人造納米結構的治療用途的製作方法

2023-06-02 07:43:06 2

專利名稱：人造納米結構的治療用途的製作方法
AJt納米結構的治療用途5 本申請要求保護美國專利60/706.072的權益，其申請日為2005年8月8日，所述內容以參考文獻形式在本申請中完整引用。申請中被完整引用以更全面描述本發明相關工藝。
技術背景io 本發明旨在製造細胞或微生物內的人造胞內納米結構。這種人造納米結構能夠但不局限於選擇性地控制細胞或微生物的生死以治療 由病原細胞或病原微生物引起的疾病。同時，也可以用相同方法生產 組織或器官內/間的人造納米結構用於治療。自裝配，在所有級別水平(分子、細胞器、細胞等)上都是基本過15 程，在生物學中擔任著重要的角色，同時對設計和裝配功能性物質也 起著重要的導向作用。尤其是自裝配可以提供具有吸引力和實用的制 造人造納米結構的方法，而納米結構在日益興起的納米科學領域中有 著廣泛的影響和應用，例如，自裝配的納米顆粒可用於產生新的光學 材料和高密度磁性記錄介質，自裝配單(分子或細胞)層可在各種底物20 上形成納米厚度的有機薄膜從而才莫擬可以控制細胞命運的生物表面、 建立分子電子裝置、發展納米造影術、產生生物醫學診斷學納米結構 等。寡肽和其它有機分子自裝配而成的納米纖維是水凝膠的功能基 質，而水凝膠在組織工程、抑制劑篩選和創傷癒合中的應用十分廣泛。 雖然以上的成果都表明自裝配納米結構在胞外環境或非生物體系中25 有了令人興奮和重要的發展，但胞內生產人造納米結構仍未被開發， 其生物效應還不為人知，儘管其有著重要的意義和潛在的應用價值。 研究胞內人造納米結構的重要意義有以下幾點首先，自裝配納 米結構例如細胞膜、核酸鏈、肌動蛋白纖絲在活細胞內數目眾多，對於細胞的重要功能是不可或缺的(即，保持細胞完整性的結構模塊、 保存遺傳信息的有效貯存、作為調節許多細胞過程的激活裝置)，因 此，胞內人造納米結構是擾亂細胞活動進而控制細胞行為的強大而有 效的手段。第二，許多疾病都與細胞納米結構被破壞有關(即，鹼基 5 對的錯配、(3-澱粉狀蛋白的形成，蛋白質的錯誤摺疊)，因此，胞內人 造納米結構為仿生、模型建立以及了解疾病機理等多個方面提供了平 臺，促進了治療學的發展。第三，過去的五十年分子細胞生物學的驚 人發展，例如生物過程的分子水平研究，已引起了對生命形式進化新 的認識，現在，我們需要一種與生物過程相關且在分子水平之上的方10 法去系統了解結構和動力學(例如，系統生物學)。自裝配的納米級胞 內人造結構增加了 一種檢測細胞和有機體功能的動力學的方法並允 許在新的複雜水平理解之前並不相關的知識領域。本發明也報導了 一種控制人造納米結構狀態的通用方法，這種人 造納米結構能夠誘導經酶促轉換(switch )的水凝膠化和活體內的水15 凝膠化。作為藥物傳遞、創傷癒合、組織工程中最有應用價值的生物 材料之一 ，水凝膠通常用天然的或合成的高分子作為凝膠因子(gelator)2。很大程度上是由於對低分子量有機凝膠因子3的研究以及 自裝配寡肽形成的水凝膠被證明成為組織工程的骨架，"在過去的十 年中水凝膠因子的範圍已經迅速擴展到小分子，這些小分子使超分子 20水凝膠成為可能。"水凝膠因子的自裝配在超分子水凝膠納米結構的形成中起著關鍵的作用。7因此，觸發及調節水凝膠因子的自裝配成為控制超分子水凝膠性質和狀態的 一個基本步驟，通常通過化學或物理幹擾來實現(即，pH、溫度、離子強度和超聲攪拌)該過程。