0012]CDR接枝涉及將來自一個可變結構域的CDR移植到另一個可變結構域的框架區(FR)上。這一策略經證實可用於使抗EGP-2scFv穩定化(Willuda等人，1999)。然而,這一策略通常用於產生抗去摺疊的可變結構域，如上面所討論，這不是最令人希望的蛋白形式。這種方法的缺點包括在CDR接枝之後可能發生親和力降低。可以通過將突變引入到這些FR中來克服這種親和力損失，然而此類突變可能在蛋白中產生免疫原性表位，從而從治療的觀點來看使蛋白不可 取。此外，CDR接枝通常需要晶體結構的分析或供體和受體可變結構域的同源性建模，以評估接枝的適合性。顯然的是，這樣的方法是費力的並且需要專門的知識。此外，由於每種可變結構域具有不同的結構，這種方法不易在多種分子中加以應用。
[0013]至於涉及將二硫鍵引入可變結構域的多種方法，雖然該鍵合可有助於蛋白正確地再摺疊，但是它也將剛性引入到可變結構域中。這種剛性可以降低抗體對抗原的親和力。此外，不是所有的可變結構域都能夠支持引入必要的半胱氨酸殘基用於二硫鍵形成，而不損失親和力或不引入免疫原性表位。此外，在高蛋白濃度下形成二硫鍵可導致蛋白聚集，從而抵消該鍵合的任何潛在的正效應。
[0014]從上文將顯而易見的是，本領域中對於包含聚集抗性可變結構域的蛋白以及它們的生產工藝存在著需要。優選地，這些工藝易於應用到多種不同的可變結構域中。
發明概要
[0015]在本發明之前的工作中，發明人力圖鑑定賦予聚集(例如在暴露於熱或濃縮之後)抗性的抗體可變結構域中的胺基酸殘基。這類聚集抗性蛋白可用於多種應用，例如治療和/或診斷/預測。減少濃縮期間或濃縮之後(例如通過凍幹)的聚集的能力還提供可作為凍幹蛋白製造的例如治療性蛋白的生產和/或儲存優勢。發明人將帶負電的胺基酸引入了 \並鑑定了賦予聚集抗性的多種殘基。發明人鑑定的殘基存在於\的互補決定區
2(CDR2)內或其附近。發明人確定，'的CDR2中的單個帶負電的胺基酸殘基對可變結構域賦予了聚集抗性。發明人另外還發現，通過在'的CDR2中包含兩個或更多個帶負電的胺基酸，能夠進一步增強聚集抗性水平。發明人還發現，能夠修飾預先存在的\以增強聚集抗性並保持結合到抗原的能力。發明人還發現，能夠修飾預先存在的 '(單獨的或在scFv中)以增強聚集抗性而不明顯降低VL或scFv的抗原親和力。
[0016]發明人還產生了包含以下部分的蛋白:在⑶R2中或附近具有一個或多個帶負電的胺基酸的\，以及根據Kabat編號系統在橫跨胺基酸28-35的區域中包含一個或多個帶負電的胺基酸的聚集抗性VH。發明人發現，這些蛋白顯示出增強的聚集抗性並保持結合到抗原的能力。
[0017]由於發明人鑑定的許多殘基位於抗體的CDR中，因此它們能夠容易地在不同的抗體之間轉移，例如包含不同框架區的不同類或亞類的抗體。這是因為已選擇抗體可變結構域來適應⑶R中的序列變化，而框架區通常無明顯變化，因為它們為呈現⑶R環提供支架。
[0018]發明人的發現提供具有聚集抗性的含修飾'的蛋白(或含'和Vh的蛋白)的基礎及其多種用途。
[0019]因此，本公開提供包含Vl的分離蛋白，該Vl在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸，該蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0020]在一個實例中，蛋白還包含在⑶Rl中含有帶電殘基的VH。
[0021]除此之外或作為另外一種選擇，本公開提供包含' 的分離蛋白，該'在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，該蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0022]在一個實例中，蛋白還包含在⑶Rl中含有帶電殘基的VH。
[0023]本公開還提供包含以下部分的分離蛋白: [0024](i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的以及
[0025](ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的Vh。
[0026]其中所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0027]在一個實例中，該蛋白包含根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸，或包含選自由Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸。
[0028]本公開還提供包含以下部分的分離蛋白:
[0029](i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸的以及
[0030](ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸的Vh。
[0031 ] 其中所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0032]在一個實例中，Vl在根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個(或兩個或更多個)位置包含帶負電的胺基酸。
[0033]在一個實例中，Vl在根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、和53組成的組的一個或多個(或兩個或更多個)位置包含帶負電的胺基酸。
[0034]在一個實例中，VL在根據Kabat編號系統的⑶R2內的一個或多個(或兩個或更多個)位置包含帶負電的胺基酸。[0035]在\內賦予聚集抗性的帶負電胺基酸所處的示例性位置選自由根據Kabat編號系統的殘基50、51、52和53組成的組及其組合。
[0036]在\內賦予聚集抗性的帶負電胺基酸所處的位置的示例性組合選自由以下組成的組:
[0037]⑴ 根據Kabat編號系統的50和51 ;
[0038](ii) 根據Kabat編號系統的50和52 ;
[0039](iii) 根據Kabat編號系統的50和53 ;
[0040](iv) 根據Kabat編號系統的51和52;
[0041](V) 根據Kabat編號系統的52和53 ;
[0042](vi) 根據Kabat編號系統的50、51和53;
[0043](vii) 根據Kabat編號系統的51、52和53;
[0044](viii)根據Kabat編號系統的50、52和53 ；以及
[0045](ix) 根據 Kabat 編號系統的 50、51、52 和 53。
[0046]在一個實例中，VL在根據Kabat編號系統的位置50、52和53包含帶負電的胺基酸。
[0047]在一個實例中，Vl還在⑶Rl或⑶R2中包含帶電殘基。
`[0048]在一個實例中，'還在根據Kabat編號系統的⑶Rl中的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。示例性位置選自由以下組成的組:
[0049]⑴ 根據Kabat編號系統的位置24 ；
[0050](ii) 根據Kabat編號系統的位置29 ;
[0051](iii) 根據Kabat編號系統的位置30和31 ;以及
[0052](iv) 根據Kabat編號系統的位置31和32。
[0053]在另一個實例中，該蛋白還在根據Kabat編號系統的Vh的選自由殘基26、39、40、50,52,52a和53組成的組的一個或多個殘基包含帶負電的胺基酸。
[0054]在一個另外的或替代的實例中，該蛋白包含聚集抗性\和任選的聚集抗性VH。
[0055]在一個實例中，帶負電的胺基酸殘基在本文所述的區域內是表面暴露的殘基。根據該實例，蛋白在根據Kabat編號系統的\的位置54不含帶負電的胺基酸。
[0056]在一個實例中，帶負電的胺基酸殘基位於以下殘基處，該殘基不與抗原直接發生相互作用或不與抗原形成鍵合，或經預測不與抗原直接發生相互作用或不與抗原形成鍵合。確定相互作用或鍵合形成的方法對本領域的技術人員將是顯而易見的，並包括例如分子建模或X射線晶體學研究。
[0057]在一個實例中，蛋白與不含上文討論的帶負電的胺基酸的蛋白相比具有降低的聚集趨勢。例如，該蛋白與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比在加熱到至少約60V或70V或優選80°C後具有降低的聚集趨勢。
[0058]在一個實例中，該蛋白在加熱到至少約60°C或70°C或優選80°C後保持特異性結合到抗原的能力。
[0059]在另一個實例中，該蛋白在濃縮(例如凍幹或通過滲濾而濃縮)後具有降低的聚集趨勢。在一個實例中，濃縮包括乾燥。在另一個實例中，濃縮包括將含有蛋白的組合物的體積降低至少50 %或60 %或70 %或80 %或85 %。[0060]例如，本公開的蛋白在凍幹和復原後具有降低的聚集趨勢。例如，本公開的蛋白與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比在凍幹和復原後聚集的量少10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%，其中聚集通過測量濁度(例如320nm處的吸光度)而測量。
[0061]在另一個實例中，本公開的蛋白在滲濾後具有降低的聚集趨勢。例如，本公開的蛋白與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比在滲濾後聚集的量少10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%，其中聚集通過測量濁度(例如320nm處的吸光度)而
測量。
[0062]在一個實例中，該蛋白能夠結合到(優選地特異性結合到)人類蛋白。
[0063]在另一個實例中，該蛋白能夠結合到(優選地特異性結合到)與人類病狀或其病因相關的蛋白。這樣的蛋白可以是人類蛋白，或得自例如感染性生物體的蛋白。在一個實例中，該蛋白是人類蛋白。示例性蛋白是可溶性和/或分泌的蛋白或受體(例如受體的胞外結構域)或膜結合蛋白(例如膜結合蛋白的胞外結構域)。
[0064]在一個實例中，帶負電的胺基酸是穀氨酸。在另一個實例中，帶負電的胺基酸是天冬氨酸。
[0065]在一個實例中，VL中帶負電的胺基酸是天冬氨酸。
[0066]在一個實例中，Vh的位置28和/或30和/或31和/或33和/或35的帶負電的
胺基酸是天冬氨酸。
[0067]在一個實例中，Vh的位置32的帶負電的胺基酸是天冬氨酸或穀氨酸。
[0068]在一種示例性形式中，該蛋白在根據Kabat編號系統的Vh的位置32和33包含帶負電的胺基酸。在另一種示例性形式中，該蛋白在根據Kabat編號系統的Vh的位置31和32和33包含帶負電的胺基酸。
[0069]在一種示例性形式中，本公開的蛋白包含\的位置52和/或53的帶負電的胺基酸和VH的位置30的帶負電的胺基酸。在一個實例中，帶負電的胺基酸是天冬氨酸。
[0070]Vh中的帶負電的胺基酸的另外示例性位置在共同擁有和共同未決的國際專利申請PCT / AU2010 / 001416中有所描述，該專利的整個內容據此以引用方式併入。
[0071]本公開還可用於產生具有改進的聚集抗性的現有蛋白的修飾形式。因此，本公開還提供一種包含能夠特異性結合到抗原的修飾 '的蛋白，其中\包含根據Kabat編號系統選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置的帶負電的胺基酸，並且其中\的未修飾形式不含帶負電的胺基酸。
[0072]本公開還提供一種包含能夠特異性結合到抗原的修飾\的蛋白，其中VL包含根據Kabat編號系統在殘基49與56之間的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸，並且其中Vl的未修飾形式不含所述位置的兩個或更多個帶負電的胺基酸。
[0073]本公開還提供包含以下部分的蛋白:
[0074](i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的修飾 '，其中\的未修飾形式不在所述位置包含帶負電的胺基酸；以及
[0075](ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的修飾Vh，其中Vh的未修飾形式不在所述位置包含帶負電的胺基酸，[0076]其中修飾的蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0077]本公開還提供修飾成包含以下部分的蛋白:
[0078](i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含至少一個帶負電的胺基酸的以及
[0079](ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含至少一個帶負電的胺基酸的Vh,
[0080]其中未修飾的蛋白不含\中的帶負電的胺基酸和VH中的帶負電的胺基酸，其中修飾的蛋白能夠特異性結合到抗原。
[0081]在一個實例中，未修飾的蛋白結合到與修飾的蛋白相同的抗原(例如相同的表位)。
[0082]在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的親和常數(KD)在未修飾的蛋白的約50 %或40 %或30 %或20 %或10 %內。在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的親和常數(KD)在未修飾的蛋白的約5%內。
[0083]在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的締合速率(Ka)在未修飾的蛋白的約50%或40%或30%或20%或10%內。在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的締合速率(Ka)在未修飾的蛋白的約5%內。
[0084]在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的解離速率(Kd)在未修飾的蛋白的約50%或40%或30%或20%或10%內。在一個實例中，修飾的蛋白結合到抗原的解離速率(Ka)在未修飾的蛋白的約5%內。
[0085]在一個實例中，蛋白包含修飾的聚集抗性\和任選的修飾的聚集抗性VH。
[0086]這樣的蛋白的示例性特徵(例如，帶負電的胺基酸和/或特定的帶負電的胺基酸的另外位點)在本文進行了描述，並將被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於本公開的形式。
[0087]在一個實例中，蛋白是抗體。
[0088]在一個實例中，根據任一實例如本文所述的蛋白在CDR內不含二硫鍵，例如CDR內二硫鍵，例如在⑶R3內。
[0089]在另一個實例中，根據任一實例如本文所述的蛋白內的可變結構域不具有總體酸性等電點。
[0090]本公開的示例性蛋白是人類、人源化或去免疫的蛋白，或融合到人類蛋白或其區域(例如，為嵌合抗體)。
[0091]在一個實例中，本公開的蛋白是單結構域抗體(dAb)或融合到另一蛋白(例如Fe區或能夠結合到免疫效應細胞的蛋白)的dAb的形式。
[0092]在一個替代實例中，本公開的蛋白包含\和Vh，其中Vh和\締合形成Fv (例如包含抗原結合位點)。在一個實例中，Fv能夠特異性結合到抗原。
[0093]在一個實例中，Vh和'在不同的多肽鏈中。例如，蛋白為抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體或Fv的形式。
[0094]在另一個實例中，V1^P Vl在同一多肽鏈中。例如，蛋白為(scFv)n或包含(scFv)η的融合蛋白的形式，其中η為數字，例如介於I與10之間。
[0095]在一個實例中，蛋白以小於約10 μ M或5 μ Μ，例如小於I μ Μ，例如小於500ηΜ，例如小於200nM，諸如小於IOOnM以及例如小於ΙΟηΜ，諸如小於InM的親和常數(KD)結合到靶
抗原或表位。
[0096]在一個替代或另外的實例中，本文所討論的任何蛋白以小於約ΙΟΟρΜ，諸如小於ΙΟρΜ，例如小於IpM的親和常數(KD)結合到靶抗原或表位。
[0097]在一個另外或替代的實例中，本公開的任一蛋白以300nM或更小，300nM至5pM，優選50nM至20pM，或5nM至200pM或InM至IOOpM的Kd從其靶抗原解離。
[0098]在一個實例中，根據任一實例的如本文所述的蛋白包含'，該'包含如SEQ IDNO:1、3、7或11中任一種(諸如7或11)所示的序列，該序列經修飾成在殘基49與56之間包含至少一個或兩個帶負電的胺基酸，或包含與所述序列至少約80%相同的序列。
[0099]在一個實例中，根據任一實例的如本文所述的蛋白包含\和具有如SEQ ID NO:9所示序列的Vh，其中\經修飾成在殘基49與56之間包含至少一個或兩個帶負電的胺基酸或與其至少約80%相同的序列，並且任選地Vh經修飾成在選自由根據Kabat編號系統的Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個或兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸。
[0100]在一個實例中，根據任一實例的如本文所述的蛋白包含'和具有如SEQ ID NO:13所示序列的Vh，其中\經修飾成在殘基49與56之間包含至少一個或兩個帶負電的胺基酸或與其至少約80%相同的序 列，並且任選地Vh經修飾成在選自由根據Kabat編號系統的Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個或兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸。
[0101]任選地，在前面三個段落中所述的蛋白包含替代'中的N端穀氨醯胺的天冬氨酸。
[0102]在一個實例中，根據任一實例的如本文所述的蛋白包含'，該'包含如SEQ IDNO:11所不的序列，該序列在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間包含至少一個或兩個帶負電的胺基酸，其中該蛋白特異性結合到人表皮生長因子受體2(HER2)。
[0103]在一個實例中，該蛋白在根據Kabat編號系統的位置52或53或在兩個位置52和53包含帶負電的胺基酸。
[0104]在一個實例中，該蛋白還包含下述Vh包含如SEQ ID N0:13所示的序列，該序列在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個或兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸。
[0105]在一個實例中，VH在位置30包含帶負電的胺基酸。
[0106]本公開還提供偶聯到化合物上的本公開的蛋白。例如，該化合物選自放射性同位素、可檢測的標記、治療性化合物、膠質、毒素、核酸、肽、蛋白、延長蛋白在受試者中的半衰期的化合物以及它們的混合物。
[0107]本公開還提供包含本公開的蛋白和藥學上可接受的載體的組合物。
[0108]本公開還提供編碼本公開蛋白的核酸。在一個實例中，核酸是表達構建體並可操作地連接到啟動子。例如，表達構建體是表達載體。
[0109]本公開還提供表達本公開的蛋白的細胞。例如，細胞包含本公開的核酸或表達構建體。示例性細胞包括哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞和原核細胞。
[0110]本公開還提供生產本公開蛋白的方法，該方法包括將本公開的表達構建體維持在足以(或使得)產生編碼蛋白的時間和條件下。例如，該方法包括將本公開的蛋白在足以(或使得)產生本公開蛋白的時間和條件下培養。
[0111]在一個實例中，該方法還包括分離本公開的蛋白。在一個實例中，該方法還包括在分離蛋白之前、期間或之後將蛋白加熱到例如至少約50V或60°C或70V或80°C。例如，將蛋白加熱從而降低在表達和純化工藝過程中天然存在的二聚體和/或三聚體的量。這樣的方法可有利於回收提高水平的本公開的蛋白。
[0112]任選地，該方法還包括將蛋白偶聯到化合物或將化合物配製成藥物組合物。
[0113]本公開還提供包括本公開的多種蛋白的文庫。
[0114]本公開還提供包括含有\的蛋白的文庫，該\根據Kabat編號系統在殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸。
[0115]本公開還提供包括含有抗體輕鏈可變結構域(')和抗體重鏈可變結構域(Vh)的蛋白的文庫，其中該蛋白包含:
[0116](a)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的以及
[0117](b)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的VH。
[0118]在一個實例中，文庫中蛋白的至少30% (或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%或98%或99% )包含帶負電的胺基酸。
[0119]本公開還提供包括含有'的蛋白的文庫，其中'的至少30% (或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%或98%或99% `)在如本文所述的位置包含帶負電的胺基酸。該蛋白還包含在本文所述的位置含有帶負電的胺基酸的VH。
[0120]在一個實例中，蛋白展示在顆粒(例如噬菌體或核糖體)或細胞的表面上。
[0121]在一個實例中，除了如上所述定位的帶負電的胺基酸之外，在'和Vh(若存在)的⑶R中(例如在⑶R3或在⑶Rl和3中或在⑶Rl、2和3中)的胺基酸為隨機的或半隨機的或衍生自人類抗體。
[0122]顯然的是，本公開還提供編碼所述文庫的核酸的文庫。
[0123]本公開還提供分離本公開蛋白的方法，該方法包括將本公開的文庫在足以(或使得)蛋白結合到抗原的時間和條件下與抗原接觸，以及分離蛋白。
[0124]本公開還提供產生包括本公開的多種蛋白的文庫的方法，該方法包括:
[0125](i)獲得或產生編碼包含'的多種蛋白的核酸，其中'在上述位置包含帶負電的
胺基酸；
[0126](ii)產生包含以下可操作地連接的核酸的表達構建體的文庫:
[0127]a)啟動子；
[0128]b)在⑴獲得或產生的核酸；和
[0129]c)編碼促進含\的蛋白在細胞或顆粒中/上展示的核酸；以及
[0130](iii)表達由表達構建體編碼的蛋白，使得它們在細胞或顆粒中/上展示。
[0131]在一個實例中，除了帶負電的胺基酸之外，在八的⑶R中(例如在⑶R3或在⑶Rl和3中或在CDR1、2和3中)的胺基酸為隨機的或半隨機的或衍生自人類抗體。
[0132]在一個實例中，該方法還包括分離編碼蛋白的核酸。這樣的核酸可引入表達構建體。任選地,可使蛋白表達。
[0133]在一個實例中，該方法還包括將包含\的一種或多種蛋白暴露於熱和/或濃縮該蛋白，並選擇與不含帶負電的胺基酸的對照蛋白相比具有降低的聚集傾向的蛋白。
[0134]本公開還考慮了對分離的蛋白進行修飾，諸如親和力成熟和/或人源化和/或去免疫化。
[0135]這樣的分離蛋白可用於產生例如抗體。
