具人鼠交叉反應的抗vegfr-2單克隆抗體及其製備、應用的製作方法

2023-06-02 14:02:31 2

專利名稱：具人鼠交叉反應的抗vegfr-2單克隆抗體及其製備、應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體及其製備、應 用，該抗體由雜交瘤細胞株8H1分泌產生，具人鼠交叉反應，高特異性識別天然 抗原VEGFR-2的三種形式。
背景技術：
血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors, VEGFs)家族
在胚胎發育及出生後的血管發育過程中均起重要的調節作用，主要參與新生血 管和淋巴管的形成。VEGF家族成員與3種酪氨酸激酶受體即血管內皮生長因子受 體(VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3)結合後發揮作用。VEGFR介導了一系列細胞行為包 括細胞遷移、存活、增殖等，在介導脈管新生過程中還有其特殊功能，如調節 血管滲透性導致的組織水腫。VEGFR2主要功能是在各種生理病理情況下介導新 生血管的形成。
近幾年免疫治療及免疫耙向療法在疾病綜合治療中的作用有了較大進步。 由於抗體的高度特異性，利用抗體將藥物導向靶點細胞是一種理想的途徑，抗 體導向的藥物治療在動物模型和臨床試驗中顯示出較強的治療作用。
同時，用於醫學科研和臨床診斷的生物試劑市場需求大，就目前國內外市 場上及現有的文獻報導，尚未見具有具人鼠交叉反應，高特異性抗VEGFR-2的單 克隆抗體，可用多種免疫學方法的研究。

發明內容
本發明目的是提供一種具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體及其製備、20 應用。
本發明所提供的可產生具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤 細胞株，名稱為8H1，該細胞株已於2009年4月9日保藏於中國普通微生物菌 種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 3013。
具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1由抗VEGFR-2單克隆抗體的 雜交瘤細胞株8H1分泌產生。
具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體的製備方法 1、製備小鼠免疫原和檢測用抗原
從GenBank獲取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253) (rmcleotides975-1283) gatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggaga aaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgc agcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 設計併合 成上下遊弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3。通過正常人臍內皮靜脈細胞中 提取總RNA，逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，以上述引物條件下，PCR擴增VEGFR-2 基因。
將VEGFR-2的PCR產物和表達載體pET28a和pGEX-4T-2分別進行連接，轉 化入大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑單菌落提取質粒，用BamHI和EcoRI雙酶切 鑑定，結果經酶切與預期結果相符，表明目的片段已正確連接入載體中，再用 測序的方法對陽性質粒進一步鑑定，測序結果表明插入片段序列正確，獲得了 兩種VEGFR-2的重組質粒，分別命名為VEGFR-2-His-pET28a和VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2。
將上述兩種質粒分別轉化大腸桿菌BL-21感受態細胞，篩選陽性轉化子進 行原核表達，對表達產物進行SDS-PAGE檢測，獲得了 11kDa和37kDa的重組蛋 白，分別用His和GST親和層析柱(美國Amersham公司)對目的蛋白進行純化， 獲取兩種帶有不同標籤的VEGFR-2重組蛋白，分別命名為His-VEGFR-2蛋白和 GST-VEGFR—2蛋白。
2、 製備抗VEGFR-2雜交瘤細胞株
用His-VEGFR-2重組蛋白作為免疫原在純系BALB/c小鼠腹部皮下注射進行 免疫接種，每次100yg/ml，共五次，在最後一次免疫接種前三天進行腹腔內加 強免疫。融合當天取小鼠脾臟，用DMEM培養基(美國GIBCO公司)製備成單細 胞懸液，在50% PEG (PH8.0)存在下，將脾細胞和SP2/0小鼠骨髓瘤細胞進行 融合，用HAT選擇性培養基(DMEM培養基98ml， HT貯存液lml， A貯存液lml) 培養7天，換用HT培養基(DMEM培養基99ml， HT lml)培養。
3、 VEGFR-2陽性單克隆抗體的篩選
根據雜交瘤細胞生長情況行酶聯免疫法(ELISA)檢測篩選，具體方法見下 述。取檢測陽性孔的細胞再次克隆化，經過5次克隆化，待所有的孔內單克隆 細胞檢測都為VEGFR-2陽性後，取數孔擴大培養並部分凍存。
ELISA方法篩選VEGFR-2陽性而正常人血清陰性的單克隆抗體，具體方法如
下
(1) 純化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用包被液(0. 1M碳 酸鹽緩衝液，pH9.6)稀釋至20"g/ml，每孔加入100ul， 4。C過夜；
(2) 用PBST洗滌液(PBS含0. 05%吐溫)洗滌5次後加入10°/。小牛血清(200 "l/孔)封閉，37。C孵育2h，洗漆5次後備用。(3) 每個孔中加入50"1雜交瘤細胞培養上清，以脾切除小鼠的血清為陽 性對照(1: 1000稀釋)，以正常小鼠的血清為陰性對照(1: 1000稀釋)37°C 孵育lh。
(4) 將以l: 5000稀釋的羊抗鼠Ig-服P第二抗體(SantaCruz公司)100 yl/孔加入到孔內，37。C孵育lh， PBST洗滌5次;