在生物醫學的應用中，酶催化、原位包括胞夕卜(組織或器官內/間)和胞內可逆25 自裝配和水凝膠因子凝膠化都是有利的，1因為它可以使水凝膠對某些組織、器官、疾病中特定的酶的表達做出應答。儘管已使用酶來交 聯聚合物以誘發水凝膠化11並報導了酶觸發超分子水凝膠的形成9, 但仍需要研究使用酶調控超分子水凝膠(即可逆調控水凝膠因子的自裝配)。因為大多數的酶促反應基本上都是不可逆的，所以單個的酶幾乎 不可能控制水凝膠的可逆反應。大自然使用 一對具有相反活性的酶來 轉換蛋白質功能從而解決了這一進退兩難的局面。1本發明模擬天然 狀態，用激酶/磷酸酶轉換調節超分子水凝膠。方案1:^~如方案1所示，兩種類型的酶促反應促成水凝膠因子(IV)的形成 (A)酶催化的鍵斷裂恢復了水凝膠因子疏水性和親水性的平衡，(B)酶o 催化的鍵形成使水凝膠因子上的疏水性和親水性達到平衡。在酶促形 成後，水凝膠因子(W)將在水中自裝配成超分子聚合物，該聚合物繼 續聚集形成納米纖維網作為所生成水凝膠的基質。另外，在生物體系 中，調節蛋白質活性最常見的機制之一就是酶促"轉換"，該過程中有 兩個具有相反活性的酶(即，其中一個酶催化某鍵的形成，另一個催15 化該鍵的斷裂)。 一種上述酶促轉換還能夠調節小分子水凝膠因子的 水凝膠化過程並形成可對生物環境產生應答的水凝膠。該內容的詳細 闡述見以下部分。方案2:如方案2所示，合成了一個五肽水凝膠因子Nap-FFGEY(l),該 物質在0.6 wt。/。時通過1的自裝配會形成水凝膠。在三磷酸腺普(ATP) 存在的條件下，向水凝膠中加入激酶可磷酸化1給出相應的磷酸(2)， 5 因此，破壞自裝配以誘導凝膠-溶膠之間的相轉變；用磷酸酶處理形 成的溶液可以使2脫去磷酸形成1，因此，恢復了自裝配形成水凝膠。 此外，給小鼠皮下注射2，能夠在體內形成超分子水凝膠。除第一個示例中的酶-轉換-調控的超分子水凝膠以及通過酶促反 應在體內形成超分子水凝膠外，激酶/磷酸酶轉換與超分子水凝膠組 io 合使用也為生物材料的製造和應用提供一個新的方法，因為作為一個 常見但重要的生物反應，磷酸化和去磷酸化存在於許多有機體中。許 多疾病，例如癌症12、糖尿病13、 Alzheimer症14、多發性硬化症15, 都與磷酸酶和/或激酶16的異常活性相關，與傳統的物理和化學過程 相比，酶-轉換-調控的水凝膠化的作用應該更加強大，因為它在酶的 15表達水平上增強了水凝膠的生物特異性反應。此外，對水凝膠因子的酶-轉換-調控的自裝配的研究有助於了解 超分子水凝膠在多酶體系生物環境中的功能。發明概述本發明包括以下內容(l)在細胞或微生物中設計和應用一個製造人造納米結構的新方法，包括以下幾個步驟(i)在允許前體進入細胞或 微生物的條件下，利用所述細胞或微生物構建一個合適的設計前體，該前體在細胞外不能夠自裝配；(ii)使細胞或微生物處於可使前體變 為納米結構的條件下；(2)在組織或器官內/間設計和應用 一種生產人5 工納米結構的新方法，包括以下步驟將一個設計好的前體注射入組 織或器官中，用 一個酶促反應將前體轉變為形成人工納米結構的水凝 膠因子同時誘發水凝膠化；(3)在組織或器官內/間設計和應用一種生 產人工納米結構的新方法，包括以下步驟，將設計好的前體及其它治 療藥物注射入組織或器官中，用 一個酶促反應將前體轉化為形成人造io 納米結構的水凝膠因子同時誘發水凝膠化，在疾病狀態下，另一種酶 將水凝膠因子轉化回前體以誘發凝膠-溶膠之間的相轉化來釋放藥 物。