[0136]本公開還可用於降低包含\和任選的Vh的現有抗體或蛋白的聚集傾向或增強聚集抗性。例如，本公開提供了增強包含\的蛋白的聚集抗性的方法，該方法包括通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾
[0137]本公開還提供了增強包含'的蛋白的聚集抗性的方法，該方法包括對'進行修飾，使得其在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，其中未修飾的蛋白不含根據Kabat編號系統的CDR2內的兩個或更多個帶負電的胺基酸。
[0138]本公開還提供增強包含'和Vh的蛋白的聚集抗性的方法，該方法包括對蛋白進行修飾使得其包含:
[0139](i)根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的帶負電的胺基酸；以及
[0140](ii)根據Kabat編號系統的選自由Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的帶負電的氨 基酸，
[0141]其中蛋白在修飾前在'和Vh的位置中不含帶負電的胺基酸。
[0142]在一個實例中，該方法包括:
[0143](i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的胺基酸而修飾\ ;以及
[0144](ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾VH。
[0145]本公開還提供增強包含'和Vh的蛋白的聚集抗性的方法，該方法包括對蛋白進行修飾使得其包含:
[0146](i)根據Kabat編號系統的所述Vl的殘基49與56之間兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸；以及
[0147](ii)根據Kabat編號系統的選自由所述￥11的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸，
[0148]其中蛋白在修飾前在'和Vh的位置中不含帶負電的胺基酸。
[0149]例如，該方法包括:
[0150](i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間兩個或更多個位置的胺基酸而修飾\ ;以及
[0151](ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置的胺基酸而修飾VH。
[0152]在一個實例中，該方法還包括對蛋白進行修飾，使得\還在⑶Rl中包含一個或多個帶負電的胺基酸和/或Vh還在根據Kabat編號系統的選自由殘基26、39、40、50、52、52a和53組成的組的一個或多個殘基包含帶負電的胺基酸。
[0153]另外的修飾位點和/或可取代的特定胺基酸殘基在本文進行了描述並被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於本發明的實例。
[0154]在一個實例中，該方法包括從蛋白中分離 '(和任選的Vh)，根據本公開的方法對'(和任選的VH)進行修飾，以及產生包含'(和任選的Vh)的蛋白。例如，該方法包括從抗體中分離 '(和任選的Vh)，根據本公開的方法對 '(和任選的Vh)進行修飾，以及產生包含修飾的'(和任選的Vh)的抗體。
[0155]在一個實例中，該方法還包括確定修飾的蛋白結合到抗原的能力。在一個實例中，該方法還包括選擇結合到抗原的修飾蛋白，其親和力(例如3/4、Ka和/或3/4)與未修飾的蛋白相似(例如在約10%內)。
[0156]在一個實例中，本公開的方法還包括在根據本公開修飾後使'(和任選的Vh)或包含它的蛋白親和力成熟和/或使蛋白去免疫化和/或使蛋白人源化和/或使蛋白嵌合。
[0157]在一個實例中，該方法還包括將修飾的蛋白暴露於熱和/或將蛋白濃縮，然後選擇與未修飾的蛋白相比聚集趨勢降低的蛋白。
[0158]在一個實例中，本公開的方法不涉及將任何另外的胺基酸殘基插入(與取代相對)\ (和任選的Vh)。
[0159]上述方法將被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於以下方面的方法:用於增加蛋白的表達，和/或用於產生能夠以高濃度儲存而不明顯聚集的蛋白，和/或增加從層析樹脂的蛋白回收率，或用於降低從層析樹脂回收蛋白所需的溶液體積。
[0160]例如，本公開提供增 加包含抗體\的可溶性蛋白的產生水平的方法，該方法包括通過用帶負電的胺基酸對根據Kabat編號系統的選自由殘基51、52和53組成的組的一個或多個位置的胺基酸進行取代從而修飾'，其中所產生的可溶性蛋白的水平與不含帶負電的胺基酸的蛋白的產生水平相比得以升高。
[0161]本公開還提供增加包含抗體' 的可溶性蛋白的產生水平的方法，該方法包括對'進行修飾使得其在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，其中未修飾的蛋白在根據Kabat編號系統的CDR2內不含所述兩個或更多個帶負電的胺基酸，並且其中所產生的可溶性蛋白的水平與不含帶負電的胺基酸的蛋白的產生水平相比得以升高。
[0162]本公開還提供增加包含抗體VL和VH的可溶性蛋白的產生水平的方法，該方法包括對蛋白進行修飾使得其包含:
[0163](i)根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的帶負電的胺基酸；以及
[0164](ii)根據Kabat編號系統的選自由Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的帶負電的胺基酸，
[0165]其中蛋白在修飾前在VL和Vh中的所述位置不含帶負電的胺基酸，並且其中所產生的可溶性蛋白的水平與不含帶負電的胺基酸的蛋白的產生水平相比得以升高。
[0166]在一個實例中，該方法包括:
[0167](i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的胺基酸而修飾\;以及
[0168](ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾VH。
[0169]本公開還提供降低從層析樹脂中回收蛋白所需的溶液體積的方法，該方法包括對根據任一實例如本文所述的蛋白或修飾蛋白進行層析。 [0170]本公開還提供降低從層析樹脂回收包含抗體'的蛋白所需的溶液體積的方法，該方法包括通過帶負電的胺基酸對根據Kabat編號系統的選自由殘基51、52和53組成的組的一個或多個位置的胺基酸進行取代從而修飾蛋白的\，以及進行層析，從層析樹脂回收蛋白所需的溶液體積水平與不含帶負電的胺基酸的蛋白的體積相比得以降低。
[0171]本公開還提供降低從層析樹脂回收包含抗體'的蛋白所需的溶液體積的方法，該方法包括修飾\使得其在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，其中未修飾的蛋白在根據Kabat編號系統的CDR2內不含所述兩個或更多個帶負電的胺基酸，以及進行層析，其中回收蛋白所需的溶液體積與不含帶負電的胺基酸的蛋白的體積相比得以降低。
[0172]本公開還提供降低從層析樹脂回收包含抗體VL和Vh的蛋白所需的溶液體積的方法，該方法包括對蛋白進行修飾使得其包含:
[0173](i)根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的帶負電的胺基酸；以及
[0174](ii)根據Kabat編號系統的選自由Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的帶負電的胺基酸，
[0175]以及進行層析，其中蛋白在修飾前在'和Vh中的所述位置不含帶負電的胺基酸，並且回收蛋白所需的溶液體積與不含帶負電的胺基酸的蛋白的體積相比得以降低。
[0176]在一個實例中，該方法包括:
[0177](i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間一個或多個位置的胺基酸而修飾\ ;以及
[0178](ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾VH。
[0179]在一個實例中，層析是尺寸排阻層析或結合-洗脫層析。
[0180]本公開還提供了本公開的蛋白或本公開的組合物在醫學中的用途。
[0181]本公開還提供了一種治療或預防受試者中的病狀的方法，該方法包括將本公開的蛋白或組合物施用給對其有需要的受試者。在一個實例中，受試者患有癌症和/或炎性疾病和/或自身免疫疾病和/或神經病狀。
[0182]本公開還提供本公開的蛋白在製造用於治療或預防病狀的藥物中的用途。
[0183]本公開還提供將化合物遞送到細胞的方法，該方法包括將細胞與本公開的蛋白或組合物接觸。
[0184]本公開還提供診斷或預測受試者病狀的方法，該方法包括將得自受試者的樣本與本公開的蛋白或組合物接觸使得蛋白結合到抗原並形成複合物，以及檢測複合物，其中複合物的檢測對受試者的病狀作出診斷或預測。在一個實例中，該方法包括測定複合物的水平，其中所述複合物的水平升高或降低對受試者的病狀作出診斷或預測。[0185]本公開還提供一種定位或檢測受試者中的抗原的方法，所述方法包括:
[0186](i)向受試者施用本公開的蛋白或組合物使得蛋白結合到抗原，其中將蛋白偶聯到可檢測的標記；以及
[0187](ii)在體內檢測或定位可檢測的標記。
[0188]附圖簡述
[0189]圖1是示意圖，顯示了在CDRl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的DPK9中的\的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。Y軸示出當在本文舉例說明的噬菌體上接受「熱/冷」測定時蛋白L結合的保留百分比。DPK9是具有低聚集抗性水平的'的實例。
[0190]圖2是示意圖，顯示了在殘基49與56之間包含單個帶負電胺基酸(天冬氨酸)改變以及它們的組合的DPK9中的\的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。Y軸示出當在本文舉例說明的噬菌體上接受「熱/冷」測定時蛋白L結合的保留百分比。
[0191]圖3是示意圖，顯示了在位置52和53包含帶負電的胺基酸的\的文庫的各個成員的聚集抗性。圖中還顯示了野生型可變結構域(WT)的聚集抗性。Y軸示出與未處理的對照相比在噬菌體上加熱和冷卻的可變結構域與蛋白L的結合百分比。< 0.001
[0192]圖4A是示意圖，顯示了加熱到85°C後八的濁度。圖中示出了使用以下八產生的結果:不含帶負電的胺基酸(DPK9)、含一個帶負電的胺基酸(50D、5ID、52D或53D)、含兩個帶負電的胺基酸(50 / 52DD、50 / 53DD、51 / 53DD、52 / 53DD)、含三個帶負電的胺基酸(50-53DADD)以及含四個帶負電的胺基酸(50-53DDDD)。X軸示出將\維持在85°C的持續時間。Y軸示出在360nm處測得的吸光度。
[0193]圖4B是示意圖，顯示了在100 μ M下作為可溶性蛋白的在' 的⑶R2中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的DPK9中的'在加熱到85°C後的聚集抗性。'的聚集通過作為濁度度量的320nm處的吸光度而測定(如Y軸上所示)。DPK9是具有低聚集抗性水平的\的實例。
[0194]圖5包括含有帶負電的胺基酸的種系'結構域DPK9的一系列圖示，其具有改善的生物物理特性，諸如可溶性表達水平(圖5A)、在凝膠過濾柱上的保留(圖5B)和純化蛋白在加熱後的聚集抗性(圖5B)。「lx」是一個帶負電的胺基酸；「2x」是兩個帶負電的胺基酸；而「31」是三個帶負電的胺基酸。
[0195]圖6是示意圖，顯示了在殘基50與53之間包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的阿達木單抗(Humira)中的'的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。DPK9是具有低聚集抗性水平的\的實例。「WT」是阿達木單抗中的\。[0196]圖7是示意圖，顯示了在殘基50與53之間包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的抗體4D5中的\的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。DPK9是具有低聚集抗性水平的\的實例。「WT」是4D5中的\。
[0197]圖8A是示意圖，顯示了在'的CDRl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。「WT」是4D5中的scFv。
[0198]圖8B是示意圖，顯示了在' 的CDR2中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。「WT」是4D5中的scFv。
[0199]圖9是示意圖，顯示了在Her2的殘基50與53之間包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5及其突變形式中scFv的結合(如X軸所示)。Y軸顯示在450nm處測得的吸光度。「WT」是4D5中的ScFv0
[0200]圖10是示意圖，顯示了在Her2的殘基50與53之間包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5及其突變形式中的scFv在加熱到80°C後的結合，以加熱前結合水平的百分比表示。「WT」是4D5中的scFv。
[0201]圖11是示意圖，顯示了在'的⑶1?2和Vh的⑶Rl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。「WT」是4D5中的scFv。
[0202]圖12是示意圖，顯示了在VL的⑶R2和Vh的⑶Rl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X軸上指出。「WT」是4D5中的scFv。
[0203]圖13是示意圖，顯示了在' 的⑶R2和Vh的⑶Rl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv的結合。任何取代的定位在X軸上指出。Y軸顯示450nm處的吸光度。「WT」是4D5中的ScFv0
[0204]圖14是示意圖，顯示了在'的⑶1?2和Vh的⑶Rl中包含單個帶負電胺基酸改變以及它們的組合的4D5中的scFv在加熱到80°C後與抗原的結合。任何取代的定位在X軸上指出。「WT」是4D5中的scFv。
[0205]圖15是示意圖，顯示了由4D5產生的scFv的突變形式的聚集。圖中指出了每條線的突變位置，其中Vh突變列於頂部，而'突變列於底部。「WT」表示野生型4D5序列。X軸表示時間(分鐘)，其中O是加熱到80°C的開始時間。Y軸表示作為濁度度量的在360nm處測得的吸光度。
[0206]圖16A是示意圖，顯示了在Vh的`⑶Rl和\的⑶R2中包含突變的作為全IgG的4D5與SK-BR-3細胞的結合曲線，如通過流式細胞術所測量。
[0207]圖16B 是示意圖，顯示了通過在 Vh(30D / WT)、Vl (WT / 52D)、VH 和 Vl (30D / 52D)中包含帶負電的胺基酸的4d5 (WT / WT)及其變體或同種型對照抗體對SK-BR-3細胞增殖的抑制。數據表示為在同種型對照存在下的增殖百分比。
[0208]圖17A是包含分別在⑶RHl和/或⑶RL2中含有種系VH3DP47和種系'k DPK9的人IgGl的洗脫圖的示意圖，如通過尺寸排阻層析所測量。X軸顯示總洗脫體積。Y軸顯示280nm處的吸光度。
[0209]圖17B是在⑶RHl和/或⑶RL2中包含帶負電胺基酸的作為全IgG的4D5的洗脫圖的示意圖，如通過尺寸排阻層析所測量。X軸顯示總洗脫體積。Y軸顯示280nm處的吸光度。
[0210]圖17C是在⑶RL2中包含帶負電胺基酸(單個或三個；如圖所示)的DPK9'的洗脫圖的示意圖，如通過尺寸排阻層析所測量。X軸顯示總洗脫體積。Y軸顯示280nm處的吸光度。
[0211]序列表檢索表
[0212]SEQ ID NO:1 是 DPK9Vl 的胺基酸序列。
[0213]SEQ ID NO:2是編碼DPK9Vl的核苷酸序列。
[0214]SEQ ID NO:3是VLk VL的胺基酸序列。[0215]SEQ ID NO:4是編碼VLk Vl的核苷酸序列。
[0216]SEQ ID NO:5是對照scFv的胺基酸序列。
[0217]SEQ ID NO:6是編碼對照scFv的核苷酸序列。
[0218]SEQ ID NO: 7是阿達木單抗的\的胺基酸序列。
[0219]SEQ ID NO:8是編碼阿達木單抗的\的核苷酸序列。
[0220]SEQ ID NO:9是衍生自阿達木單抗的scFv的胺基酸序列。
[0221]SEQ ID NO:10是編碼衍生自阿達木單抗的scFv的核苷酸序列。
[0222]SEQ ID NO: 11是4D5的\的胺基酸序列。
[0223]SEQ ID NO:12是編碼4D5的\的核苷酸序列。
[0224]SEQ ID NO: 13是4D5的Vh的胺基酸序列。
[0225]SEQ ID NO: 14是編碼4D5的Vh的核苷酸序列。
[0226]SEQ ID NO:15是衍生自4D5的scFv的胺基酸序列。
[0227]SEQ ID NO:16是編碼衍生自4D5的scFv的核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0228]概述
[0229]貫穿本說明書，除非另外明確地說明或上下文另有要求，否則提及單個步驟、物質構成、步驟的組或物質構成的組應當被理解成包括這些步驟、物質構成、步驟的組或物質構成的組的一個和多個(即一個或多個)。
[0230]本領域的技術人員將理解本公開是容易進行改變和變更的，除外確切地說明的那些。應當理解的是本公開包括所有此類改變和變更。本公開還包括在本說明書中逐個地或共同地提及或指出的所有這些步驟、特徵、組合物和化合物，以及所述步驟或特徵的任何和所有的組合或其中的任何兩種或更多種。
[0231]本公開並不局限於本文所述的特定實例的範圍內，這些實例僅旨在用於舉例說明目的。功能上等效的產物、組合物和方法顯然地在本公開的範圍內，如本文所述。
[0232]本公開的任一實例將被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於本公開的任何其他實例，除非另外明確說明。
[0233]涉及包含抗體\的蛋白的本文所述的任一實例或其用途將被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於包含免疫球蛋白可變結構域的蛋白或其用途。
[0234]除非另外明確地定義，本文使用的所有技術和科學術語應當認為具有與本領域(例如，在細胞培養、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白化學和生物化學中)普通技術人員通常理解的相同含義。
[0235]除非另外說明 ，本公開中使用的重組蛋白、細胞培養和免疫技術是本領域的技術人員熟知的標準程序。此類技術在以下來源的文獻中進行了說明和解釋，諸如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J.Sambrooket al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989), T.A.Brown (editor)，Essential Molecular Biology:A PracticalApproach，Volumesland2，IRL Press (199D，D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach，Volumesl-4，IRL Press (1995and 1996)，andF.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-1nterscience (1988,包括至今的所有更新)，Ed Harlow and DavidLane(editors)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory,(1988), and J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology, Johnffiley&Sons (包括至今的所有更新)。
[0236]通過Kabat (1987 和 / 或 1991)、Bork 等人(1994)和 / 或 Chothia 和 Lesk (1987和1989)或Al-Lazikani等人(1997)中的討論可以進一步闡明本文的可變結構域及其部分、免疫球蛋白、抗體及其片段的說明和定義。
[0237]術語「和/或」(例如「X和/或Y」)應當理解為是指「X和Y」或「X或Y」並且應當理解成為兩種含義或為任一含義提供明顯支持。
[0238]在本說明書全文中，詞語「包含」或變型形式諸如「包括」或「含有」將被理解為意在包含所述的要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟的群組，但不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟的群組。
[0239]如本文所用，術語「衍生自」應當被認為是指特定的整體可以從特定的來源獲得，儘管不需要直接從該來源獲得。
[0240]術語「之 間」當涉及胺基酸殘基或位置時包括所列的末端殘基。例如，「參見49與56 之間」包括殘基 49、50、51、52、53、54、55 和 56。
[0241]在本公開的上下文中，提及馬庫什(Markush)組(即，「選自由......組成的組」)
將被理解為涵蓋「逐個地或共同地選自由......組成的組」並為其提供明顯支持。
[0242]對於「逐個地」表示本公開單獨地涵蓋所列的殘基或多個殘基的組，並表示儘管單獨的殘基或多個殘基的組可能並未在本文單獨地列出，但是隨附的權利要求可以單獨地定義此類殘基或多個殘基的組並且可以彼此分開。
[0243]對於「共同地」表示本公開涵蓋任何數目或組合的所列殘基或多個殘基的組，並表示儘管此類數目的或組合的殘基或多個殘基的組可能並未在本文具體列出，但是隨附的權利要求可以單獨地定義此類組合或亞組合，並且可以與殘基或殘基的組的任何其他組合分開。
[0244]所選的定義
[0245]如本文所用，術語「聚集」是指在不用將蛋白再摺疊成天然或未聚集狀態的試劑對蛋白進行處理的情況下是不可逆的蛋白之間的締合或結合。這種聚集可導致功能的喪失，天然摺疊的喪失，和/或細胞毒性或免疫原性的獲得。該定義包括在體內形成的有害的無功能蛋白組裝以及在生物醫藥研究以及生物技術中在體外形成的無功能蛋白組裝兩者。然而，它不包括等電的或「鹽析的」沉澱，其中當轉移到類似天然緩衝劑條件時，組成性蛋白立即回到它們可溶的天然形式。
