利用死亡受體配體和cd20抗體的方法

2023-06-08 16:08:36

專利名稱：利用死亡受體配體和cd20抗體的方法
技術領域：
本發明涉及利用死亡受體配體和CD20抗體的方法。更具體的說，本發明涉及將Apo-2配體/TRAIL或死亡受體抗體與CD20抗體聯合用於治療諸如癌症和免疫相關疾病等多種病理紊亂的方法。
背景技術：
本領域已經鑑定了屬於腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多種配體和受體。在這些配體中有腫瘤壞死因子-α(「TNF-α」)、腫瘤壞死因子-β(「TNF-β」或「淋巴毒素-α」)、淋巴毒素-β(「LT-β」)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-1BB配體、LIGHT、Apo-1配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)(參見例如Ashkenazi，Nature Review，2420-430(2002)；Ashkenazi and Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi andDixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages377-411；Locksley et al.，Cell，104487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，853378-3404(1995)；Schmid et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，831881(1986)；Dealtryet al.，Eur.J.Immunol.，17689(1987)；Pitti et al.，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996)；Wiley et al.，Immunity，3673-682(1995)；Browning et al.，Cell，72847-856(1993)；Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；WO97/01633，公開於1997年1月16日；WO 97/25428，公開於1997年7月17日；Marsters et al.，Curr.Biol.，8525-528(1998)；Chicheportiche et al.，Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Hahne et al.，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；WO 98/28426，公開於1998年7月2日；WO 98/46751，公開於1998年10月22日；WO 98/18921，公開於1998年5月7日；Moore et al.，Science，285260-263(1999)；Shu et al.，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；Schneider etal.，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al.，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999))。
由這些TNF家族配體介導的多種細胞應答的誘發通常是通過它們與特定細胞受體結合而開始的。有些但非所有TNF家族配體結合細胞表面「死亡受體」，並由此誘發多種生物學活動以激活胱天蛋白酶或者執行細胞死亡或凋亡途徑的酶(Salvesen et al.，Cell，91443-446(1997))。在迄今為止已經鑑定的TNF受體超家族成員中包括TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也稱作Apo-1或CD95)、DR4(也稱作TRAIL-R1)、DR5(也稱作Apo-2或TRAIL-R2)、DcR1、DcR2、護骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也稱作DR3或TRAMP)(參見例如Ashkenazi，Nature Reviews，2420-430(2002)；Ashkenazi and Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley et al.，Cell，104487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，853378-3404(1995)；Hohman et al.，J.Biol.Chem.，26414927-14934(1989)；Brockhaus et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，873127-3131(1990)；EP 417,563，公開於1991年3月20日；Loetscher et al.，Cell，61351(1990)；Schall et al.，Cell，61361(1990)；Smith et al.，Science，2481019-1023(1990)；Lewis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，882830-2834(1991)；Goodwin et al.，Mol.Cell.Biol.，113020-3026(1991)；Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989)；Mallett et al.，EMBO J.，91063-1068(1990)；Anderson et al.，Nature，390175-179(1997)；Chicheportiche et al.，J.Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Pan et al.，Science，276111-113(1997)；Pan et al.，Science，277815-818(1997)；Sheridan et al.，Science，277818-821(1997)；Degli-Esposti et al.，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；Marsters et al.，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Tsuda et al.，BBRC，234137-142(1997)；Nocentiniet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，946216-6221(1997)；vonBulow et al.，Science，278138-141(1997))。
大多數這些TNF受體家族成員共享細胞表面受體的典型結構，包括胞外區、跨膜區和胞內區，而其它成員則天然發現是缺少跨膜和胞內結構域的可溶性蛋白質。典型TNFR的胞外部分包含從NH2-末端起始的多個富含半胱氨酸結構域(CRD)的重複胺基酸序列樣式。
數年前，將稱作Apo2L或TRAIL的配體鑑定為TNF細胞因子家族的成員(參見例如Wiley et al.，Immunity，3673-682(1995)；Pitti et al.，J.Biol.Chem.，27112697-12690(1996)；WO 97/01633；WO 97/25428；美國專利5,763,223，授權於1998年6月9日；美國專利6,284,236，授權於2001年9月4日)。全長天然序列人Apo2L/TRAIL多肽是281個胺基酸的II型跨膜蛋白質。有些細胞能通過酶促切割多肽的胞外區來生成天然的可溶形式多肽(Mariani et al.，J.Cell.Biol.，137221-229(1997))。對可溶形式Apo2L/TRAIL的晶體學研究揭示了與TNF和其它相關蛋白質結構類似的同三聚體結構(Hymowitz et al.，Molec.Cell，4563-571(1999)；Cha et al.，Immunity，11253-261(1999)；Mongkolsapaya et al.，Nature Structural Biology，61048(1999)；Hymowitz et al.，Biochemistry，39633-644(2000))。但是，與其它TNF家族成員不同，發現Apo2L/TRAIL具有獨特的結構特徵，即三個半胱氨酸殘基(同三聚體中各個亞基的第230位)一起與鋅原子配位，而且鋅結合對於三聚體穩定性和生物學活性來說是重要的(Hymowitz et al.，見上文；Bodmer etal.，J.Biol.Chem.，27520632-20637(2000))。
文獻中已有報導，Apo2L/TRAIL可能在免疫系統的調節中起作用，包括自身免疫病，諸如類風溼性關節炎(參見例如Thomas et al.，J.Immunol.，1612195-2200(1998)；Johnsen et al.，Cytokine，11664-672(1999)；Griffith etal.，J.Exp.Med.，1891343-1353(1999)；Song et al.，J.Exp.Med.，1911095-1103(2000))。
還有報導，可溶形式的Apo2L/TRAIL在多種癌細胞中誘導凋亡，包括結腸、肺、乳房、前列腺、膀胱、腎、卵巢和腦腫瘤，以及黑素瘤、白血病和多發性骨髓瘤(參見例如Wiley et al.，見上文；Pitti et al.，見上文；美國專利6,030,945，授權於2000年2月29日；美國專利6,746,668，授權於2004年6月8日；Rieger et al.，FEBS Letters，427124-128(1998)；Ashkenazi et al.，J.Clin.Invest.，104155-162(1999)；Walczak et al.，Nature Med.，5157-163(1999)；Keane et al.，Cancer Research，59734-741(1999)；Mizutani et al.，Clin.Cancer Res.，52605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，131817-1824(1999)；Yuet al.，Cancer Res.，602384-2389(2000)；Chinnaiyan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，971754-1759(2000))。鼠腫瘤模型的體內研究還表明，單獨使用Apo2L/TRAIL或者與化療或放療聯合能發揮實質性的抗腫瘤作用(參見例如Ashkenazi et al.，見上文；Walzcak et al.，見上文；Gliniak et al.，Cancer Res.，596153-6158(1999)；Chinnaiyan et al.，見上文；Roth et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2651999(1999)；PCT申請US/00/15512；PCT申請US/01/23691)。與許多類型的癌細胞相反，大多數正常人細胞類型表現出對某些重組形式Apo2L/TRAIL誘導的凋亡有抗性(Ashkenazi et al.，見上文；Walzcak et al.，見上文)。Jo等人報導，多組氨酸標記的可溶形式Apo2L/TRAIL在體外在分離的正常人肝細胞中誘導凋亡，非人源的則不然(Jo et al.，Nature Med.，6564-567(2000)；Nagata，Nature Med.，6502-503(2000))。認為，某些重組Apo2L/TRAIL製備物在生物化學特性和生物學活性方面對患病細胞和正常細胞可有所變化，這取決於例如標籤分子的存在與否、鋅含量和三聚體含量百分比(參見Lawrence et al.，Nature Med.，Letter tothe Editor，7383-385(2001)；Qin et al.，Nature Med.，Letter to the Editor，7385-386(2001))。
已經發現Apo2L/TRAIL結合至少五種不同受體。至少兩種結合Apo2L/TRAIL的受體包含功能性胞質死亡結構域。一種這樣的受體稱作「DR4」(或稱作TR4或TRAIL-R1)(Pan et al.，Science，276111-113(1997)；WO 98/32856，公開於1998年7月30日；WO 99/37684，公開於1999年7月29日；WO 00/73349，公開於2000年12月7日；US 6,433,147，授權於2002年8月13日；US 6,461,823，授權於2002年10月8日；US 6,342,383，授權於2002年1月29日)。
另一種這樣的Apo2L/TRAIL受體稱作DR5(或稱作Apo-2、TRAIL-R或TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2、或KILLER)(參見例如Sheridan et al.，Science，277818-821(1997)；Pan et al.，Science，277815-818(1997)；WO 98/51793，公開於1998年11月19日；WO 98/41629，公開於1998年9月24日；Screaton et al.，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak et al.，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu et al.，Nature Genetics，17141-143(1997)；WO 98/35986，公開於1998年8月20日；EP 870,827，公開於1998年10月14日；WO 98/46643，公開於1998年10月22日；WO 99/02653，公開於1999年1月21日；WO 99/09165，公開於1999年2月25日；WO 99/11791，公開於1999年3月11日；US 2002/0072091，公開於2002年8月13日；US2002/0098550，公開於2001年12月7日；US 6,313,269，授權於2001年12月6日；US 2001/0010924，公開於2001年8月2日；US 2003/01255540，公開於2003年7月3日；US 2002/0160446，公開於2002年10月31日；US2002/0048785，公開於2002年4月25日；US 6,342,369，授權於2002年2月；US 6,569,642，授權於2003年5月27日；US 6,072,047，授權於2000年6月6日；US 6,642,358，授權於2003年11月4日；US 6,743,625，授權於2004年6月1日)。像DR4一樣，DR5據報導包含胞質死亡結構域且能夠通過配體結合(或者通過結合諸如模擬配體活性的激動性抗體等分子)發出凋亡信號。Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的複合物的晶體結構描述於Hymowitz et al.，Molecular Cell，4563-571(1999)。
配體結合後，DR4和DR5都能經由稱作FADD/Mort1的含死亡結構域的連接物(adaptor)分子通過募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶-8而獨立引發凋亡(Kischkel et al.，Immunity，12611-620(2000)；Sprick et al.，Immunity，12599-609(2000)；Bodmer et al.，Nature Cell Biol.，2241-243(2000))。
Apo2L/TRAIL據報導還結合那些稱作DcR1、DcR2和OPG的受體，認為這些受體發揮信號傳遞的抑制物而非轉換器的功能(參見例如DCR1(也稱作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Pan et al.，Science，276111-113(1997)；Sheridan et al.，Science，277818-821(1997)；McFarlane et al.，J.Biol.Chem.，27225417-25420(1997)；Schneider et al.，FEBS Letters，416329-334(1997)；Degli-Esposti et al.，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；Mongkolsapaya et al.，J.Immunol.，1603-6(1998))；DCR2(也稱作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters et al.，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Pan et al.，FEBS Letters，42441-45(1998)；Degli-Esposti et al.，Immunity，7813-820(1997))；和OPG(Simonet et al.，見上文))。與DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受體不發出凋亡信號。
文獻中已經報導了某些與DR4和/或DR5受體結合的抗體。例如，針對DR4受體且在某些哺乳動物細胞中具有激動或凋亡活性的抗DR4抗體描述於例如WO 99/37684，公開於1999年7月29日；WO 00/73349，公開於2000年7月12日；WO 03/066661，公開於2003年8月14日。還可參見例如Griffithet al.，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Chuntharapai et al.，J.Immunol.，1664891-4898(2001)；WO 02/097033，公開於2002年12月2日；WO 03/042367，公開於2003年5月22日；WO 03/038043，公開於2003年5月8日；WO03/037913，公開於2003年5月8日。同樣已經描述了某些抗DR5抗體，參見例如WO 98/51793，公開於1998年11月8日；Griffith et al.，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Ichikawa et al.，Nature Med.，7954-960(2001)；Hylander et al.，「An Antibody to DR5(TRAIL-Receptor 2)Suppresses theGrowth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice」，Abstract，2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers，Aug.29-Sept.1，2002，Banff，Alberta，Canada；WO 03/038043，公開於2003年5月8日；WO 03/037913，公開於2003年5月8日。另外，已經描述了某些對DR4和DR5受體都具有交叉反應性的抗體(參見例如美國專利6,252,050，授權於2001年6月26日)。
CD20抗原(也稱作人B淋巴細胞限制分化抗原，Bp35)是位於前B(pre-B)淋巴細胞和成熟B淋巴細胞上、分子量約35kD的疏水性跨膜蛋白質(Valentine et al.，J.Biol.Chem.，264(19)11282-11287(1989)；Einfeld et al.，EMBO J.，7(3)711-717(1988))。該抗原還在超過90％的B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達(Anderson et al.，Blood，63(6)1424-1433(1984))，但在造血幹細胞、原B(pro-B)細胞、正常漿細胞或其它正常組織上沒有發現(Tedder et al.，J.Immunol.，135(2)973-979(1985))。CD20調節細胞周期起始和分化的激活過程的早期步驟(Tedder et al.，見上文)，而且可能發揮鈣離子通道的功能(Tedder et al.，J.Cell.Biochem.，14D195(1990))。假如CD20在B細胞淋巴瘤中表達，則該抗原可用作「靶向」此類淋巴瘤的候選物。
rituximab(利妥昔單抗，RITUXAN)抗體是針對CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體。rituximab就是1998年4月7日授權的美國專利5,736,137(Anderson等人)中稱為「C2B8」的抗體。RITUXAN指明用於治療患有復發性或頑固性低級或濾泡性CD20陽性B細胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用機制的體外研究表明，RITUXAN結合人補體並通過補體依賴性細胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細胞系(Reff et al.，Blood，83(2)435-445(1994)；Cragg and Marlin，Blood，1032738-2743(2004))。另外，它在抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)測定法中具有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標記胸苷摻入測定法中顯示出具有抗增殖效果且直接誘導凋亡，而其它抗CD19和CD20抗體則不然(Maloney et al.，Blood，88(10)637a(1996))。在試驗中還觀察到RITUXAN與化療和毒素之間的協同作用。具體而言，RITUXAN使耐藥性人B細胞淋巴瘤細胞系對多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細胞毒性作用敏感(Demidem et al.CancerChemotherapy Radiopharmaceuticals，12(3)177-186(1997))。體內臨床前研究顯示，RITUXAN從獼猴的外周血、淋巴結和骨髓中消減B細胞，可能是通過補體和細胞介導的過程(Reff et al.，Blood，83(2)435-445(1994))。