本發明提供了通過一個酶促反應或者一系列酶促反應而形成胞 內納米結構來控制哺乳動物細胞或微生物命運的通用方法。胞內納米15 結構的形成，例如，納米纖維或者納米物質的聚集物，都是通過分子 或者納米物質的胞內自裝配完成的。細胞內的自裝配是通過酶促反應 將適當的前體如分子或納米物質轉變成為另一個在細胞內、組織內或 器官內聚集的分子或納米物質而觸發的。這種胞內納米結構能夠使細 胞內的水分凝膠化或者阻斷內源性細胞活性，這樣可以改變細胞、微20 生物或生物體的行為。例如，這種胞內的納米結構能夠觸發細胞、微 生物或有機體的死亡、停止包括幹細胞在內的細胞分化、抑制微生物 或有機體的生長和改變包括幹細胞在內的細胞或有機體分化行為。本 發明中的胞內納米結構的形成能夠特異地作用於致病細胞或者微生 物，因此，本發明的方法可用於治療由於細胞機能障礙或微生物或有25 才幾體感染而引起的疾病。另外，在組織或器官內/間，用酶促反應將前體轉化成可形成人造納米結構的水凝膠因子並誘發水凝膠化；或者在疾病狀態下，另一 個酶將水凝膠因子轉變回前體引起凝膠-溶膠之間的相轉變以釋放藥物。本方法提供了一種控制藥物釋i丈、形成新治療藥物和原位形成水 凝膠治療慢性疾病如骨關節炎的新方法。


圖1 (A)胞內納米纖維的形成導致水凝膠化及細胞死亡的概略圖。 5 (B)前體分子(la)及其相對應的水凝膠因子(2a)的化學構造和圖解。圖2 (A)含有8 mM (0.5 wt%)la和0.2 mg酶溶液pH = 8.0(37 。C) 的溶液的振蕩流變學。(B)在水中通過酶凝膠化la形成水凝膠(插圖 光學圖像)的TEM圖(濃度=0.5 wt%， pH = 8.0); (C)細胞培養基 (DMEM)，圖2B中的凝膠，用la培養前及培養後的HeLa細胞的紫 io 外光譜；(D)用la培養三天後死亡的HeLa細胞形成的水凝膠TEM圖 (插圖光學圖像)(箭頭表明由h形成納米纖維)。圖3在含有0.02、 0.04和0.O8wt。/。la的培養基中培養0、 1、 2 和3天的HeLa細胞和NIH3T3細胞的光學圖像(x100)。顯微鏡的焦 平面對準培養皿的底部，表面細胞的形狀改變和細胞數量減少表明細 15 胞死亡。圖4(A)凝膠I; (B)向凝膠I加入添激酶後得到的溶液和(C)凝 膠II的光學圖像及相應的高效液相圖譜。組圖(A, C)右邊為水凝膠， 從瓶的底部觀察。1和2的配比為近1: 1的溶液在傾斜的瓶(組圖B) 中形成一個彎月面。 20 圖5 (A)凝膠I的動態應變掃描圖，頻率1.0rad/s; (B)凝膠I在應變為0.8%時的動態頻率掃描圖；(C)含有0.3wt。/。的1、 0.3wt。/。的2 及400 U/mL鹼性磷酸酶的緩衝溶液在應變為0.8%及頻率為1 rad/s 時的動態時間掃描圖。圖6凍幹(A)凝膠I; (B)凝膠II; (C)含1 (0.3 wt %)的緩衝溶液； 25及(D)含1 (0.32 wt %)和2 (0.28 wt %)的緩沖溶液的TEM圖。圖7(A)凝膠I和II的圓二色i普圖(B)凝膠I、凝膠II及溶液 1的螢光光i普(、x = 272 nm)。