[0246]對於「聚集抗性」是指在暴露於使蛋白變性或者誘導或促使蛋白或其結構域聚集的條件(例如熱或儲存一段時間，諸如長期儲存(例如，至少約I周或I個月或兩個月或三個月或12個月)或濃縮)後，本公開的蛋白與不含本文所述的帶負電的胺基酸和/或能夠以構象特異性方式再摺疊並結合到結合伴侶的蛋白相比不聚集或以降低的水平聚集(例如低10 %或低20 %或低30 %或低40 %或低50 %或低60 %或低70 %或低80 %或低90 % )。例如，在暴露於該條件後，蛋白能夠特異性結合到抗原和/或超抗原，例如蛋白A或蛋白L。在一個實例中，在部分或完全變性(或去摺疊)後，蛋白能夠再摺疊成允許特異性結合到抗原或超抗原的構象。示例性蛋白在暴露於通常使蛋白或其結構域變性的條件(例如熱)後不明顯聚集。例如，在暴露於熱(例如60 C或70 C或80 C )後，在包含多種所述蛋白的組合物中本公開的蛋白多於約10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%不發生聚集。因此，本公開的蛋白可被視為能夠熱再摺疊的。在另一個實例中，蛋白在例如通過凍幹和/或室溫濃縮而濃縮時不發生聚集。例如，該蛋白與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比在凍幹和/或室溫濃縮(例如通過滲濾)後聚集量低約10%或20%或30% 或 40% 或 50% 或 60% 或 70% 或 80% 或 90%。
[0247]如本文所用，術語「抗體」應當理解成表示包含由多條多肽鏈組成的可變結構域(例如輕鏈可變結構域(\)和重鏈可變結構域(VH))的蛋白。抗體通常還包含恆定結構域，這些恆定結構域可以排列成恆定區或恆定片段或可結晶片段(Fe)。抗體可以特異性結合到一種或一些密切相關的抗原。通常，抗體包含四鏈結構作為它們的基本單元。全長抗體包含共價連接的兩條重鏈(約50-70kD)和兩條輕鏈(每條約23kD)。輕鏈通常包含可變結構域和恆定結構域，並且在哺乳動物中為K輕鏈或λ輕鏈。重鏈通常包含可變結構域和通過鉸鏈區連接到另外的恆定結構域上的一個或兩個恆定結構域。哺乳動物的重鏈具有以下類型之一:α、δ、ε、Y或μ。每條輕鏈還共價地連接到這些重鏈之一。例如,通過鏈間二硫鍵並且通過非共價相互作用將兩條重鏈以及重鏈和輕鏈保持在一起。在不同類型的抗體之中，鏈間二硫鍵的數量可以變化。每條鏈具有N端可變結構域(VH或'，其中各自為約110個胺基酸長)並且在C端具有一個或多個恆定結構域。輕鏈的恆定結構域(約110個胺基酸長的CL)與重鏈的第一恆定結構域(約330-440個胺基酸長的CH)對齊並通過二硫鍵鍵合到其上。輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。抗體重鏈可以包含2個或更多個另外的CH結構域(例如，CH2、CH3等)並且可以包含可以在CHI與CH2恆定結構域之間進行鑑定的鉸鏈區。抗體可以具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2)或亞類。優選地，抗體是IgG,諸如IgG3。優選地，抗體是鼠類(小鼠或大鼠)抗體或靈長類(諸如人類)抗體。術語「抗體」還涵蓋人源化抗體、靈長類化抗體、去免疫化抗體、人類抗體以及嵌合抗體。該術語不涵蓋抗體樣分子，諸如T細胞受體，此類分子由術語「免疫球蛋白」涵蓋。
[0248]如本文所用，「可變結構域」是指包含⑶R(即⑶R1XDR2和⑶R3以及FR)的胺基酸序列的如本文所定義的抗體或免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的部分。Vh是指重鏈的可變結構域。'是指輕鏈的可變結構域。根據本公開中使用的方法，分配給CDR和FR的胺基酸位置根據Kabat (1987和1991)定義並根據Kabat編號系統進行編號。技術人員將能夠容易地將其他編號系統用於執行本公開，例如Clothia和Lesk (1987)和/或Chothia (1989)和/或Al-Lazikani等人(1997)的高變區環編號系統。例如，使用Kabat或Clothia和Lesk (1987)和/或Chothia (1989)的編號系統，Vl的CDR2限定在相同的位置。
[0249]如本文所用，術語「重鏈可變結構域」或「VH」應當理解成表示能夠結合到一種或更多種抗原，優選地特異性結合到一種或更多種抗原，並且至少包含⑶Rl的蛋白。優選地，重鏈連同三個⑶R —起包含三個 或四個FR(例如FR1、FR2、FR3以及任選地FR4)。在一個實例中，重鏈包含根據Kabat編號系統編號的以下殘基1-30 (FRI) ,26-35或31-35(或35b)(CDRl)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66-94(FR3)、95-102 (CDR3)和 103-113 (FR4)定位的 FR和⑶R。在一個實例中，重鏈從包含所述重鏈和多個(優選3個或4個)恆定結構域的抗體衍生或連接到恆定片段(Fe)。
[0250]如本文所用，術語「輕鏈可變結構域」或應當理解成表示能夠結合到一種或更多種抗原，優選地特異性結合到一種或更多種抗原，並且至少包含CDRl的蛋白。優選地，輕鏈連同三個⑶R —起包含三個或四個FR(例如FRl、FR2、FR3以及任選地FR4)。優選地，輕鏈包含根據Kabat編號系統編號的以下殘基1-23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)和 98-107 (FR4)定位的 FR 和 CDR。在一個實例中，輕鏈從包含連接到一個恆定結構域和/或不連接到恆定片段(Fe)的所述輕鏈的抗體衍生。[0251]在本公開的一些實例中，術語「框架區」將理解為表示除了⑶R殘基之外的那些可變結構域殘基。天然存在的抗體的每個可變結構域典型地具有鑑定為FRl、FR2、FR3和FR4的四個FR。如果⑶R根據Kabat而定義，則示例性輕鏈FR(LCFR)殘基定位在殘基1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)以及 98-107 (LCFR4)的附近。注意，λ LCFRl不含包含在KLCFRI中的殘基10。示例性重鏈FR(HCFR)殘基定位在殘基1_30 (HCFRl)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)和 103-113 (HCFR4)的附近。
[0252]如本文所用，術語「互補決定區」(同義詞⑶R ;即⑶R1、⑶R2和⑶R3或高變結構域)是指其存在對於抗原結合所必需的抗體可變結構域的胺基酸殘基。每個可變結構域典型地具有鑑定為⑶R1、⑶R2和⑶R3的三個⑶R區。每個互補決定區可以包含來自如Kabat (1987或1991或1992)定義的「互補決定區」的胺基酸殘基。在本公開的一個實例中，在重鏈可變結構域中，⑶RHl在殘基26至35 (或35b)之間，⑶RH2在殘基50至65之間，而⑶RH3在殘基95至102之間(根據Kabat編號系統進行編號)。在輕鏈中，⑶RLl在殘基24至34之間，CDRL2在殘基50至56之間，而CDRL3在殘基89至97之間(根據Kabat編號系統進行編號)。這些⑶R還可以包含多個插入，例如，如Kabat (1987和/或1991和/或1992)中所述。
[0253]如本文所用，術語「Fv」應當理解為表示任何蛋白，無論是由多個多肽還是由單個多肽構成，其中VL和合併形成具有抗原結合位點(即能夠特異性結合到抗原)的複合物。形成抗原結合位點的VH和'可在單條多肽鏈中或在不同的多肽鏈中。此外，本公開的Fv(以及本公開的任何蛋白)可具有可以或可以不結合相同抗原的多個抗原結合位點。該術語應當理解成涵蓋從抗體直接衍生的片段以及對應於使用重組手段生產的這種片段的蛋白。在一些實例中，Vh不連接到重鏈恆定結構域(CH)I和/或'不連接到輕鏈恆定結構域(Cl)。示例性的包含Fv的多肽或蛋白包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、或更高級的複合物、結構域抗體(例如VH)或連接到恆定區或其結構域的上述中的任何一項，例如CH2或CH3結構域。「Fab片段」由抗體的單價抗原結合片段組成，並且可以通過用木瓜酶消化整個免疫球蛋白而產生，從而得到由完整的輕鏈和重鏈的一部分組成的片段，或可以使用重組手段產生。「Fab'片段」可通過用胃蛋白酶處理整個抗體然後進行還原而獲得，從而得到由完整的輕鏈和重鏈的一部分組成的分子。以這種方式處理的每個抗體得到兩個Fab'片段。還可以通過重組手段產生Fab'片段。抗體的「F(ab' ) 2片段」由通過兩個通過二硫鍵保持在一起的Fab'片段的二聚體組成，並且通過用胃蛋白酶處理整個抗體而獲得，後續不進行還原。「Fab2」片段是包含使用例如亮氨酸拉鏈或CH3結構域連接的兩個Fab片段的重組片段。「單鏈Fv」或「scFv」是包含抗體的可變結構域片段(Fv)的重組分子，其中'和Vh通過適當的柔性多肽接頭共價連接。落在該術語範圍內的示例性的包含Fv的蛋白的詳細討論將在下文提供。
[0254]如本文所用，術語「抗原結合位點」應當理解成表示由能夠特異性結合到抗原的蛋白形成的結構。抗原結合位點不需要是一系列的連續胺基酸，或甚至單條多肽鏈中的胺基酸。例如，在由兩條不同的多肽鏈產生的Fv中，抗原結合位點由 '和VH的一系列區域構成，這些區域與抗原相互作用並通常但不總是在每個可變結構域中的一個或多個CDR中。在一個實例中，本文提及抗原結合位點是提及抗體的CDR或其可變區。
[0255]「恆定結構域」是抗體中的結構域，其序列在相同類型的抗體(例如IgG或IgM或IgE)中是高度相似的。抗體的恆定區通常包含多個恆定結構域，例如Y、α和δ重鏈的恆定區包含三個恆定結構域並且Υ、α和δ重鏈的Fe包含兩個恆定結構域。μ和ε重鏈的恆定區包含四個恆定結構域並且Fe區包含兩個恆定結構域。
[0256]如本文所用的術語「可結晶片段」或「Fe」是指包含至少一個恆定結構域的抗體的一部分，並且它通常(但不必定)糖基化並結合到一個或多個Fe受體和/或補體級聯的組分(例如賦予效應子功能)。可以從五種同種型(α、δ、ε、Υ、或μ)的任何一項中選擇重鏈恆定區。此外，不同亞類的重鏈(諸如重鏈的IgG亞類)負責不同的效應子功能並因此通過選擇所需的重鏈恆定區，可以產生具有所需效應子功能的蛋白。優選的重鏈恆定區為 Y I (IgGl)、Y2(IgG2)以及 Y3(IgG3)0
[0257]對於「Kabat編號系統」表示用於以與Kabat (1987和/或1991和/或1992)中提出的系統一致的形式對免疫球蛋白的可變結構域中的殘基進行編號的系統。
[0258]術語「表面暴露的」應理解為是指胺基酸的側鏈在摺疊時處於蛋白的表面上，使得它們能夠與其中存在或懸浮有蛋白的溶劑接觸。就\而言，表面暴露的殘基例如選自由根據Kabat編號系統的殘基49、50、51、52、53和55組成的組。根據Kabat編號系統的\的位置54通常不表面暴露。預測胺基酸是否表`面暴露的方法在本領域是已知的並例如在Holbrook等人，1990中有所描述。
[0259]術語「蛋白」應當理解成包括單一多肽，即通過肽鍵連接的一系列連續胺基酸，或者共價地或非共價地彼此連接的一系列多肽(即，多肽複合物)。例如，該系列多肽可以使用合適的化學或二硫鍵共價連接。非共價鍵的實例包括氫鍵、離子鍵、範德華力以及疏水性相互作用。本公開考慮的非共價鍵是Vh與\之間的相互作用，例如在雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體或抗體的一些形式中。
[0260]術語「多肽」將理解成是指來自上述段落，表示通過肽鍵連接的一系列連續胺基酸。
[0261 ] 如本文所用，術語「抗原」應當理解成表示可以針對它而產生免疫球蛋白反應(例如抗體反應)的任何物質組合物。示例性抗原包括蛋白類、肽類、多肽類、碳水化合物類、磷酸根基團、磷酸肽類或多肽類、糖基化肽或肽類等。
[0262]如本文所用，術語「特異性結合」或「以特異性方式結合」應當理解成表示與本公開的蛋白與替代的抗原或細胞反應或締合相比較，它以更長的持續時間和/或以更大的親和力更頻繁地、更迅速地與一種特定抗原或多種抗原或表達它們的細胞反應或締合。例如，與特異性結合到抗原的蛋白結合到其他抗原相比較，它以更大的親和力、親合力、更容易地和/或以更長的持續時間結合該抗原。通過閱讀本定義還將理解的是，例如特異性結合到第一抗原的蛋白可以或可以不特異性結合到第二抗原。這樣，「特異性結合」不必要求專一地結合或不可檢出地結合另一種抗原。通常但非必須，提及結合表示特異性結合，並且每個術語應當理解成為另一術語提供明確支持。
[0263]如本文所用，在VJ以及任選Vh)的背景下術語「修飾的」表示與親本(或未修飾的相比較' 的序列發生改變。例如，將在殘基49與56之間包含除帶負電的胺基酸之外的胺基酸的 '進行修飾，以用帶負電的胺基酸取代那些胺基酸中的一個或多個。例如，在殘基49與56之間對\進行修飾以增加在這些位置的帶負電的胺基酸的數量，例如增加到總共I個或2個或3個或4個或5個或更多個。在一個示例性形式中，將所列位置處帶負電的胺基酸的數量增加到至少兩個。
[0264]包含可變結構域的蛋白
[0265]本公開考慮了包含特異性地或選擇性地結合到一種或更多種抗原並且如根據任何一個實例如本文所述進行修飾的免疫球蛋白輕鏈可變結構域的任何蛋白。技術人員將會理解術語「免疫球蛋白」包括符合Kabat編號系統的免疫球蛋白超家族的任何蛋白。免疫球蛋白超家族成員的實例包括T細胞受體。
[0266]在一個實例中，本公開考慮了包含特異性地或選擇性地結合到一種或更多種抗原(例如通過抗原結合位點)並且根據任何一個實例如本文所述進行修飾的抗體'的任何蛋白。
[0267]抗體可變結構域
[0268]基於本文的說明對技術人員將顯而易見的是，本公開的蛋白可以包含來自經修飾以在本文所述的位置包含帶負電的胺基酸的抗體的一個或多個K以及在一些情況下，可進行修飾但不必定如本文所述進行修飾的Vh)。此類蛋白包括多種抗體(例如整個抗體或全長抗體)。可以通過首先產生針對感興趣抗原的抗體然後對該抗體進行修飾(例如使用重組手段)或通過對之前產生的抗體進行修飾來生產此類抗體。作為另外一種選擇，產生了包含本公開的\的蛋白，然後對該蛋白進行修飾或用來生產抗體。
[0269]用於生產抗體的方法是本領域已知的。例如，用於生產單克隆抗體的方法(諸如雜交瘤技術)由Kohler和Milstein(1975)進行了說明。在雜交瘤方法中，典型地用免疫原或抗原或表達它們的細胞來免疫小鼠、倉鼠或其他適當的宿主動物，以引發淋巴細胞產生或能夠產生將特異性結合到免疫原或抗原的抗體。然後使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)使來自免疫動物的淋巴細胞或脾細胞與永生化細胞系融合，從而形成雜交瘤細胞(Goding, 1986)。可以將所得的雜交瘤細胞在合適的培養基中進行培養，該培養基優選地含有抑制未融合的永生化細胞生長或存活的一種或更多種物質。例如，如果親本蛋白缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤的培養基典型地將包含次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(「HAT培養基」)，這些物質將阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。本公開還考慮了用於生產抗體的其他方法，例如使用一般在Largaespada (1990)或Weissinger等人(1991)中詳細說明的ABL-MYC技術。
[0270]作為另外一種選擇，抗體或其編碼序列由之前產生的表達感興趣抗體的細胞(例如雜交瘤或轉染瘤)生成。此類雜交瘤和/或轉染瘤的多種來源對技術人員將是顯而易見的，並包括例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)和/或歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)。用於分離和/或修飾編碼抗體中的'的序列的方法對技術人員將是顯而易見的和/或在本文進行說明。可根據本公開進行修飾的示例性抗體包括但不限於:SYNAGIS? (帕利珠單抗;MedImmune)，它是一種人源化抗呼吸道合胞體病毒(RSV)單克隆抗體；HJERCEPTIN? (曲妥珠單抗；Genentech)，它是一種人源化抗HER2單克隆抗體；REIVnCADWg)(英夫利昔單抗；CentOCOr)，它是一種嵌合的抗TNFcc單克隆抗體；REOPRO? (阿昔單抗；Centocor)，它是一種抗糖蛋白Iib / IIIa受體抗體；ZENAPAX? (達利珠單抗；Roche Pharmaceuticals),它是一種人源化抗0)25單克隆抗體；RITUXAN? / MAB THERA?(利妥昔單抗)，它是一種嵌合的抗CD20IgGl抗體(IDEC Pharm / Genentech, Roche) ；STIMULECT?(巴利昔單抗；Novartis),它是一種嵌合的抗IL-2Ra抗體；ERBITUX(西妥昔單抗；ImClone)，它是一種嵌合的抗EGFR抗體；MYL0TARG?(吉姆單抗；Celltech / Wyeth)，它是一種人源化抗 CD33 抗體；CampathlH /LDP-03 (阿侖單抗；ILEX / Schering / Millenium),它是一種人源化抗⑶52IgGl 抗體；X0LAIR?(奧馬佐單抗；Tanox / Genentech / Novartis), 一種人源化抗 IgE Fe 抗體；AVASTIN? (貝伐單抗fenentech)人源化抗VEGF抗體；RAPTIVA?(依法珠單抗；Genentech / Merck Serono),它是一種人源化抗 CDlla 抗體；LUCENTIS (蘭尼單抗；Genentech / Novartis),它是一種人源化抗VEGF-A抗體；TYSABRI?(那他珠單抗；Biogen Idec/EIail Pharmaceuticals),它是一種人源化抗整聯蛋白a4抗體；SOLIRIS?(依庫珠單抗；Alexion Pharmaceuticals),它是一種人源化抗補體蛋白C5抗體；VECTIBIX? (帕尼單抗；Amgen)全人抗EGFR單克隆抗體；HUMIRA? (阿達木單抗；Abbott / MedImmune Cambridge)全人抗 TNFa ；SIMPONI? (戈利木單抗抗 TNF a t ；Centocor Ortho Biotech, Inc) ;ARZERRA? (奧法木單抗抗⑶2O ；Glaxo Group andGenMab AS) ;OMNITARG? (帕妥珠單抗抗 Her2 fenentech，Inc)。包含抗體 ' 的其他抗體和蛋白是本領域已知的並且不排除在外。
[0271]本領域的技術人員將能夠容易地獲得已知抗體的VLS的序列。示例性序列包括阿達木單抗的VJSEQ ID NO:7)或4D5的VjSEQ ID N0:11)。根據本公開可以容易地修飾這些序列。
[0272]在生產抗體和/或將其編碼序列分離之後，將抗體或其\修飾成在必要的位置包含帶負電的胺基酸(例如天冬氨酸或穀氨酸)以賦予聚集抗性，例如根據任何一個實例如本文所述。通常，這包括分離編碼\或抗體的核酸然後將其序列修飾成在必要的位點處包括編碼天冬氨酸(即GAA或GAG)或穀氨酸(即GAT或GAC)的一個或多個密碼子。
[0273]嵌合的人源化和人類抗體
[0274]本公開的蛋白可以是人源化抗體或人類抗體或從中得到的術語「人源化抗體」應當理解成是指嵌合蛋白，該嵌合蛋白通常使用重組技術而製備，具有從來自非人類物種的抗體衍生的抗原結合位點並且該分子的剩餘抗體結構基於人類抗體的結構和/或序列。抗原結合位點包含接枝到人類抗體可變結構域中的適當FR( 即，Vl中除了⑶R之外的區域)上的來自非人類抗體的CDR而剩餘區域來自人類抗體。抗原結合位點可以是野生型的或被一個或多個胺基酸取代所修飾。在一些情況下，人類抗體的框架殘基被相應的非人類殘基替換。人源化抗體還可以包含在受者抗體或輸入的CDR或框架序列中均不存在的殘基。通常，人源化抗體將包含非人類抗體的CDR以及人類抗體或其一致序列的所有或基本上所有FR區。用於人源化非人類抗體的方法是本領域已知的。基本上可以按照US5225539、US6054297或US5585089的方法進行人源化。不排除用於人源化抗體的其他方法。
[0275]如結合抗體和結合性蛋白在本文使用的術語「人類抗體」是指具有可變的以及任選地恆定的衍生自或對應於在人類中(例如在人類種系細胞或體細胞中)存在的序列的抗體區的抗體。「人」抗體可以包含不由人類序列編碼的胺基酸殘基，例如，通過隨機或體外定點突變引入的突變(具體地講，在抗體的少量殘基中涉及保守取代或突變的突變，例如在抗體的1、2、3、4或5個殘基中，優選地例如在構成抗體的一個或多個⑶R的1、2、3、4或5個殘基中)和/或在本文所述的位置處的帶負電的胺基酸。示例性人類抗體或蛋白包含人類框架區(例如，來自人類種系)以及在除了包含帶負電的胺基酸的位置之外的⑶R中的任意胺基酸。這些「人類抗體」實際上並不必須由人類產生，相反，它們可以使用重組手段產生和/或從包含編碼人類抗體恆定和/或可變結構域的核酸的轉基因動物(例如小鼠)中分離。可以使用本領域已知的多種技術，包括噬菌體展示文庫(例如，如在Hoogenboom和Winterl991、US5，885，793中所述的和/或在下面說明的)或使用表達人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如，如在W02002 / 066630、Lonberg等人(1994)或Jakobovits等人(2007)中所述的)來產生人類抗體或其片段。
[0276]在一個實例中，本公開的蛋白包含人八。例如，該蛋白包含全部人框架區。
[0277]在一個實例中，該蛋白不包含人源化'或不包含從人源化抗體衍生的VL。在一個實例中，該蛋白不包含從人源化Fab4D5 (例如，如US6407213中所述，諸如humAb4D5，諸如humAb4D5-l)衍生的 Vl。
[0278]在一個實例中 ，如本文所述的蛋白不結合到雞蛋溶菌酶。
[0279]在一個實例中，如本文所述的蛋白不結合到人血管內皮生長因子A(VEGF-A)和/或人 her2 / neu。
[0280]在一個實例中，本公開的蛋白是嵌合抗體。術語「嵌合抗體」是指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與從特定物種(例如鼠類，諸如小鼠)得到的抗體中相應的序列相同或同源或屬於特定抗體類別或亞類，而該鏈的剩餘部分與從另一個物種(例如靈長類，諸如人類)得到的抗體中相應的序列相同或同源或屬於另一個抗體類別或亞類，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物活性即可(US4816567)。典型地，嵌合抗體利用嚙齒類動物或兔可變結構域以及人恆定區，以便產生主要具有人類結構域的抗體。例如，嵌合抗體包含來自根據本公開進行修飾的融合到人類恆定區上的小鼠抗體的可變結構域。此類嵌合抗體的生產是本領域已知的，並且可以通過標準手段實現(如例如在US5807715、US4816567 和 US4816397 中所述)。
[0281]包含W的蛋白
[0282]單結構域抗體