發明概述本發明提供了利用死亡受體配體，諸如Apo-2配體/TRAIL多肽或死亡受體抗體，及CD20抗體的方法。本發明的實施方案包括治療癌症的方法，包括使癌細胞暴露於有效量的Apo2L/TRAIL和CD20抗體。任選的是，使癌細胞暴露於有效量的死亡受體抗體諸如激動性DR4抗體或激動性DR5抗體及CD20抗體。任選的是，所述方法中所採用的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的量有效實現治療性協同效果，例如它們的聯合抗癌效果大於在單獨採用Apo2L/TRAIL或抗體作為單一治療劑時所達到的抗癌效果。所述方法可能需要體外使用或體內使用，其中將Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體施用於哺乳動物(患者)。任選的是，在所述方法中，用Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體處理的癌細胞是淋巴瘤細胞。
本發明的其它實施方案包括治療免疫相關疾病的方法，包括對哺乳動物施用有效量的Apo2L/TRAIL和CD20抗體。任選的是，將有效量的死亡受體抗體諸如激動性DR4抗體或激動性DR5抗體及CD20抗體施用於所述哺乳動物。任選的是，所述方法中所採用的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的量有效實現治療性協同效果，例如它們在治療免疫相關疾病中的聯合效果大於在單獨採用Apo2L/TRAIL或抗體作為單一治療劑時所達到的效果。任選的是，在所述方法中，所述免疫相關疾病是類風溼性關節炎或多發性硬化。
本發明的方法包括治療哺乳動物中諸如免疫相關疾病或癌症等紊亂的方法，包括如下步驟從哺乳動物中獲取組織或細胞樣品，對所述組織或細胞檢驗CD20、DR4和/或DR5的表達，並在確定所述組織或細胞樣品表達一種或多種所述受體後，對所述哺乳動物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體。所述方法中用於檢驗一種或多種所述受體表達的步驟可以多種測定法方式進行，包括檢測mRNA表達的測定法和免疫組織化學測定法。
任選的是，本發明的方法包括，在施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受體抗體及CD20抗體之外，還對哺乳動物施用化療劑或放療。
本發明的更多實施方案以舉例方式闡述於以下權利要求中1.處理癌細胞的方法，包括使哺乳動物癌細胞暴露於協同有效量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
2.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含

圖1(SEQ ID NO1)的第1-281位胺基酸或其片段或變體。
3.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ ID NO1)的第114-281位胺基酸。
4.權利要求1的方法，其中所述癌細胞在體內暴露於所述協同效應量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述癌細胞是淋巴瘤細胞。
6.權利要求1的方法，進一步包括使癌細胞暴露於一種或多種生長抑制劑。
7.權利要求1的方法，進一步包括使細胞暴露於放射處理。
8.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽在選自下組的重組宿主細胞中表達CHO細胞、酵母細胞和大腸桿菌。
9.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽與聚乙二醇分子連接。
10.權利要求1的方法，其中所述CD20抗體是單克隆抗體。
11.權利要求10的方法，其中所述CD20抗體是抗體Rituximab。
12.治療免疫相關疾病的方法，包括對哺乳動物施用協同有效量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
13.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ IDNO1)的第1-281位胺基酸或其片段或變體。
14.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ IDNO1)的第114-281位胺基酸。
15.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽在選自下組的重組宿主細胞中表達CHO細胞、酵母細胞和大腸桿菌。
16.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽與聚乙二醇分子連接。
17.權利要求12的方法，其中所述免疫相關疾病是類風溼性關節炎或多發性硬化。
18.權利要求12的方法，其中所述CD20抗體是單克隆抗體。
19.權利要求18的方法，其中所述CD20抗體是抗體Rituximab。
20.權利要求1或12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體是順序施用的。
21.權利要求1或12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體是同時施用的。
附圖簡述圖1A顯示了人Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其衍生的胺基酸序列(SEQ ID NO1)。核苷酸第447位的「N」用於指示該核苷酸鹼基可以是「T」或「G」。
圖2A和2B顯示了全長人DR4cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其衍生的胺基酸序列(SEQ ID NO3)。人DR4的核苷酸序列和胺基酸序列還報導於Pan et al.，Science，276111(1997)。
圖3A顯示了1998年11月19日公開的WO 98/51793中披露的411個胺基酸的人DR5序列(SEQ ID NO5)。本領域知道人DR5的一種轉錄剪接變體。此DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示1998年8月20日公開的WO98/35986中披露的440個胺基酸的人DR5序列(SEQ ID NO6)。
圖4描繪了B淋巴瘤細胞系中Apo2L/TRAIL受體的表達。
圖5描繪了B淋巴瘤細胞系中CD20的表達。
圖6顯示了Apo2L/TRAIL、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響。
圖7顯示了有關Apo2L/TRAIL、RITUXAN或Apo2L/TRAIL加RITUXAN聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響的更多結果。
圖8顯示了Apo2L/TRAIL、RITUXAN或Apo2L/TRAIL加RITUXAN聯合處理對SCID小鼠中生長的皮下預先移植BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物中胱天蛋白酶加工的影響。
圖9顯示了DR5激動性抗體、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響。
圖10顯示了DR5激動性抗體、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中生長的皮下預先移植BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物中胱天蛋白酶加工的影響。
圖11描繪了CD20和Apo2L/TRAIL受體在NHL細胞系中的表達。
圖12顯示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的Ramos RA1腫瘤異種移植物生長的影響。
圖13顯示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或聯合處理對SCID小鼠中預先移植的DOHH-2濾泡淋巴瘤異種移植物生長的影響。
圖14描繪了Apo2L/TRAIL、Rituximab或聯合處理對BJAB細胞的細胞殺傷作用的效果和機制。
圖15顯示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或聯合處理對SCID小鼠中RamosT1腫瘤異種移植物生長的影響。
圖16顯示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或聯合處理對SCID小鼠中BJAB-Luc腫瘤異種移植物的影響。
優選實施方案的詳述除非另有說明，本文所用的所有技術術語、符號及其它科學術語均意圖具有本發明所屬領域技術人員通常所理解的含意。在有些情況中，為了清楚和/或便於參考，本文對具有通常所理解含意的術語給出了定義，而且本文這些定義的內含不應必然解釋為代表了與本領域通常所理解含意的實質差異。本文所描述或參考的技術和流程普遍得到本領域技術人員的充分理解，而且通常利用常規方法得以採用，諸如例如廣泛應用的分子克隆方法，參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y。如果適當，除非另有說明，牽涉使用商品化試劑盒和試劑的流程通常依照製造商規定的方案和/或參數進行。
在描述本發明的方法、試劑盒及其用途之前，應當理解本發明不限於所以變化。還應當理解本文所用術語只是為了描述具體實施方案，並非意圖限制本發明的範圍，只有所附權利要求才對本發明範圍進行了限制。
必須注意的是，在用於本文及所附權利要求時，除非另有明確規定，單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括複數所指物。
在此收入本文提及的所有出版物作為參考，以揭示和描述與所引用出版物有關的方法和/或材料。引用本文所引用的出版物是由於它們是在本申請的提交日之前公開的。憑藉較早的優先權日或發明在前日期，本文的任何文字都不應解釋為承認本發明的發明人沒有資格早於所述出版物公開。此外，實際發表日可能與所顯示的有所不同而需要獨立查證。
I.定義術語「Apo-2配體」、「Apo-2L」、「Apo2L」、「Apo2L/TRAIL」、「Apo-2配體/TRAIL」和「TRAIL」在本文中可互換使用，指包含圖1所示胺基酸序列的胺基酸殘基114-281(含)、殘基95-281(含)、殘基92-281(含)、殘基91-281(含)、殘基41-281(含)、殘基39-281(含)、殘基15-281(含)或殘基1-281(含)的多肽序列，以及上述序列的生物學活性片段、刪除、插入或替代變體。在一個實施方案中，多肽序列包含圖1的殘基114-281。任選的是，多肽序列包含圖1的殘基92-281或殘基91-281。Apo-2L多肽可以由圖1所示天然核苷酸序列編碼。任選的是，編碼殘基Pro119(圖1)的密碼子可以是「CCT」或「CCG」。任選的是，片段或變體具有生物學活性，且與任一上述序列具有至少約80％的胺基酸序列同一性，更優選至少約90％的序列同一性，甚至更優選至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。該定義涵蓋Apo2配體的替代變體，其中其至少一個天然胺基酸用另一種胺基酸諸如丙氨酸殘基替代。任選的替代變體包含一個或多個殘基替代。任選的變體可包含與圖1的天然序列Apo-2配體多肽序列不同的胺基酸序列，且在圖1的殘基位置具有一個或多個如下胺基酸替代S96C；S101C；S111C；R170C；K179C。該定義還涵蓋從Apo-2配體來源分離的或者通過重組或合成方法製備的天然序列Apo-2配體。本發明的Apo-2配體包括1997年1月16日公開的WO 97/01633、1997年7月17日公開的WO 97/25428、1999年7月22日公開的WO 99/36535、2001年1月4日公開的WO 01/00832、2002年2月7日公開的WO 02/09755和2000年12月14日公開的WO00/75191中披露的稱作Apo-2配體或TRAIL的多肽。這些術語通常用於指Apo-2配體的各種形式，包括多肽的單體、二聚體、三聚體、六聚體或稱作寡聚體的形式。除非另有說明，Apo-2L序列中提及的所有胺基酸殘基編號採用依照圖1的編號。例如，「D203」或「Asp203」指圖1提供的序列中第203位的天冬氨酸殘基。
術語「Apo-2配體選擇性變體」在用於本文時指在天然Apo-2配體序列中包含一個或多個胺基酸突變且對DR4受體或DR5受體具有選擇性結合親和力的Apo-2配體多肽。在一個實施方案中，Apo-2配體變體對DR4受體具有選擇性結合親和力且在天然Apo-2配體序列的第189、191、193、199、201或209位中任一位置包含一個或多個胺基酸替代。在另一實施方案中，Apo-2配體變體對DR5受體具有選擇性結合親和力且在天然Apo-2配體序列的第189、191、193、264、266、267或269位中任一位置包含一個或多個胺基酸替代。優選的Apo-2配體選擇性變體包含一個或多個胺基酸突變且呈現出對DR4的結合親和力等於或大於(≥)天然序列Apo-2配體對DR4受體的結合親和力，甚至更優選的是，Apo-2配體變體呈現出對DR5受體的結合親和力小於(＜)天然序列Apo-2配體所呈現的對DR5的結合親和力。當此類Apo-2配體變體對DR4受體的結合親和力與天然序列Apo-2配體相比大致相等(未改變)或較大(提高了)且Apo-2配體變體對DR5受體的結合親和力與天然序列Apo-2配體相比較小或幾乎可忽略時，為了本發明，認為Apo-2配體變體的結合親和力對DR4受體有「選擇性」。本發明的優選DR4選擇性Apo-2配體變體對DR5受體具有至少小10倍的結合親和力(與天然序列Apo-2配體相比)，甚至更優選的是，對DR5受體具有至少小100倍的結合親和力(與天然序列Apo-2配體相比)。可通過本領域知道的ELISA、RIA和/或BIAcore測定法來測定Apo-2配體變體的各種結合親和力並與天然Apo-2L(諸如114-281形式)的結合特性進行比較。本發明的優選DR4選擇性Apo-2配體變體會在至少一種類型的哺乳動物細胞(優選癌細胞)中誘導凋亡，而且此類凋亡活性可通過本領域知道的方法諸如alamar blue或結晶紫測定法來測定。DR4選擇性Apo-2配體變體可具有或不具有對Apo-2L的任何誘餌受體(decoy receptor)的改變的結合親和力，那些誘餌受體在本領域稱作DcR1、DcR2和OPG。
其它優選的Apo-2配體選擇性變體包含一個或多個胺基酸突變且呈現出對DR5的結合親和力等於或大於(≥)天然序列Apo-2配體對DR5受體的結合親和力，甚至更優選的是，此類Apo-2配體變體呈現出對DR4受體的結合親和力小於(＜)天然序列Apo-2配體所呈現的對DR4的結合親和力。當此類Apo-2配體變體對DR5受體的結合親和力與天然序列Apo-2配體相比大致相等(未改變)或較大(提高了)且Apo-2配體變體對DR4受體的結合親和力與天然序列Apo-2配體相比較小或幾乎可忽略時，為了本發明，認為Apo-2配體變體的結合親和力對DR5受體有「選擇性」。本發明的優選DR5選擇性Apo-2配體變體對DR4受體具有至少小10倍的結合親和力(與天然序列Apo-2配體相比)，甚至更優選的是，對DR4受體具有至少小100倍的結合親和力(與天然序列Apo-2配體相比)。可通過本領域知道的ELISA、RIA和/或BIAcore測定法來測定Apo-2配體變體的各種結合親和力並與天然Apo-2L(諸如114-281形式)的結合特性進行比較。本發明的優選DR5選擇性Apo-2配體變體會在至少一種類型的哺乳動物細胞(優選癌細胞)中誘導凋亡，而且此類凋亡活性可通過本領域知道的方法諸如alamar blue或結晶紫測定法來測定。DR5選擇性Apo-2配體變體可具有或不具有對Apo-2L的任何誘餌受體的改變的結合親和力，那些誘餌受體在本領域稱作DcR1、DcR2和OPG。
胺基酸標識可採用胺基酸的單字母符號系統或三字母符號系統，即AspD 天冬氨酸IleI 異亮氨酸ThrT 蘇氨酸 LeuL 亮氨酸SerS 絲氨酸 TyrY 酪氨酸GluE 穀氨酸 PheF 苯丙氨酸ProP 脯氨酸 HisH 組氨酸GlyG 甘氨酸 LysK 賴氨酸AlaA 丙氨酸 ArgR 精氨酸CysC 半胱氨酸TrpW 色氨酸ValV 纈氨酸 GlnQ 穀氨醯胺MetM 甲硫氨酸AsnN 天冬醯胺術語「Apo2L/TRAIL胞外域」或「Apo2L/TRAIL ECD」指基本上不含跨膜域和胞質域的Apo2L/TRAIL形式。通常，ECD具有少於1％的此類跨膜域和胞質域，且優選具有少於0.5％的此類結構域。應當理解，對本發明多肽所鑑定的任何跨膜域是依照本領域常規用於鑑定那種類型的疏水結構域的標準而鑑定的。跨膜域的精確邊界可以變化，但最有可能是最初鑑定的結構域的任一末端不超過約5個胺基酸。在優選的實施方案中，ECD由該多肽的可溶性胞外域序列組成，不含跨膜域和胞質或胞內域(且不與膜結合)。具體的Apo-2L/TRAIL胞外域序列記載於PCT公開號WO 97/01633和WO97/25428。
術語「Apo2L/TRAIL單體」或「Apo2L單體」指Apo2L的胞外域序列的共價鏈。
術語「Apo2L/TRAIL二聚體」或「Apo2L二聚體」指通過二硫鍵以共價連接相連的兩個Apo-2L單體。該術語在用於本文時包括游離存在的Apo2L二聚體和Apo2L三聚體形式內的Apo2L二聚體(即與另一個、第三個Apo2L單體結合)。
術語「Apo2L/TRAIL三聚體」或「Apo2L三聚體」指非共價結合的三個Apo2L單體。
術語「Apo2L/TRAIL聚集體」用於指自結合的較高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL，諸如Apo2L/TRAIL三聚體，它們形成例如六聚體和九聚體形式的Apo2L/TRAIL。可採用本領域知道的方法和測定法(並使用商品化材料)，諸如天然大小排阻HPLC(「SEC」)、使用十二烷基硫酸鈉的變性大小排阻(「SDS-SEC」)、反相HPLC和毛細管電泳來測定Apo2L/TRAIL單體、二聚體或三聚體(或其它聚集體)的存在和數量。
「Apo-2配體受體」包括本領域稱作「DR4」和「DR5」的受體，其多核苷酸和多肽序列分別顯示於圖2和3。Pan等人描述了稱作「DR4」的TNF受體家族成員(Pan et al.，Science，276111-113(1997)；WO 98/32856，公開於1998年7月30日；WO 99/37684，公開於1999年7月29日；WO 00/73349，公開於2000年12月7日；US 6,433,147，授權於2002年8月13日；US 6,461,823，授權於2002年10月8日；US 6,342,383，授權於2002年1月29日)。Sheridan等人(Science，277818-821(1997))和Pan等人(Science，277815-818(1997))描述了Apo2L/TRAIL的另一種受體(還可參見WO 98/51793，公開於1998年11月19日；WO 98/41629，公開於1998年9月24日)。此受體稱作DR5(該受體還可稱作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER；Screaton et al.，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak et al.，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu et al.，Nature Genetics，17141-143(1997)；WO98/35986，公開於1998年8月20日；EP 870,827，公開於1998年10月14日；WO 98/46643，公開於1998年10月22日；WO 99/02653，公開於1999年1月21日；WO 99/09165，公開於1999年2月25日；WO 99/11791，公開於1999年3月11日；US 2002/0072091，公開於2002年8月13日；US 2002/0098550，公開於2001年12月7日；US 6,313,269，授權於2001年12月6日；US2001/0010924，公開於2001年8月2日；US 2003/01255540，公開於2003年7月3日；US 2002/0160446，公開於2002年10月31日；US 2002/0048785，公開於2002年4月25日；US 6,569,642，授權於2003年5月27日；US 6,072,047，授權於2000年6月6日；US 6,642,358，授權於2003年11月4日)。如上所述，Apo-2L的其它受體包括DcR1、DcR2和OPG(參見Sheridan et al.，見上文；Marsters et al.，見上文；Simonet et al.，見上文)。術語「Apo-2L受體」在用於本文時涵蓋天然序列受體和受體變體。這些術語涵蓋在多種哺乳動物包括人中表達的Apo-2L受體。Apo-2L受體可以是內源表達的，如在多種人組織譜系中天然發生的，或者可以是通過重組或合成方法表達的。「天然序列Apo-2L受體」包括與衍生自自然界的Apo-2L受體具有相同胺基酸序列的多肽。因此，天然序列Apo-2L受體可以具有來自任何哺乳動物的天然存在Apo-2L受體的胺基酸序列。此類天然序列Apo-2L受體可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生產。術語「天然序列Apo-2L受體」明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位基因變體。受體變體可包括天然序列Apo-2L受體的片段或刪除突變體。圖3A顯示了1998年11月19日公開的WO 98/51793中披露的411個胺基酸的人DR5序列。本領域知道人DR5的一種轉錄剪接變體。此DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示1998年8月20日公開的WO 98/35986中披露的440個胺基酸的人DR5序列。