(5) 加入過氧化物酶底物顯色液100tU/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸 中止反應。用multiskan spectrum (Thermo labsystems， USA)酶標儀檢測，比 色採用雙波長450 nm/630 nm，檢測結果大於正常鼠血清OD值2. 5倍的為VEGFR-2 陽性克隆，最終選取2株穩定分泌抗VEGFR-2抗體的雜交瘤細胞，分別命名為 8H1和8H2，它們分泌的單抗分別命名為A8H1和A8H2。
4、 單克隆抗體的亞型鑑定
用美國Sigma公司的單克隆抗體亞型鑑定試劑盒(ISO-2KT)進行抗體的亞 型，結果示抗VEGFR-2抗體A8H1、 A8H2的亞型都為Ig2a。
5、 BALB/c小鼠體內生產單抗並純化
六周齡小鼠腹腔接種降植烷0. 5ml/只，10天後腹腔接種用無血清DMEM培 養基稀釋的上述8H1、 8H2雜交瘤細胞懸液，同時用SP2/0骨髓瘤細胞做對照， 每隻小鼠5X107隻。IO天后收集腹水，離心取上清後二氧化矽粉末去雜質，用 Protein G親和層析柱(美國Amersham公司)純化抗體，測定濃度後分裝，-70
'C凍存。
6、 ELISA方法對A8H1進行功能鑑定及應用
用包被液稀釋商品化的重組VEGFR-2蛋白(購自美國R&D公司)至2^g/ml， 每孔加入100(4包被96孔ELISA板，4'C過夜;PBST (PBS含0. 5% Tween20) 5°/0脫脂牛奶-洗滌緩衝液封閉，37"C孵育2h; PBST洗滌5次後，每個 中加入A8H1 (2Pg/ml起始濃度，11個濃度梯度稀釋)4'C過夜；以1: 5000稀 釋的羊抗人二抗(Santa Cruz公司)100W/孔加入到孔內，37。C孵育lh;過氧 化物酶底物顯色液100W/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸中止反應，上機檢測 比色採用雙波長450歷/630醒。
結果示A8H1與商品化抗原VEGFR-2有較好的結合活性，A8H1具有較高的 ELISA反應滴度。
7、 免疫印跡(WB)方法對A8H1進行功能鑑定及應用
將1X17個高表達VEGFR-2的人臍內皮靜脈細胞(HUVEC)和低或無表達 VEGFR-2的小鼠成纖維細胞(NIH3T3)為陰性對照，在RAPI裂解液中裂解，取 得細胞總蛋白，將總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上，將此 膜與20ug/ml A8H1和內參抗體P-actin稀釋1: 1000 (Santa Cruz公司)同 時孵育，1: 1000稀釋的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司)和ECL發光試劑 盒(美國Pierce公司)曝光於X片(柯達公司)。
結果示HUVEC總蛋白泳道在230kDa和43kDa處各出現一亮條帶，分別為 成熟型VEGFR-2和內參P -actin; NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa處出現一暗 帶，為成熟型VEGFR-2， 43kDa的內參3-actin處有一亮條帶；
隨曝光時間延長，HUVEC總蛋白泳道在200kDa處又出現一亮條帶，為磷酸 化VEGFR-2， NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa處一暗帶成亮帶，為成熟型 VEGFR-2， 200kDa處未見條帶出現；
由此可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有較好的結合活性，在 WB應用中能識別兩種形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型和磷酸化)。
8、 免疫沉澱方法(IP)對A8H1進行功能鑑定及應用
將1 X 107個HUVEC和NIH3T3細胞(陰性對照)在0. 5 ml RAPI裂解液中裂解，取得細胞總蛋白；取4個EP管編號a、 b、 c、 d,每管內分別加20 u g A8H1、 40y 1的ProteinA/ G (sigma公司)，再加PBS 450 u 1 4 。C混懸3 h， 4 。C 12000rpm30"棄上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分別100 u 1 NIH3T3細胞總 蛋白、30ii 1、 70ul、 100iil HUVEC總蛋白4 。C混懸過夜，4 。C 12000rpm 30 〃PBS洗3次棄上清，各管加入40yl的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱 器100 °C 2'，上樣於10% SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上；將此膜與 20yg/ml A8H2抗體孵育，1: 1000稀釋的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司) 和ECL發光試劑盒(美國Pierce公司)曝光於X片(柯達公司)。
結果示曝光3〃 ，各泳道在230kDa處均見一亮帶，為成熟的VEGFR-2蛋白； 曝光3'，各泳道在230kDa和200kDa處均見兩亮帶，後者是磷酸化的 VEGFR-2蛋白；在HUVEC總蛋白(b、 c、 d管)3泳道中還有150kDa的未成熟型 的VEGFR-2; NIH3T3總蛋白a泳道中未見此條帶；同時在c， d兩泳道可見明顯 的重鏈(75kDa)和輕鏈(30kDa) ， b， a泳道無輕重鏈可見。
由上可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特異性的結合活性， 在IP應用中可識別三種形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未成熟型)。 9、免疫螢光檢測技術(IF)對A8H1進行功能鑑定及應用 將HUVEC和NIH3T3細胞(陰性對照)進行爬片培養，待細胞長約玻片80% 面積左右時候，0. P/。多聚甲醛固定細胞半小時後無菌預冷4。C的PBS衝洗三遍， 加濃度為20 u g/ml的A8H1抗體4。C過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光 二抗(sigama公司)，避光室溫孵育1小時，PBS衝洗三遍，加入DAPI (Dojindo 公司，日本)染細胞核，37t:孵育20' ， PBS衝洗三遍，甘油封片後在倒置顯 微鏡(Olympus公司，日本)下觀察並拍攝照片。