圖8 1在凝膠II的納米管中一種可能的分子排布由於氫鍵而形成P-摺疊(A); 1沿著(B)和與納米管交叉(C)的分子結構；整個分 子堆積在納米管中(D)。圖9 1和2處理HeLa細胞的MTT法分析。圖10(A)給小鼠注射2後1小時皮下形成水凝膠的光學圖像；(B) 5給小鼠注射2後1小時的腹腔光學圖像；(C)圖IOA為水凝膠的HPLC 圖譜；(D)注射2後1小時腹液的HPLC圖譜。圖11皮下(A)和腹膜內(B)注射0.5 mL濃度為0.8 wt。/o的2後小鼠 的體重增加(n = 6，初始體重=20 ± 2g)。生理鹽水溶液(0.5ml)作 為兩種注射類型的對照。 io 發明詳述本發明包括以下內容(l)在細胞或微生物中設計和應用 一種製造 人造納米結構的新方法，包括以下幾個步驟(i)構建一個合適的前體， 該前體在細胞外不能夠自裝配；(ii)在允許前體進入細胞或^i:生物的 條件下使所述前體與所述細胞或糹鼓生物接觸；(iii)使細胞或微生物處 15 於可使前體變為納米結構的條件下；(2)在組織或器官內/間設計和應 用一種生產人工納米結構的新方法，包括以下步驟將一個設計好的 前體注射入組織或器官中，用一個酶促反應將前體轉變為形成人工納 米結構的水凝膠因子同時誘發水凝膠化；(3)在組織或器官內/間設計 和應用一種生產人工納米結構的新方法，包括以下步驟，將設計好的 20 前體及其它治療藥物注射入組織或器官中，用一個酶促反應將前體轉 化為形成人造納米結構的水凝膠因子同時誘發水凝膠化，在疾病狀態 下，另 一種酶將水凝膠因子轉化為前體以誘發凝膠-溶膠之間的相轉 化來釋放藥物。本發明旨在製造組織或器官內或組織或器官間的胞內人造納米 25結構，該納米結構能夠通過但不限於酶促反應觸發超分子水凝膠化特 異性作用於病原細胞或孩t生物，該凝膠化過程包括以下步驟(1)構 建一個合適的在胞外不能自裝配的設計前體，該前體進入細胞的方式 不限於簡單擴散；(2)在細胞中表達的一種可將前體轉變為能夠自裝配成為納米纖維水凝膠因子的酶，該納米纖維是一種簡單的納米結構；(3)納米纖維的形成引起水凝膠化，水凝膠壓迫細胞、促使細胞死亡，這種細胞轉變很容易觀察。這種在細胞內或組織或器官內/間產生的納米結構也可用於終止胞在內的細胞或有機體的分化行為。本發明的方法可用於治療由細胞功能障礙或微生物感染引起的 動物及人類疾病，因為這種在細胞內或組織或器官內/間生成的人造 納米結構能夠特異性作用於致病細胞或微生物。io 有效量的本發明前體可用於治療癌症、糖尿病、Alzheimer症以及多發性硬化症等疾病。酶促水凝膠化前體的基本結構是(1) 一個疏水基(即萘基、芳香 基、烴鏈(hydrocarbontai1)—直鏈或支鏈；(2)—個親水基(即溶於水的 二-、三-、四-、五-或寡肽、羧酸、氨基糖苷類、抗生素及其它的水15 溶性治療藥物)；(3) —個可斷裂的基團(即磷酸(包括鹽和酯 (phosphate))、 丁酸、硫酸(包括鹽和酯(sulphate))、銨、乙二醇)。