「死亡受體抗體」在用於本文時通常指針對腫瘤壞死因子受體超家族中且包含能夠發出凋亡信號的死亡結構域的受體的抗體，這樣的抗體包括DR5抗體和DR4抗體。
「DR5受體抗體」、「DR5抗體」或「抗DR5抗體」以廣義使用，指結合至少一種形式的DR5受體或其胞外域的抗體。任選的是，DR5抗體與異源序列或分子融合或連接。優選的是，異源序列容許或幫助抗體形成更高等級或寡聚複合物。任選的是，DR5抗體結合DR5受體但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR4、DcR1或DcR2)結合或發生交叉反應。任選的是，該抗體是DR5信號活性的激動劑。
任選的是，根據BIAcore結合測定法的測量，本發明的DR5抗體在約0.1nM到約20mM的濃度範圍內結合DR5受體。任選的是，根據BIAcore結合測定法的測量，本發明的DR5抗體呈現出約0.6nM到約18mM的Ic50值。
「DR4受體抗體」、「DR4抗體」或「抗DR4抗體」以廣義使用，指結合至少一種形式的DR4受體或其胞外域的抗體。任選的是，DR4抗體與異源序列或分子融合或連接。優選的是，異源序列允許或幫助抗體形成更高等級或寡聚複合物。任選的是，DR4抗體結合DR4受體但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR5、DcR1或DcR2)結合或發生交叉反應。任選的是，該抗體是DR4信號活性的激動劑。
任選的是，根據BIAcore結合測定法的測量，本發明的DR4抗體在約0.1nM到約20mM的濃度範圍內結合DR4受體。任選的是，根據BIAcore結合測定法的測量，本發明的DR4抗體呈現出約0.6nM到約18mM的Ic50值。
術語「激動劑」以最廣義使用，包括在體外、原位或在體內部分或完全增強、刺激或激活Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一種或多種生物學活性的任何分子。Apo2L/TRAIL結合DR4或DR5的此類生物學活性的例子包括凋亡以及文獻中報導的其它活性。激動劑可以直接或間接方式起作用。例如，激動劑可以在體外、原位或在體內由於其直接結合DR4或DR5從而引起受體活化或信號轉導的結果起作用而部分或完全增強、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學活性。激動劑還可以在體外、原位或在體內由於例如刺激另一種效應分子繼而引起DR4或DR5活化或信號轉導的結果間接起作用而部分或完全增強、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學活性。設想了激動劑可作為間接起作用來增強或提高DR4或DR5活化或活性的增強分子。例如，激動劑可增強哺乳動物中內源Apo-2L的活性。這可通過例如預複合DR4或DR5或者通過穩定各自配體與DR4或DR5受體的複合物(諸如穩定Apo-2L與DR4或DR5之間形成的天然複合物)來實現。
術語「DR4」和「DR4受體」在用於本文時指以下文獻中所描述的全長且可溶性胞外域形式的受體Pan et al.，Science，276111-113(1997)；WO 98/32856 published July 30，1998；US Patent 6,342,363 issued January 29，2002；and WO 99/37684 published July 29，1999。DR4受體的全長胺基酸序列在此提供於圖2中。
術語「DR5」和「DR5受體」在用於本文時指以下文獻中所描述的全長且可溶性胞外域形式的受體Sheridan et al.，Science，277818-821(1997)；Panet al.，Science，277815-818(1997)，US Patent 6,072,047 issued June 6，2000；USPatent 6,342,369；WO 98/51793 published November 19，1998；WO 98/41629published September 24，1998；Screaton et al.，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak et al.，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu et al.，Nature Genetics，17141-143(1997)；WO 98/35986 published August 20，1998；EP870,827published October 14，1998；WO 98/46643 published October 22，1998；WO 99/02653 published January 21，1999；WO 99/09165 published February 25，1999；WO 99/11791 published March 11，1999。DR5受體在本領域還稱為Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER。術語DR5受體在用於本文時包括圖3A中所提供的全長411個胺基酸的多肽和圖3B-C中所提供的全長440個胺基酸的多肽。
術語「多元醇」在用於本文時廣泛的指多羥基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶性聚(亞烷基氧化物)聚合物，而且可具有線性的或分支的鏈。優選的多元醇包括那些在一個或多個羥基位置用化學基團諸如具有1至4個碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亞烷基二醇)，優選聚(乙二醇)(PEG)。然而，本領域技術人員認識到，其它多元醇諸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中關於PEG描述的偶聯技術得以採用。本發明的多元醇包括本領域眾所周知的那些類型以及可公開獲得的那些類型，諸如獲自商業來源。
術語「偶聯(conjugate)」在本文中依照其最廣泛的定義使用，指接合或連接到一起。若分子像接合在一起時起作用或運作，則它們是「偶聯」的。
術語「胞外域」或「ECD」指基本上不含跨膜域和胞質域的配體或受體形式。通常，可溶性ECD具有少於1％的所述跨膜域和胞質域，優選具有少於0.5％的所述結構域。
術語「二價金屬離子」指具有兩個正電荷的金屬離子。用於本發明的二價金屬離子的例子包括但不限於鋅、鈷、鎳、鎘、鎂和錳。可採用的此類金屬的具體形式包括鹽形式(例如藥學上可接受的鹽形式)，諸如上述二價金屬離子的氯化物、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽形式。如本文所述，優選以足以實現例如以下效果的濃度或數量(例如有效量)使用二價金屬離子(1)在需要的一段時間內提高Apo-2L三聚體的貯藏穩定性，(2)提高重組細胞培養或純化方法中Apo-2L三聚體的生產或產量，(3)提高Apo-2L三聚體的溶解度(或者降低聚集)，或(4)增強Apo-2L三聚體形成。
「分離的」，在用於描述本文所公開的各種蛋白質時，指已經鑑定且與/由其天然環境的一種成分分開和/或回收的蛋白質。其天然環境的汙染成分指通常將會干擾該蛋白質的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將蛋白質純化至(1)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或(2)根據使用考馬斯藍或優選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE，達到同質。既然蛋白質的天然環境的至少一種成分不會存在，那麼分離的蛋白質包括重組細胞內的原位蛋白質。然而，分離的蛋白質通常將通過至少一個純化步驟來製備。
「分離的」核酸分子指已經鑑定且與所述核酸在其天然來源中通常相關的至少一種汙染核酸分子分開的核酸分子。分離的Apo-2配體核酸分子不同於在自然界中發現它時的形式或背景。分離的Apo-2配體核酸分子因此與天然細胞中存在的Apo-2配體核酸分子有區別。然而，分離的Apo-2配體核酸分子包括通常表達Apo-2配體的細胞中所包含的Apo-2配體核酸分子，例如所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同於它在天然細胞中的染色體定位。
關於本文所鑑定序列的「百分比(％)胺基酸序列同一性」定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與Apo-2配體序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。可以本領域技術範圍內的多種方式進行序列對比以測定百分比胺基酸序列同一性。本領域技術人員可決定測量序列對比的適宜參數，包括指派對所比較的全長序列獲得最大對比所需的任何算法。為了本發明，可使用序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得百分比胺基酸序列同一性值，ALIGN-2程序由Genentech，Inc.編寫，其原始碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(US Copyright Office，Washington DC，20559)，並以美國版權註冊號TXU510087註冊。公眾可通過Genentech公司(South SanFrancisco，California)得到ALIGN-2程序。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。
術語「控制序列」指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。
若一條核酸與另一條核酸序列處於功能性相互關係中，則它是「可操作連接」的。例如，若前序列或分泌前導序列的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接」意味著相連的DNA序列是相鄰的，且在分泌前導序列的情況中意味著相鄰且處於同一讀碼狀態。然而，增強子不必相鄰。連接可通過在方便的限制性位點處的連接反應來實現。如果沒有此類位點，那麼使用與常規實踐一致的合成寡核苷酸銜接頭或接頭。
「B細胞」是在骨髓中成熟的淋巴細胞，包括幼稚B細胞、記憶B細胞、或效應B細胞(漿細胞)。本文中的B細胞可以是正常的或非惡性的B細胞。
「CD20」抗原是在超過90％來自外周血或淋巴樣器官的B細胞表面上發現的約35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細胞二者上，但在幹細胞上不表達。文獻中CD20的其它名稱包括「B淋巴細胞限制抗原」和「Bp35」。CD20抗原描述於例如Clark et al.，PNAS(USA)821766(1985)。
結合CD20抗原的抗體的例子包括「C2B8」，現在稱作「Rituximab」(「RITUXAN」)(美國專利5,736,137)；釔[90]標記的2B8鼠源抗體，稱作「Y2B8」或「Ibritumomab Tiuxetan」ZEVALIN，可從Idec Pharmaceuticals公司購買(美國專利5,736,137；2B8於1993年6月22日保藏於ATCC，編號HB11388)；鼠源IgG2a「B1」，也稱作「Tositumomab」，任選用131I標記以產生「131I-B1」抗體(碘131 Tositumomab，BEXXARTM)，可從Corixa購買(還可參見美國專利5,595,721)；鼠源單克隆抗體「1F5″(Press et al.，Blood，69(2)584-591(1987))及其變體，包括「框架修補」或人源化1F5(WO 2003/002607，Leung，ATCC保藏物HB-96450)；鼠源2H7和嵌合2H7抗體(美國專利5,677,180)；人源化2H7；HUMAX-CD20TM完全人的、高親和力抗體，靶向B細胞細胞膜中的CD20分子(Genmab，丹麥；參見例如Glennie and van deWinkel，Drug Discovery Today，8503-510(2003)；Cragg et al.，Blood，1011045-1052(2003))；WO 04/035607(Teeling等人)中所列的人單克隆抗體；AME-133TM抗體(Applied Molecular Evolution)；A20抗體或其變體，諸如嵌合或人源化A20抗體(分別是cA20或hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics)；及單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可從國際白細胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得(Valentine等人，《Leukocyte Typing III》，McMichael編，p.440，OxfordUniversity Press，1987)。本文中優選的CD20抗體是嵌合的、人源化的、或人的CD20抗體，更優選rituximab、人源化2H7、嵌合或人源化A20抗體(Immunomedics)、和HUMAX-CD20TM人CD20抗體(Genmab)。
術語「rituximab」或「RITUXAN」在本文中指針對CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137中稱作「C2B8」，包括其保持結合CD20能力的片段。
純粹為了本發明且除非另有說明，「人源化2H7」指人源化CD20抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體在體內有效消減靈長類B細胞，該抗體在其重鏈可變區(VH)中至少包含來自抗人CD20抗體的CDR H3序列和基本上人重鏈亞型III(VHIII)的人共有框架(FR)殘基。
優選的人源化2H7是如下完整抗體或抗體片段，其包含輕鏈可變區序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO7)；和重鏈可變區序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
當人源化2H7抗體是完整抗體時，優選的是，它包含輕鏈胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO9)；和重鏈胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO10)或重鏈胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO11)。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」指由細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨後引起靶細胞溶解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)中第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用於此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公開的。
「人效應細胞」指表達一種或多種FcR並行使效應物功能的白細胞。優選的是，該細胞至少表達FcγRIII並執行ADCC效應物功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優選PBMC和NK細胞。
術語「Fc受體」和「FcR」用於描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是與IgG抗體結合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)和FcγRIIB(「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，區別主要在於其胞質域。活化受體FcγRIIA在其胞質域中包含免疫受體基於酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質域中包含免疫受體基於酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述參見Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。術語「FcR」在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會鑑定的FcR。該術語還包括新生兒受體，FcRn，它負責將母體的IgG轉移給胎兒(Guyer etal.，J.Immunol.117587(1976)；Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。FcR在本文中包括多態性，諸如編碼FcγRIIIa的基因中的遺傳二態性，它導致位於受體結合IgG1的區域中的胺基酸第158位為苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。純合纈氨酸FcγRIIIa(FcγIIIa-158V)已經在體外顯示出相對於純合苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或雜合(FcγIIIa-158F/V)受體具有更高的對人IgG1的親和力且介導提高的ADCC。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」指在存在補體時分子溶解靶物的能力。補體激活途徑是由補體系統第一組分(C1q)結合與關聯抗原複合的分子(如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
術語「抗體」在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)，及抗體片段，只要它們展現所需生物學活性。
「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選包含其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
「天然抗體」通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變區(VH)，接著是多個恆定區。每條輕鏈在一端具有一個可變區(VL)，而另一端是一個恆定區。輕鏈的恆定區與重鏈的第一恆定區排列在一起，而輕鏈的可變區與重鏈的可變區排列在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區之間形成界面。
術語「可變的」指可變區中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用於每種特定抗體針對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性並非均勻分布於抗體的整個可變區。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱作高變區的三個區段。可變區中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各自包含四個FR，它們大多採取β-摺疊構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-摺疊結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恆定區不直接涉及抗體與抗原的結合，但展現多種效應物功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱作「Fab」片段，各自具有一個抗原結合位點，和一個殘餘「Fc」片段，其名稱反映了它易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F(ab′)2片段，它具有兩個抗原結合位點，並且仍能夠交聯抗原。
「Fv」是包含完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區域由緊密、非共價結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的二聚體組成。正是在這種構造中，各個可變區的三個高變區相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了一個抗原結合位點。六個高變區共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或只包含對抗原特異的三個高變區的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，儘管親和力低於完整結合位點。