結果HUVEC細胞質和膜可見強螢光，而部分NIH3T3細胞核見螢光，可見A8H1在IF中應用，具高特異性結合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
10、 流式細胞術(FACS)對A8H1進行功能鑑定及應用
分別將2 X 10s個HUVEC和NIH3T3細胞用含0. 1%多聚甲醛PBS固定細胞半小 時後，無菌預冷4'C的PBS衝洗三遍，加A8H1梯度濃度為20u g/ml 、 10u g/ml 共孵育4"過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光二抗(sigama公司)，避 光室溫孵育1小時後PBS衝洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 u 1重懸，在FACS (Becton Dickinson, San Jose， CA)上進行免疫螢光分析，以加SP2/0骨髓瘤
細胞注射產生腹水一抗為本底。
結果為細胞與陰性腹水本底0.41%; HUVEC與A8H1 (20yg/ml)結合率達 35.55%，與A8H1 (10y g/ml)結合率達31. 33%; NIH3T3與抗體A8H1 (20ug/ml) 結合率10. 18%，與抗體A8H1 (10yg/ml)結合率10. 12%。
由此可見抗VEGFR-2抗體A8H1在FACS中應用，可與表達VEGFR-2的人源、 鼠源的細胞不同程度的特異性結合。
11、 免疫組化技術(IHC)對A8H1進行功能鑑定及應用
腸間質瘤、肝癌石蠟組織連續切片，切片上組織經高溫抗原修復後，加A8H1 (20ug/ml) 37。C孵育30',以CD34—抗(DAKO公司)作陽性對照，隨後用 ENVISION試劑盒(DAKO公司)試劑37。C孵育30' ， DAB顯色，以自身對照為陰 性對照，顯微鏡下觀察終止顯色，最後用蘇木素復染細胞核。
結果A8H1與CD34均和血管上皮結合而顯棕色，同時肝癌細胞的細胞質內 和膜上也顯棕色(該肝癌細胞過表達VEGFR-2)，可見A8H1在IHC中應用，可 與過表達VEGFR-2的組織結合。
12、 質譜(MALDI-MS)分析A8H1結合蛋白質的胺基酸序列及應用 利用IP、 SDS-PAGE和質譜分析目的蛋白質的胺基酸序列，從而確定單克隆抗體A8H1抗VEGFR-2的準確性。20ugA8Hl、 40n 1的ProteinA/G (sigma公 司)，PBS 450yl 4 。C混懸3h， 4 。C 12000rpm 30"棄上清PBS洗3次，107 個HUVEC經O. 5ml RIPA裂解的總蛋白100ix 1, 4 。C混懸過夜，4 。C 12000rpm 30〃棄上清PBS洗3次，加入40 u 1的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱器 100 °C 2'，上樣於10%SDS-PAGE電泳，在230kDa處可見一亮條帶。切取該條 帶送質譜分析其蛋白質的胺基酸序列，結果示A8H1特異性識別VEGFR-2抗原。
獲得的單克隆抗體A8H1是目的抗VEGFR-2單抗，具高特異性識別重組 VEGFR-2蛋白抗原，人源、鼠源的天然VEGFR-2蛋白抗原，可用於ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF、 IHC， MALDI-MS的免疫學研究，也可潛在用於以潛在用於血管相 關(包括一些高表達VEGFR-2的腫瘤)疾病的診斷和治療。
所述的具人鼠交叉反應抗VEGFR-2的單克隆抗體A8H1在檢測VEGFR-2抗原 中的應用。
所述的具人鼠交叉反應抗VEGFR-2的單克隆抗體A8H1在製備相關的治療性 藥物、相關的診斷試劑及科研試劑中的應用。 本發明與現有技術相比具有的優點
從GenBank獲取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253) (nucleotides 975-1283)，運用單克隆抗體製備技術製備的具人鼠交叉反應的 抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1，可以應用於酶聯免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫印跡(Western blot, WB)、免疫沉i定 (I,noprecipitation， IP)、流式細胞術(Flow cytometry, FACS)、免疫熒 光(Immunofluorescence, IF)、免疫組化(I腿unohistochemistry， IHC)的 研究，也可以潛 用於血管相關(包括一些高表達VEGFR-2的腫瘤)疾病的診 斷和治療，國內外未見相同報導。該具人鼠交叉反應的抗體A8H1用於體外免疫學研究和診斷，具有無毒、多 種免疫學研究方法用途的優點，原因在於1)A8H1抗體本身是一種免疫球蛋白， 不會通過呼吸道、身體表面接觸而傷害健康；2) A8H1可以同時應用於ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF， IHC免疫學研究；3) A8H1具高特異抗VEGFR-2功能，可同 時識別天然抗原VEGFR-2的三種形式(成熟型、磷酸化型，未成熟型)；4)經 質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)和胺基酸序列分析，A8H1特異性識別VEGFR-2抗原；5)可潛在用於 血管相關(包括一些高表達VEGFR-2的腫瘤)疾病的診斷和治療。
同時，該抗體A8H1可潛在應用於體內研究、診斷和治療血管(包括一些高 表達VEGFR-2的腫瘤)相關疾病，具有廣譜、低毒或無毒、低耐藥性的優點， 其原因在於l)腫瘤血管內皮細胞突變少，不易產生耐藥性；2)雖然不同類型 的腫瘤特異性靶蛋白不同，但是其血管無本質差異，因此具有廣譜性；3)直接 作用於血管內皮包括腫瘤內部的新生血管，避免了腫瘤內部高壓及藥物分布的 問題。