[0283]在一些實例中，本公開的蛋白是單結構域抗體(它與術語「結構域抗體」或「dAb」可互換使用)。單結構域抗體是包含抗體的輕鏈可變結構域的全部或一部分的單條多肽鏈。在某些實例中，單結構域抗體是人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA ;參見例如 US6, 248，516、W090 / 05144,W02003 / 002609 和 / 或 W02004 / 058820)。在一個實例中，單結構域抗體由能夠特異性結合到抗原並且能夠根據本公開進行修飾的抗體輕鏈可變結構域的全部或一部分組成。本公開還涵蓋融合到另一分子(例如，另一結構域抗體或Fe區)的結構域抗體。[0284]雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體
[0285]包含'的示例性蛋白是雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及更高級的蛋白複合物，諸如在W098 / 044001和W094 / 007921中所述的那些。
[0286]如本文所用，術語「雙鏈抗體」應當理解成表示包含兩條締合的多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈包括結構'-X-Vh或VH-X-'，其中' 是抗體輕鏈可變結構域，Vh是抗體重鏈可變結構域，X是包含不足以允許單條多肽鏈中的％和'相締合(或形成Fv)的殘基的接頭或不存在，並且其中一條多肽鏈的Vh結合到另一條多肽鏈的\以形成抗原結合位點，即形成能夠特異性結合到一種或更多種抗原的Fv分子。每條多肽鏈中的 '和￥11可以相同或每條多肽鏈中的\和Vh可以不同以便形成雙特異性雙鏈抗體(即，包含兩個具有不同特異性的Fv)。
[0287]如本文所用，術語「三鏈抗體」應當理解成表示包含三條締合的多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈包括如上關於雙鏈抗體所提出的結構，其中一條多肽鏈的Vh與另一條多肽鏈的\相締合從而形成三聚體蛋白(三鏈抗體)。
[0288]如本文所用，術語「四鏈抗體」應當理解成表示包含四條締合的多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈包括如上關於雙鏈抗體所提出的結構，並且其中一條多肽鏈的Vh與另一條多肽鏈的\相締合從而形成四聚體蛋白(四鏈抗體)。
[0289]技術人員將知道雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體以及它們的生產方法。Vh和VL可以任何順序定位，即'-VH* VH-'。通常，這些蛋白包含多肽鏈，其中V1^P '直接地或使用接頭連接，該接頭具有不足以允許Vh和VL締合的長度。包含Vh和\的蛋白根據接頭(如果存在的話)的長度和/或Vh和'結構域的順序相締合形成雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體。優選地，接頭包含`12個或更少的胺基酸。例如，在多肽鏈具有以下以N到C順序按VH-X-'排列的結構的情況下(其中X為接頭)，具有3-12個殘基的接頭通常導致形成雙鏈抗體，當接頭具有I或2個殘基或當接頭不存在時通常導致形成三鏈抗體。在多肽鏈具有以下以N到C順序按VL-X-Vh排列的結構的情況下(其中X為接頭)，具有3-12個殘基的接頭通常導致形成雙鏈抗體，具有I或2個殘基的接頭通常導致形成雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體，而不含接頭的多肽通常形成三鏈抗體或四鏈抗體。
[0290]單鏈Fv (scFv)
[0291]技術人員將知道的是scFv在單條多肽鏈中包含Vh和\區。優選地，多肽鏈還包含Vh與 '之間的多肽接頭，它使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構(即，用於單條多肽鏈的Vh和\彼此締合從而形成Fv)。這與其中來自不同多肽鏈的可變結構域彼此締合或結合的雙鏈抗體或更高級的多聚體不同。例如，接頭包含超過12個胺基酸殘基，其中(Gly4Ser)3是針對scFv更偏愛的接頭之一。
[0292]本公開還考慮了二硫鍵穩定的Fv(或diFv或dsFv)，其中將單個半胱氨酸殘基引入Vh的FR和\的FR，並且半胱氨酸殘基通過二硫鍵連接從而產生穩定的Fv (參見例如Brinkmann 等人，1993)。
[0293]作為另外一種選擇或除此之外，本公開提供了二聚體scFv，即包含兩個通過非共價鍵或共價鍵連接的scFv分子的蛋白。此類二聚體scFv的實例包括例如連接到亮氨酸拉鏈結構域(例如，從Fos或Jun衍生的)的兩個scFv,由此這些亮氨酸拉鏈結構域相締合從而形成二聚體化合物(參見例如Kostelny 1992或Kruif和Logtenberg, 1996)。作為另外一種選擇，通過具有允許兩個scFv形成並且允許結合到抗原上的足夠長度的肽接頭來連接兩個scFv (例如，如在US20060263367中所述)。
[0294]本公開還考慮了 scFv的修飾形式，例如包含經修飾以允許糖基化的接頭的scFv (例如，如在US6323322中所述)。
[0295]技術人員將能夠容易地產生scFv或其修飾形式，後者包含根據本公開的基於本文公開內容的合適的修飾八。關於scFv的綜述,參見Pliickthun(1994)。另外的scFv說明將見於例如Bird等人，1988。
[0296]微抗體
[0297]技術人員將知道的是微抗體包含融合到抗體的CH2和/或3 / 43結構域的抗體的Vh和\結構域。任選地，微抗體包含Vh和VL與CH2和/或Ch3結構域之間的鉸鏈區，有時這種構象被稱為柔性微抗體(Flex Minibody) (Hu等人，1996)。微抗體不含CHl或Q。優選地，V1^P \結構域融合到抗體的鉸鏈區以及CH3結構域。每個區域可以從同一個抗體衍生。作為另外一種選擇，Vh和'結構域可以從一個抗體衍生而鉸鏈和CH2 / CH3來自另一個抗體，或鉸鏈和CH2 / CH3也可以從不同抗體衍生。本公開還考慮了包含來自一個抗體的Vh和\以及來自另一個抗體的Vh和\的多特異性微抗體。
[0298]示例性微抗體以及它們的生產方法例如在W094 / 09817中進行了說明。
[0299]包含其他可變結構域的蛋白
[0300]US5731168說明了其中一對Fv的界面經工程改造以便使異源二聚體的百分比最大化的分子，該異源二聚體從重組細胞培養物中回收而得，由此產生雙特異性蛋白。優選的界面包括CH3結構域的至少一部分。在這種方法中，來自第一蛋白的界面的一條或更多條小胺基酸側鏈被更大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小的胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換較大的胺基酸側`鏈在第二蛋白的界面上產生了與較大側鏈具有相同或相似尺寸的補償性「空腔」。
[0301]包含可變結構域的雙特異性蛋白包括交聯的或「異共軛的」(heteroconjugate)蛋白。例如，處於異共軛狀態的蛋白之一可以偶合到親和素上而另一個偶合到生物素上。例如已經提出此類蛋白將免疫系統細胞靶向到不想要的細胞上(US4676980)。可以使用任何便利的交聯方法製備包含可變結構域的異共軛蛋白。合適的交聯劑是本領域已知的，並連同多種交聯技術在US4676980中有所公開。
[0302]還可以使用化學鍵來製備包含可變結構域的雙特異性蛋白。Brennan(1985)說明了一種程序，其中將完整的抗體蛋白水解切割從而生成F(ab' )2片段。在二硫醇絡合劑、亞砷酸鈉的存在下將這些片段還原，以穩定鄰位二硫醇並防止分子間二硫鍵的形成。然後將生成的Fab'片段轉化成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然後通過用巰基乙胺還原將這些Fab' -TNB衍生物中的一種再轉化成Fab'-硫醇，並與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合從而形成雙特異性蛋白。
[0303]包含另外的可變結構域的蛋白包括例如單鏈Fab(例如，Hust等人，2007)或Fab3 (例如，如在EP19930302894中所述)。
[0304]恆定結構域融合物
[0305]本公開涵蓋了包含本公開的修飾' 以及恆定區(例如Fe)或其結構域(例如CH2和/或CH3結構域)的蛋白。例如，本公開提供了微抗體(如上面所討論)或結構域抗體-Fe融合物或scFv-Fc融合物或雙鏈抗體-Fe融合物或三鏈抗體-Fe融合物或四鏈抗體-Fe融合物或結構域抗體-CH2融合物、SCFC-CH2融合物或雙鏈抗體_CH2融合物或三鏈抗體_Ch2融合物或四鏈抗體_Cn2融合物或結構域抗體-CH3融合物或SCFV-CH3融合物或雙鏈抗體-CH3融合物或三鏈抗體-CH3融合物或四鏈抗體-CH3融合物。這些蛋白中的任何一種可以在可變結構域與恆定區或恆定結構域之間包含接頭，優選抗體鉸鏈區。優選地，這種Fe融合蛋白具有效應子功能。
[0306]如本文所用，術語「CH2結構域」包含重鏈抗體分子的部分，該部分例如從根據Kabat EU編號系統(如在Kabatl991或1992中所公開)的位置231-340附近之間延伸。兩條N連接的分支碳水化合物鏈通常插入完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。在一個實例中，本公開的蛋白包含從IgGl分子(例如人類IgGl分子)衍生的Ch2結構域。在另一個實例中，本公開的蛋白包含從IgG4分子(例如，人類IgG4分子)衍生的CH2結構域。
[0307]如本文所用，術語「CH3結構域」包含重鏈抗體分子的部分，該部分從Ch2結構域的N端延伸大約110個殘基，例如從位置341-446b附近(KabatEU編號系統)。CH3結構域典型地形成IgG抗體的C-端部分。然而，在一些抗體中，另外的結構域可以從C3/43結構域延伸從而形成分子的C端部分(例如，IgM的μ鏈和IgE的e鏈中的Ch4結構域)。在一個實例中，本公開的蛋白包含從IgGl分子(例如人類IgGl分子)衍生的CH3結構域。在另一個實例中，本公開的蛋白包含從IgG4分子(例如人類IgG4分子)衍生的Ch3結構域。
[0308]可以從多種不同來源獲得用於生產本公開的蛋白的恆定區序列。在優選的實例中，蛋白的恆定區或其部分從人類抗體衍生。然而應當理解的是，恆定區或其部分可以從另一種哺乳動物物種的免疫球蛋白或抗體衍生，包括例如嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人靈長類(例如黑 猩猩、恆河猴)物種。此外，恆定區結構域或其部分可以從任何抗體類別衍生。
[0309]如本文所用，術語「效應子功能」是指Fe區或其部分(例如Ch2結構域)結合免疫系統的蛋白和/細胞並調節各種生物效應的功能性能力。效應子功能可以是抗原依賴性的或抗原非依賴性的。「抗原依賴性效應子功能」是指通常在抗體結合到抗原之後誘導的效應子功能。典型的抗原依賴性效應子功能包括結合補體蛋白(例如Clq)的能力。例如，補體的Cl組分結合到Fe區可活化經典的補體系統，從而導致調理作用和細胞病原體的溶解(稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)的一個過程)。補體的活化還刺激炎症反應，並且也可涉及自體免疫超敏反應。其他抗原依賴性效應子功能通過抗體經由它們的Fe區結合到細胞上的某些Fe受體(「FcR」)而介導。存在針對不同類別的抗體(包括IgGU受體或IgXR)、IgE( ε受體或IgsR)、IgA(α受體或IgaR)以及IgM(μ受體或i~R))特異性的多種Fe受體。抗體與細胞表面上的Fe受體的結合觸發許多重要的並且多樣化的生物學反應，包括免疫複合物的內吞作用、抗體包被的顆粒或微生物的吞食和破壞(也稱為抗體依賴性吞噬作用或ADCP)、免疫複合物的清除、通過殺傷細胞溶解抗體包被的靶細胞(稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性或ADCC)、炎性介質的釋放、免疫系統細胞活化的調節、胎盤轉移以及抗體生產的控制。
[0310]如本文所用，術語「抗原非依賴性效應子功能」是指可通過抗體誘導的效應子功能，無論它是否結合其相應的抗原。典型的抗原非依賴性效應子功能包括抗體的細胞運輸、循環半衰期和清除率，以及純化的促進。結構上獨特的Fe受體「新生兒Fe受體」或「FcRn」(也稱為挽救受體)在調節半衰期和細胞運輸方面起著重要作用。從微生物細胞純化的其他Fe受體(例如葡萄球菌蛋白A或G)能夠以高親和力結合到Fe區並且可用於促進含Fe的蛋白的純化。
[0311]例如可以使用聚合酶鏈式反應以及被選擇用來擴增感興趣結構域的引物來克隆恆定區結構域。抗體序列的克隆在例如US5658570中進行了說明。
[0312]本公開的蛋白可以包含任何數量的不同類型的恆定區/結構域。
[0313]構成蛋白恆定區的恆定結構域或其部分可以從不同的抗體分子衍生。例如，蛋白可以包括從IgGl分子衍生的CH2結構域或其部分以及從IgG3分子衍生的CH3區或其部分。
[0314]在本公開的另一個實例中，本公開的蛋白包含足以賦予FcRn結合的Fe的至少一個區域。例如，結合到FcRn的Fe區的部分包含根據Kabat EU編號的IgGl的從大約胺基酸 282 至 438。
[0315]在一個實例中，本公開的改變的蛋白包括修飾的恆定區，其中一個或多個恆定區結構域部分地或完全地缺失(「結構域缺失的恆定區」)。本公開還涵蓋修飾的Fe區或已經改變的部分(例如，提高的或降低的效應子功能)。許多此類修飾的Fe區是本領域已知的並且例如在 W02005 / 035586, W02005 / 063815 或 W02005 / 047327 中進行了說明。
[0316]本公開還涵蓋包含能夠誘導效應子功能的附加區域的蛋白。例如，該蛋白包含能夠結合到T細胞(例如結合到CD4，諸如BiTE)或NK細胞(例如結合到CD19)的抗體可變區。
[0317]去免疫化的蛋白
[0318]本公開還考慮了去免疫化的蛋白。去免疫化的蛋白將一個或多個表位(例如B細胞表位或T細胞表位)移除( 即突變)，由此降低受試者將產生針對該蛋白的免疫反應的可能性。用於生產去免疫化的蛋白的方法是本領域已知的並且例如在W000 / 34317、W02004 / 108158和W02004 / 064724中進行了說明。例如，該方法包括執行計算機分析以預測蛋白中的表位並且使預測表位中的一個或多個殘基突變，由此降低其免疫原性。然後對該蛋白進行分析(例如，計算機方式或體外地或體內地)以確保其保持結合到抗原上的能力。例如，存在於CDR內的表位不發生突變，除非該突變不可能降低抗原結合。用於預測表位的方法是本領域已知的並且例如在Saha(2004)中進行了說明。
[0319]基於本文的說明，用於引入適當的突變以及表達和分析所得蛋白的方法對於技術人員將是顯而易見的。
[0320]文庫和篩選方法
[0321]本公開還涵蓋了包含多種根據本公開修飾的'(以及任選地Vh)的蛋白的文庫，例如該文庫包括具有不同結合特性的多種蛋白。
[0322]本公開的實例包括天然文庫、免疫文庫或合成文庫。天然文庫從適當宿主的B淋巴細胞得到，該宿主尚未用任何免疫原激發，也未展示出感染或炎症的症狀。免疫文庫通過由適當地「免疫的」宿主(即，已用免疫原激發的宿主)獲得的B細胞和漿細胞的混合物製備。在一個實例中，使用本領域已知的方法(例如，寡dT引物和逆轉錄酶)將來自這些細胞的mRNA翻譯成cDNA。在一個可供選擇的實例中，用適當的引物通過PCR擴增編碼來自宿主細胞的抗體的核酸(mRNA或基因組DNA)。用於此類抗體基因擴增的引物是本領域已知的(例如US6096551和W000 / 70023)。在一個另外的實例中，將來自宿主細胞的mRNA合成為cDNA，然後在PCR反應中用抗體特異性引物對這些cDNA進行擴增(例如US6319690)。作為另外一種選擇，可以通過常規cDNA克隆技術(Sambrook and Russell,eds, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed, vols.1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)來克隆所有組成部分，而不使用PCR。在克隆過程中或之後將DNA修飾成在必要的位點處包含帶負電的胺基酸。
[0323]在另一個實例中，建立了公開的人源抗體序列資料庫，其中將抗體序列彼此進行比對。該資料庫用來定義抗體序列的亞群，這些序列在CDR環的序列和經典摺疊兩個方面顯示出高度的相似性(如通過抗體結構分析而確定)。對於每個亞群而言，推導出一致序列，該序列代表該亞群的多個成員；因此一致序列的全部集合表示人類抗體的全部結構清單。
[0324]然後例如通過全基因分析或通過使用合成的遺傳亞基來構建這些人工基因。這些遺傳亞基對應於多肽水平上的結構亞元件。在DNA水平上，這些遺傳亞基通過在這些亞元件的每一個的起點和終點處的切割位點而定義，在載體系統中這些切割位點是唯一的。作為一致序列集合的成員的所有基因的構建使得它們包含相應的遺傳亞序列的相似模式。例如，所述多肽為或衍生自 HuCAL —致基因:VK1、VK2、VK3、VK4、VX 1、νλ 2、νλ 3、Vh1A、Vh1B、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6、CK、C λ、ChI或所述HuCAL —致基因的任何組合。然後可以使用DNA分子的該集合來產生抗體的「合成文庫」，優選地Fv、二硫鍵連接的Fv、單鏈Fv(scFv)、Fab片段或Fab'片段，它們可用作特異性結合到抗原的蛋白的來源。US6，300，064公開了用於製備合成文庫的方法。此類合成文庫經修飾成包含根據本公開的帶負電的胺基酸。在另一個實例中，通過合成方法由限定的V基因元件製備合成的人類抗體。Winter (EP0368684)提供了一種用於擴增(例如通過PCR)、克隆以及表達抗體可變結構域基因的方法。以這些基因開始，他能夠通過對重鏈和/或輕鏈的CDR3進行隨機化處理而產生功能性抗體片段的文庫。這個過程在功能上等效於在免疫系統的B細胞發育過程中發生的VJ和VDJ重組的天然過程。例如，可以在體外通`過連接到五個隨機胺基酸殘基的合成「D片段」和J片段來重排人類種系VH基因片段的所有組成部分，以產生具有八個殘基的合成的第三互補決定區(⑶R)。US5885793公開了製備諸如這些的此類抗體文庫的方法。對技術人員將顯而易見的是，包括本公開的蛋白的文庫的產生使得擴增的V區包含編碼本文所述位置處的帶負電的胺基酸的密碼子。
[0325]根據本公開的蛋白可以是可溶性分泌蛋白或者可以作為融合蛋白遞呈在細胞或顆粒(例如噬菌體或其他病毒、核糖體或孢子)的表面上。
[0326]各種展示文庫形式是本領域已知的，並且綜述見於例如Levin和Weiss (2006)。例如，文庫是體外展示文庫(即，使用體外展示來展示蛋白，其中所表達的結構域連接到其從中表達的核酸上，使得所述結構域在不存在宿主細胞的情況下遞呈)。因此，通過體外展示技術產生的文庫不受轉化或轉染效率的限制。體外展示方法的實例包括核糖體展示、共價展示以及mRNA展示。
[0327]在一個實例中，體外展示文庫是核糖體展示文庫。技術人員將知道的是，核糖體展示文庫直接地將由表達文庫編碼的mRNA連接到其編碼的蛋白。用於產生核糖體展示文庫的方法包括以可操作地與適當的啟動子序列和核糖體結合序列相連接的方式布置編碼包含'(以及任選Vh)的蛋白的核酸。優選的啟動子序列是噬菌體T3和T7啟動子。優選地，以可操作地與間隔區序列以及終止密碼子被去除的修飾終止序列相連接的方式布置核酸。如本發明上下文中所使用，術語「間隔區序列」應當理解成表示編碼融合到肽上的肽的一系列核酸。將間隔區序列結合到基因構建體中，因為在翻譯之後由間隔區序列編碼的肽保留在核糖體通道中，同時允許包含vl(以及任選Vh)的蛋白自由地摺疊並與另一種蛋白或核酸相互作用。優選的間隔區序列是例如編碼絲狀噬菌體M13mpl9的基因III的胺基酸211-299的核酸。
[0328]使用本領域已知的和/或例如在Ausubel等人(1987)以及Sambrook等人(2001)中所述的方法在體外對展示文庫進行轉錄和翻譯。用於體外轉錄和翻譯的市售系統的實例包括例如得自Promega的體外轉錄和翻譯系統中的TNT。在冰上將表達反應物冷卻通常使翻譯終止。通過添加諸如乙酸鎂或氯黴素的試劑對抗肽和/或其編碼mRNA的解離而穩定核糖體複合物。通過如本文所述的多種方法篩選此類體外展示文庫。
[0329]在另一個實例中，本公開的展示文庫是核糖體失活展示文庫。根據該實例，將核酸可操作地連接到編碼第一間隔區序列的核酸。優選的是，該間隔區序列是富含甘氨酸/絲氨酸的序列，該序列允許含有由其編碼的'(以及任選VH)的蛋白自由地摺疊並與目標抗原相互作用。第一間隔區序列連接到編碼使核糖體失活的毒素的核酸。優選的是，毒素包括蓖麻毒蛋白A鏈，它使真核核糖體失活並且使核糖體停滯在翻譯複合物上而不釋放mRNA或編碼的肽。將編碼毒素的核酸連接到編碼第二間隔區序列的另一核酸上。第二間隔區是佔據核糖體通道的錨，並允許肽和毒素兩者都正確地摺疊並且變得具有活性。此類間隔區序列的實例是從M13卩遼菌體的基因III衍生的序列。通常使用諸如可從Promega獲得的兔網織紅細胞裂解物系統的系統對核糖體失活展示文庫進行體外轉錄和翻譯。當翻譯編碼毒素的mRNA並正確摺疊這種蛋白時，核糖體失活，同時仍然結合到所編碼的多肽和其從中翻譯的mRNA兩者上。
[0330]在另一個實例中，展示文庫是mRNA展示文庫。根據該實例，將核酸可操作地連接到編碼間隔區序列的核酸上，諸如富含甘氨酸/絲氨酸的序列，該序列允許包含由本公開的表達文庫編碼的'(以及任選Vh)的蛋白自由地摺疊並與靶抗原相互作用。將編碼間隔區序列的核酸可操作地連接到轉錄終止子。通常使用本領域已知的方法體外轉錄mRNA展示文庫，諸如使用可從Promega得到的HeLaScribe核提取體外轉錄系統(HeLaScribeNuclear Extract IN Vitro Transcription System)。隨後使用本領域已知的技術將編碼的mRNA共價連接到DNA寡核苷酸上，該DNA寡核苷酸共價連接到結合到核糖體的分子上，諸如嘌呤黴素上，並且在例如Roberts和Szostak(1997)中進行了說明。優選地，將寡核苷酸共價連接到補骨脂素部分上，由此寡核苷酸光交聯到由本公開的表達文庫編碼的mRNA上。然後使用本領域已知的方法翻譯從表達文庫轉錄的mRNA。當核糖體到達mRNA與寡核苷酸的接點時，核糖體停滯並且嘌呤黴素部分進入核糖體的磷酸轉移酶位點並因此將編碼的多肽共價連接到其從中表達的mRNA上。
[0331]在又一個實例中，展示文庫是共價展示文庫。根據該實例，將編碼包含以及任選VH)的蛋白的核酸可操作地連接到第二核酸上，該第二核酸編碼與其從中編碼的DNA相互作用的蛋白。DNA相互作用蛋白的實例包括但不限於大腸桿菌噬菌體P2病毒A蛋白(P2A)以及從噬菌體186、HPl和PSP3分離的等效蛋白。使用諸如可從Promega得到的兔網織紅細胞裂解物系統的系統對共價展示基因構建體進行體外轉錄和翻譯。當翻譯包含Vl(以及任選Vh)的蛋白與P2A蛋白的融合物時，P2A蛋白在其所結合的核酸中產生切口並與其形成共價鍵。因此，核酸片段共價地連接到其編碼的多肽上。