Fab片段還包含輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區(CH1)。Fab』片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端增加了少數殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab』-SH是本文中對其中恆定區半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab』的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對Fab』片段生成的，在Fab』片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯。
來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」，根據其恆定區胺基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。
根據抗體重鏈恆定區胺基酸序列，可將其歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。將與不同抗體類別對應的重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於一條多肽鏈上。優選的是，該Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結合所需的結構。關於scFv的綜述參見Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。
術語「雙抗體」指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對，並產生兩個抗原結合位點。雙抗體更完整的描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)。
術語「單克隆抗體」在用於本文時指由一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異的，針對單一抗原性位點。另外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優越性體現在它們是通過雜交瘤培養合成的，未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語「單克隆」指示抗體由基本上同質的抗體群獲得的特徵，並不解釋為需要通過任何特定方法來生產抗體。例如，依照本發明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法來製備，或者可通過重組DNA方法來製備(參見例如美國專利4,816,567)。「單克隆抗體」還可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體庫分離。
單克隆抗體在本文中明確包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現所需生物學活性(美國專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或獼猴等)的可變區抗原結合序列和人恆定區序列的「靈長類化(primatized)」抗體(美國專利5,693,780)。
非人(如鼠源)抗體的「人源化」形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區，其中整個或基本上整個高變環對應於非人免疫球蛋白的高變環，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。更多細節參見Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術語「高變區」在用於本文時指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基(例如輕鏈可變區中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或那些來自「高變環」的殘基(例如輕鏈可變區中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。「框架區」或「FR」殘基指本文定義的高變區殘基以外的可變區殘基。
「結合」目的抗原例如CD20或者DR4或DR5的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結合抗原的抗體，使得該抗體可作為治療劑用於靶向表達該抗原的細胞。
為了本發明，「免疫療法」指用抗體治療哺乳動物(優選人類患者)的方法，其中抗體可以是未偶聯的或「裸露的」抗體，或者抗體可以偶聯或融合有異源分子或試劑，諸如一種或多種細胞毒劑，由此產生「免疫偶聯物」。
「分離的」抗體指已經鑑定且與/由其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環境的汙染成分指將會干擾該拮抗劑或抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據Lowry方法的測定，抗體重量超過95％，最優選重量超過99％，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或(3)根據使用考馬斯藍或優選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE，達到同質。既然抗體的天然環境的至少一種成分不會存在，那麼分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來製備。
表述「有效量」指有效預防、改善或治療所討論疾病或狀況的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的量。
術語「免疫抑制劑」在本文中用於輔助療法時指作用於抑制或掩蓋本文所治療哺乳動物的免疫系統的物質。這將包括抑制細胞因子生成、下調或抑制自身抗原表達、或掩蓋MHC抗原的物質。此類藥劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利4,665,077，在此收入其公開內容作為參考)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；硫唑嘌呤(azathioprine)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；溴隱亭(bromocryptine)；達扎唑(danazol)；氨苯碸(dapsone)；戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美國專利4,120,649中所述)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A；類固醇，諸如糖皮質類固醇，例如潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)和氫化可的松(hydrocortisone)；甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羥氯喹(hydroxychloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗幹擾素-γ、-β或-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；泛T(pan-T)抗體，優選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域的可溶性肽(90年7月26日公開的WO 90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕黴素(rapamycin)；T細胞受體(Cohen等人，美國專利5,114,721)；T細胞受體片段(Offner et al.，Science251430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature 341482(1989)；WO91/01133)；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。
術語「細胞毒劑」在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，或其片段。
為了本發明，「協同活性」或「協同作用」或「協同效應」或「協同有效量」意指在採用Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的組合時所觀察到的效果(1)大於單獨(或者個別)使用Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體或CD20抗體時所獲得的效果，且(2)大於Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的效果相加(疊加)總和。這樣的協同作用或協同效應可通過本領域技術人員知道的多種手段來測定。例如，可在檢驗腫瘤細胞數目或腫瘤質量減少/減小的體外或體內測定法形式中觀察到Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和CD20抗體的協同效應。
術語「凋亡」和「凋亡活性」以廣義使用，指哺乳動物中有序或受控形式的細胞死亡，通常伴隨著一種或多種特徵性細胞變化，包括細胞質濃縮、質膜微絨毛喪失、細胞核節段化、染色體DNA降解或線粒體功能喪失。此活性可使用本領域眾所周知的方法來測定和測量，例如通過細胞生存力測定法、FACS分析或DNA電泳、膜聯蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、細胞碎裂和/或膜囊(稱為凋亡小體)形成。測定抗體(例如Rituximab)誘導凋亡的能力的測定法參見例如Shan et al.，Cancer ImmunolImmunther 48673-83(2000)；Pedersen et al.，Blood 991314-9(2002)；Demidem et al.，Cancer Chemotherapy Radiopharmaceuticals 12(3)177-186(1997)。
術語「癌症」、「癌性」和「惡性(腫瘤)」指或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理狀況。癌症的例子包括但不限於癌包括腺癌、淋巴瘤、母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、和白血病。此類癌症的更具體例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、何杰金氏(Hodgkin)和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、成膠質細胞瘤、膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌諸如肝的癌和肝細胞瘤(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(諸如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌諸如腎細胞癌和維爾姆斯氏(Wilms)腫瘤、基細胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食管癌、及各種類型的頭和頸癌。
術語「免疫相關疾病」指哺乳動物中由哺乳動物免疫系統成分引起、介導、或以其它方式促成發病的疾病。還包括刺激或幹預免疫應答對疾病發展具有改善作用的疾病。該術語包括自身免疫病、免疫介導的炎性疾病、非免疫介導的炎性疾病、傳染病和免疫缺陷病。可依照本發明治療的免疫相關和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T細胞介導的，包括系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、幼年型慢性關節炎、脊椎關節病、系統性硬化病(硬皮病)、特發性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sjogren)症候群、系統性血管炎、結節病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細胞減少症、陣發性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少症(特發性血小板減少性紫癜、免疫介導的血小板減少症)、甲狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質性腎炎)、中樞和周圍神經系統的脫髓鞘病諸如多發性硬化病、特發性脫髓鞘多神經病或格-巴二氏(Guillain-Barré)症候群、和慢性炎性脫髓鞘多神經病、肝膽病諸如傳染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病諸如炎性腸病(潰瘍性結腸炎克羅恩氏(Crohn)病)、麩膠敏感性腸病、和惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫性或免疫介導的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、變應性疾病諸如哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎、食物超敏反應和蕁麻疹、肺的免疫學疾病諸如嗜曙紅細胞性肺炎、特發性肺纖維化和超敏感性肺炎、移植相關疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。傳染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、細菌感染、真菌感染、原生動物感染和寄生蟲感染。
「B細胞惡性腫瘤」指牽涉B細胞的惡性腫瘤。例子包括何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴細胞為主型的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；毛細胞白血病；類漿細胞淋巴細胞性淋巴瘤；套細胞淋巴瘤；AIDS或HIV相關淋巴瘤；多發性骨髓瘤；中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；移植後淋巴增殖紊亂(PTLD)；瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症(淋巴漿細胞性淋巴瘤)；黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤；和邊緣區淋巴瘤/白血病。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)包括但不限於低級/濾泡NHL、復發性或頑固性NHL、前線(front line)低級NHL、階段III/IV NHL、化療耐受性NHL、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡NHL、中級瀰漫性NHL、瀰漫性大細胞淋巴瘤、攻擊性(agressive)NHL(包括攻擊性前線NHL和攻擊性復發NHL)、自體幹細胞移植後復發性或頑固性NHL、高級成免疫細胞NHL、高級成淋巴細胞NHL、高級小非分裂細胞NHL、貯積病(bulky disease)NHL等。
「自身免疫病」在本文中指源於且針對個體自身組織的疾病或紊亂或其共分離(co-segregate)或表現或由其導致的狀況。自身免疫性疾病或紊亂的例子包括但不限於關節炎(類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎、和強直性脊柱炎)、銀屑病、皮炎包括特應性皮炎、慢性特發性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解症、系統性硬皮病和硬化症、與炎性腸病(IBD)(克羅恩氏(Crohn)病、潰瘍性結腸炎)有關的應答、和伴有壞疽性膿皮症、結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎、和/或鞏膜外層炎共分離的IBD、呼吸窘迫症候群包括成人型呼吸窘迫症候群(ARDS)、腦膜炎、IgE介導的疾病諸如過敏性和變應性鼻炎、腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen)腦炎、葡萄膜炎、結腸炎諸如微觀結腸炎(microscopic colitis)和膠原性結腸炎、腎小球腎炎(GN)諸如膜性GN、特發性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和快速發展的GN、變應性狀況、溼疹、哮喘、牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應答的狀況、動脈粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細胞粘附缺陷、系統性紅斑狼瘡(SLE)諸如皮膚SLE、狼瘡(包括狼瘡腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫髮)、幼年期發作的糖尿病、多發性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-optical)MS、變應性腦脊髓炎、與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和延遲性超敏感有關的免疫應答、結核病、結節病、肉芽腫病包括韋格納氏(Wegener)肉芽腫病、粒細胞缺乏、血管炎(包括大血管血管炎(包括風溼性多肌痛和巨細胞(高安氏(Takayasu))動脈炎)、中血管血管炎(包括川崎(Kawasaki)病和結節性多動脈炎)、CNS血管炎、和ANCA相關血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或症候群(CSS))、再生障礙性貧血、庫姆斯(Coombs)陽性貧血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)貧血、免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、純紅細胞自身障礙(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒細胞減少症、全血細胞減少症、白細胞減少症、牽涉白細胞滲出的疾病、CNS炎性紊亂、多器官損傷症候群、重症肌無力、抗原-抗體複合物介導的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體症候群、變應性神經炎、貝切特氏(Bechet)病、卡斯爾曼氏(Castleman)症候群、古德帕斯丘氏(Goodpasture)症候群、朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無力症候群、雷諾氏(Reynaud)症候群、斯耶格倫氏(Sjogren)症候群、史-約二氏(Stevens-Johnson)症候群、實體器官移植排斥(包括預處理針對高反應性抗體滴度組、組織中的IgA沉積、和源自腎移植、肝移植、腸移植、心臟移植等的排斥)、移植物抗宿主病(GVHD)、大皰性類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、和黏膜類天皰瘡型天皰瘡)、自身免疫性多內分泌腺病、萊特氏(Reiter)病、僵人(stiff-man)症候群、免疫複合物腎炎、IgM多神經病或IgM介導的神經病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、血小板減少症(例如心肌梗死患者發生的)包括自身免疫性血小板減少症、睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發性甲狀腺功能減退症；自身免疫性內分泌病包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎)、亞急性甲狀腺炎、特發性甲狀腺功能減退症、阿狄森氏(Addison)病、格雷夫斯氏(Graves)病、自身免疫性多腺體症候群(或多腺體內分泌病症候群)、I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)包括兒科IDDM、和席漢氏(Sheehan)症候群；自身免疫性肝炎、淋巴樣間質性肺炎(HIV)、梗阻性細支氣管炎(非移植)較之NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barré)症候群、貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病)、原發性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉(麩質腸病)、頑固性口炎性腹瀉伴有共分離的皰疹樣皮炎、冷球蛋白血症、肌萎縮性側索硬化(ALS；盧格裡克氏(Lou Gehrig)病)、冠狀動脈病、自身免疫性內耳病(AIED)、自身免疫性聽力損失、視性眼陣攣肌陣攣症候群(OMS)、多軟骨炎諸如頑固性多軟骨炎、肺泡蛋白質沉積症、澱粉樣變、巨細胞性肝炎、鞏膜炎、性質未確定/未知的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、周圍神經病、瘤外症候群、通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉紊亂、耳聾、盲、周期性癱瘓、和CNS的通道病；孤獨症、炎性肌病、和病灶性節段性腎小球硬化(FSGS)。