基於上述優點，可以潛在應用A8H1為活性成分製成與血管相關疾病的診斷 及治療的試劑或藥物。該抗體製備方法簡單，可由雜交瘤細胞株8H1直接分泌 產生。本發明不僅為進一步研究VEGFR-2的生物學功能及其作用機理奠定了基 礎，而且在製備血管(包括一些高表達VEGFR-2的腫瘤)相關疾病的診斷性試 劑和治療性藥物中具有潛在的應用前景。


以下將結合附圖對本發明作進一步說明
圖1為重組His-VEGFR-2蛋白和GST-VEGFR-2蛋白的SDS-PAGE檢測結果， His-VEGFR-2蛋白禾口 GST—VEGFR-2蛋白分別為11 kDa和37kDa。圖2為抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1與商品化抗原的酶聯免疫吸附試驗檢測 結果，顯示A8H1有較高的滴度反應。
圖3-1、 3-2為抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1與細胞來源的天然抗原免疫印 跡鑑定結果，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有較好的結合活性，能識 別兩種形式的VEGFR-2。
圖4-1、 4-2為抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1與細胞來源的天然抗原免疫沉 澱鑑定結果，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特異性的結合活性， 能識別三種形式的VEGFR-2。
圖5-1、 5-2為免疫螢光技術鑑定抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1與細胞表達 VEGFR-2的定位結果，HUVEC細胞質和膜可見強螢光，而部分NIH3T3細胞核見 螢光。可見A8H1具高特異性結合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
圖6為流式細胞術鑑定抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1細胞表達的VEGFR-2活 性的結果，HUVEC與A8H1結合率達30%以上，NIH3T3與抗體A8H1結合率為10% 左右。
圖7-1、7-2、7-3、7-4用免疫組織化學技術分析抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1 的石蠟切片組織定位結果，A8H1和血管上皮結合而顯棕色，同時肝癌細胞的細 胞質內和膜上也顯棕色。
圖8-1、 8-2質譜鑑定、胺基酸序列分析結果，示A8H1特異性識別VEGFR-具體實施例方式
實施例l、抗VEGFR-2單克隆抗體的製備及篩選 應用雜交瘤技術製備抗VEGFR-2單克隆抗體，具體步驟如下 1、製備小鼠免疫原和檢測用抗原從GenBank獲取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253)
aaagcttgtcttaaattgtacagcaag犯ctgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaat 1111 gagcac c 11 aa.c t a t agat ggt gt aac c c ggagt gac caaggat t gt acac c t gt gc agcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 設計併合 成上下遊弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatmtcatgaactctaacaaaggtg-3。通過正常人臍內皮靜脈細胞中 提取總RNA，逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，以上述引物條件下，PCR擴增VEGFR-2 基因。
將VEGFR-2的PCR產物和表達載體pET28a和pGEX-4T-2分別進行連接，轉 化入大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑單菌落提取質粒，用BamHI和EcoRI雙酶切 鑑定，結果經酶切與預期結果相符，表明目的片段已正確連接入載體中，再用 測序的方法對陽性質粒進一步鑑定，測序結果表明插入片段序列正確，獲得了 兩種VEGFR-2的重組質粒，分別命名為VEGFR-2-His-pET28a和 VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2 。
將上述兩種質粒分別轉化大腸桿菌BL-21感受態細胞，篩選陽性轉化子進 行原核表達，對表達產物進行SDS-PAGE檢測，獲得了 11kDa和37kDa的重組蛋 白，分別用His和GST親和層析柱(美國Amersham公司)對目的蛋白進行純化， 獲取兩種帶有不同標籤的VEGFR-2重組蛋白，分別命名為His-VEGFR-2蛋白和 GST-VEGFR-2蛋白。
2、製備抗VEGFR-2雜交瘤細胞株
用His-VEGFR-2重組蛋白作為免疫原在純系BALB/c小鼠腹部皮下注射進行免疫接種，每次100"g/ml，共五次，在最後一次免疫接種前三天進行腹腔內加強免疫。融合當天取小鼠脾臟，用DMEM培養基(美國GIBCO公司)製備成單細胞懸液，在50% PEG (PH8.0)存在下，將脾細胞和SP2/0小鼠骨髓瘤細胞進行融合，用HAT選擇性培養基(函EM培養基98ml， HT貯存液lml， A貯存液lml)培養7天，換用HT培養基(DMEM培養基99ml， HT lml)培養。3、 VEGFR-2陽性單克隆抗體的篩選
根據雜交瘤細胞生長情況行酶聯免疫法(ELISA)檢測篩選，具體方法見下述。取檢測陽性孔的細胞再次克隆化，經過5次克隆化，待所有的孔內單克隆細胞檢測都為VEGFR-2陽性後，取數孔擴大培養並部分凍存。
ELISA方法篩選VEGFR-2陽性而正常人血清陰性的單克隆抗體，具體方法如
下
(1) 純化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用包被液(0. 1M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)稀釋至20yg/ni1，每孔加入100yl， 4。C過夜；