[0332]在又一個實例中，展示文庫是噬菌體展示文庫，其中包含'(以及任選Vh)的表達蛋白展示在噬菌體的表面上(如例如在US5821047、US6248516和US6190908中所述)。所述的基本原理涉及將包含編碼含有'(以及任選Vh)的蛋白的序列的第一核酸融合到包含編碼噬菌體外殼蛋白的序列的第二核酸，諸如選自M13蛋白-3、M13蛋白-7或M13蛋白-8的噬菌體外殼蛋白。然後將這些序列插入合適的載體，即能夠在細菌細胞中複製的載體。然後，用重組載體轉化適當的宿主細胞(諸如大腸桿菌)。還用編碼核酸片段可操作地連接到其上的衣殼蛋白的未修飾形式的輔助噬菌體顆粒來感染所述宿主細胞。在適合在顆粒表面上形成包含不止一個融合蛋白拷貝的重組噬菌粒顆粒的條件下培養轉化的、感染的宿主細胞。在產生病毒顆粒(諸如λ噬菌體、Τ4噬菌體、Ml3噬菌體、Τ7噬菌體和杆狀病毒)方面，該系統經證實是有效的。然後對此類噬菌體展示顆粒進行篩選，以鑑定具有足以結合到靶抗原的構象的展示結構域。
[0333]其他病毒展示文庫包括逆轉錄病毒展示文庫，其中所表達的肽或蛋白結構域展示在逆轉錄病毒顆粒的表面上，例如，如在US6297004中所述。
[0334]本公開還考慮了細菌展示文庫(例如，如在US5516637中所述)、酵母展示文庫(例如,如在US6423538中所述)或哺乳動物展示文庫(例如,如在Strenglin等人1988中所述)。
[0335]用於篩選展示 文庫的方法是本領域已知的。在一個實例中，使用親和純化來篩選本公開的展示文庫。親和純化技術是本領域已知的，並在例如Scopes (1994)中進行了說明。親和純化的方法典型地涉及:使包含由文庫展示的'(以及任選Vh)的蛋白與靶抗原和/或超抗原(例如，蛋白A或蛋白L)接觸，然後在洗滌之後，對仍然結合到抗原上的那些結構域進行洗脫。抗原優選地結合到另一分子上以便於純化，諸如選自以下的分子:蛋白G、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、生物素、穀胱甘肽S轉移酶(GST)和FLAG表位。因此，通過離心或通過結合到另一分子(例如鏈黴親和素)上或結合特異性抗體(例如抗FLAG抗體或抗GST抗體)而簡單地分離靶蛋白或核酸。
[0336]在另一個實例中，對本公開的展示文庫進行表達從而允許使用FACS分析來鑑定結合的肽。使用FACS分析篩選文庫在US645563中進行了說明。優選地，通過FACS分選來篩選體外展示文庫。體外展示蛋白共價連接到適於FACS分選的顆粒或珠粒上,諸如玻璃、聚合物類，諸如聚苯乙烯、乳膠或交聯葡聚糖例如瓊脂糖凝膠、纖維素、尼龍、特氟隆等。將結合到顆粒或珠粒上的展示文庫添加到抗原或超抗原上，該抗原或超抗原已用可檢測的標記進行標記，諸如螢光分子或可通過第二螢光分子檢出的分子。然後對珠粒進行洗滌並接受FACS分選，這允許具有結合的螢光抗原或超抗原的珠粒與未結合到螢光靶蛋白或核酸的珠粒分離。
[0337]作為另外一種選擇，使用基於生物傳感器的測定法來篩選文庫，諸如Biacore傳感器晶片技術(Biacore AB, UK)。Biacore傳感器晶片是塗覆有用羧甲基化葡聚糖修飾的金薄層的玻璃表面，而靶蛋白或核酸共價連接到其上。然後使本公開的文庫暴露於包含抗原的Biacore傳感器晶片。
[0338]蛋白生產[0339]誘奪
[0340]使用本領域的標準方法來分離編碼包含可變結構域的蛋白的DNA。例如，將引物設計成退火到位於感興趣區域側翼的可變結構域內的保守區上，然後使用這些引物來擴增插入的核酸，例如通過PCR進行擴增。合適的方法和/或引物是本領域已知的和/或例如在Borrebaeck(編輯)，1995和/或Froyen等人，1995中進行了說明。用於此類擴增方法的模板DNA的合適來源源於例如雜交瘤、轉染瘤和/或表達包含可變結構域的蛋白的細胞(例如，如本文所述)。
[0341]在分離之後，通過本領域已知的多種方法中的任何一種將DNA修飾成包含編碼必要位置處帶負電的胺基酸的密碼子。這些方法包括但不限於通過前面製備的編碼蛋白的DNA進行定點(或寡核苷酸介導的)誘變、PCR誘變以及盒式誘變來製備。還可以通過限制性片段操縱或通過用合成的寡核苷酸進行重疊延伸PCR來構建重組蛋白的變體。誘變引物編碼帶負電的胺基酸，例如包括組成編碼帶負電的胺基酸(例如天冬氨酸(即GAA或GAG)或穀氨酸(即GAT或GAC))的密碼子的殘基。可以使用標準誘變技術來生成編碼這種突變DNA的DNA。一般性指導原則可見於Sambrook等人1989和/或Ausubel等人1993。
[0342]定點誘變是一種用於製備取代變體(即突變蛋白)的方法。該技術是本領域已知的(參見例如Carter等人1985 ;或設)等人1989)。簡而言之，在進行DNA的定點誘變中，通過首先將編碼所需突變的寡核苷酸雜交到(例如，插入一個或多個編碼帶負電的胺基酸的密碼子)起始DNA的單鏈上而改變這種起始DNA。在雜交之後，使用雜交的寡核苷酸作為引物，並使用起始DNA的單鏈作為模板，將DNA聚合酶用於合成完整的第二鏈。因此，編碼所需突變的寡核苷酸被結合在所得的雙鏈DNA中。可以在表達蛋白的基因內進行定點誘變從而在表達質粒中發生誘變，然後可以對所得的質粒測序以確認所需的帶負電的胺基酸置換突變的引入。定點方案和方式包括市售試劑盒，例如QuikChange?多位點定向誘變試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)。
[0343]PCR誘變還適合於製備起始蛋白的胺基酸序列變體。參見Higuchi, 1990 ;Ito等人，1991。簡而言之，當將少量的模板DNA用作PCR中的起始材料時，可以使用在序列上與模板DNA中的相應區域略有不同的引物`來生成相對大量的特異性DNA片段，該特異性DNA片段僅在引物與模板不同的位置處與模板序列不同。
[0344]用於製備變體的另一種方法盒式誘變基於Wells等人，1985所述的技術。起始材料是包含待突變的起始蛋白DNA的質粒(或其他載體)。對需要突變的起始DNA中的密碼子進行鑑定。在所鑑定的突變位點的每一側上必須存在唯一的限制性內切酶位點。如果不存在此類限制位點，則可以使用上述寡核苷酸介導的誘變方法來生成這些位點以將它們引入到起始DNA中的適當位置。在這些位點處對質粒DNA進行切割從而將其線性化。使用標準程序來合成編碼位於限制位點之間但是包含所需突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸，其中單獨地合成寡核苷酸的兩條鏈然後使用標準技術雜交到一起。這種雙鏈寡核苷酸被稱為盒。該盒被設計成具有與線性化質粒的末端相容的5'和3'末端，從而使得它可以直接地連接到質粒上。現在該質粒包含突變的DNA序列。可以通過DNA測序來確認包含所編碼的帶負電的胺基酸置換的突變DNA。
[0345]還通過基於PCR的誘變使用雙鏈質粒DNA作為模板通過寡核苷酸定向誘變來生成單個突變(Sambrook等人，2001)。[0346]在一個實例中，如果本公開的蛋白包含位置50的天冬氨酸和位置56的穀氨酸，則以下一項或更多項適用:
[0347](i) 位置51的胺基酸不是丙氨酸；
[0348](ii) 位置52的胺基酸不是絲氨酸；
[0349](iii) 位置53的胺基酸不是天冬醯胺或絲氨酸；
[0350](iv) 位置54的胺基酸不是亮氨酸；和/或
[0351](V) 位置56的胺基酸不是蘇氨酸或絲氨酸。
[0352]在一個實例中，如果本公開的蛋白包含位置50的天冬氨酸和位置53的天冬氨酸，則以下一項或更多項適用:
[0353](i) 位置51的胺基酸不是丙氨酸；
[0354](ii) 位置52的胺基酸不是賴氨酸；
[0355](iii) 位置54的胺基酸不是亮氨酸；
[0356](iv) 位置55的胺基酸不是組氨酸；和/或
[0357](V) 位置56的胺基酸不是蘇氨酸或絲氨酸。
[0358]在一個實例中，如果本公開的蛋白包含位置50或位置55的一個帶負電的胺基酸，則以下一項或更多項適用:
[0359](i) 位置51的胺基酸不是丙氨酸；
[0360](ii) 位置52的胺基酸不是賴氨酸；
[0361](iii) 位置53的胺基酸不是天冬醯胺或絲氨酸或蘇氨酸；
[0362](iv) 位置54的胺基酸不是亮氨酸或精氨酸或色氨酸或賴氨酸；和/或
[0363](V) 位置56的胺基酸不是蘇氨酸或絲氨酸或苯丙氨酸。
[0364]在一個實例中，本公開的蛋白不含一個或多個(例如兩個或三個或四個)FR或不來源於或基於選自 08、018、L18、L4、L12、L22、A2、DPK14、A17、Al、All、L20、L6 和 B3 的人類種系VK片段。
[0365]在一個實例中，本公開包含兩個或更多個帶負電的胺基酸的蛋白不含一個或多個(例如兩個或三個或四個)FR或不來源於或基於選自08、018、L18、L4、L12和L22的人類種系VK片段。
[0366]在一個實例中，本公開的蛋白不含'的全人類⑶R2。對於「'的全人類⑶R2」將理解成表示CDR2可來自非人的物種或可以為合成的或可以為人類CDR2的突變形式，例如通過親和力成熟產生。
[0367]重鉬表汰
[0368]就重組蛋白而言，優選地將編碼該蛋白的核酸置於表達載體中，然後將表達載體轉染到宿主細胞中，優選可以產生二硫橋或鍵的細胞，諸如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，諸如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或原本不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，從而獲得在重組宿主細胞中的蛋白的合成。關於在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述論文包括Skerra等人(1993)和Pluckthun (1992)。用於實現這些目的的分子克隆技術是本領域已知的並且例如在Ausubel等人(1987)和Sambrook等人(2001)中進行了說明。廣泛多樣的克隆以及體外擴增方法適於構建重組核酸。生產重組抗體的方法也是本領域已知的。參見US4816567。[0369]在分離之後，優選地將編碼本公開的蛋白的核酸插入表達構建體或可複製載體中，用於進一步克隆(DNA的擴增)或用於在無細胞系統中或在細胞中進行表達。優選地，將核酸可操作地連接到啟動子上。
[0370]如本文所用，術語「啟動子」應當在其最廣義的背景下理解並且包括基因組基因的轉錄調節序列，包括在具有或不具有另外的調節元件(例如上遊活化序列、轉錄因子結合位點、增強子和沉默子)下對於精確轉錄起始所必需的TATA盒或起始子元件,這些調節元件例如響應於發育和/或外部刺激或以組織特異性方式改變核酸的表達。在本發明的上下文中，術語「啟動子」還用來說明賦予、活化或增強其可操作地連接的核酸的表達的重組核酸、合成核酸或融合核酸或衍生物。優選的啟動子可以包含一個或多個特異性調節元件的另外拷貝，以進一步增強表達和/或改變所述核酸的空間表達和/或時間表達。
[0371]如本文所用，術語「可操作地連接到」表示將啟動子相對於核酸定位使得核酸的表達受啟動子的控制。
[0372]本公開還考慮了無細胞表達系統。例如，將編碼本公開蛋白的核酸可操作地連接到合適的啟動子上，例如T7啟動子，並使所得的表達構建體暴露於足以轉錄和翻譯的條件下。用於體外表達或無細胞表達的典型表達載體已有說明並且包括但不限於TNT T7和TNTT3 系統(Promega)、pEXPl-DEST 和 pEXP2_DEST 載體(Invitrogen)。
[0373]用於在細胞中表達的許多載體是可用的。載體組分通常包括但不限於以下一者或更多者:信號序列、編碼本公開的蛋白的序列(例如，從本文提供的信息中得到的)、增強子元件、啟動子以及轉錄終止序列。技術人員將知道合適的用於蛋白表達的序列。例如，示例性信號序列包括原核分泌信號(例如pelB、鹼性磷脂酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II)、酵母分泌信號(例如轉化酶前導序列、因子前導序列或酸性磷酸酶前導序列)或哺乳動物分泌信號(例如單純皰疹gD信號)。
[0374]示例性啟動子包括`在原核生物中具有活性的那些(例如phoA啟動子、β -內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統以及雜合啟動子，諸如tac啟動子)。這些啟動子可用於在原核生物中表達，原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸細菌科，諸如埃希桿菌屬(Escherichia)例如大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬(Shigella)，以及桿菌，諸如枯草芽孢桿菌；(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis),假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa),和鏈黴菌屬(Streptomyces)。優選地,宿主是大腸桿菌。一個優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC31, 446)，但其他菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC31, 537)以及大腸桿菌 W3110(ATCC27, 325)、DH5a 或 DHlOB 也是合適的。
[0375]在哺乳動物細胞中具有活性的示例性啟動子包括巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV-1E)、人延長因子Ι-a啟動子(EFl)、小核RNA啟動子(Ula和Ulb)、a-肌球蛋白重鏈啟動子、猿猴病毒40啟動子(SV40)、勞氏肉瘤病毒啟動子(RSV)、腺病毒主要晚期啟動子、β-肌動蛋白啟動子、包含CMV增強子/ β肌動蛋白啟動子的雜合調節元件，或免疫球蛋白啟動子或其活性片段。可用的哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7, ATCC CRL165D ;人胚腎系(經亞克隆用於在懸浮培養中生長的293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10);或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
[0376]適於在酵母細胞諸如選自巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(S.pombe)的酵母細胞中表達的典型啟動子包括但不限於=ADHl啟動子、GALl啟動子、GAL4啟動子、CUPl啟動子、PH05啟動子、nmt啟動子、RPRl啟動子或TEFl啟動子。
[0377]適於在昆蟲細胞中表達的典型啟動子包括但不限於0PEI2啟動子、從家蠶(Bombyx muri)分離的昆蟲肌動蛋白啟動子、果蜆(Drosophila sp.)Dsh啟動子(Marsh等人，2000)以及誘導型金屬硫蛋白啟動子。用於表達重組蛋白的優選昆蟲細胞包括選自以下的昆蟲細胞:BT1-TN-5B1_4細胞和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如sfl9細胞、sf21細胞)。適於表達核酸片段的昆蟲包括但不限於果蠅。還考慮了草地貪夜蛾的用途。
[0378]用於將分離的核酸分子或包含該核酸分子的基因構建體引入細胞進行表達的手段對於本領域的技術人員而言是已知的。用於給定細胞的技術取決於已知的成功技術。用於將重組DNA引入細胞中的手段包括微注射、由DEAE-葡聚糖介導的轉染、由脂質體介導的轉染(諸如通過使用 lipofectamine (Gibco,MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco』MD, USA))、PEG介導的DNA攝取、電穿孔和微粒轟擊(諸如通過使用DNA包被的鶴或金顆粒(AgracetusInc.，WI，USA))等等 ο
[0379]可以在多種培養基中培養用於生產本公開蛋白的宿主細胞，具體取決於所用的細胞類型。諸如 Ham’s FlO (Sigma)、最低必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMl-1640 (Sigma)以及Dulbecco氏改良Eagle氏培養基((DMEM)，Sigma)的市售培養基適用於培養哺乳動物細胞。用於培養本文討論的其他細胞類型的培養基是本領域已知的。
[0380]蛋白的分離
[0381]本公開的蛋白優選 地得到分離。對於「分離的」表示蛋白基本上得以純化或從其天然存在的環境中移出，例如處於異源環境中。對於「基本上純的」表示蛋白基本上不含汙染劑，例如至少約70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%不含汙染劑。
[0382]用於純化本公開的蛋白的方法是本領域已知的和/或本文說明的。例如，使蛋白與能夠結合到其上的試劑在足以使結合發生的時間和條件下接觸。任選地，在洗滌以除去未結合的蛋白之後，本公開的蛋白得以分離(例如洗脫)。
[0383]當使用重組技術時，本公開的蛋白可以在細胞內、在周質間隙中產生或直接分泌到培養基中。如果在細胞內產生蛋白，則作為第一步驟，例如通過離心或超濾將微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)除去。Carter等人(1992)說明了用於分離分泌到大腸桿菌周質間隙中的抗體的程序。簡而言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下將細胞糊(cell paste)經大約30分鐘融化。可以通過離心除去細胞碎片。當將蛋白分泌到培養基中時，通常首先使用市售蛋白濃縮過濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元將得自此類表達系統的上清液濃縮。可以將蛋白酶抑制劑諸如PMSF包括在上述步驟的中任一種中以抑制蛋白水解，並且可以包括多種抗生素以防止偶發汙染物的生長。
[0384]從這些細胞製備的蛋白可以使用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析以及親和層析進行純化，其中親和層析是優選的純化技術。作為親和配體的蛋白A的適應性取決於蛋白中存在的任何抗體Fe結構域的種類和同種型(如果確實存在的話)。可以使用蛋白A來純化基於人Y 1、Y 2或Y 4重鏈的抗體(Lindmark等人，1983)。蛋白G被推薦用於所有小鼠同種型以及用於人Y 3 (Guss等人，1986)。另外可以使用本公開蛋白中的可變結構域結合到其上或升高到其上的抗原或表位決定簇來進行親和層析。親和配體所附連的基質最常見的是瓊脂糖，但是其他基質也是可用的。與使用瓊脂糖可以實現的相比較，機械穩定的基質諸如受控多孔玻璃或聚(苯二乙烯)苯(poly (styrenedivinyl) benzene)允許更快的流速和更短的加工時間。用於蛋白純化的其他技術諸如離子交換柱上的分級分離、乙醇沉澱法、反相高效液相色譜、矽石上的層析、肝素上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂上的SEPHAROSE?層析(諸如聚天冬氨酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沉澱法也是可用的，具體取決於待回收的蛋白。
[0385]技術人員還將知道的是，本公開的蛋白可以修飾成包含標籤以促進純化或檢測，例如聚組氨酸標籤，例如六聚組氨酸標籤，或流感病毒血凝素(HA)標籤、或猿猴病毒5 (V5)標籤、或FLAG標籤、或穀胱甘肽S-轉移酶(GST)標籤。優選地，標籤是六聚組氨酸標籤。然後使用本領域已知的方法諸如親和純化對所得的蛋白進行純化。例如，包含六聚組氨酸標籤的蛋白通過以下方式純化:使包含蛋白的樣品與固定在固體或半固體載體上特異性結合六聚組氨酸標籤的氮川三乙酸鎳(N1-NTA)接觸，將該樣品洗滌以除去未結合的蛋白，隨後將結合蛋白洗脫。作為另外一種選擇或除此之外，將結合到標籤上的配體或抗體用於親和純化方法。
[0386]在任何初步純化步驟之後，可以使包含本公開的蛋白和汙染物的混合物接受低pH疏水相互作用層析。
[0387]蛋白合成
[0388]使用標準技術(例如使用BOC或FMOC化學)從其確定的胺基酸序列可容易地合成本公開的蛋白。合成肽使用固相、液相或肽縮合或它們的任何組合的已知技術而製備，並且可以包含天然的和/或非天然的胺基酸。用於肽合成的胺基酸可以是具有Merrifield，1963的原固相程序的脫保護、中和、偶合以及洗滌方案或由Carpino和Han，1972說明的鹼不穩定性Na-氨基保護的9-芴甲氧羰基(Fmoc)胺基酸的標準Boc (Na-氨基保護的Na-叔丁氧羰基)胺基酸樹脂。Fmoc和Boc Na-氨基保護的胺基酸均可以從多種商業來源獲得，諸如 Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem 或 Peninsula Labs。
[0389]評估蛋白聚集抗性的方法
[0390]可以使用本領域已知的方法分析本公開的蛋白或組合物的聚集抗性。可以使用本領域的技術人員可接受的聚集抗性參數。示例性參數在下文有更詳細的說明。在示例性實例中，評估了熱再摺疊能力(refoldability)。在一些實例中，評估了本公開的蛋白的表達水平(例如，如通過％產率度量)。在其他實例中，評估了本公開的蛋白的聚集水平。在某些實例中，將本公開的蛋白或組合物的聚集抗性與合適的對照進行比較。
[0391]可以使用本領域已知的多種非限制性生物物理或生物化學技術來分析本公開的蛋白的聚集抗性。這種技術的實例是分析光譜學，諸如圓二色(CD)光譜。CD光譜測量隨增加的溫度而變化的蛋白的光學活性。圓二色(CD)光譜測量由於結構不對稱性產生的左手偏振光對比右手偏振光的吸收差異。無序或去摺疊的結構導致CD光譜與有序或摺疊結構的光譜差異巨大。CD光譜反映蛋白對於增加溫度的變性作用的靈敏度並因此指示蛋白的聚集抗性(參見 van Mierlo 和 Steemsma, 2000)。
[0392]用於測量聚集抗性的另一種示例性分析光譜方法是螢光發射光譜(參見vanMierlo和Steemsma，上文)。用於測量聚集抗性的又一種示例性分析光譜方法是核磁共振(NMR)光譜(參見例如van Mierlo和Steemsma,上文)。
[0393]在其他實例中，以生物化學方式測量本公開的組合物或蛋白的聚集抗性。用於評定聚集抗性的示例性生物化學方法是熱挑戰測定法(thermal challenge assay)。在「熱挑戰測定法」中，使本公開的蛋白接受一定範圍的高溫持續一個設定的時間段。例如，使測試蛋白接受一定範圍的升高的溫度。然後通過相關生物化學測定法來測定蛋白的活性。例如，可以通過功能或定量ELISA來測定結合蛋白的結合活性。用於測定結合親和力的另一種方法採用表面等離子體共振。表面等離子體共振是允許例如使用BIAcore系統(PharmaciaBiosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)通過檢測生物傳感器基質內的蛋白濃度改變對實時雙特異性相互作用進行分析的一種光學現象。 [0394]在其他實例中，通過測量其聚集傾向來確定本公開的組合物或蛋白的聚集抗性。可以通過許多非限制性生物化學或生物物理技術對聚集進行測量。例如，本公開的組合物或蛋白的聚集可使用濁度測量而評估。為此，監測320nm處或作為另外一種選擇330nm、340nm或350nm處的吸光度。