術語「前體藥物」在用於本申請時指與母藥(parent drug)相比對癌細胞的細胞毒性較小且能夠酶促活化或轉變為更具活性母藥形式的藥用活性物質的前體和衍生物形式。參見例如Wilman，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)；Stella et al.，「ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」，Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本發明的前體藥物包括但不限於含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-胺基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含β-內醯胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙醯胺的前體藥物或含任選取代苯乙醯胺的前體藥物、可轉化為更具活性而無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物。可衍生為本發明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子包括但不限於下文描述的那些化療劑。
術語「細胞毒劑」在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。
「化療劑」指可用於治療癌症的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環磷醯胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素γ1I和加利車黴素ωIl(參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴黴素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycins)諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米託坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物鹼類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安絲菌素(ansamitocin)；米託胍腙(mitoguazone)；米託蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米託蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。
該定義還包括作用於調節或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON託瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME核酸)和HER2表達抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。
「生長抑制劑」在用於本文時指在體外或在體內抑制細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑是顯著降低在S期過表達此類基因的細胞的百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處於S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春花生物鹼類(vincas)(長春新鹼(vincristine)和長春鹼(vinblastine))、紫杉醇(taxol)、和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)和博來黴素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉑、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可參見《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為「Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs」，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13頁。
術語「細胞因子」指由一種細胞群釋放的、作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。這類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨醯人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子；血小板衍生生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；幹擾素，諸如幹擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用於本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列細胞因子的生物學活性等效物。
「包裝插頁」用於指通常包括在治療用產品的商品包裝中的說明書，它們包含有關涉及此類治療用產品應用的適應徵、用法、劑量、施用、禁忌症、與該包裝產品聯合的其它治療用產品、和/或警告的信息。
術語「處理」、「治療」和「療法」在用於本文時指治療性處理、預防性處理、和防範性處理。
術語「哺乳動物」在用於本文時指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人、牛、馬、犬和貓。在本發明的一個優選實施方案中，哺乳動物是人。
II.本發明的組合物和方法與TNF配體家族相關的細胞因子，在本文中鑑別為「Apo-2配體」或「TRAIL」的細胞因子已有描述。天然人Apo-2配體的預測成熟胺基酸序列包含281個胺基酸，具有大約32.5kDa的計算分子量。缺少信號序列及存在內部疏水區表明Apo-2配體是II型跨膜蛋白質。可溶性胞外域Apo-2配體多肽也已有描述。參見例如1997年7月17日公開的WO 97/25428。進一步描述了Apo-2L替代變體。丙氨酸掃描技術已經用於鑑定具有生物學活性的各種替代變體分子。具體的Apo-2配體替代變體包括其中至少一個胺基酸用另一種胺基酸諸如丙氨酸殘基替代的那些變體。這些替代變體鑑別為例如「D203A」、「D218A」和「D269A」。此命名法用於鑑別Apo-2配體變體，其中第203、218和/或269位(採用圖1所示編號)的天冬氨酸殘基用丙氨酸殘基替代。任選的是，本發明的Apo-2L變體可包含一個或多個胺基酸替代。任選的是，此類Apo-2L變體將是DR4或DR5受體選擇性變體。
下文描述涉及生成Apo-2配體包括Apo-2配體變體的方法，即培養經含Apo-2配體編碼核酸的載體轉化或轉染的宿主細胞並從細胞培養物中回收所述多肽。
編碼Apo-2配體的DNA可從任何cDNA文庫獲得，所述cDNA文庫是從認為具有Apo-2配體mRNA且以可檢測水平表達它的組織製備的。因此，人Apo-2配體DNA可方便的從以人組織製備的cDNA文庫獲得，諸如WO97/25428中所述的人胎盤cDNA的噬菌體文庫。Apo-2配體編碼基因還可從基因組文庫或通過寡核苷酸合成獲得。
可用為鑑定目的基因或其編碼的蛋白質而設計的探針(諸如針對Apo-2配體的抗體或至少約20-80個鹼基的寡核苷酸)篩選文庫。可使用標準流程用選定探針對cDNA或基因組文庫進行篩選，諸如Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，New York，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中所述。分離編碼Apo-2配體的基因的備選方法是採用PCR方法(Sambrook et al.，見上文；Dieffenbach et al.，PCR PrimerALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)。
Apo-2配體的胺基酸序列片段或變體可通過在Apo-2配體DNA中引入適宜的核苷酸變異或者通過合成期望的Apo-2配體多肽來製備。此類片段或變體代表了圖1為全長Apo-2配體所示胞內區、跨膜區或胞外區或者胺基酸序列內、或者一端或兩端的殘基插入、替代和/或刪除。可進行插入、替代和/或刪除的任意組合以獲得最終的構建物，只要最終的構建物具有例如本文所定義的期望生物學活性，諸如凋亡活性。在一個優選的實施方案中，所述片段或變體與本文為Apo-2配體的胞內域、跨膜域或胞外域或者Apo-2配體的全長序列所鑑定的序列具有至少約80％的胺基酸序列同一性、更優選至少約90％的序列同一性、甚至更優選至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。胺基酸變化還可能改變Apo-2配體的翻譯後加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置或者改變膜錨定特性。
如上所述Apo-2配體序列中的變異可利用美國專利5,364,934中關於保守和非保守突變所列任何技術和指導方針來產生。這些包括寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變。
可採用掃描胺基酸分析沿著連續的序列鑑定一個或多個胺基酸。優選的掃描胺基酸中是相對較小的中性胺基酸。此類胺基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是這一類中的優選掃描胺基酸，因為它消除了β-碳的側鏈且不大可能改變變體的主鏈構象(Cunningham et al.，Science，2441081(1989))。丙氨酸通常還因為它是最常見的胺基酸而成為優選的。此外，在隱藏的和暴露的位置都經常可以找到它(Creighton，《The Proteins》，W.H.Freeman Co.，NY；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976))。
根據其側鏈特性的相似性，胺基酸可如下分組(A.L.Lehninger，《Biochemistry》，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New York，1975)(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電荷、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)鹼性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根據共同的側鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的Asp、Glu；(4)鹼性的His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro；(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。
表1
同樣包括在本發明範圍內的Apo-2配體序列中的變異涉及氨基末端衍生物或修飾形式。此類Apo-2配體序列包括本文所述在多肽序列N末端具有甲硫氨酸或經修飾甲硫氨酸(諸如甲醯甲硫氨醯基或其它受封閉甲硫氨醯基類型)的任何Apo-2配體多肽。
可將編碼天然或變異Apo-2配體的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入可複製載體以便進一步克隆(DNA擴增)或表達。可公開獲得多種載體。載體構件通常包括但不限於如下一種或多種信號序列、複製起點、一種或多種標誌基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列，它們在下文中都有描述。可採用的任選的信號序列、複製起點、標誌基因、增強子元件和轉錄終止子序列是本領域已知的且更為詳細的描述於WO 97/25428。
表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別且與Apo-2配體核酸序列可操作連接的啟動子。啟動子是位於結構基因起始密碼子上遊(5′)(通常在大約100至1000bp內)且控制與其可操作連接的特定核酸序列諸如Apo-2配體核酸序列的轉錄和翻譯的非翻譯調控序列。此類啟動子通常分成兩類，誘導型的和組成性的。誘導型啟動子指響應培養條件的某些變化(如營養物的存在與否或溫度變化)而啟動受其控制的DNA的升高水平轉錄的啟動子。現在，眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源DNA中的啟動子並將分離的啟動子序列插入載體，由此將這些啟動子與Apo-2配體編碼DNA可操作連接。天然Apo-2配體啟動子序列和許多異源啟動子都可用於指導Apo-2配體DNA的擴增和/或表達。
適用於原核和真核宿主的啟動子是本領域已知的，而且更為詳細的描述於WO 97/25428。
用於在大腸桿菌中生成可溶性Apo-2L的優選方法採用誘導型啟動子來調節產物表達。使用可控的誘導型啟動子容許使培養物生長至期望細胞密度，然而誘導產物表達並積聚宿主可能不太耐受的大量產物。
為了表達Apo-2L(114-281形式)，申請者評估了幾種誘導型啟動子系統(T7聚合酶、trp和鹼性磷酸酶(AP))。使用這三種啟動子之一導致從收穫的細胞漿中回收到大量可溶性生物學活性Apo-2L三聚體。因為啟動子調控更緊密及在收穫的細胞漿中達到的細胞密度和滴度更高，所以AP啟動子在這三種測試的誘導型啟動子系統中是優選的。
包含一種或多種上述構件的合適載體的構建採用標準連接技術。將分離的質粒或DNA片段切割、剪裁、並以期望方式重新連接以產生所需質粒。
為了進行分析以證實所構建質粒中的序列正確，可用連接混合物轉化大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31,446)並在適當條件下通過氨苄青黴素或四環素抗性選擇成功的轉化子。從轉化子製備質粒，通過限制性內切核酸酶消化進行分析，和/或使用本領域已知的標準技術進行測序(參見例如Messinget al.，Nucleic Acids Res.，9309(1981)；Maxam et al.，Methods in Enzymology，65499(1980))。
可採用在哺乳動物細胞中提供編碼Apo-2配體的DNA的瞬時表達的表達載體。通常，瞬時表達牽涉使用能夠在宿主細胞中高效複製的表達載體，使得宿主細胞積聚許多拷貝的表達載體並繼而高水平的合成由該表達載體編碼的期望多肽(Sambrook et al.，見上文)。包含合適表達載體和宿主細胞的瞬時表達系統容許方便的正向鑑定(positive identification)由所克隆DNA編碼的多肽，以及對所述多肽快速篩選期望生物學或生理學特性。因此，為了鑑定是生物學活性Apo-2配體的Apo-2配體類似物和變體，瞬時表達系統在本發明中特別有用。
適於修改以在重組脊椎動物細胞培養物中合成Apo-2配體的其它方法、載體和宿主細胞描述於Gething et al.，Nature，293620-625(1981)；Mantei etal.，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060；EP 117,058。
適於克隆或表達本文載體中DNA的宿主細胞包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適於此目的的原核生物包括但不限於真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacteria)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacillus)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公開的DD 266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈黴菌屬(Streptomyces)。優選的是，宿主細胞應分泌最小量的蛋白水解酶。
除了原核生物之外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是適於Apo-2配體編碼載體的克隆或表達宿主。適用於表達糖基化Apo-2配體的宿主細胞衍生自多細胞生物體。所有此類宿主細胞的例子，包括CHO細胞，進一步描述於WO 97/25428。
用上文為Apo-2配體生產而描述的表達或克隆載體轉染和優選轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的營養培養基中培養。
轉染指宿主細胞對表達載體的攝取，無論任何編碼序列事實上是否表達。普通技術人員知道許多轉染方法，例如CaPO4和電穿孔。當宿主細胞內出現此載體運轉的任何跡象時，通常承認轉染是成功的。
轉化指將DNA導入生物體，使得該DNA可複製，或是作為染色體外元件或是通過染色體成分(integrant)。根據所用宿主細胞，使用適於此類細胞的標準技術進行轉化。採用氯化鈣的鈣處理，如Sambrook et al.，見上文中所述，或者電穿孔，通常用於具有堅固細胞壁屏障的原核生物或其它細胞。使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進行的感染用於轉化某些植物細胞，如Shaw et al.，Gene，23315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859中所述。此外，可使用超聲處理轉染植物，如1991年1月10日公開的WO 91/00358中所述。
對於沒有此類細胞壁的哺乳動物細胞，可採用Graham and van der Eb，Virology，52456-457(1978)的磷酸鈣沉澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般情況描述於美國專利4,399,216。對酵母的轉化通常依照Van Solingen etal.，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)的方法進行。然而，還可使用將DNA導入細胞的其它方法，諸如通過核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞融合、或聚陽離子例如polybrene、聚鳥氨酸。關於轉化哺乳動物細胞的各種技術參見Keown et al.，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour et al.，Nature，336348-352(1988)。
用於生產Apo-2配體的原核細胞可在合適的培養基中培養，通常如Sambrook et al.，見上文中所述。可用於培養大腸桿菌的培養基的具體形式進一步描述於下文實施例。用於生產Apo-2配體的哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。
商品化培養基的例子包括Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養基(「MEM」，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(「DMEM」，Sigma)。任何此類培養基都可根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GentamycinTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或相當能源。還可以本領域技術人員知道的適宜濃度包括任何其它必需補充物。培養條件諸如溫度、pH等就是先前為了表達而選擇用於宿主細胞的那些培養條件，而且對於普通技術人員是顯而易見的。
一般而言，用於使哺乳動物細胞培養物的生產力最大化的原理、方案和實用技術可參閱《Mammalian Cell BiotechnologyA Practical Approach》，M.Butler編，IRL出版社，1991。
依照本發明的一個方面，通常在用於培養或發酵宿主細胞的培養基中加入或包含一種或多種二價金屬離子。二價金屬離子優選以足以增強貯藏穩定性、提高溶解度、或幫助以一個或多個鋅離子配位的穩定Apo-2L三聚體形成的濃度水平存在或加入培養基中。可添加的二價金屬離子的量部分取決於培養物中的宿主細胞密度或宿主細胞對此類二價金屬離子的潛在敏感性。當培養物中的宿主細胞密度較高時，提高二價金屬離子的濃度可能是有益的。如果二價金屬離子在宿主細胞表達產物期間或之後加入，那麼可能希望隨著宿主細胞產物表達的增加而調整或提高二價金屬離子濃度。通常認為典型的通常可獲得的細胞培養基中可能存在的痕量水平二價金屬離子可能對於穩定三聚體形成是不足夠的。因此，如本文所述添加更多量的二價金屬離子是優選的。
如果在培養物中的宿主細胞的生長期加入二價金屬離子，那麼優選以不對宿主細胞生長產生不利或消極影響的濃度將二價金屬離子加入培養基中。在搖瓶培養中，觀察到以大於1mM的濃度加入ZnSO4可導致宿主細胞密度降低。本領域技術人員意識到細菌細胞可通過形成金屬離子與細胞基質的複合物而有效鰲合(sequester)金屬離子。因此，在細胞培養中，優選在生長期之後(達到期望宿主細胞密度之後)或恰好在宿主細胞表達產物之前將選定的二價金屬離子加入培養基中。為了保證存在足夠量的二價金屬離子，在產物表達期可向細胞培養基中添加或供給額外的二價金屬離子。