(2) 用PBST洗滌液(PBS含0. 05%吐溫)洗滌5次後加入10%小牛血清(200ul/孔)封閉，37。C孵育2h，洗滌5次後備用。
(3) 每個孔中加入50"1雜交瘤細胞培養上清，以脾切除小鼠的血清為陽性對照(1: IOOO稀釋)，以正常小鼠的血清為陰性對照(1: IOOO稀釋)37°C孵育lh。
(4) 將以l: 5000稀釋的羊抗鼠Ig-朋P第二抗體(Santa Cruz公司)100ul/孔加入到孔內，37。C孵育lh， PBST洗滌5次;
(5) 加入過氧化物酶底物顯色液100ul/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸中止反應。用multiskan spectrum (Thermo labsystems， USA)酶標儀檢測，比色採用雙波長450 nm/630 nm，檢測結果大於正常鼠血清OD值2. 5倍的為VEGFR-2陽性克隆，最終選取2株穩定分泌抗VEGFR-2抗體的雜交瘤細胞，分別命名為8H1和8H2，它們分泌的單抗分別命名為A8H1和A8H2。
可產生具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株8H1，已於2009年4月9日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo. 3013。
4、 單克隆抗體的亞型鑑定
用美國Sigma公司的單克隆抗體亞型鑑定試劑盒(ISO-2KT)進行抗體的亞型，結果示抗VEGFR-2抗體A8H1、 A8H2的亞型都為Ig2a。
5、 BALB/c小鼠體內生產單抗並純化
6周齡小鼠腹腔接種降植烷0. 5ml/只，10天後腹腔接種用無血清1640培養基稀釋的上述8H1、 8H2雜交瘤細胞懸液，同時用SP2/0骨髓瘤細胞做對照，每隻小鼠5X107隻。10天後收集腹水，離心取上清後二氧化矽粉末去雜質，用ProteinG親和層析柱(美國Amersham公司)純化抗體，測定濃度後分裝，-70
t:凍存。
實施例2抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1的功能活性鑑定及應用1、 ELISA方法對A8H1進行功能鑑定及應用
用包被液稀釋商品化的重組VEGFR-2蛋白(購自美國R&D公司)至2^/ml，每孔加入包被96孔ELISA板，4。C過夜；PBST (PBS含0. 5% Tween20)5%脫脂牛奶-洗滌緩衝液封閉，37"C孵育2h; PBST洗滌5次後，每個孔中加入A8H1 (2Pg/ml起始濃度，11個濃度梯度稀釋)4。C過夜；以1: 5000稀釋的羊抗人二抗(Santa Cruz公司)100W/孔加入到孔內，37。C孵育lh;過氧化物酶底物顯色液100W/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸中止反應，上機檢測比色採用雙波長450腿/630 nm結果見圖2示A8H1與商品化抗原VEGFR-2有較好的結合活性，A8H1具有 較高的ELISA反應滴度。
2、 免疫印跡(WB)方法對A8H1進行功能鑑定及應用
將1乂107個高表達VEGFR-2的人臍內皮靜脈細胞(HUVEC)和低或無表達 VEGFR-2的小鼠成纖維細胞(NIH3T3)為陰性對照，在RAPI裂解液中裂解，取 得細胞總蛋白，將總蛋白進行10%SDS_PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上，將此 膜與20ug/ml A8H1和內參抗體P-actin稀釋1: 1000 (Santa Cruz公司)同 時孵育，1: 1000稀釋的羊抗人工gG 二抗(Santa Cruz公司)和ECL發光試劑 盒(美國Pierce公司)曝光於X片(柯達公司)。
結果如圖3-1: HUVEC總蛋白泳道在230kDa和43kDa處各出現一亮條帶， 分別為成熟型VEGFR-2和內參P -actin; NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa處出 現一暗帶，為成熟型VEGFR-2， 43kDa的內參e-actin處有一亮條帶；
隨曝光時間延長如圖3-2， HUVEC總蛋白泳道在200kDa處又出現一亮條帶， 為磷酸化VEGFR-2， NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa處一暗帶成亮帶，為成熟 型VEGFR-2， 200kDa處未見條帶出現；
由此可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有較好的結合活性，在 WB應用中能識別兩種形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型和磷酸化)。
3、 免疫沉澱方法(IP)對A8H1進行功能鑑定及應用
將1 X 107個HUVEC和NIH3T3細胞(陰性對照)在0. 5 ml RAP工裂解液中裂解， 取得細胞總蛋白；取4個EP管編號a、 b、 c、 d，每管內分別加20 y g A8H1、 40ul的ProteinA/ G (sigma公司)，再加PBS 450u 1 4 。C混懸3 h， 4 。C 12000rpm30〃棄上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分別100 u 1 NIH3T3細胞總 蛋白、30 ul、 70 ul、 100 iil HUVEC總蛋白4 。C混懸過夜，4 。C 12000rpm 30"PBS洗3次棄上清，各管加入40y 1的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱 器100 °C 2'，上樣於10% SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上；將此膜與 20ug/ml A8H2抗體孵育，1: 1000稀釋的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司) 和ECL發光試劑盒(美國Pierce公司)曝光於X片(柯達公司)。
結果圖4-1示曝光3"，各泳道在230kDa處均見一亮帶，為成熟的VEGFR-2 蛋白；