[0395]作為另外一種選擇或作為另外一種選擇，可以使用層析法例如尺寸排阻層析(SEC)來評估組合物或蛋白的聚集抗性。SEC基於尺寸大小而分離分子。柱子填充有聚合物凝膠的半固體珠粒，該凝膠將允許離子和小分子進入它們內部但是較大的分子不能進入。當將蛋白或組合物施加到柱子頂部時，與大的蛋白聚集體可獲得的相比較，緊密摺疊的蛋白(即非聚集蛋白)通過更大體積的溶劑進行分配。因此，大的聚集體更快地移動通過該柱子，並且以此方式，混合物可以被分離或分級分離成其組分。當每個餾分從凝膠中洗脫時，可以單獨地對它們進行定量(例如，通過光散射)。因此，可以通過將餾分濃度與施加到凝膠上蛋白的總濃度進行比較來確定本公開的蛋白或組合物的聚集百分比。聚集抗性組合物基本上作為單個餾分從柱子中洗脫出來，並在洗脫譜圖或層析圖中基本上作為單峰出現。
[0396]在其他實例中，在表達蛋白(例如重組表達)之後，通過測量回收的蛋白的量(本文為產率」)對本公開的組合物的聚集抗性進行評估。例如，可以通過針對每毫升宿主培養基確定回收蛋白的毫克數(例如，mg / ml蛋白)來測量％產率。在一個優選的實例中，在哺乳動物宿主細胞(例如CHO細胞)中表達之後評估％產率。
[0397]在又一個實例中，在儲存一個限定的時間段之後通過在一定範圍的溫度下(例如，從約25°C至約80°C )監測蛋白的損失而評估本公開的組合物的聚集抗性。可以使用本領域已知的任何蛋白定量方法來測定回收蛋白的量或濃度，並與蛋白的初始濃度進行比較。示例性蛋白定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford測定。
[0398]在另外其他實例中，可以通過對標記化合物與結合性分子的變性或去摺疊部分的結合進行定量而評估本公開的蛋白的聚集抗性。此類分子優選地為疏水的，因為它們優選地與通常埋在天然蛋白內部的胺基酸(但是在變性或去摺疊的結合性分子中它們是暴露的)的較大疏水補丁相結合或相互作用。一種示例性標記化合物是疏水性螢光染料1-苯胺基-8-萘磺酸鹽(ANS)。
[0399]其他實例涉及檢測僅結合到正確摺疊的可變結構域上的蛋白的結合(例如，蛋白A結合到正確摺疊的IgG3vH上)。
[0400]偶聯物
[0401]本公開還提供了偶聯到另一種化合物上的本公開的蛋白，例如，包含偶聯到不同部分上的本公開的蛋白的偶聯物(免疫偶聯物)，例如直接地或間接地結合到蛋白上的治療劑。其他部分的實例包括但不限於酶、螢光團、細胞毒素、放射性同位素(例如碘-131、釔-90或銦-111)、免疫調節劑、抗血管生成劑、抗新生血管形成和/或其他血管生成劑、毒素、抗增殖劑、促凋亡劑、化學治療劑以及治療性核酸。
[0402]細胞毒素包括對細胞有害(例如殺死)的任何試劑。有關本領域已知的這些類別的藥物及其作用機理，參見Goodman等人(1990)。與製備抗體免疫毒素相關的另外技術在例如US5，194，594中有所提供。示例性毒素包括白喉A鏈、白喉毒素的未結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α -帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAP1、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚黴素、依諾黴素和單端孢黴烯類。參見例如W093 / 21232。
[0403]用於形成本公開的免疫偶聯物的合適治療劑包括:紫杉酚、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米託蒽醌、光輝黴素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質激素類、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、以及嘌羅黴素、抗代謝藥類(諸如甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羥基脲、門冬醯胺酶、吉西他濱、克拉屈濱)、烷化劑類(諸如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、達卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、絲裂黴素C、順鉬和其他鉬衍生物類，諸如卡鉬)、抗生素類(諸如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、柔紅黴素(以前稱為道諾黴素)、多柔比星、伊達比星、光輝黴素、絲裂黴素、米託蒽醌、普卡黴素、安麴黴素(AMC))。
[0404]多种放射性核素可用於產生放射性偶聯的抗體。實例包括但不限於212B1、1311、9°Y和 186Re0
[0405]在另一個實例中，蛋白可以偶聯到「受體」(諸如鏈黴親和素)以用於預靶向，其中將蛋白-受體偶聯物施用給患者，緊接著使用清除劑從循環中除去未結合的偶聯物，然後施用偶聯到治療劑(例如放射性核素)的「配體」(例如親和素)。
[0406]本公開的蛋白可進一步修飾成包含本領域已知的並且易於獲得的另外的非蛋白部分。優選地，適於蛋白衍生的部分是水溶性的聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖或聚乙烯醇。
[0407]用於將化合物偶聯到本領域已知的蛋白殘基上的多種方法是本領域已知的並且對於技術人員將是顯而易見的。
[0408]裡途
[0409]本公開的蛋白可用於多種應用，包括研究、診斷/預測、工業和治療應用。取決於蛋白所結合的抗原，該蛋白可以用於將化合物遞送到細胞，例如以殺死該細胞或阻止生長和/或用於成像和/或用於體外測定。在一個實例中，蛋白可用於成像以及將細胞毒性劑遞送到細胞，即，它偶聯到可檢測標記上，並且細胞毒性劑或組合物包含其中一些偶聯到細胞毒性劑上而其中一些偶聯到可檢測標記上的蛋白的混合物。
[0410]本文所述的蛋白還可以充當拮抗劑以抑制(可以是降低或阻止)(a)(例如配體、抑制劑)結合到受體上，(b)受體信號傳導功能，和/或(C)刺激功能。充當受體功能拮抗劑的蛋白可以直接或間接地阻斷配體結合(例如通過引起構象改變)。[0411]本公開的蛋白還可以是受體的激動劑，從而例如(a)增強或誘導(例如配體)結合到受體上，(b)增強或誘導受體信號傳導功能，和/或(C)提供刺激功能。
[0412]技原
[0413]本公開考慮了包含能夠特異性結合到除了在本文的任一實例、實施例或權利要求書中明確除外的那些之外的任何抗原上的根據本公開修飾的至少一個八(以及任選Vh)的蛋白，即本公開的實例與要求特異性抗原相對是一般性的。
[0414]在一個實例中，本公開的蛋白不結合到來自微生物和/或來自鳥類的蛋白上。
[0415]在一個實例中，蛋白不結合到溶菌酶(例如雞蛋溶菌酶)和/或β -半乳糖苷酶和/或澱粉酶(例如α澱粉酶)和/或脫水酶(例如碳酸酐酶)和/或B5R (例如來自牛痘(Vaccinia))上。在一個實例中，蛋白不結合到人白蛋白上。在一個實例中，蛋白不結合到人VEGF上。
[0416]示例性蛋白特異性結合到人蛋白上或衍生自針對人蛋白產生的抗體。
[0417]本公開的實例考慮了特異性結合到與疾病或障礙(即病狀)相關的抗原上的蛋白，例如與癌或癌性/轉化細胞相關或由所述細胞表達，和/或與自身免疫疾病相關，和/或與炎性疾病或病狀相關，和/或與神經退行性疾病相關，和/或與免疫缺陷障礙相關。
[0418]針對其可以產生本公開的蛋白的示例性抗原包括BMPRIB(骨形態生成蛋白受體 IB 型；W02004063362)、EI6(LAT1, SLC7A5, W02004048938)、STEAPI (前列腺的六跨膜上皮細胞抗原，W02004065577)、CA125(MUC16, W02004045553)、MPF(MSLN, SMR,巨核球增強因子，間皮素，W02003101283)、Napi3b (W02004022778)、Sema5b (W02004000997)、PSCA (US2003 129 192) , ETBR (WO2004045516)、MSG783 (WO2 OO 3 I O4275),STEAP2 (W02003087306)、TrpM4 (US2003143557)、CRIPTO (US20032244 1 1)、CD 21(ff02004045520), CD 79b(ff02004016225), SPAPIB(ff020040 I 62 2 5),HER2 (W02004048938)、NCA (W02004063709)、MDP (W02003016475)、IL_20Ra (EP1394274)、短蛋白聚糖(US2003186372)、EphB2R(W02003042661)、ASLG659(US20040101899)、PSCA (W02004022709)、GEDA (ff02003054 I 52)、BAFF-R (WO2004058309)、CD22(ff02003072036), CD79a(ff02003088808), CXCR5(WO2004040000)、HLA-DOB (W09958658)、P2X5 (W02004047749)、CD72 (W02004042346)、LY64 (US2002193567)、FcRHI (W02003077836)、IRTA2 (W02003077836)、TENB2 (W02004074320)、CD20 (W094/11026)、vEGF-A(Presta等人，1997)、p53、EGFR、孕酮受體、組織蛋白酶D、Bcl_2、E鈣粘蛋白、CEA、Lewis X、Ki67、PCNA, CD3、CD4、CD5、CD7、CDllc、CDllcU c_Mvc、tau、PrPSC、TNFa、音蝟因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、EPHA2、催乳素受體、催乳素、IL-2、TNF-受體、IL-21、IL-21 受體、CXCR7、FGFR2、FGF2 或 Αβ。
[0419]在另一個實例中，本公開的蛋白結合到可溶性蛋白上，優選體內分泌的可溶性蛋白。示例性可溶性蛋白包括細胞因子類。術語「細胞因子」是由一個細胞群釋放的蛋白或多肽的通稱，它們在另一個細胞上作為細胞間介質發揮作用。細胞因子的實例包括淋巴因子、單核因子、生長因子以及傳統的多肽激素。細胞因子包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨醯基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、鬆弛素、鬆弛素原、糖蛋白激素類諸如卵泡刺激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)、肝生長因子；前列腺素、成纖維細胞生長因子、催乳素、胎盤催乳素、OB蛋白、腫瘤壞死因子-α和-β ;繆勒管抑制物質、促性腺激素相關肽、抑制素、活化素、血管內皮生長因子、整聯蛋白、血小板生成素(TPO)、神經生長因子類諸如NGF-B、血小板生長因子、轉化生長因子類(TGF)諸如TGF-a和TGF-β，胰島素樣生長因子I或II，促紅細胞生成素(ΕΡ0)，骨誘導性因子、幹擾素類例如幹擾素α、β或Y ;集落刺激因子類(CSF)諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；以及粒細胞-CSF(G-CSF)，白介素類(Ii)諸如 IL-U IL-1a, IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1UIL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21 和 LIF。優選的細胞因子選自由白介素 2、13 或 21、TNFa、TGF β、BAFF 和 GM-CSF 組成的組。
[0420]在另一個實例中，可溶性蛋白是趨化因子。趨化因子通常作為化學引誘物發揮作用，以將免疫效應細胞募集到趨化因子表達位點。趨化因子包括但不限於RANTES、MCAF,MIPl-a或MIPl-β。技術人員將認識到，某些細胞因子還已知具有化學引誘物作用並且也可歸類到術語趨化因子下。優選的趨化因子是RANTES。
[0421]在另一個實例中，可溶性蛋白是肽類激素。示例性肽類激素包括胰島素、ΝΡΥ、、高血糖素和催乳素。
[0422]在一個另外的實例中，可溶性蛋白是蛋白酶。示例性蛋白酶包括因子X、因子VI1、因子IX或激肽釋放酶。
[0423]在另一個實例中，本公開的蛋白結合到受體或膜相關蛋白上。示例性抗原包括G-蛋白偶聯受體(諸如CXCR7、CXCR5、CXCR3、C5aR或β -2-腎上腺素能受體)或離子通道(諸如鈉通道或鉀通道或鈣通道，優選地菸鹼乙醯膽鹼受體)或單跨膜蛋白(諸如T-細胞受體或催乳素受體或細胞因子受體(例如IL-21受體)或I類MHC或2類MHC或CD4或CD8)。
[0424]在一個另外的實例中，本公開的蛋白結合到以下一者或更多者:幹擾素α受體
I(IFNARl)、血管生成素-2、IL-4Ra、IL-33、CXCL13、晚期糖基化終末產物的受體(RAGE)、IC0S、IgE、幹擾素 a、IL-6、IL-6 受體4卩1^4、0)19、61^^?受體、CD22、IL_22、EphA2、IL-13、高遷移率族蛋白I (HMGl)、間變型淋巴瘤激酶(ALK)、整聯蛋白(例如整聯蛋白α νβ 3)、Eph受體、IL-9、EphA4、PC細胞衍生生長因子(P⑶GF)、神經生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(I3DGF)、血小板衍生生長因子受體(TOGFR，例如TOGFRa或PDGFR~)或 IL-5。
[0425]本公開的蛋白可以從中衍生的示例性抗體對於技術人員將是顯而易見的並且包括上文列出的那些。
[0426]示例性雙特異性蛋白可以結合到感興趣抗原的兩個不同表位上。其他此類蛋白可以使一個抗原結合位點與另一種蛋白的結合位點相結合。作為另外一種選擇，感興趣區域的抗抗原可以與結合到白細胞上的觸發分子上的區域相結合，觸發分子諸如T細胞受體分子(例如0)3)或IgG(FcyR)的Fe受體，諸如FcyRI (CD64)、FcyRII (CD32)和/或FcyRIII (CD16)，從而將細胞防禦機制集中和定位到表達感興趣抗原的細胞上。還可以使用雙特異性蛋白將細胞毒性劑定位到表達感興趣抗原的細胞。這些蛋白具有結合感興趣抗原的區域以及結合細胞毒性劑(例如肥皂草素、抗幹擾素_a、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的區域。W096 / 16673說明了一種雙特異性抗ErbB2 /抗FcyRIII抗體，美國專利5，837，234公開了一種雙特異性抗ErbB2 /抗FcyRI抗體。一種雙特異性抗ErbB2 / Fca抗體在W098 / 02463中示出。US5，821，337教導了一種雙特異性抗ErbB2 /抗⑶3抗體。
[0427]藥物組合物和治療方法
[0428]本公開的蛋白(義詞活性成分)可用於腸胃外、外用、口腔或局部給藥、氣溶膠給藥或經皮給藥以用於預防性或治療性治療。能夠以多種單位劑型施用這些藥物組合物，這取決於給藥方法。例如，適於經口給藥的單位劑型包括散劑、片劑、丸劑、膠囊劑或錠劑或通過腸胃外給藥。應當認識到，本公開的藥物組合物當經口給藥時應當保護避免消化。這典型地通過使蛋白與組合物複合從而使它抗酸水解或酶水解，或通過將化合物包裝到適當的抗性載體諸如脂質體中來實現。避免蛋白消化的手段是本領域已知的。
[0429]典型地，將治療有效量的蛋白配製成組合物以便施用給受試者。短語「治療有效量」是指足以在受試者中促進、誘導和/或增強治療或其他療效的量。將顯而易見的是，在這些製劑中本公開的蛋白的濃度可以廣泛地變化，並將根據所選的特定給藥模式和患者的需要主要基於體液量、粘度、體重等進行選擇。取決於疾病的類型和嚴重性，治療有效量可為約lug / kg至IOOmg / kg(例如0.1-1Omg / kg)蛋白，無論是例如通過一次或更多次單獨給藥還是通過連續輸注。典型的每日劑量可在從約lug / kg至IOOmg / kg或更多的範圍內。對於經數天或更長時間的反覆給藥，取決於病狀，治療持續到直至發生所需的疾病狀狀抑制。示例性給藥分案包括施用約4mg / kg的初始負荷劑量，接著約2mg / kg蛋白的每周維持劑量。其他給藥方案也是可用的。例如，以約375mg / m2的劑量來施用抗CD20抗體，諸如利妥昔單抗。以5mg / kg-1Omg / kg的劑量施用抗VEGF抗體,諸如貝伐單抗。以4mg / kg-8mg / kg的負荷劑量以及2mg / kg_6mg / kg的每周一次/每兩周一次維持劑量施用抗Her2 / neu抗體,諸如曲妥珠單`抗。以約400mg /周的劑量施用抗TNFa抗體諸如阿達木單抗以治療類風溼性關節炎，或以160mg的負荷劑量持續第一周以及40mg /周的維持劑量，或以80mg的負荷劑量以及40mg /周的維持劑量用於治療銀屑病。通過常規技術和測定法可容易地監測治療過程。
[0430]本公開的蛋白的合適劑量將根據特定的蛋白、待診斷/治療/預防的病狀和/或進行治療的受試者而變化。確定合適的劑量在熟練醫生的能力範圍之內，例如通過以次優劑量開始並逐漸增加地改變劑量以確定最佳或可用劑量。作為另外一種選擇，為了確定用於治療/預防的適當劑量，使用得自細胞培養測定或動物研究的數據，其中合適的劑量在包括具有很小或無毒性的活性化合物的ED50的循環濃度的範圍之內。劑量可以在這個範圍內改變，具體取決於採用的劑型以及使用的給藥途徑。最初可以從細胞培養測定法來估計治療/預防有效劑量。可以在動物模型中配製劑量，以達到包括在細胞培養中確定的IC50( 即，達到症狀的半最大抑制的化合物濃度)的循環血漿濃度範圍。此類信息可用於更準確地確定人體中的有用劑量。血漿中的水平可例如通過高效液相色譜法測量。[0431]作為另外一種選擇，以濃縮劑量配製本公開的蛋白，在施用給受試者之前將該濃縮劑量稀釋成治療有效劑量。
[0432]本公開的組合物尤其可用於腸胃外給藥，例如配製成通過靜脈內、肌內、皮下、經皮或其他此類途徑進行注射，包括蠕動給藥以及直接滴注到腫瘤或疾病位置(腔內給藥)。用於給藥的組合物通常將包括溶於藥學上可接受的載體(優選水性載體)中的本公開蛋白的溶液。可以使用多種水性載體，例如緩衝鹽水等。其他示例性載體包括水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液以及5%人血清白蛋白。還可以使用非水性載體，諸如混合的油和油酸乙酯。脂質體也可以用作載體。載體可以含有增強等滲性和化學穩定性的微量添加劑，例如緩衝劑和防腐劑。組合物可根據需要包含藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，諸如pH調節和緩衝劑、毒性調節劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
[0433]用於製備藥物組合物的技術通常是本領域已知的，如通過Remington』 sPharmaceutical Sciences, 16th Ed.Mack Publishing Company, 1980 舉例說明。
[0434]W02002 / 080967說明了用於施用包含用於治療例如哮喘的蛋白的氣霧化組合物的組合物和方法，它們也適於施用本公開的蛋白。
[0435]本公開的蛋白可以與第二化合物結合在藥物組合物、製劑或給藥方案中作為聯合療法。藥物聯合製劑或給藥方案的第二化合物具有與聯合製劑的蛋白的互補活性，使得它們不對彼此造成不利影響。
[0436]第二化合物可以是化學治療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心臟保護劑。此類分子以對於預期的目的有效的量而適當地存在於聯合製劑中。包含本公開蛋白的藥物組合物還可以具有治療有效量的化學治療劑，諸如微管蛋白形成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA結合劑。
[0437]還可以使用藥物「緩釋」膠囊或組合物。緩釋製劑通常被設計成在延長的時期內提供恆定的藥物水平並且可以用來遞送本公開的化合物。
[0438]本公開還提供了一種治療或預防受試者中的病狀的方法，該方法包括將治療有效量的本公開的蛋白施用給對其有需要的受試者。
[0439]如本文所用，在防止病狀的背景中的術語「防止」包括施用足以停止或抑制特定疾病或病狀的至少一種症狀發展的一定量的本文所述的蛋白。
[0440]如本文所用，術語「治療」包括施用足以降低或消除特定疾病或病狀的至少一種症狀的治療有效量的本文所述的抑制劑和/或藥劑。
[0441]如本文所用，術語「受試者」應當理解成表示任何動物，包括人類，優選哺乳動物。示例性受試者包括但不限於人類、靈長類、家畜(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、寵物(例如狗、貓)、實驗室試驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠)、俘獲的野生動物(例如狐狸、鹿)。優選地，哺乳動物是人或靈長類。更優選地，哺乳動物是人。
[0442]如本文所用，「病狀」是對正常功能的破壞或幹擾，並且不限於任何特定病狀，並將包括疾病或障礙。在一個實例中，病狀是癌症或自身免疫或炎性障礙。
[0443]示例性癌症包括但不限於癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體實例包括血癌(例如淋巴瘤或白血病)、鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、惡性膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。優選地，癌症是乳腺癌或肺癌或卵巢癌或前列腺癌。
[0444]炎性或自身免疫病狀是由免疫球蛋白或T細胞受體對抗原的反應而引起的病狀。這些病狀包括自身免疫疾病和超敏反應(例如，I型:過敏反應、蕁麻疹、食物過敏、哮喘；