培養基中的二價金屬離子濃度不應超過可能對宿主細胞有害或有毒的濃度。在本發明採用宿主細胞大腸桿菌的方法中，優選培養基中的二價金屬離子濃度不超過約1mM(優選≤1mM)。甚至更優選的是，培養基中的二價金屬離子濃度是約50微摩爾至約250微摩爾。最優選的是，此類方法中使用的二價金屬離子是硫酸鋅。希望以其中金屬離子和Apo-2配體三聚體可以1∶1摩爾比存在的量將二價金屬離子加入細胞培養基中。
二價金屬離子可以任何可接受的形式加入細胞培養基中。例如，可用水製備金屬離子溶液，然後可向培養基中加入或供給二價金屬離子溶液。
可直接測量樣品中的Apo-2L表達，例如以本文提供的序列為基礎，使用適當標記的探針，通過常規的Southern印跡、對mRNA轉錄進行定量的Northern印跡(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))、點印跡(DNA分析)或原位雜交。可採用多種標記物，最常用的是放射性同位素，特別是32P。然而，也可採用其它技術，諸如使用生物素修飾的核苷酸導入多核苷酸中。然後將生物素用作結合親合素或抗體的位點，所述親合素或抗體可用極其多種標記物進行標記，諸如放射性核苷酸、螢光劑或酶。或者，可採用能識別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體。抗體繼而可進行標記，並可進行這樣的測定法，其中使雙鏈體結合到某一表面上，使得在該表面上形成雙鏈體後，可檢測與雙鏈體結合的抗體的存在。或者，可通過免疫學方法來測量基因表達，諸如細胞或組織切片的免疫組織化學染色和細胞培養物或體液的測定法，以對基因產物的表達進行直接定量。關於免疫組織化學染色技術，通常通過脫水和固定來製備細胞樣品，隨後與對所偶聯基因產物特異的經標記抗體進行反應，其中標記物通常是可直觀檢測的，諸如酶標記物、螢光標記物、發光標記物等。
可用於免疫組織化學染色和/或體液樣品測定法的抗體可以是單克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳動物中製備。方便的是，可針對天然Apo-2配體多肽或針對基於本文所提供的DNA序列的合成肽或針對與Apo-2配體DNA融合且編碼特異抗體表位的外源序列製備抗體。
Apo-2配體優選作為分泌多肽從培養液中回收，儘管在沒有分泌信號而直接產生時也可從宿主細胞裂解物中回收。若Apo-2配體是膜結合的，則可使用合適的去汙劑溶液(例如Triton-X 100)將它從膜上釋放下來或者可通過酶促切割釋放它的胞外區。
當在人起源的重組細胞以外的重組細胞中生產Apo-2配體時，該Apo-2配體不含人起源的蛋白質或多肽。然而，通常必需從重組細胞蛋白質或多肽中回收或純化Apo-2配體以獲得就Apo-2配體而言基本上同質的製備物。第一步，可將培養液或裂解物離心以除去微粒狀細胞碎片。然而通過合適的純化流程從汙染性可溶性蛋白質和多肽中純化Apo-2配體，例示性流程如下離子交換柱上的分級分離；乙醇沉澱；反相HPLC；矽土或陽離子交換樹脂諸如DEAE或CM上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱；使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾；滲濾；和蛋白A Sepharose柱以除去汙染物諸如IgG。
在一個優選的實施方案中，可通過親和層析來分離Apo-2配體。其中有殘基已刪除、插入或替代的Apo-2配體片段或變體以與天然Apo-2配體相同的方式回收，考慮由於變異引起的任何實質性的特性變化。例如，Apo-2配體與另一蛋白質或多肽例如細菌或病毒抗原的融合物的製備方便了純化；可使用含有所述抗原之抗體的免疫親和柱吸附所述融合多肽。
蛋白酶抑制劑諸如苯基甲基磺醯氟(PMSF)也可用於抑制純化過程中的蛋白水解性降解作用，而且可包括抗生素來防止外來汙染物的生長。本領域技術人員意識到由於重組細胞培養中表達的Apo-2配體或其變體的特性改變，適於天然Apo-2配體的純化方法可能需要進行修改。
在任何這些純化步驟中，可能希望將回收的Apo-2L暴露於含二價金屬離子的溶液或含一種或多種二價金屬離子的純化材料(諸如層析介質或支持物)。在一個優選的實施方案中，在Apo-2L的回收或純化期間使用二價金屬離子和/或還原劑。任選的是，二價金屬離子和還原劑，諸如DTT或BME，都可在Apo-2L的回收或純化期間使用。認為在回收或純化期間使用二價金屬離子會穩定Apo-2L三聚體或保護細胞培養步驟中形成的Apo-2L三聚體。
下文描述還涉及生成共價附著(以下稱為「偶聯」)有一種或多種化學基團的Apo-2配體的方法。適用於本發明Apo-2L偶聯物的化學基團優選沒有顯著毒性或免疫原性。任選選擇化學基團以生成能在適於貯存的條件下貯存和使用的Apo-2L偶聯物。可與多肽偶聯的多種例示性化學基團是本領域已知的，包括例如碳水化合物，諸如天然存在於糖蛋白上的碳水化合物、多穀氨酸(酯/鹽)、和非蛋白質聚合物諸如多元醇(參閱例如美國專利6,245,901)。
例如，多元醇可與多肽諸如Apo-2L在一種或多種胺基酸殘基處包括賴氨酸殘基偶聯，正如WO 93/00109，見上文中所公開的。所採用的多元醇可以是任何水溶性聚(亞烷基氧化物)聚合物，而且可具有線性鏈或分支鏈。合適的多元醇包括那些在一個或多個羥基位置用化學基團諸如具有1至4個碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亞烷基二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，因此，為了便於描述，餘下討論涉及例示性實施方案，其中所採用的多元醇是PEG且將多元醇與多肽偶聯的過程稱為「PEG化」(pegylation)。然而，本發明技術人員認識到，其它多元醇諸如例如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中關於PEG描述的偶聯技術得以採用。
Apo-2L PEG化中所採用的PEG的平均分子量可有所變化，通常範圍可以是約500至約30,000道爾頓(D)。優選的是，PEG的平均分子量是約1,000至約25,000D，更優選約1,000至約5,000D。在一個實施方案中，使用平均分子量約1,000D的PEG進行PEG化。任選的是，PEG同聚物是未取代的，但是它也可以在烷基的一端取代。優選的是，所述烷基是C1-C4烷基，最優選甲基。PEG製品可商購，通常適用於本發明的那些PEG製品是依照平均分子量出售的非同質製品。例如，商品化PEG(5000)製品通常含有分子量略有變化的分子，通常是±500D。
本發明的Apo-2配體可以是多種形式的，諸如單體形式或三聚體形式(包含三個單體)。任選的是，Apo-2L三聚體是以這樣的方式PEG化的，使得PEG分子與構成三聚體Apo-2L的三個單體中的一個、兩個或每個連接或偶聯。在這樣的一個實施方案中，優選所採用的PEG的平均分子量為約1,000至大約5,000D。還設想了Apo-2L三聚體可以是「部分」PEG化的，即其中構成三聚體的三個單體中只有一個或兩個與PEG連接或偶聯。
本領域知道用於蛋白質PEG化的多種方法。生成與PEG偶聯的蛋白質的具體方法包括美國專利4,179,337、美國專利4,935,465和美國專利5,849,535中記載的方法。通常，蛋白質經由該蛋白質的一個或多個胺基酸殘基與聚合物的末端反應性基團共價鍵合，主要取決於反應條件、聚合物的分子量、等等。具有反應性基團的聚合物在本文中稱作活化的聚合物。反應性基團選擇性的與蛋白質上的游離氨基或其它反應性基團起反應。PEG聚合物可與蛋白質上的氨基或其它反應性基團以隨機或位點特異的方式偶聯。然而，應當理解，為了獲得最佳結果，所選擇反應性基團的類型和數量以及所採用聚合物的類型將取決於所採用的具體蛋白質或蛋白質變體，以避免反應性基團與蛋白質上過多的特別活躍的基團起反應。由於這可能不能完全避免，所以通常推薦每摩爾蛋白質使用約0.1至1000摩爾，優選2至200摩爾活化的聚合物，這取決於蛋白質濃度。最終的每摩爾蛋白質使用的活化聚合物的量是維持最佳活性同時，如果有可能，維持最佳蛋白質循環半衰期的平衡。
還設想了還可使用本領域已知的技術將本文所述Apo2L與亮氨酸拉鏈序列連接或融合。
************************用於生成死亡受體抗體和CD20抗體的方法在本文中也有描述。將用於生成或篩選抗體的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的一部分。或者/另外，可使用在其細胞表面表達抗原的細胞來生成或篩選抗體。可用於生成抗體的其它形式的抗原對本領域技術人員是顯而易見的。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優選通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關抗原與在待免疫的物種中有免疫原性的蛋白質偶聯可能是有用的，例如匙孔血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過將例如100μg或5μg蛋白質或偶聯物(分別用於兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，並將溶液皮內注射於多個部位，由此將動物針對抗原、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。一個月後，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯物初始量的1/5-1/10對動物進行強化。7-14天後，採集動物的血液，並測定血清的抗體滴度。對動物進行強化直到滴度達到穩定。優選的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑偶聯得到的偶聯物進行強化。偶聯物還可在重組細胞培養物中作為蛋白質融合物來製備。同樣，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本上同質的抗體獲得的，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。由此，修飾語「單克隆」表示抗體的特徵，即不是分立的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可以通過最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法來製備，或者可通過重組DNA方法來製備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用於免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然後，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
將如此製備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基優選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤的培養基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質阻止缺乏HGPRT的細胞生長。
優選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持選擇的抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、並對諸如HAT培養基等培養基敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)購得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，以及可從American Type Culture Collection(Manassas，Virginia，USA)購得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。用於生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優選的是，通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。
單克隆抗體的結合親和力可通過例如Munson et al.，Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析來測定。
在鑑定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，所述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，並使用標準方法進行培養(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。適於這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內培養。
可通過常規免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分開。
編碼單克隆抗體的DNA易於通過常規流程分離並測序(例如使用能夠特異性結合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為此類DNA的優選來源。一旦分離，可將DNA置於表達載體中，然後將該表達載體轉染到宿主細胞中，諸如不另外產生免疫球蛋白蛋白質的大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關於編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在另一個實施方案中，可從使用McCafferty et al.，Nature 348552-554(1990)所述技術構建的噬菌體抗體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson etal.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。後續出版物描述了通過鏈改組(Marks et al.，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.212265-2266(1993))，生成高親和力(nM範圍)的人源抗體。由此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替換方法。
還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列。
通常，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恆定區，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變區，產生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點以及對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。
(iii)人源化抗體本領域已經描述了用於將非人抗體人源化的方法。優選的是，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱作「輸入」殘基，它們通常取自「輸入」可變區。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進行(Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))，通過用高變區序列替代相應的人抗體序列。因此，此類「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中本質上少於整個人可變區用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。
用於製備人源化抗體的人可變區的選擇，包括輕鏈和重鏈，對於降低抗原性非常重要。根據所謂的「最適(best-fit)」方法，用嚙齒類抗體可變區序列對已知的人可變區序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(FR)(Sims et al.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞型的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區。同一框架可用於數種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
更為重要的是，抗體在人源化後保持對抗原的高親和力以及其它有利的生物學特性。為了實現這一目的，依照一種優選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的方法來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領域熟練技術人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基並進行組合，從而獲得所需抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力提高。通常，高變區殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。
(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫後生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊後生成人抗體。參見例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.733(1993)；及美國專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))可用於在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區基因全集生成人抗體和抗體片段。根據這種技術，將抗體V區基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，並在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。由此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；有關綜述參見例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571(1993)。V基因區段的數種來源可用於噬菌體展示。Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。可本質上依照Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)所述技術，由未免疫人供體構建V基因全集，並分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利5,565,332和5,573,905。
還可通過體外激活B細胞(參見美國專利5,567,610和5,229,275)來生成人抗體。
(v)抗體片段已經開發了用於生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan et al.，Science 22981(1985))。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，並通過化學方法偶聯形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab′)2片段。用於生成抗體片段的其它技術對熟練從業人員是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。抗體片段還可以是「線性抗體」，例如美國專利5,641,870中描述的抗體。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結合CD20、DR4或DR5受體的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於B細胞。這些抗體擁有B細胞標誌結合臂及結合細胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗幹擾素-α、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可將雙特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)。
用於製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生成基於兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature 305537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩，且產物產量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.103655-3659(1991)中公開了類似的流程。