圖4-2示曝光3'，各泳道在230kDa和200KDA處均見兩亮帶，後者是磷酸 化的VEGFR-2蛋白；在HUVEC總蛋白(b、 c、 d管)3泳道中還有150kDa的未 成熟型的VEGFR-2; NIH3T3總蛋白a泳道中未見此條帶；同時在c， d兩泳道可 見明顯的重鏈(75kDa)和輕鏈(30kDa) ， b， a泳道無輕重鏈可見。
由上可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特異性的結合活性， 在工P應用中可識別三種形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未成熟型)。
4、免疫螢光檢測技術(IF)對A8H1進行功能鑑定及應用
將HUVEC和NIH3T3細胞(陰性對照)進行爬片培養，待細胞長約玻片80% 面積左右時候，0. 1。/。多聚甲醛固定細胞半小時後無菌預冷4。C的PBS衝洗三遍， 加濃度為20u g/ml的A8H1抗體4。C過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光 二抗(sigama公司)，避光室溫孵育1小時，PBS衝洗三遍，加入DAPI (Dojindo 公司，日本)染細胞核，37。C孵育20' ， PBS衝洗三遍，甘油封片後在倒置顯 微鏡(Olympus公司，日本)下觀察並拍攝照片。
結果HUVEC細胞質和膜可見強螢光(圖5-l: HUVEC細胞，從左到右分別 為A8H1紅色螢光、DAPI藍色螢光染核，白光照)，而部分NIH3T3細胞核見熒 光(圖5-2: NIH3T3細胞，從左到右分別為A8H1紅色螢光、DAPI藍色螢光染核， 白光照)。可見A8H1在IF中應用，具高特異性結合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
5、 流式細胞術(FACS)對A8H1進行功能鑑定及應用
分別將2 X 106個HUVEC和NIH3T3細胞用含0. 1%多聚甲醛PBS固定細胞半小 時後，無菌預冷4。C的PBS衝洗三遍，加A8Hl梯度濃度為20ug/ml、 10ug/ml 共孵育4。C過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光二抗(sigama公司)，避 光室溫孵育1小時後PBS衝洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 u 1重懸，在FACS (Becton Dickinson, San Jose， CA)上進行免疫螢光分析，以加SP2/0骨髓瘤 細胞注射產生腹水一抗為本底。
結果如圖6:
從左到右5個結果圖分別為HUVEC與陰性腹水本底0.41%; HUVEC與A8H1 (20ug/ml)結合率達35.55%，與A8H1 (10ug/ml)結合率達31. 33%; NIH3T3 與抗體A8Hl(20u g/ml)結合率10. 18%，與抗體A8H1(10 y g/ml)結合率10. 12%。
由此可見抗VEGFR-2抗體A8H1在FACS中應用，可與表達VEGFR-2的人源、 鼠源的細胞不同程度的特異性結合。
6、 免疫組化技術(IHC)對A8H1進行功能鑑定及應用
腸間質瘤、肝癌石蠟組織連續切片，切片上組織經高溫抗原修復後，加A8H1 (20tig/ml) 37。C孵育30'，以CD34—抗(DAKO公司)作陽性對照，隨後用 ENVISION試劑盒(DAKO公司)試劑37。C孵育30' ， DAB顯色，以自身對照為陰 性對照，顯微鏡下觀察終止顯色，最後用蘇木素復染細胞核。
結果A8H1 (圖7-1)與CD34 (圖7-2)均和血管上皮結合而顯棕色，為A8H1 與血管反應(圖7-3)，同時肝癌細胞的細胞質內和膜上也顯棕色(圖7-4)， 可見A8H1在IHC中應用，可與過表達VEGFR-2的組織結合。
7、 MALDI-MS質譜(MALDI-MS)分析A8H1結合蛋白質的胺基酸序列及應用 利用IP、 SDS-PAGE和質譜分析目的蛋白質的胺基酸序列，從而確定單克隆 抗體A8H1抗VEGFR-2的準確性。20y g A8H1、 40 n 1的ProteinA/ G (sigma公 司)，PBS 450 ul 4 。C混懸3h， 4 °C 12000rpm 30〃棄上清PBS洗3次，107 個HUVEC經O. 5 ml RIPA裂解的總蛋白lOOyl， 4 。C混懸過夜，4 °C 12000rpm 30〃棄上清PBS洗3次，加入40ul的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱器 100 °C 2'，上樣於10%SDS-PAGE電泳，如圖8-1示，在230kDa處可見一亮條 帶。切取該條帶送質譜分析其蛋白質的胺基酸序列，結果如圖8-2示A8Hl特異 性識別VEGFR-2抗原。
上述實施例2的系列實驗結果證明實施例1獲得的單克隆抗體A8H1是目的 抗VEGFR-2單抗，具高特異性識別重組VEGFR-2蛋白抗原，人源、鼠源的天然 VEGFR-2蛋白抗原，可用於ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF, IHC的免疫學研究，也 可潛在用於以潛在用於血管相關(包括一些高表達VEGFR-2的腫瘤)疾病的診 斷和治療。
權利要求
1、一種具人鼠交叉反應抗VEGFR-2的單克隆抗體A8H1，是由保藏號為CGMCCNo.3013的鼠源雜交瘤細胞株8H1所分泌的。
2、 具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體的製備方法，其特徵在於 1)製備小鼠免疫原和檢測用抗原從GenBank獲取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253)aaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgc agcat,ccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 設計併合 成上下遊弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3;通過正常人臍內皮靜脈細胞中 提取總RNA，逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，以上述引物條件下，PCR擴增VEGFR-2 基因；將VEGFR-2的PCR產物和表達載體pET28a和pGEX-4T-2分別進行連接，轉 