II型:自身免疫溶血性貧血、輸血反應；111型:血清病、壞死性血管炎、腎小球腎炎、類風溼性關節炎、狼瘡；Iv型:接觸性皮炎、移植排斥)。自身免疫疾病包括類風溼性障礙(諸如類風溼性關節炎、斯耶格倫症候群、硬皮病、狼瘡諸如SLE和狼瘡腎炎、多發性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗體症候群和銀屑病關節炎)、骨性關節炎、自身免疫胃腸和肝障礙(諸如炎性腸疾病(例如潰瘍性結腸炎和克羅恩病)、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、原發性硬化性膽管炎和乳糜瀉)、血管炎(諸如ANCA相關性血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韋格納肉芽腫病和多動脈炎)、自身免疫性神經障礙(諸如多發性硬化、斜視性眼陣攣肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎和自身免疫性多神經病)、腎障礙(諸如腎小球腎炎、肺出血腎炎症候群和伯格病)、自身免疫性皮膚學障礙(諸如銀屑病、風疹、蕁麻疹、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡和皮膚紅斑狼瘡)、血液學障礙(諸如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜和自身免疫性溶血性貧血)、動脈硬化、葡萄膜炎、自身免疫聽力疾病(諸如內耳疾病和聽力損失)、貝切特病、雷諾症候群、器官移植以及自身免疫性內分泌障礙(諸如糖尿病相關自身免疫疾病，例如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、阿狄森病和自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯病和甲狀腺炎))。更優選的此類疾病包括例如類風溼性關節炎、潰瘍性結腸炎、ANCA相關性血管炎、狼瘡、多發性硬化、斯耶格倫症候群、格雷夫斯病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎以及腎小球腎炎。
[0445]在另一個實例中，炎性病狀是涉及嗜中性細胞、單核細胞、肥大細胞、嗜鹼性細胞、嗜酸性細胞、巨噬細胞的病狀，其中發生細胞因子釋放、組胺釋放、氧化爆發、吞噬作用、其他顆粒酶的釋放和趨化性。超敏反應(上述)也可以被認為是炎性疾病(急性或慢性)，因為它們通常涉及補體激活以及各種白細胞諸如嗜中性細胞、肥大細胞、嗜鹼性細胞等的募集/浸潤。`
[0446]將本公開的組合物以與製劑相容的方式以及以具有治療/預防有效性的量施用。製劑易於以多種方式施用，例如通過攝取或注射或吸入。
[0447]其他治療性方案可以與施用本公開的蛋白相結合。聯合治療可以作為同時的或序貫的方案施用。當序貫施用時，可以兩次或更多次給藥的方式施用該組合。聯合給藥包括同時給藥(使用單獨的製劑或單一藥物製劑)和以任一順序的順序給藥，其中當兩種(或所有)活性劑都同時地產生它們的生物學活性時，優選地存在一個時間段。
[0448]在治療性用途之前，優選地在體外和/或體內對本公開的蛋白進行測試，例如如下所述。
[0449]體外測試
[0450]在一個實例中，本公開的蛋白結合到抗原上，即使偶聯到化合物上也是如此。在蛋白從預先存在的蛋白(例如抗體)衍生的情況下，本公開的蛋白可以至少與它從中衍生的蛋白同樣好地結合到抗原上。作為另外一種選擇，本公開的蛋白以它從中衍生蛋白的至少約10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%的親和力或親合力結合到抗原或不含帶負電殘基的蛋白的一種形式上。[0451]用於確定蛋白結合親和力的示例性方法包括簡單的免疫測定法，該免疫測定法顯示出蛋白阻斷抗體結合到靶抗原上的能力，例如競爭性結合測定法。在一個測定法中確定競爭性結合，其中測試的蛋白抑制參考蛋白與共同抗原的特異性結合。多種類型的競爭結合測定法是已知的，例如固相直接或間接放射性免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心式競爭測定(參見Stahli等人，1983)、固相直接生物素-親和素EIA (參見Kirkland等人，1986)、固相直接標記的測定、固相直接標記的夾心式測定(參見Harlow和Lane，1988)、固相直接生物素-親和素EIA(Cheung等人，1990)或直接標記的RIA(Moldenhauer等人，1990)。典型地,這樣的測定涉及使用結合到固體表面或具有未標記的測試蛋白和標記的參考蛋白之一的細胞上的純化抗原。在測試蛋白存在下通過確定結合到固體表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。
[0452]本公開還涵蓋用於測試本公開蛋白的活性的方法。多種測定法可用於體外評定本公開的蛋白的活性。例如，將本公開的蛋白施用到細胞或其群體中，以確定它是否能夠結合到所述細胞上和/或被所述細胞內化。這樣的測定法通過用可檢測標記來標記本公開的蛋白而促進(即，產生偶聯物)，然而，這不是必要的，因為本公開的蛋白也能夠用標記的蛋白檢測。這樣的測定法可用於評定本公開的蛋白將化合物(即有效載荷)遞送到細胞中的能力和/或它在成像中的實用性。優選地，細胞表達本公開的蛋白所結合的抗原並且更優選地是需要檢測或處理的細胞類型的細胞系或原代細胞培養物。
[0453]通常，例如偶聯到細胞毒性分子上的本公開蛋白的細胞毒性或細胞抑制活性通過如下方式測量:將表達本公開蛋白所結合的抗原的細胞暴露於本公開的蛋白；將細胞培養一段合適的時間(例如從約6小時至約5天)使蛋白產生生物效應；然後測量細胞活力、細胞毒性和/或細胞死亡。可用於測量活力(增殖)、細胞毒性和細胞死亡的基於細胞的體外測定是本領域已知的。 [0454]例如，CellTiter-Glo?發光細胞活力測定法(CellTiter-Glo? LuminescentCell Viability Assay)是一種基於鞘翅目螢光素酶重組表達的市售(Promega Corp.,Madison, WI)均相測定法(美國專利5583024,5674713和5700670)。這種細胞增殖測定法基於細胞中存在的ATP (代謝活性細胞的一個指示物)的量而確定培養物中活細胞的數量。作為另外一種選擇，使用無螢光刃天青測定細胞活力，在本公開的蛋白存在下將它添加到培養的細胞中。活細胞將刃天青還原成紅色螢光的試滷靈，可以使用例如顯微術或螢光酶標儀容易地檢出。用於分析細胞活力的試劑盒可以例如從Molecular Probes, Eugene,OR, USA 獲得。
[0455]細胞活力的其他測定法包括在DNA合成時確定3H-胸腺嘧啶核苷或4C-胸腺嘧啶核苷向DNA的結合(即，確定與細胞分裂相關的DNA合成)。在這樣的測定中，在標記的胸腺嘧啶核苷存在下將細胞孵育足以使細胞分裂發生的一段時間。在洗滌以便除去任何未結合的胸腺嘧啶核苷之後，例如使用閃爍計數器檢測標記(例如放射性標記)。用於確定細胞增殖的替代測定法包括例如通過BrdU結合來測量DNA合成(通過ELISA或免疫組織化學，可從 Amersham Pharmacia Biotech 獲得的試劑盒)。
[0456]用於檢測細胞死亡的示例性測定法包括AP0PTEST (可從Immunotech獲得)染色凋亡早期細胞，並且不需要將細胞樣品固定(Martin等人，1994)。這種方法利用膜聯蛋白V抗體來檢測經歷凋亡的細胞所特有的細胞膜重配置。然後可通過螢光激活細胞分選(FACS)、 ELISA或通過使用固定的膜聯蛋白V抗體進行粘附和淘選(panning)，將以這種方式染色的凋亡細胞進行分選。作為另外一種選擇，使用末端脫氧核苷酸基轉移酶介導的生物素醯化UTP切口末端標記(TUNEL)測定法來確定細胞死亡的水平。TUNEL測定法使用末端脫氧核苷醯基轉移酶，用生物素醯化的核苷酸標記在凋亡期間產生的3' -OH DNA末端。然後使用偶聯到可檢測標記物上的鏈黴親和素來檢測生物素醯化的核苷酸。用於TUNEL染色的試劑盒可以從例如Intergen Company, Purchase, NY獲得。
[0457]還可以通過將本公開的蛋白暴露於血清和/或細胞隨後使用例如免疫親和純化來分離本公開的蛋白而評定或預測本公開的蛋白的體內穩定性。回收的本公開的蛋白的減少量表明本公開的蛋白在血清中或當暴露於細胞時被降解。
[0458]在另一個實例中，使用標準放射免疫測定發或螢光免疫測定發來評定本公開的蛋白阻斷配體結合到受體上的能力。
[0459]還可以通過在蛋白存在或不存在下確定受體的信號傳導來評定本公開的蛋白激動或拮抗受體的能力。
[0460]體內測試
[0461]還可以測試本公開蛋白的體內穩定性和/或療效。例如，將本公開的蛋白施用給受試者，然後例如使用ELISA或通過檢測偶聯到蛋白上的可檢測標記，以檢測隨著時間變化的蛋白血清水平。這允許確定本公開的蛋白的體內穩定性。
[0462]還可以將本公開的蛋白施用給人類疾病的動物模型並確定其對症狀的影響。技術人員將能夠基於本公開的蛋白所結合的抗原而容易地確定合適的模型。例如人類癌症的示例性模型是本領域已知的。例如，乳腺癌的小鼠模型包括過表達成纖維細胞生長因子3 (Muller 等人，1990)、TGF-α (Matsui 等人，1990)、erbB2 (Guy 等人，1992)的小鼠；或將人類乳腺癌癌細胞移植到SCID小鼠中。卵巢癌的模型包括將卵巢癌細胞移植到小鼠(例如如Roby等人，2000中所述)、慢性地分泌促黃體激素的轉基因小鼠(Risma等人，1995)或Wx / Wv小鼠中。前列腺癌的小鼠模型也是本領域已知的，並且包括例如從增強表達SV40早期基因中得到的模型(例如TRAMP模型，它利用最小限度的大鼠probasin啟動子來表達SV40早期基因，或使用長probasin啟動子來表達大T抗原的轉基因小鼠，統稱為『LADY』模型，或表達c-myc或Bcl-2或FgfSb或表達顯性負相TGFB的小鼠(有關前列腺癌轉基因模型的綜述，參見Matusik等人,2001)。
[0463]本公開的蛋白還可以施用給除了癌症之外的疾病的動物模型，例如NOD小鼠，以測試它們抑制、預防、治療或延遲糖尿病的能力(例如，如Tang等人，2004中所述)和/或用於GVHD小鼠模型(例如，如Trenado，2002中所述)和/或用於銀屑病小鼠模型(例如，Wang等人,2008)和/或用於類風溼性關節炎模型,例如SKG品系小鼠(Sakaguchi等人)，大鼠II型膠原關節炎模型，小鼠II型膠原關節炎模型或在多個物種中抗原誘導的關節炎模型(Bendele，2001))和/或多發性硬化模型(例如，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE ;Bradl和Linington，1996))和/或炎性氣道病(例如，OVA挑戰或蟑螂抗原挑戰(Chen等人』2007)和/或炎性腸病模型(例如，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎或結腸炎的Muc2缺陷型小鼠模型(Van der Sluis等人,2006)。
[0464]診斷/預測方法
[0465]在一個實例中，本公開提供了用於診斷或預測病狀的方法。[0466]如本文所用，術語「診斷(diagnosis)」及其變型形式(例如但不限於「診斷(diagnose) 」、「診斷(diagnosed) 」、「診斷(diagnosing)」)包括臨床狀態的任何初步診斷或復發性疾病的診斷。
[0467]如本文所用，「預測(Prognosis) 」、「預測(prognosing) 」及其變型形式是指疾病的可能結果或過程，包括恢復或復發的可能性。
[0468]在一個實例中，方法包括確定樣品中抗原的量。因此，本公開的蛋白可用於諸如細胞分選(例如流式細胞術、螢光激活細胞分選)的多種應用，以用於診斷或研究目的。例如，使樣品與本公開的蛋白在足以使蛋白與抗原結合併形成複合物的時間和條件下接觸，然後對複合物進行檢測或確定複合物的水平。為了這些目的，可將蛋白進行標記或不進行標記。蛋白可直接標記，例如使用本文所述的標記。未標記時，可以使用合適的手段例如在凝集測定法中來檢測這些蛋白。未標記的抗體或片段還可以與另一種(即，一種或更多種)可用來檢測蛋白的合適試劑結合使用，諸如與蛋白具有反應性的標記抗體(例如第二抗體)或其他合適的試劑(例如標記的蛋白A)。
[0469]優選地，將本公開的蛋白用於免疫測定。優選地，使用選自以下的測定法:免疫組織化學、免疫螢光、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、螢光聯接免疫吸附測定(FLISA)Western印跡、RIA、生物傳感器測定、蛋白晶片測定以及免疫染色測定(例如免疫螢光)。
[0470]標準固相ELISA或FLISA形式尤其可用於從多種樣品中測定蛋白的濃度。
[0471]在一種形式中 ，這樣的測定涉及將生物學樣品固定到固體基質上，諸如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或測驗片、膜或玻璃載體(例如載玻片)。使特異性結合到感興趣抗原上的本公開的蛋白與固定的樣品直接接觸，並形成與所述樣品中存在的其靶抗原的任何一種的直接結合。本公開的蛋白通常用可檢測的報告分子進行標記，諸如就FLISA而言的螢光標記(例如FITC或德克薩斯紅)或螢光半導體納米晶體(如US6，306，610中所述)，或就ELISA而言的酶(例如辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)或β -半乳糖苷酶)，或作為另外一種選擇可以使用結合到本公開的蛋白上的標記抗體。在洗滌以便除去任何未結合的蛋白之後，直接地(就螢光標記而言)或通過添加諸如過氧化氫、TMB或甲苯胺或5-溴代-4-氯代-3-吲哚-β -D-半乳吡喃糖酐(x-gal)的底物(就酶標記而言)來檢測標記。此類基於ELISA或FLISA的系統尤其適於通過針對已知量的蛋白所結合到的蛋白標準品(諸如分離的和/或重組的蛋白或其免疫原性片段或其表位)校準檢測系統而定量樣品中蛋白的量。
[0472]在另一種形式中，ELISA或FLISA包括將本公開的蛋白或結合到感興趣抗原上的抗體固定到固體基質上，諸如膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板、聚苯乙烯或聚碳酸酯測驗片或玻璃載體。然後使樣品與本公開的所述蛋白或抗體物理接觸，而所述化合物所結合的蛋白被結合或「捕獲」。然後使用本公開的標記蛋白對結合蛋白進行檢測，該標記蛋白結合到不同的蛋白或同一抗原的不同位點。作為另外一種選擇，可以使用第三標記抗體，該抗體結合第二(檢測)蛋白。
[0473]成像方法
[0474]通過上述內容，對技術人員將顯而易見的是，本公開還考慮了使用本公開的蛋白的成像方法。為了成像，將本公開蛋白偶聯到可檢測標記上，該標記可以是能夠發射可以被成像技術檢出的信號的任何分子或試劑。例如，可檢測標記可以是蛋白、放射性同位素、螢光團、發射可見光的螢光團、發射紅外線的螢光團、金屬、鐵磁性物質、發射電磁波的物質、具有特異性磁共振(MR)光譜特徵的物質、吸收或反射X射線的物質或改變聲音的物質。
[0475]在成像程序之前，可以將本公開的蛋白全身性地或局部地施用給待成像的腫瘤、器官或組織。通常，以有效實現所需的腫瘤、組織或器官光學圖像的劑量來施用蛋白。此類劑量可以根據所用的特定蛋白，接受成像程序的腫瘤、組織或器官，所用的成像設備等而在很大程度上變化。
[0476]在本公開的一些實例中，將本公開的蛋白作為組織和器官的體內光學成像劑用於多種生物醫學應用，包括但不限於腫瘤成像、器官斷層成像、器官功能監測、冠狀動脈造影術、螢光內窺鏡術、雷射引導手術、光聲和聲致螢光方法等。其中本公開的蛋白可用於成像的示例性疾病例如癌症在本文進行了說明，並且應當理解成將被考慮為在細節上加上必要的改動而應用於本公開的實例中。在一個實例中，本公開的蛋白偶聯物可用於通過監測本公開的特定蛋白在受試者體內的集中位置而檢測腫瘤和其他異常的存在。在另一個實例中，本公開的蛋白可用於雷射輔助的引導手術，以在腹腔鏡檢查時檢測腫瘤的微小轉移。在又一個實例中，本公開的蛋白可用於診斷動脈粥樣硬化斑塊以及血塊。
[0477]成像方法的實例包括磁共振成像(MRI)、MR光譜學、放射線照相術、CT、超聲、平面Y射線照相機成像、單光子發射計算斷層攝影術(SPECT)、正電子發射斷層攝影術(PET)、其他基於核醫學的成像、使用可見光的光學成像、使用螢光素酶的光學成像、使用螢光團的光學成像、其他光學成像、使用近紅外線的成像或使用紅外線的成像。
[0478]本公開方法的某些實例還包括在對受試者進行手術操作期間對組織成像。
[0479]用於成像的多種技術是本領域的普通技術人員已知的。這些技術中的任何一種均可用在本公開成像方法的背景中，以測量來自可檢測標記的信號。例如，光學成像是在醫學特定領域中已經得到廣泛接受的一種成像模式。實例包括細胞組分的光學標記以及血管造影術，諸如螢光素血管造影術和吲哚氰綠血管造影術。光學成像劑的實例包括例如螢光素、螢光素衍生物、吲哚青綠、俄勒R綠、俄勒R綠衍生物的衍生物、羅丹明綠、羅丹明綠的衍生物、曙紅、赤蘚紅(ery11 irosin)、德克薩斯紅、德克薩斯紅的衍生物、孔雀綠、磺基琥拍醯亞胺酯納米金、級聯藍、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑衍生物、級聯黃染料、dapoxyl染料。
[0480]考慮了 Y照相機成像作為成像方法，該方法可用於測量從可檢測標記得到的信號。本領域的普通技術人員應當熟悉Y照相機成像的應用技術。在一個實例中，測量信號可以涉及mIn或99mTc偶聯物具體地講mIn-奧曲肽或99nTC-促生長素抑制素類似物的Y照相機成像的用途。
[0481]在本公開的背景中，考慮了計算機斷層攝影術(CT)作為成像模式。通過從不同角度取得一系列X射線然後用計算機軟體將它們組合，CT使得其可能構建出身體任何部分的三維圖像。計算機被編程為從任何角度並以任何深度展示二維切片。可以將這些切片合併來建立三維畫像。
[0482]在CT中，當初始CT掃描不是診斷性的時，靜脈注射偶聯到本公開蛋白(結合到感興趣抗原)的輻射不 透性造影劑可有助於鑑定和描繪組織塊(例如軟組織塊)。類似地，造影劑有助於評定軟組織損傷的血管供應。例如，使用造影劑可以幫助描繪腫瘤和相鄰血管結構的關係。
[0483]CT造影劑包括例如碘化造影劑。這些試劑的實例包括碘酞酸鹽、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘醇和碘番酸鹽。也已經報導了釓試劑能夠用作CT造影劑，例如釓噴胺。
[0484]磁共振成像(MRI)是使用高強度磁體和射頻信號來產生圖像的成像模式。在MRI中，將待成像的樣品置於強靜止磁場中並用射頻(RF)輻射的脈衝激發而在樣品中產生淨磁化。然後不同的磁場梯度和其他RF脈衝發揮作用，將空間信息編碼到記錄的信號中。通過收集和分析這些信號，有可能計算出三維圖像，類似於CT圖像，它通常以二維切片來展示。可以將這些切片合併來建立三維畫像。
[0485]用於MRI或MR光譜成像的造影劑與用於其他成像技術中的那些不同。MRI造影劑的實例包括釓螯合物、錳螯合物、鉻螯合物以及鐵顆粒。例如，將本公開的蛋白偶聯到包括選自以下的順磁性金屬的螯合物的化合物上:鈧、鈧、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鑰、釕、鈰、銦、鐠、釹、鉕、釤、銪、釓、鋱、鏑、欽、鉺、銩和鐿。可用於本公開的成像劑的一個另外的實例是基於滷烴的納米顆粒諸如PFOB或其他基於氟的MRI試劑。CT和MRI兩者提供解剖學信息，該信息有助於區別組織邊界和血管結構。
[0486]提供關於細胞水平信息諸如細胞活力的信息的成像模式包括正電子發射斷層攝影術(PET)和單光子發射計算機斷層攝影術(SPECT)。在PET中，患者咽下或注射有發射正電子的放射性物質，當該物質移動通過身體時這些正電子可以被監測。
[0487]PET與SPECT之間的主要區別在於替代正電子發射物質，SPECT使用發射高能光子的放射性示蹤劑。SPECT對於診斷包括冠狀動脈疾病的多種疾病具有價值，並且每年在美國已經進行了大約250萬例SPECT心臟研究。
[0488]對於PET，將本公開的蛋白通常用諸如nC、13N、150、18F、82Rb、62Cu和68Ga的正電子發射體標記。對於SPECT，將本公開的蛋白用諸如99mTC、2(llTl和67Ga、mIn的正電子發射體標記。
[0489]動物和人的非侵入性螢光成像也可提供體內診斷信息並用於廣泛多樣的臨床專業方向。例如，過去多年已經 開發出了多種技術，包括在螢光團的UV激發後的簡單觀察直到使用先進的設備進行複雜的光譜學成像(參見例如Andersson-Engels等人，1997)。本領域已知的用於體內檢測螢光(例如來自螢光團或螢光蛋白)的特定設備或方法包括但不限於體內近紅外突光(參見例如Frangioni, 2003)、Maestro?體內突光成像系統(CambridgeResearch&Instrumentation, Inc.;Woburn, MA)、使用飛點掃描儀的體內突光成像(參見例如 Ramanujam 等人,2001)等。
[0490]用於檢測光學響應的其他方法或設備包括但不限於視覺檢查、CXD照像機、錄像照相機、照相膠片、雷射掃描設備、突光計、光電二極體、量子計數器、落射突光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細胞儀、螢光酶標儀或使用光電倍增管的信號放大。
[0491]在一些實例中，在用於人體中之前使用體外或體內測定法對成像劑進行測試(例如使用本文所述的模型)。
[0492]製品
[0493]本公開還提供了包含本公開蛋白的製品或「試劑盒」。製品可以包括容器和在容器上或與容器相關的標籤或包裝插頁，例如從而提供本公開的蛋白在根據任一實例在本文所述的方法中的使用說明。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包裝等。容器可由諸如玻璃或塑料的多種材料形成。容器容納本公開組合物的蛋白並可以具有無菌入口(例如，容器可以是靜脈注射溶液袋或具有可通過皮下注射針頭刺穿的膠塞的小瓶)。作為另外一種選擇或除此以外，製品還可以包含第二(或第三)容器，該容器容納藥學上可接受的緩衝劑，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格爾氏溶液和葡萄糖溶液。其還可以包括從商業和用戶觀點來看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針和注射器。試劑盒還可以或作為另外一種選擇包括用於檢測本公開的蛋白和/或用於偶聯到本公開的蛋白的試劑。
[0494]在下面的非限制性實施例中將對本公開進行進一步說明。
[0495]實施例1:材料與方法
[0496]1.1突奪Vi和scFv的牛成
[0497]使用Zoller和Smith(1987)說明的方法,加以由Kunkel等人(1987)引入的改進生成了人可變結構域的突變體。為此目的，將編碼所需突變的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的單鏈模板DNA(dU-ssDNA)上，在酶作用下延伸並連接從而形成共價閉環DNA。通過使用ApaLl和Notl位點將編碼單個人輕鏈可變(Vl)結構域(DPK9 (SEQ ID NO:2)或得自阿達木單抗(SEQ ID NO:8)或4D5(SEQ ID NO: 12)的Vl的DNA片段克隆到噬菌體展示載體FdMyc中生成了模板。通過電穿孔將共價閉環DNA轉化到ung+大腸桿菌株TGI中，從而引起未突變dU-ssDNA的優先破壞。通過DNA序列分析確認了構建的突變體的序列。
[0498]為了生成scFv突變體，使用ApaLl和Sail克隆位點將編碼Vh結構域和合成接頭區的DNA片段克隆到相應的VfFdMyc構建體中。通過DNA序列分析確認了構建的突變體的序列。編碼對照scFv的序列如SEQ ID NO:6所示，編碼衍生自阿達木單抗的scFv的序列如SEQ ID NO:10所示，而編碼衍生自4D5的scFv的序列如SEQ ID NO:14所示。
[0499]當\作為可溶性蛋白表達時，N端穀氨醯胺被天冬氨酸取代。當Vh或scFv作為可溶性蛋白表達時，N端穀氨醯胺被穀氨酸取代。