根據一種不同的方法，將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。融合優選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定區。優選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，並共轉染到合適的宿主生物體中。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導致高產量時或在該比率沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個載體。
在本方法的一個優選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發現這種不對稱結構便於將所需雙特異性複合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開於WO94/04690。關於生成雙特異性抗體的其它細節參見例如Suresh et al.，Methodsin Enzymology 121210(1986)。根據美國專利5,731,168中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，將從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含至少部分CH3抗體恆定區。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大胺基酸側鏈，在第二抗體分子的界面上產生針對大側鏈的相同或相似大小的補償性「空腔」。這提供了較之其它不想要的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異源偶聯」抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體建議用於將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利4,676,980)，和用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法製備異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，並且連同許多交聯技術一起公開於美國專利4,676,980。
文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan et al.，Science 22981(1985)；Shalaby etal.，J.Exp.Med.，175217-225(1992)。
還描述了從重組細胞培養物直接製備和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原，形成單體，然後重新氧化，形成抗體異二聚體。這種方法也可用於生成抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)描述的「雙抗體」技術提供了製備雙特異性抗體片段的替換機制。該片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL區與另一個片段上的互補VL和VH區配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報導了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber etal.，J.Immunol.1525368(1994)。
設想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt et al.，J.Immunol.14760(1991)。WO 01/77342(Miller和Presta)中描述了具有三個或更多抗原結合位點的抗體，在此明確收入作為參考。
任選將本文方法中所使用的或製品中所包含的抗體與細胞毒劑偶聯。
上文已經描述了可用於生成此類抗體-細胞毒劑偶聯物的化療劑。
本文還設想了抗體與一種或多種小分子毒素形成的偶聯物，諸如加利車黴素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢菌毒素和CC1065。在本發明的一個實施方案中，將抗體與一個和多個美登素分子偶聯(例如每個抗體分子偶聯約1個至約10個美登素分子)。例如可將美登素轉變為May-SS-Me，後者可還原為May-SH3並與經修飾抗體反應(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))以產生美登木素生物鹼-抗體偶聯物。
或者，將抗體與一個或多個加利車黴素分子偶聯。加利車黴素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車黴素的結構類似物包括但不限於γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998))。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(neomycin)和單端孢菌毒素(tricothecenes)。還可參見例如1993年10月28日公開的WO 93/21232。
本發明還設想了與具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)偶聯的抗體。
有多种放射性同位素可用於生成放射性偶聯的拮抗劑或抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備抗體和胞毒劑的偶聯物，諸如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞氨基酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己胺-1-羧酸琥珀醯亞氨基酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸二甲基己二醯亞胺酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 2381098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與拮抗劑或抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。接頭可以是便於在細胞中釋放細胞毒性藥物的「可切割接頭」。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))。
或者，可例如通過重組技術或肽合成法來製備包含抗體和胞毒劑的融合蛋白。
還可將本發明的抗體與前體藥物活化酶偶聯，後者將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉變為活性抗癌藥。參見例如WO 88/07378和美國專利4,975,278。
此類偶聯物的酶成分包括能夠以這樣一種方式作用於前體藥物從而將其轉變為更具活性的細胞毒性形式的任何酶。
可用於本發明方法的酶包括但不限於可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉變為游離藥物的鹼性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉變為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉變為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉變為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可轉化含D-胺基酸替代的前體藥物的D-丙氨醯羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉變為游離藥物的碳水化合物切割酶類，諸如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可將β-內醯胺衍生的藥物轉變為游離藥物的β-內醯胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙醯基或苯乙醯基衍生的藥物轉變成游離藥物的青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗體，本領域也稱作「抗體酶」，將本發明的前體藥物轉變為游離活性藥物(參見例如Massey，Nature 328457-458(1987))。可如本文所述製備抗體-抗體酶偶聯物，用於將抗體酶投遞至腫瘤細胞群。
可通過本領域眾所周知的技術將本發明的酶與抗體共價結合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯劑。或者，可使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建包含與本發明酶的至少功能活性部分連接的抗體的至少抗原結合區的融合蛋白(參見例如Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984))。
本文還設想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5,739,277中所述將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用於本文時，術語「補救受體結合表位」指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區中負責提高IgG分子體內血清半衰期的表位。或者/另外，可通過改變抗體Fc區胺基酸序列以生成具有改變的FcRn結合的變體來提高或降低血清半衰期。WO00/42072(Presta，L.)中描述了具有改變的FcRn結合和/或血清半衰期的抗體。
*************************************本發明還提供了包含Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體和/或CD20抗體的配製劑。認為此類配製劑特別適於貯存以及治療性施用。所述配製劑可通過已知技術來製備。例如，可通過凝膠過濾柱上的緩衝液交換來製備所述配製劑。
通常，配製劑中使用適當量的可接受鹽或載體使得配製劑等滲。藥學可接受載體的例子包括鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。配製劑的pH優選約6至約9，更優選約7至約7.5。對於本領域技術人員顯而易見的是，根據例如施用路徑及Apo-2配體、死亡受體抗體和/或CD20抗體的濃度，某些載體可能是更優選的。
可如下製備治療用配製劑，即將具有期望純度的所需分子與任選的載體、賦形劑或穩定劑混合(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以凍幹劑型、水溶液或水懸浮液的形式貯存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑優選在所採用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩衝劑，諸如Tris、HEPES、PIPES、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此類載體的其它例子包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質諸如人血清清蛋白、緩衝物質諸如甘氨酸、山犁酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽、或電解質諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、矽膠、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮和基於纖維素的物質。用於局部的或基於凝膠的形式的載體包括多糖諸如羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、和木蠟醇。對於所有施用，適當使用常規貯存(depot)形式。此類形式包括例如微膠囊、納米膠囊、脂質體、硬膏劑、吸入形式、鼻腔噴霧、舌下片劑、和持續釋放製劑。
將用於體內施用的製劑應當是無菌的。這可容易的通過在凍幹和重建之前或之後經無菌濾膜過濾來實現。所述配製劑可以凍幹形式或以溶液貯存，如果系統施用的話。如果是凍幹形式，它通常聯合其它成分一起配製，在使用時用適當的稀釋劑重建。液體配製劑的例子是裝在單劑藥瓶中用於皮下注射的無菌、清澈、無色、無防腐處理(unpreserved)的溶液。
治療用配製劑通常置於具有無菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶。配製劑優選以重複的靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉內(i.m.)注射或灌輸，或者作為適於鼻內或肺內投遞的氣霧劑劑型(關於肺內投遞參閱例如EP 257,956)來施用。
Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和CD20抗體還可以持續釋放製劑的形式施用。持續釋放製劑的合適例子包括含有蛋白質的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，如Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982)所述，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919、EP 58,481)、L-穀氨酸和γ-乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22547-556(1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer et al.，見上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
本文所述Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體和CD20抗體可用於各種治療應用。在這些應用中有治療癌症和免疫相關疾病的方法。本領域技術人員可對哺乳動物中本文所述各種病理狀況進行診斷。本領域可得到容許例如診斷或檢測哺乳動物中的癌症或免疫相關疾病的診斷技術。例如，可通過以下技術來鑑定癌症，包括但不限於觸診、血液分析、x-射線、NMR等等。免疫相關疾病也很容易鑑定。在系統性紅斑狼瘡中，疾病的重要媒介是產生了針對自身蛋白質/組織的自身反應性抗體並隨後產生了免疫介導的炎症。在臨床上多種器官和系統受到影響，包括腎、肺、肌骨骼系統、黏膜與皮膚、眼、中樞神經系統、心血管系統、胃腸道、骨髓和血液。類風溼性關節炎(RA)是主要牽涉多個關節的滑膜且導致關節軟骨損傷的慢性系統性自身免疫性炎性疾病。發病機理是T淋巴細胞依賴性的，且與類風溼因子，針對自身IgG的自身抗體的產生有關，導致免疫複合物的形成並在關節液和血液中達到高水平。關節中的這些複合物可誘導淋巴細胞和單核細胞顯著滲透進入滑膜及隨後顯著的滑液改變；關節間隙/關節液，如果受到相似細胞的滲透及添加了眾多嗜中性粒細胞(the joint space/fluid if infiltrated by similar cells with theaddition of numerous neutrophils)。受影響的組織主要是關節，通常是對稱模式。然而，還有關節外疾病以兩種主要形式出現。一種形式是關節外損傷的發展，伴隨著正在發展的進行性關節病和典型的肺纖維化損傷、脈管炎和皮膚潰瘍。第二種形式的關節外疾病是在RA疾病進程晚期發生的所謂費爾提氏(Felty)症候群，有時在關節病沉寂後，牽涉嗜中性白血球減少、血小板減少和脾大的出現。這可伴隨著多個器官中的脈管炎以及梗塞、皮膚潰瘍和壞疽的形成。患者常常還在覆蓋受影響關節的皮下組織中形成類風溼結節；節結晚期具有由混合的炎性細胞滲入物環繞的壞死中心。RA中可能發生的其它表現包括心包炎、胸膜炎、冠狀動脈炎、伴有肺纖維化的間質性肺炎、乾燥性角膜結膜炎和類風溼結節。
Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和CD20抗體可依照已知方法施用，諸如靜脈內施用像推注或一段時間的持續灌輸，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入路徑。任選的是，可使用各種商品化裝置通過微型泵灌輸進行施用。
施用Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和CD20抗體的有效劑量和進度表可憑經驗決定，而且做出這樣的決定在本領域技術範圍內。可採用單個劑量或多個劑量。目前認為單獨使用Apo2L/TRAIL的有效劑量或數量的範圍可以是每天約1μg/kg至約100mg/kg體重或更多。可以本領域已知的方式進行劑量的物種間定標，例如可參閱Mordenti et al.，Pharmaceut.Res.，81351(1991)。
在採用體內施用Apo2L/TRAIL時，正常劑量的範圍可以是每天約10ng/kg至高達100mg/kg哺乳動物體重或更多，優選約1μg/kg/天至10mg/kg/天，取決於施用路徑。文獻中提供了有關具體劑量和投遞方法的指導；參閱例如美國專利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。預期不同配製劑將對不同治療用化合物和不同紊亂有效，即例如靶向一種器官或組織的施藥可能必須以不同於另一器官或組織的方式投遞。本領域技術人員將理解，必須施用的Apo2L/TRAIL劑量將根據例如將接受Apo2L/TRAIL的哺乳動物、施用路徑、和正施用於該哺乳動物的其它藥品或療法而變化。
CD20抗體可以是未與細胞毒劑偶聯的抗體，諸如Rituximab或人源化2H7。未綴合抗體的合適劑量例如在約20mg/m2至約1000mg/m2的範圍內。在一個實施方案中，所述抗體的劑量不同於目前所推薦的Rituximab劑量。CD20抗體的例示性劑量方案包括375mg/m2每周一次×4或8；或者1000mg×2(例如在第1天和第15天)。
設想了可在所述方法中採用另外的療法。所述一種或多種其它療法可包括但不限於施行本領域已知且具體在上文章節I中進一步定義的放射療法、細胞因子、生長抑制劑、化療劑、細胞毒劑、酪氨酸激酶抑制劑、ras法呢基轉移酶抑制劑、血管發生抑制劑和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。
例示性治療用抗體包括抗HER2抗體，包括rhuMAb 4D5(HERCEPTIN)(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992)；美國專利5,725,856)；抗IL-8(St John et al.，Chest，103932(1993)；國際公開號WO95/23865)；抗VEGF抗體，包括人源化的和/或親和力成熟的抗VEGF抗體，諸如人源化抗VEGF抗體huA4.6.1 AVASTIN(Kim et al.，Growth Factors，753-64(1992)；國際公開號WO 96/30046；和1998年10月15日公開的WO98/45331)；抗PSCA抗體(WO 01/40309)；抗CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO 00/75348)；抗CD11a抗體，包括RaptivaTM(美國專利5,622,700；WO 98/23761；Steppe et al.，Transplant Intl.43-7(1991)；及Hourmant et al.，Transplantation 58377-380(1994))；抗IgE抗體(Presta et al.，J.Immunol.1512623-2632(1993)；國際公開號WO 95/19181；1998年2月3日授權的美國專利5,714,338；1992年2月25日授權的美國專利5,091,313；1993年3月4日公開的WO 93/04173；1998年6月30日提交的國際申請PCT/US98/13410；美國專利5,714,338)；抗CD18抗體(1997年4月22日授權的美國專利5,622,700；或1997年7月31日公開的WO 97/26912)；抗Apo-2受體抗體抗體(1998年11月19日公開的WO 98/51793)；抗TNF-α抗體，包括cA2(REMICADE)、CDP571和MAK-195(參閱1997年9月30日授權的美國專利5,672,347；Lorenz et al.J.Immunol.156(4)1646-1653(1996)；及Dhainaut et al.Crit.CareMed.23(9)1461-1469(1995))；抗組織因子(TF)抗體(1994年11月9日授權的歐洲專利0 420 937 B1)；抗人α4-β7整聯蛋白抗體(1998年2月19日公開的WO 98/06248)；抗EGFR抗體(如1996年12月19日公開的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗體)；抗CD3抗體，諸如OKT3(1985年5月7日授權的美國專利4,515,893)；抗CD25或抗Tac抗體，諸如CHI-621(SIMULECT)和ZENAPAX(參閱1997年12月2日授權的美國專利5,693,762)；抗CD4抗體，諸如cM-7412抗體(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1)52-56(1996))；抗CD52抗體，諸如CAMPATH-1H(Riechmann et al.Nature 332323-337(1988))；抗Fc受體抗體，諸如針對Fc_RI的M22抗體，見Graziano et al.J.Immunol.155(10)4996-5002(1995)；抗癌胚抗原(CEA)抗體，諸如hMN-14(Sharkey etal.Cancer Res.55(23 Suppl)5935s-5945s(1995)；針對乳房上皮細胞的抗體，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23)5852s-5856s(1995)；及Richman et al.Cancer Res.55(23 Supp)5916s-5920s(1995))；結合結腸癌細胞的抗體，諸如C242(Litton et al.Eur J.Immunol.26(1)1-9(1996))；抗CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis et al.J.Immunol.155(2)925-937(1995))；抗CD33抗體，諸如Hu M195(Jurcic et al.Cancer Res 55(23 Suppl)5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771；抗CD22抗體，諸如LL2或LymphoCide(Juweid et al.Cancer Res 55(23 Suppl)5899s-5907s(1995)；抗EpCAM抗體，諸如17-1A(PANOREX)；抗GpIIb/IIIa抗體，諸如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO)；抗RSV抗體，諸如MEDI-493(SYNAGIS)；抗CMV抗體，諸如PROTOVIR；抗HIV抗體，諸如PRO542；抗肝炎抗體，諸如抗Hep B抗體OSTAVIR；抗CA 125抗體OvaRex；抗獨特型GD3表位抗體BEC2；抗.v.3抗體VITAXIN；抗人腎細胞癌抗體，諸如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗體(3622W94)；抗人結腸直腸腫瘤抗體(A33)；針對GD3神經節苷脂的抗人黑素瘤抗體R24；抗人鱗狀細胞癌(SF-25)；及抗人白細胞抗原(HLA)抗體，諸如Smart ID10和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。