化入大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑單菌落提取質粒，用BamHI和EcoRI雙酶切 鑑定，與預期結果相符，表明目的片段已正確連接入載體中，再用測序的方法 對陽性質粒進一步鑑定，測序結果表明插入片段序列正確，獲得了兩種VEGFR-2 的重組質粒，分別命名為VEGFR-2-His-pET28a和VEGFR-2-GST- pGEX-4T-2;將上述兩種質粒分別轉化大腸桿菌BL-21感受態細胞，篩選陽性轉化子進 行原核表達，對表達產物進行SDS-PAGE檢測，獲得了 11kDa和37kDa的重組蛋白，與VEGFR-2蛋白的分子量大小相符，分別用His和GST親和層析柱對目的 蛋白進行純化，獲取兩種帶有不同標籤的VEGFR-2重組蛋白，分別命名為 His-VEGFR-2蛋白和GST-VEGFR-2蛋白；2) 製備抗VEGFR-2雜交瘤細胞株用His-VEGFR-2重組蛋白作為免疫原在純 系BALB/c小鼠腹部皮下注射進行免疫接種，每次100ug/ml，共五次，在最後 一次免疫接種前三天進行腹腔內加強免疫；融合當天取小鼠脾臟，用DMEM不完 全培養基製備成單細胞懸液，在PH 8. 0的50% PEG存在下，將脾細胞和SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞進行融合，用HAT選擇性培養基培養7天，換用HT培養基培養；3) VEGFR-2陽性而正常人血清陰性的單克隆抗體的篩選 根據雜交瘤細胞生長情況行ELISA檢測篩選，取檢測陽性孔的細胞再次克隆化，經過5次克隆化，待所有的孔內單克隆細胞檢測都為VEGFR-2陽性後， 取數孔擴大培養並部分凍存；ELISA方法篩選VEGFR-2陽性的單克隆抗體，具體方法如下(1) 純化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用0. 1M碳酸鹽緩衝 液，pH9.6的包被液稀釋至20ug/ml，每孔加入100"1， 4。C過夜；(2) 用PBST洗滌液洗滌5次後加入10。/。小牛血清封閉，每孔200ul/孔， 37t:孵育2h，洗滌5次後備用；(3) 每個孔中加入50ul雜交瘤細胞培養上清，以l: IOOO稀釋的脾切除 小鼠的血清為陽性對照，以1: 1000稀釋的正常小鼠的血清為陰性對照，37°C 孵育lh;(4) 將以l: 5000稀釋的羊抗鼠Ig-服P第二抗體100ul/孔加入到孔內， 37。C孵育lh， PBST洗滌5次;(5) 加入過氧化物酶底物顯色液100u 1/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸中止反應；用酶標儀檢測，比色採用雙波長450 nm/630 nm，檢測結果大於正常 鼠血清0D值2. 5倍的為VEGFR-2陽性，最終選取2株穩定分泌抗VEGFR-2抗體 的雜交瘤細胞，分別命名為8H1和8H2，它們分泌的單抗分別命名為A8H1和A8H2;4) 單克隆抗體A8H1和A8H2的亞型鑑定用單克隆抗體亞型鑑定試劑盒進行抗體的亞型，結果示抗VEGFR-2抗體 A8H1、 A8H2的亞型都為Ig2a;5) BALB/c小鼠體內生產單抗並純化六周齡小鼠腹腔接種降植垸0. 5ml/只，10天後腹腔接種用無血清DMEM培養 基稀釋的上述8H1、 8H2雜交瘤細胞懸液，同時用SP2/0骨髓瘤細胞做對照，每隻小鼠 5X107隻；IO天后收集腹水，離心取上清後二氧化矽粉末去雜質，用Protein G親和層析柱純化抗體；6) 酶聯免疫吸附試驗方法對A8H1進行功能鑑定及應用 用包被液稀釋商品化的重組VEGFR-2蛋白至2Pg/ml，每孔加入包被96孔ELISA板，4t:過夜；PBST洗滌後用5%脫脂牛奶-洗滌緩衝液封閉，37'C孵 育2h; PBST洗滌5次後，每個孔中加入A8H1，以2Pg/ml起始濃度，11 個濃度梯度稀釋，4'C過夜；以1: 5000稀釋的羊抗人二抗100W/孔加入到孔內， 37。C孵育lh;過氧化物酶底物顯色液10(M/孔，室溫下15分鐘後用2M硫酸中 止反應，上機檢測比色採用雙波長450nm/630nm;結果示A8H1與商品化抗原VEGFR-2有較好的結合活性，A8H1具有較高的 ELISA反應滴度；7) 免疫印跡方法對A8H1進行功能鑑定及應用將107個高表達VEGFR-2的人臍內皮靜脈細胞和低或無表達VEGFR-2的NIH3T3小鼠成纖維細胞為陰性對照，在RAPI裂解液中裂解，取得細胞總蛋白， 將總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上，將此膜與20ug/ml A8H1和內參抗體e-actin 1: 1000同時孵育，1: 1000稀釋的羊抗人IgG 二抗 和ECL發光試劑盒曝光於X片；結果示人臍內皮靜脈細胞總蛋白泳道在230kDa和43kDa處各出現一亮條 帶，分別為成熟型VEGFR-2和內參0-actin; NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa 處出現一暗帶，為成熟型VEGFR-2， 43kDa的內參0-actin處有一亮條帶；隨曝光時間延長，人臍內皮靜脈細胞總蛋白泳道在200kDa處又出現一亮條 帶，為磷酸化VEGFR-2， NIH3T3細胞總蛋白泳道在230kDa處一暗帶成亮帶，為 成熟型VEGFR-2， 200kDa處未見條帶出現；由此可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有較好的結合活性，在 WB中應用中識別兩種形式成熟型和磷酸化的VEGFR-2天然抗原；8)免疫沉澱方法對A8H1進行功能鑑定及應用將107個人臍內皮靜脈細胞和NIH3T3細胞在0. 5 ml RAPI裂解液中裂解， 取得細胞總蛋白；取4個EP管編號a、 b、 c、 d，每管內分別加20 n g A8H1、 40 ul的ProteinA/ G,再加PBS 450 u 1 4 。C混懸3 h， 4 。C 12000rpm 30" 棄上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分別100"l NIH3T3細胞總蛋白、30ul、 70w 1、 100y 1 HUVEC總蛋白4 。C混懸過夜，4 。