[0500]基於VKl / DPK9生成了人類'結構域的噬菌體展示文庫。使用合成的寡核苷酸介導的多樣化在FdMyc中構建了文庫(K`unkel等人，1987)(胺基酸編號根據Kabat,而核苷酸編碼根據IUPAC-1UB，Cornish-Bowden，1985)。為此，使用編碼位置28、30、31和32的簡併密碼子KMT(Y / A / D / S)的合成寡核苷酸將多樣性引入了 LI。使用編碼(20% Y;17%G；15%S；7%D/A；4%T/P/V/R / I /L；2%ff/F/M/Q/N/H/K/E)的三核苷酸亞磷醯胺寡核苷酸(Virnekas等人，1994)在位置91、92、93、94和96引入了L3多樣性。L2限於種系VKl / DPK9 —致序列(WT)或位置52和53 (52D / 53D)的天冬氨酸。
[0501]1.2聚集抗性的噬菌體ELISA ( 「熱/冷測定」)
[0502]在噬菌體ELISA形式中通過測量熱孵育之後的信號保留對克隆的聚集抗性進行了分析(McCafferty等人,1990 ; Jespers等人,2004)。用碳酸鹽緩衝液(ρΗ9.6)中的蛋白Α、蛋白L或祀抗原將Nunc Maxisorp Immuno板的孔包被過夜。用PBS將板洗漆一次,然後用在PBS中稀釋的約4% (w / v)奶粉(MPBS)封閉。從瓊脂板中挑取單個克隆，然後在補充有約15μ g / ml四環素的2xTY培養基(含約16g / L胰蛋白腖、約IOg / L酵母提取物、約5g / L NaCl、pH7.0)中在約30°C和震蕩下生長過夜。通過離心將細胞移除，通過添加生物素-PEO4-N-羥基琥珀醯亞胺(Pierce ;約50 μ M終濃度)在培養物上清液中直接將噬菌體生物素化。將過量的生物素化試劑用IOOmM TrisHcl ρΗ7.5猝滅。對於熱選擇，首先將上清液在約80°C孵育約10分鐘，然後在約4°C持續約10分鐘。將上清液添加到封閉的ELISA孔中。在用PBS洗滌三次後，使用Extravidin-HRP偶聯物(Sigma)和3，3 ^，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)底物來檢測結合的噬菌體顆粒。通過減去在450nm和650nm處的測量值而計算吸光度。
[0503]在噬菌體ELISA形式中通過測量熱孵育之後的信號保留對克隆針對靶抗原的聚集抗性進行了分析(McCafferty等人，1990 Jespers等人,2004)。用PBS緩衝液中的鏈黴親和素將Nunc Maxisorp Immuno板的孔包被過夜。用PBS將板洗漆一次,然後用在PBS中稀釋的約4% (w / v)奶粉(MPBS)封閉。然後將生物素化的抗原加到板中。從瓊脂板中挑取單個克隆，然後在補充有約15yg / ml四環素的2xTY培養基(含約16g / L胰蛋白腖、約IOg / L酵母提取物、約5g / LNaCl、pH7.0)中在約30°C和震蕩下生長過夜。通過離心將細胞移除。將IOOmM TrisHCl pH7.5加入上清液中。對於熱選擇，首先將上清液在約80°C孵育約10分鐘，然後在約4°C持續約10分鐘。將上清液添加到封閉的ELISA孔中。在用PBS洗滌三次後，使用Extravidin-HRP偶聯物(Sigma)和3，3 ^，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)底物來檢測結合的噬菌體顆粒。通過減去在450nm和650nm處的測量值而計算吸光度。
[0504]1.3Vl結構域的表汰和鈍化
[0505]開展了實驗以確定天然和突變' 的可溶性表達水平。為此，使用Sail和BamHl位點將編碼結構域的DNA片段克隆進表達載體pET12。將質粒轉化進大腸桿菌BL21-Gold (克隆DE3) (Novagen),通過添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG ; ImM的最終濃度)而誘導可溶性蛋白表達。然後使細胞在30°C生長48小時，其中在24小時後執行再次誘導步驟。通過離心移除細胞，將含有表達蛋白的上清液過濾(0.22μπι)。將'結構域的上清液加到rProtein L樹脂(Genscript)中,在4°C孵育過夜。將蛋白L樹脂加到重力柱中,其中讓上清液經過樹脂，然後用PBS洗滌。通過添加0.1M甘氨酸鹽酸pH2.7而洗脫\結構域，然後通過添加0.1M Tris-HCl pH8.0對餾分進行中和。將結構域針對PBS滲析並濃縮。通過SDS-PAGE 在 4-12% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)上評估了蛋白純度。
[0506]1.4泖I定VT結構域的可溶件表汰7k平Domains
[0507]使用蛋白L ELISA測定了各'變體的可溶性表達水平，其中針對相同的純化蛋白的標準曲線測量可溶性結構域的濃度。為此，使新轉化的大腸桿菌BL21-Gold的三個單獨克隆生長，如上所述誘導表達48小時。通過離心移除細胞，通過添加生物素-PE04-N-羥基琥珀醯亞胺(Pierce ;50 μ M的最終濃度)而在培養上清液中將片段直接生物素化。將培養上清液和已知濃度的相同突變體的生物素化純化片段加到用5μ g / ml蛋白L(Sigma)包被過夜並用PBS中的4% (w / V)脫脂奶粉封閉的96孔Maxisorp免疫板(Nunc)。在用PBST洗滌三次後，將結合的抗體片段用Extravidin-HRP偶聯物(Sigma)和TMB底物進行檢測。測量了 450nm(參考650nm)處的吸光度，使用線性回歸分析從標準曲線外推了各樣品的濃度。
[0508]1.5加熱後的尺寸排阻層析和再摺疊能力
[0509]通過尺寸排阻層析測定了加熱後的'洗脫體積和再摺疊復性。為此，將20mMPO4 (pH7.4)中100 μ M的純化Vl變體加熱到85°C維持20min,然後在4°C維持IOmin ;或不進行加熱。將加熱和未加熱的樣品在16，OOOxg下離心lOmin，然後在用PBS平衡的連接到AKTA Purifier(GEHealthcare)的 Superdex_G75 柱(GE Healthcare)上分析。將樣品以0.5ml / min的流速和500 μ I的體積進樣。通過測量加熱樣品的曲線下面積測定了各變體的回收率，表示為未加熱樣品的百分比。
[0510]還通過尺寸排阻層析測量了全IgG分子的洗脫體積。為此，將包含種系Vh結構域DP47 和種系 Vl 結構域 DPK9 (在 CDR-Hl (31-33DED)、CDR_L2 (50, 52-53DDD)或兩個結構域一起(31-33DED / 50, 52-53DDD)中具有天冬氨酸和/或穀氨酸取代)的人IgGl在用PBS平衡的連接到 AKTA 淨化器(GE Healthcare)的 Superdex_S200 柱(GE Healthcare)上純化。將PBS中0.5mg / ml的樣品以100 μ I的體積和0.5ml/min的流速進樣。同樣，通過如上所述的尺寸排阻層析，評估了在CDR-Hl (位置30)、CDR-L2 (位置52)或兩者中包含天冬氨酸取代的4D5的IgG的洗脫體積。
[0511]1.6濁度測暈
[0512]通過在加熱下測量純化片段360nm處的吸光度，進行了含有突變種系VL和scFv片段的溶液的濁度測量。各片段類型的條件如下:種系八突變體以10(^]?處於201111PO4(pH7.4)中，85°C ;scFv突變體以10 μ M處於磷酸鹽緩衝鹽水中，85°C。測量使用光程長度為Icm的QS-24石英比色皿在Varian Cary50Bio紫外-可見光分光光度計(AgilentTechnologies)上進行。
[0513]1.7SK二BR=3細朐結合測定
[0514]在SK-BR-3人乳腺癌細胞系上進行了使用4D5變體作為全IgG的全細胞結合測定。為此，將不同的濃度的在CDR-Hl (位置30)、CDR-L2(位置52)或兩者中含有突變的作為人IgGl的4D5加到細胞(2.5 X IO4個細胞/樣品)中，一式兩份，在冰上保持I小時。在含有1% BSA的PBS中`洗滌後，將二抗抗人IgG-FITC(Sigma)加入，在冰上保持30min。使用FACSCalibur (BD Biosciences)記錄了活細胞群的突光強度,使用FlowJo7.6.5軟體(TreeStar)進行了分析。
[0515]1.8SK-BR-3細朐增葙測定
[0516]將SK-BR-3細胞保持在補充了 10 %胎牛血清(FBS)的RPM1-1640培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。將細胞使用 0.05%胰蛋白酶 / EDTA(Invitrogen)脫離，以2X IO4個細胞/ ml懸浮在完全培養基中。將500 μ I的等分試樣加到48孔細胞培養板(Corning, Lowell, MA)中，讓細胞貼壁30分鐘，然後將4D5IgG變體以10 μ g / ml的最終濃度加入。7天後，將細胞用RPMI培養基(不含FBS)洗滌、脫離(如上所述)並對活細胞計數。將細胞增殖水平計算為在不存在IgG下生長的細胞的百分比。
[0517]1.9親和力測量
[0518]使用表面等離子體共振(BIAcore,GE Healthcare)測量了 4D5scFv變體的結合親和力。將生物素化HER2胞外結構域固定在鏈黴親和素傳感器晶片上。將各scFv變體的稀釋序列以20μ I / min的流速進樣，將曲線擬合到1:1朗繆爾結合模型。
[0519]實施例2:DPK9⑶Rl突變體的聚集抗性
[0520]開展了實驗以研究將單個或多個帶負電的胺基酸引入DPK9的CDRl的作用。如上詳述(參見材料與方法章節)，構建了突變'並針對聚集抗性進行了測試。簡而言之，將噬菌體展示的\加熱到80°C持續10分鐘，之後在4°C下冷卻10分鐘。通過蛋白L ELISA捕獲了正確摺疊的 ' 並將處理樣品的吸光度信號計算為未處理樣品的百分比。
[0521]結果在圖1中示出。總之，將帶負電的胺基酸引入DPK9八的⑶Rl稍微改善了聚集抗性，而在位置24和29的取代賦予了最高水平的聚集抗性。
[0522]實施例3:DPK9FR2 / CDR2突變體的聚集抗性
[0523]然後開展了實驗以研究將單個或多個帶負電的胺基酸引入DPK9的CDR2和相鄰的FR2的作用。
[0524]如上詳述(參見材料與方法章節)，構建了 DPK9Vl結構域的⑶R2和相鄰FR2區域中的單個胺基酸變化和變化的組合，並針對聚集抗性進行了測試。簡而言之，將噬菌體展示的\加熱到80°C持續10分鐘，之後在4°C下冷卻10分鐘。通過蛋白L ELISA捕獲了正確摺疊的Vh並將處理樣品的吸光度信號計算為未處理樣品的百分比。
[0525]結果如圖2所示。總之，在FR2的位置49或⑶R2的位置50、51、52和53的中任一種引入帶負電的胺基酸導致了'結構域相當大的聚集抗性。此外，兩個、三個或四個突變的組合導致了聚集抗性，其中這些組合的許多都實現了幾乎100%的聚集抗性。
[0526]實施例4:聚集抗性可變結構域的文庫的產生
[0527]通過隨機化表面暴露的⑶R殘基、模擬抗體庫中的天然胺基酸分布而產生了'變體的文庫。在Vh的位置32和33或' 的位置52和53引入天冬氨酸明顯增加了文庫的平均聚集抗性(圖3)。觀察到的效應在很大程度上與其他CDR殘基無關，從而突出突變在熱點位置的支配性作用。
[0528]實施例5:溶液中聚集抗性的表徵
[0529]將代表性蛋白變體作為單個結構域表達，以評定它們作為可溶性蛋白的聚集傾向。種系Vh和'結構域在加熱到 它們的熔解溫度之上後快速聚集。在'內(包括位置50、51、52或53)引入單個負電荷適度增加了聚集抗性(圖4)。在選自位置50至53的兩個或更多個位置的電荷進一步增加了聚集抗性(圖4A和B)。引入逐漸增多的負電荷數還改善了抗體可變結構域的一系列其他生物物理特性(表1和圖5)。隨著突變數從無增加至三，VL結構域的表達水平提高2倍。其他常見的度量指標(諸如在凝膠過濾上的洗脫體積和再摺疊復性)也明顯改善(表1和圖5)。
[0530]表1:帶負電的殘基在Vl中的作用。
【權利要求】
1.一種包含抗體輕鏈可變結構域(VL)的分離蛋白，所述可變結構域在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
2.根據權利要求1所述的蛋白，在根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的位置包含兩個或更多個帶負電的胺基酸。
3.—種分離蛋白，包含: (i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的抗體輕鏈可變結構域(VL);以及 (ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的抗體重鏈可變結構域(Vh)， 其中所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
4.根據權利要求3所述的蛋白，包含根據Kabat編號系統的\的殘基49與56之間的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸或包含選自由VH的殘基28、30、31、32、33、35組成的組的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸。
5.—種分離蛋白，包含: (i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸的抗體輕鏈可變結構域(VL);以及 (ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸的抗體重鏈可變結構域(Vh)， 其中所述蛋白能夠特異性結合到抗原。
6.根據權利要求3或4所述的蛋白，其中所述VL在根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。
7.根據權利要求3至6任一項所述的蛋白，其中所述八還在⑶Rl中包含一個或多個帶負電的胺基酸和/或所述Vh還在根據Kabat編號系統的選自由殘基26、39、40、50、52、52a和53組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。
8.根據權利要求1至7任一項所述的分離蛋白，其中所述蛋白能夠以高於10μ M的親和力特異性結合到抗原。
9.根據權利要求1至8任一項所述的蛋白，與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比具有降低的聚集趨勢。
10.根據權利要求1至9任一項所述的蛋白，與不含帶負電的胺基酸的蛋白相比在加熱到至少約60°C後具有降低的聚集趨勢。
11.根據權利要求1至9任一項所述的蛋白，在加熱到至少約60°C後具有特異性結合到抗原的能力。
12.根據權利要求1至11任一項所述的蛋白，在濃縮並任選地稀釋或復原後具有降低的聚集趨勢。
13.根據權利要求1至12任一項所述的蛋白，能夠結合到人類蛋白。
14.根據權利要求1至13任一項所述的蛋白，能夠結合到與人類病狀或其病因相關的蛋白。
15.根據權利要求1至14任一項所述的蛋白，其中所述帶負電的胺基酸為天冬氨酸。
16.根據權利要求1至15任一項所述的蛋白，其為人類的或人源化的或去免疫的或者融合到人類蛋白或其區域。
17.一種包含能夠特異性結合到抗原的修飾抗體輕鏈可變結構域的蛋白，其中所述\包含根據Kabat編號系統選自由殘基49、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置的帶負電的胺基酸，並且其中所述\的未修飾形式不含帶負電的胺基酸。
18.根據權利要求17所述的蛋白，還在位置55包含帶負電的胺基酸。
19.一種包含能夠特異性結合到抗原的修飾抗體輕鏈可變結構域的蛋白，其中所述\包含根據Kabat編號系統在殘基49與56之間的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸，並且其中所述 '的未修飾形式不含所述位置的兩個或更多個帶負電的胺基酸。
20.一種蛋白，包含: (i)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的位置包含帶負電的胺基酸的修飾抗體輕鏈可變結構域(VJ，其中所述\的未修飾形式不在所述位置包含帶負電的胺基酸；以及 (ii)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的修飾抗體重鏈可變結構域(VH)，其中所述％的未修飾形式不在所述位置包含帶負電的胺基酸， 其中所述修飾蛋白能夠特異性結合到抗原。
21.根據權利要求19或20所述的蛋白，在根據Kabat編號系統的選自\的由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。
22.根據權利要求1至21任一項所述的蛋白，其中所述蛋白選自: (i)抗體； (ii)單結構域抗體； (iii)含單鏈Fv(scFv)的蛋白； (iv)雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體； (V)包含(ii)-(iv)中任一種和抗體Fe結構域或其結構域的融合蛋白；以及 (vi)包含(ii)-(iv)中任一種和能夠結合到免疫效應細胞的蛋白的融合蛋白。
23.根據權利要求1至22任一項所述的蛋白，其偶聯到化合物。
24.一種包含根據權利要求1至23任一項所述的蛋白和藥學上可接受的載體的組合物。
25.—種包含多種根據權利要求1至24任一項所述的蛋白的文庫。
26.一種包含多種蛋白的文庫，所述蛋白包含抗體輕鏈可變結構域(VLS)，所述'根據Kabat編號系統在殘基49與56之間的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。
27.根據權利要求26所述的文庫，其中所述'在所述位置的兩個或更多個中包含帶負電的胺基酸。
28.—種包含多種蛋白的文庫，所述蛋白包含抗體輕鏈可變結構域(VLS)和抗體重鏈可變結構域(Vh)，其中所述蛋白包含: (a)在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的一個或多個位置包含至少一個帶負電的胺基酸的以及 (b)在根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸的vH。
29.根據權利要求26至28任一項所述的文庫，其中所述蛋白佔所述文庫的至少30%。
30.一種分離根據權利要求1至22任一項所述的蛋白的方法，所述方法包括將根據權利要求26-28任一項所述的文庫與抗原結合併分離結合到其上的蛋白。
31.一種增強包含抗體輕鏈可變結構域(')的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基49、50、51、52、53和56組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾所述VL。
32.一種增強包含抗體輕鏈可變結構域(')的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括對所述\進行修飾，使得其在根據Kabat編號系統的殘基49與56之間的兩個或更多個位置包含帶負電的胺基酸，其中所述未修飾的蛋白不含所述兩個或更多個帶負電的胺基酸。
33.一種增強包含抗體輕鏈可變結構域(')和抗體重鏈可變結構域(Vh)的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括對所述蛋白進行修飾，使得其包含: (i)根據Kabat編號系統的所述\的殘基49與56之間一個或多個位置的帶負電的胺基酸；以及 (ii)根據Kabat編號系統的選自由所述Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的帶負電的胺基酸， 其中所述蛋白在修飾前在所述 '和所述所述位置中不含帶負電的胺基酸。
34.根據權利要求33所述的方法，包括: (i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的所述\的殘基49與56之間一個或多個位置的胺基酸而修飾所述\ ;以及 (ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的一個或多個位置的胺基酸而修飾所述Vh。
35.一種增強包含抗體輕鏈可變結構域(')和抗體重鏈可變結構域(Vh)的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括對所述蛋白進行修飾，使得其包含: (i)根據Kabat編號系統的所述\的殘基49與56之間兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸；以及 (ii)根據Kabat編號系統的選自由所述Vh的殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置的帶負電的胺基酸， 其中所述蛋白在修飾前在所述 '和所述所述位置中不含帶負電的胺基酸。
36.根據權利要求35所述的方法，包括: (i)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的所述\的殘基49與56之間兩個或更多個位置的胺基酸而修飾所述\;以及 (ii)通過帶負電的胺基酸取代根據Kabat編號系統的選自由殘基28、30、31、32、33和35組成的組的兩個或更多個位置的胺基酸而修飾所述VH。
37 .根據權利要求33至36任一項所述的方法，還包括對所述蛋白進行修飾，使得所述'還在⑶Rl中包含一個或多個帶負電的胺基酸和/或所述VH還在根據Kabat編號系統的選自由殘基26、39、40、50、52、52a和53組成的組的一個或多個位置包含帶負電的胺基酸。
38.根據權利要求1至23任一項所述的蛋白或根據權利要求24所述的組合物在醫學中的用途。
39.一種治療或預防受試者病狀的方法，所述方法包括向對其有需要的受試者施用根據權利要求1至23任一項所述的蛋白或根據權利要求24所述的組合物。
40.一種向細胞遞送化合物的方法，所述方法包括將所述細胞與根據權利要求23所述的蛋白或根據權利要求24所述的組合物接觸，其中所述蛋白偶聯到所述化合物。
41.一種診斷或預測受試者病狀的方法，所述方法包括將得自所述受試者的樣本與根據權利要求1至23任一項所述的蛋白或根據權利要求24所述的組合物接觸使得所述蛋白結合到抗原並形成複合物，以及檢測所述複合物，其中所述複合物的檢測對所述受試者的病狀作出診斷或預測。
42.根據權利要求41所述的方法，包括測定所述複合物的水平，其中所述複合物的水平升高或降低對所述受試者的病狀作出診斷或預測。
43.一種定位或檢測受試者中的抗原的方法，所述方法包括在所述受試者中檢測或定位根據權利要求23所述的蛋白或根據權利要求24所述的組合物，其中所述蛋白結合到所述抗原，並且其中所述蛋白偶聯到可檢測標記。
【文檔編號】A61K39/395GK103619877SQ201280029269
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年4月19日 優先權日:2011年4月21日
【發明者】丹尼爾·克裡斯特, 基普·達吉恩, 羅曼·魯埃 申請人:加文醫學研究所