化療劑的製備和劑量給藥方案可依照製造商的說明書進行，或者由技術人員憑經驗決定。此類化學療法的準備和劑量給藥方案也可參閱《Chemotherapy Service》，M.C.Perry編，Williams Wilkins，Baltimore，MD，1992。化療劑可在施用Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和/或CD20抗體之前或之後施用，或者可同時給藥。
有時，額外施用一種或多種細胞因子或生長抑制劑可能是有益的。
Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和CD20抗體(及一種或多種其它療法)可同時或順序施用。施用後，可分析體外處理細胞。在體內處理的情況中，可用技術人員眾所周知的多種方式監測接受處理的哺乳動物。例如，可對癌細胞進行病理學檢查以測定壞死情況，或者可對血清分析免疫系統應答。
對於RA和其它自身免疫病，Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和/或CD20抗體可與如下藥劑聯合上文定義部分所列舉的任何一種或多種免疫抑制劑、化療劑和/或細胞因子；任何一種或多種減輕疾病的抗風溼藥(DMARD)，諸如羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨喋呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青黴胺、金(口服)、金(肌肉內)、米諾環素(minocycline)、環孢菌素(cyclosporine)、葡萄球菌蛋白A免疫吸附；靜脈內免疫球蛋白(IVIG)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；糖皮質激素(例如經由關節注射)；皮質類固醇(例如甲潑尼龍(methylprednisolone)和/或潑尼松(prednisone))；葉酸；抗腫瘤壞死因子(TNF)抗體，例如etanercept/ENBRELTM、infliximab/REMICADETM、D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech)；IL-1R拮抗劑(例如Kineret)；IL-10拮抗劑(例如Ilodecakin)；血液凝結調質(例如WinRho)；IL-6拮抗劑/抗TNF(CBP 1011)；CD40拮抗劑(例如IDEC 131)；Ig-Fc受體拮抗劑(MDX33)；免疫調節物(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn)；抗CD5抗體(例如H5g1.1)；巨噬細胞抑制劑(例如MDX 33)；共刺激封閉劑(例如BMS 188667或Tolerimab)；補體抑制劑(例如h5G1.1、3E10或抗衰變加速因子(DAF)抗體)；或IL-2拮抗劑(zxSMART)。
對於例如B細胞惡性腫瘤，Apo2L/TRAIL、死亡受體抗體、和/或CD20抗體可與如下藥劑聯合化療劑；細胞因子，例如淋巴因子諸如IL-2、IL-12或幹擾素諸如幹擾素α-2a；其它抗體，例如放射性標記抗體，諸如ibritumomabtiuxetan(ZEVALIN)、碘I131tositumomab(BEXXARTM)、131I Lym-1(ONCOLYMTM)、90Y-LYMPHOCIDETM；抗CD52抗體，諸如alemtuzumab(CAMPATH-1HTM)，抗HLA-DR-β抗體，諸如apolizumab，抗CD80抗體(例如IDEC-114)，epratuzumab，Hu1D10(SMART 1D10TM)，CD19抗體，CD40抗體或CD22抗體；免疫調節劑(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn)；血管發生抑制劑(例如抗血管內皮生長因子(VEGF)抗體，諸如AVASTINTM或沙利度胺(thalidomide))；獨特型疫苗(EPOCH)；ONCO-TCSTM；HSPPC-96(ONCOPHAGETM)；脂質體療法(例如檸檬酸柔紅黴素(daunorubicin)脂質體)，等等。
在本發明的另一個實施方案中，提供了包含可用於治療上文所述癌症或免疫相關疾病的物質的製品。一方面，該製品包括(a)裝有CD20抗體的容器(優選裝有該抗體和藥學可接受載體或稀釋劑的容器)；(b)裝有Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的容器(優選裝有Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體和藥學可接受載體或稀釋劑的容器)；和(c)附有在患者中治療癌症或免疫相關疾病的說明書的包裝插頁，其中所述說明書指出對患者施用一定量的CD20抗體和Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體以在疾病的治療中有效提供協同作用。
在所有這些方面，所述包裝插頁貼在所述容器上或與其相關。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各種材料諸如玻璃或塑料製成。該容器裝有有效治療癌症或免疫相關疾病的組合物，可具有無菌存取口(例如該容器可以是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。所述組合物中的至少一種活性劑是CD20抗體、Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體。所述標籤或包裝插頁表明該組合物用於在符合治療條件的患者或受試者中治療癌症或免疫相關疾病，所述治療遵循關於所提供的抗體和任何其它藥物的劑量給藥數量和間隔的具體指示。該製品還可包括另外的容器，其中裝有藥學可接受的稀釋緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。該製品還可包括商業和使用者立場上所需的其它物質，包括其它緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
下文實施例只用於例示目的，並非意圖以任何方式限制本發明的範圍。在此完整收入本說明書中引用的所有專利和參考文獻作為參考。
實施例除非另有說明，實施例中提及的商品化試劑依照製造商的說明書使用。下文實施例和整篇說明書中所鑑定的那些細胞的來源ATCC指美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)。
實施例1B淋巴瘤細胞系中Apo2L/TRAIL受體表達的分析為了檢驗人淋巴瘤細胞系中Apo2L/TRAIL受體(DR4、DR5、DcR1和DcR2)的細胞表面表達，使用對DR4(mAb 4H6.17.8；ATCC HB-12455)、DR5(mAb 3H3.14.5；HB-12534)、DcR1(mAb 6G9；Genentech，Inc.)或DcR2(mAb1G9，Genentech，Inc.)特異的單克隆抗體通過FACS分析B淋巴瘤細胞系Ramos、Daudi、Raji和BJAB(ATCC)。對於Ramos細胞，進行了兩次分析Ramos、Daudi、Raji和BJAB(ATCC)。對於Ramos細胞，進行了兩次分析以保證再現性(RAMOS A和B)。
如圖4所示，DR4和DR5在所有四種細胞系中以顯著水平表達(平均螢光變化大約0.5-1.7個單位)，而DcR1和DcR2則以較低或極小水平表達(平均螢光變化大約0-0.3個單位)。
實施例2B淋巴瘤細胞系中CD20表達的分析為了檢驗人淋巴瘤細胞系中CD20的細胞表面表達，使用對CD20特異的單克隆抗體(RITUXAN，Genentech，Inc.)通過FACS分析B淋巴瘤細胞系Ramos、Daudi、Raji和BJAB(ATCC)。對於Ramos細胞，進行了兩次分析以保證再現性(RAMOS A和B)。
如圖5所示，所有四種細胞系都表達高水平的CD20，表現為5-15個單位的平均螢光變化。
實施例3Apo2L/TRAIL、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響給SCID小鼠皮下注射人B細胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤細胞(ATCC)(每隻小鼠注射2×107個細胞)，並使腫瘤生長至約200mm3。然後將小鼠分成4個研究組(每組8隻小鼠)，並如下處理兩周內每周五劑(即第0-4天和第7-11天)腹膜內(IP)媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02％Tween 20 pH＝7.2)、Apo2L/TRAIL(圖1的胺基酸第114-281位)(60mg/kg)、或兩周內每周一劑(即第0天和第7天)IP RITUXAN(4mg/kg，Genentech，Inc.)、或者後兩種Apo2L/TRAIL和RITUXAN方案的組合(圖6)。
用媒介物處理的小鼠中腫瘤生長迅速，而單一藥劑Apo2L/TRAIL或RITUXAN處理則顯著延緩腫瘤生長。Apo2L/TRAIL組中的一隻小鼠顯示出腫瘤完全消融，留下7/8的腫瘤發生率(TI)。RITUXAN處理未消融任何腫瘤，但顯示出更長時間的效果。重要的是，Apo2L/TRAIL和RITUXAN聯合處理在所有小鼠中都引起腫瘤體積顯著縮小，在至少28天內，8隻小鼠中有5隻顯示出腫瘤完全消融且3/8顯示出腫瘤生長極低。這些結果表明，Apo2L/TRAIL和RITUXAN可針對淋巴瘤異種移植物發揮協同抗腫瘤作用。
實施例4Apo2L/TRAIL、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中生長的皮下預先移植BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響進行了與實施例3所述相似的研究。給SCID小鼠皮下注射人B細胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤細胞(ATCC)(每隻小鼠注射2×107個細胞)，並使腫瘤生長至約200mm3。然後將小鼠分成4個研究組(每組8隻小鼠)，並如下處理兩周內每周五劑(即第0-4天和第7-11天)腹膜內(IP)媒介物(0.5MArg-琥珀酸/20mM Tris/0.02％ Tween 20 pH＝7.2)、Apo2L/TRAIL(「Apo2L.0」；圖1的胺基酸第114-281位)(60mg/kg)、或兩周內每周一劑(即第0天和第7天)IP RITUXAN(4mg/kg)、或者後兩種Apo2L/TRAIL和RITUXAN方案的組合。
結果顯示於圖7。用媒介物處理的小鼠中腫瘤生長迅速，而單一藥劑Apo2L/TRAIL或RITUXAN處理則顯著延緩腫瘤生長。Apo2L/TRAIL或RITUXAN單獨處理都未引起任何完全消退，而RITUXAN顯示出更長時間的效果。正如實施例3中所述研究，Apo2L/TRAIL和RITUXAN聯合處理在所有小鼠中都引起腫瘤體積顯著縮小，7隻小鼠中有6隻顯示出腫瘤完全消融。這些結果表明，Apo2L/TRAIL和RITUXAN可針對淋巴瘤異種移植物發揮協同抗腫瘤作用。
實施例5Apo2L/TRAIL、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中生長的皮下預先移植BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物中胱天蛋白酶加工的影響為了檢驗所處理腫瘤中介導凋亡的胱天蛋白酶加工(表現為蛋白水解性胱天蛋白酶加工)，給SCID小鼠皮下注射人B細胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤細胞(ATCC)(每隻小鼠注射2×107個細胞)，並使腫瘤生長至約200mm3。然後如下處理小鼠媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02％ Tween 20pH＝7.2)(n＝1)、1劑IP Apo2L/TRAIL(60mg/kg)(n＝1)、或1劑IP RITUXAN(4mg/kg，Genentech，Inc.)(n＝2)、或者後兩種Apo2L/TRAIL和RITUXAN藥劑的組合(n＝2)。處理後兩天，獲取腫瘤，在裂解緩衝液中裂解，並用針對胱天蛋白酶8、3、9和7的特異性抗體進行免疫印跡(用抗β肌動蛋白抗體作為加樣對照)以顯現胱天蛋白酶加工(圖8)。
與媒介物對照(V)相比，Apo2L/TRAIL處理(A)誘導胱天蛋白酶8、3、9和7的加工增加，而RITUXAN(R)則不誘導胱天蛋白酶加工。值得注意的是，與Apo2L/TRAIL單獨處理相比，Apo2L/TRAIL和RITUXAN聯合處理(AR)沒有進一步增加胱天蛋白酶加工。這些結果表明，Apo2L/TRAIL和RITUXAN之間的協同抗腫瘤作用不是必然通過凋亡的增強來介導的，表明Apo2L/TRAIL介導的凋亡激活和補體依賴性裂解的組合以及RITUXAN介導的ADCC可能是所觀察到的抗腫瘤協同作用的基礎。
實施例6激動性DR5抗體、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中皮下預先移植的BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物生長的影響給SCID小鼠皮下注射人B細胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤細胞(ATCC)(每隻小鼠注射2×107個細胞)，並使腫瘤生長至約200mm3。然後將小鼠分成4個研究組(每組7隻小鼠)，並如下處理兩周內每周一次(即第0天和第7天)腹膜內(IP)注射媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02％Tween 20 pH＝7.2)、激動性DR5單克隆抗體(「Apomab」)(10mg/kg)、或RITUXAN(4mg/kg)、或者後兩種DR5抗體和RITUXAN方案的組合(圖9)。
用媒介物處理的小鼠中腫瘤生長迅速，而單一藥劑DR5抗體或RITUXAN處理則顯著延緩腫瘤生長。重要的是，DR5抗體和RITUXAN聯合處理在所有小鼠中都引起腫瘤體積顯著縮小，在至少35天內，7隻小鼠中有5隻顯示出腫瘤完全消融且2/7顯示出腫瘤生長極低。這些結果表明，激動性DR5抗體和RITUXAN可針對淋巴瘤異種移植物發揮協同抗腫瘤作用。
實施例7激動性DR5抗體、RITUXAN或聯合處理對SCID小鼠中生長的皮下預先移植BJAB淋巴瘤腫瘤異種移植物中胱天蛋白酶加工的影響為了檢驗所處理腫瘤中介導凋亡的胱天蛋白酶加工(表現為蛋白水解性胱天蛋白酶加工)，給SCID小鼠皮下注射人B細胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤細胞(ATCC)(每隻小鼠注射2×107個細胞)，並使腫瘤生長至約200mm3。然後如下處理小鼠媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02％ Tween 20pH＝7.2)(n＝1)、或1劑IP RITUXAN(4mg/kg)(n＝2)、或1劑IP激動性DR5抗體(10mg/kg)(n＝2)、或者後兩種DR5抗體和RITUXAN藥劑的組白酶8、3、9和7的特異性抗體進行免疫印跡(用抗β肌動蛋白抗體作為加樣對照)以顯現胱天蛋白酶加工(圖10)。
與媒介物對照(V)相比，激動性DR5抗體處理(A)誘導胱天蛋白酶8、3、9和7的加工增加，而RITUXAN(R)則不誘導胱天蛋白酶加工。值得注意的是，與DR5抗體單獨處理相比，DR5抗體和RITUXAN聯合處理(AR)沒有進一步增加胱天蛋白酶加工。這些結果說明，DR5和RITUXAN之間的協同抗腫瘤作用不是必然通過凋亡的增強來介導的，而是激動性DR5抗體介導的凋亡激活和補體依賴性裂解的組合以及RITUXAN介導的ADCC可能是所觀察到的抗腫瘤協同作用的基礎。
圖11-16提供了更多的數據，闡明NHL細胞系中CD20和Apo2L/TRAIL受體表達以及Rituximab、Apo2L/TRAIL及其組合對癌細胞的作用。
權利要求
1.處理癌細胞的方法，包括使哺乳動物癌細胞暴露於協同有效量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
2.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ ID NO1)的第1-281位胺基酸或其片段或變體。
3.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ ID NO1)的第114-281位胺基酸。
4.權利要求1的方法，其中所述癌細胞在體內暴露於所述協同效應量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述癌細胞是淋巴瘤細胞。
6.權利要求1的方法，進一步包括使癌細胞暴露於一種或多種生長抑制劑。
7.權利要求1的方法，進一步包括使細胞暴露於放射處理。
8.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽在選自下組的重組宿主細胞中表達CHO細胞、酵母細胞和大腸桿菌。
9.權利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽與聚乙二醇分子連接。
10.權利要求1的方法，其中所述CD20抗體是單克隆抗體。
11.權利要求10的方法，其中所述CD20抗體是抗體Rituximab。
12.治療免疫相關疾病的方法，包括對哺乳動物施用協同有效量的Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體。
13.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ IDNO1)的第1-281位胺基酸或其片段或變體。
14.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包含圖1(SEQ IDNO1)的第114-281位胺基酸。
15.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽在選自下組的重組宿主細胞中表達CHO細胞、酵母細胞和大腸桿菌。
16.權利要求12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽與聚乙二醇分子連接。
17.權利要求12的方法，其中所述免疫相關疾病是類風溼性關節炎或多發性硬化。
18.權利要求12的方法，其中所述CD20抗體是單克隆抗體。
19.權利要求18的方法，其中所述CD20抗體是抗體Rituximab。
20.權利要求1或12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體是順序施用的。
21.權利要求1或12的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽和CD20抗體是同時施用的。
全文摘要
本發明提供了利用死亡受體配體，諸如Apo－2配體/TRAIL多肽或死亡受體抗體，及CD20抗體來治療諸如癌症和免疫相關疾病等狀況的方法。本發明的實施方案包括將Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體諸如DR5抗體和DR4抗體與CD20抗體聯合使用的方法。
文檔編號A61P35/00GK101048424SQ200580036391
公開日2007年10月3日 申請日期2005年9月7日 優先權日2004年9月8日
發明者阿維·J·阿什克納齊 申請人:健泰科生物技術公司