C 12000rpm 30〃 PBS洗3次棄 上清，各管加入40"1的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱器100 °C 2'， 上樣於10% SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上；將此膜與20 u g/ml A8H2抗 體孵育，i: lOOO稀釋的羊抗人IgG二抗和ECL發光試劑盒曝光於X片；結果示曝光3"，各泳道在230kDa處均見一亮帶，為成熟的VEGFR-2蛋白； 曝光3'，各泳道在230kDa和200kDa處均見兩亮帶，後者是磷酸化的VEGFR-2蛋白；在b、 c、 d管HUVEC總蛋白中還有150kDa的未成熟型的VEGFR-2; NIH3T3總蛋白a泳道中未見此條帶；同時在c， d兩泳道可見明顯的75kDa的重 鏈和30kDa的輕鏈，b， a泳道無輕重鏈可見；由上可見，A8H1與人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特異性的結合活性， 在免疫印跡應用中可識別三種形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未 成熟型)；9) 免疫螢光檢測技術對A8H1進行功能鑑定及應用將人臍內皮靜脈細胞和NIH3T3細胞進行爬片培養，待細胞長約玻片80%面 積左右時候，0. W多聚甲醛固定細胞半小時後無菌預冷4。C的PBS衝洗三遍，加 濃度為20 n g/ml的A8H1抗體4。C過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光二 抗，避光室溫孵育l小時，PBS衝洗三遍，加入DAPI染細胞核，37。C孵育20'， PBS衝洗三遍，甘油封片後在倒置顯微鏡下觀察並拍攝照片；結果人臍內皮靜脈細胞的細胞質和膜可見強螢光，而部分NIH3T3細胞核見 螢光；可見A8H1在免疫螢光技術中應用，具高特異性結合人源、鼠源的天然抗 原VEGFR-2;10) 流式細胞術對A8H1進行功能鑑定及應用採用流式細胞術分析A8H1與天然抗原VEGFR-2的結合活性，分別將2X 106 個人臍內皮靜脈細胞和NIH3T3細胞用含0.淺多聚甲醛PBS固定細胞半小時後， 無菌預冷4。C的PBS衝洗三遍，加A8H1梯度濃度為20y g/ml 、 10ug/ml共孵 育4i:過夜，PBS衝洗三遍後加入IgG羅丹明螢光二抗，避光室溫孵育l小時後 PBS衝洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 ul重懸，在FACS上進行免疫螢光分 析，以加SP2/0骨髓瘤細胞注射產生腹水一抗為本底；結果為細胞與陰性腹水本底0. 41%;人臍內皮靜脈細胞與濃度為20y g/ml的A8H1結合率達35. 55%,與濃度為10ug/ml的A8H1結合率達31. 33%;NIH3T3 與濃度為20 txg/ml A8H1結合率10.18%,與濃度為10ug/ml A8H1的結合率/10. 12%;由此可見抗VEGFR-2抗體A8H1在流式細胞術中應用，可與人源、鼠源的天 然抗原VEGFR-2特異性結合；(11) 利用免疫組化技術對A8H1進行功能鑑定及應用腸間質瘤、肝癌石蠟組織連續切片，切片上組織經高溫抗原修復後，加20 ug/ml的A8H1 37。C孵育30'，以CD34—抗作陽性對照，隨後用ENVISION試 劑盒試劑37。C孵育30' ， DAB顯色，以自身對照為陰性對照，顯微鏡下觀察終 止顯色，最後用蘇木素復染細胞核；結果A8H1與CD34均和血管上皮結合而顯棕色，同時肝癌細胞的細胞質內 和膜上也顯棕色，A8H1在IHC中應用，可與過表達VEGFR-2的組織結合；(12) 質譜分析A8H1結合的目的蛋白質的胺基酸序列及應用 利用免疫沉澱、SDS-PAGE和質譜分析目的蛋白質的胺基酸序列，從而確定單克隆抗體A8H1抗VEGFR-2的準確性；20 u g A8H1、 40 u 1的ProteinA/G， PBS 450 y 1， 4 。C混懸3h， 4 。C 12000rpm 30〃棄上清PBS洗3次，107個冊VEC經0. 5 ml RIPA裂解的總蛋白100ul， 4 。C混懸過夜，4 。C 12000rpm 30〃棄上清PBS 洗3次，加入40ii1的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，乾濕加熱器100 °C 2'，上 樣於10%SDS-PAGE電泳，在230kDa處可見一亮條帶；切取該條帶送質譜分析其 蛋白質的胺基酸序列，結果示A8H1特異性識別VEGFR-2抗原。
3、 權利要求1或2所述的具人鼠交叉反應抗VEGFR-2的單克隆抗體A8H1在 檢測VEGFR-2抗原中的應用。
4、 權利要求1或2所述的具人鼠交叉反應抗VEGFR-2的單克隆抗體A8H1在製備血管相關的治療性藥物、相關的診斷試劑及科研試劑中的應用。
5、分泌權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞，是保藏號為CGMCC No. 3013的鼠源雜交瘤細胞株8H1 。
全文摘要
本發明涉及的是一種具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體及其製備、應用，該抗體由雜交瘤細胞株8H1分泌產生，具人鼠交叉反應，高特異性識別天然抗原VEGFR-2的三種形式。具人鼠交叉反應的抗VEGFR-2單克隆抗體A8H1由抗VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株8H1分泌產生。其製備方法製備小鼠免疫原和檢測用抗原；製備抗VEGFR-2雜交瘤細胞株，用His-VEGFR-2重組蛋白作為免疫原在純系BALB/c小鼠腹部皮下注射進行免疫接種；VEGFR-2陽性單克隆抗體的篩選，ELISA方法篩選VEGFR-2陽性而正常人血清陰性的單克隆抗體；單克隆抗體的亞型鑑定；BALB/c小鼠體內生產單抗並純化；採用ELISA等方法對A8H1進行功能鑑定及應用。
文檔編號C07K16/28GK101643509SQ200910026399
公開日2010年2月10日 申請日期2009年4月22日 優先權日2009年4月22日
發明者馮振卿, 劉新建, 奇 唐, 進 朱, 管曉虹, 洋 譚, 黃劍飛 申請人:南京醫科大學;中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所