本發明的方法包括一個設計合適的在細胞外不能自裝配的前體， 由三個不同的模塊合成(1)能提供疏水力來增強其在水環境中自裝 配的基團，包括萘基(C10H7CHr)、烷基(CnH2n+l， n = 4-30)和芳族20 基；(2)分子或納米級片段(即單個的胺基酸殘基、二肽、苯丙氨醯 基-苯丙氨酸(phe-phe)或X-Y(X、 Y都代表胺基酸殘基)、三肽、四肽、 五肽、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、二膦酸鹽類、抗生素、抗瘤劑、抗 真菌劑、抗寄生物分子、鐵氧化物納米顆粒(5到50nm)等)，這些片 段除了作為與水相互作用的氫鍵受體和供體外還是自裝配的主要構25 建模塊，(3) —個可斷裂的基團(即丁二酸、二膦酸鹽、磷酸、糖類 等)，該基團能夠通過化學鍵(共價的或非共價的)與片段共價連接，酶 或酶促轉換能夠破壞該鍵來調節疏水作用和親水作用的平衡並在沒 有酶促反應發生時阻止水凝膠化。本發明進一步提供一種在組織或器官內或組織或器官間設計和應用製造人造納米結構的新方法，由以下步驟組成將一個合適的設 計前體注射到組織或器官內，酶促反應將前體轉化為一個能形成人工 納米結構的水凝膠因子同時誘發水凝膠化；在疾病狀態，另一種酶將 5水凝膠因子轉變會前體卩I起凝膠-;容膠之間的相轉變以釋放藥物。在組織或器官內/間，用酶促反應將前體轉變為水凝膠因子以形 成人工納米結構並誘發水凝膠化，在疾病狀態，另一種酶將水凝膠因 子轉變回前體同時誘發凝膠-溶膠的相轉變並釋放出藥物。該方法提 供了 一種控制藥物釋放、形成新治療藥物和原位形成水凝膠治療慢性 io 疾病如骨關節炎的新方法。本發明也提供了一種治療癌症、糖尿病、Alzheimer症以及多發 性硬化症，慢性疾病如骨關節炎的方法，包括給予受試者有效劑量的 前體，該前體在胞內或組織或器官內/間能形成納米結構。本領域的 普通技術人員可以理解本發明可以用於治療或預防其他疾病。在一個 15實施方案中，所述前體是一種nap-FFGEY型前體。在本發明中，受試者包括哺乳動物。在一個實施方案中受試者為 動物。在另一個實施方案中受試者是人。本發明也4是供了用所構建前體治療和預防疾病的不同用途。最 後，本發明提供了包括之前所述前體的試劑盒。20 通過參考下面的實施例可以更好的理解本發明，但是本領域的技術人員可以理解這些例子僅用於說明，並不限制本發明，實施例後的 權利要求界定了本發明範圍。 實驗方案詳述實施例l:胞內納米結構的形成構的基本概念。可以使用不同的方法形成胞內納米結構，這些方法具有以下基本 特徵(i)構建模塊必須能夠自裝配以形成納米結構；(ii)自裝配納米結構應只能在細胞內形成；(iii)自裝配應由某一胞內過程引起或與其偶 聯；(iv)納米結構的形成可？ 1起可只見察的現象或細胞轉化從而易於筌 另寸。如圖11A所示， 一種合適的在胞外不能夠自裝配的設計前體通 過但不限於簡單擴散進入細胞； 一旦前體進入細胞，在細胞內表達的 5 —種酶將前體轉變為一種能自動裝配成納米纖維的水凝膠因子 (hydrogelator)，該納米纖維是一種簡單的納米結構；納米纖維的形成 導致水凝膠化，水凝膠化壓迫細胞並引起細胞死亡，這種細胞轉變很 容易觀察。為了滿足圖1A所描述的概念，設計併合成了一種由三個不同模 io 塊組成的前體(la,圖1B): —個能提供疏水力以增強其在水環境中 自裝配的基團，包括萘基(C10H7CHr)、烷基(CnH2n+l， n = 4-30)和 芳族基；(即單個的胺基酸殘基、二肽、苯丙氨醯基-苯丙氨酸或X-Y(X, Y都代表胺基酸殘基)、三肽、四肽、五肽、氨基糖苷類、氟喹諾酮 類、二膦酸鹽類、抗生素、抗瘤藥、抗真菌劑、抗寄生物分子、鐵氧 15 化物納米顆粒(5到50nm)等)，除了作為與水相互作用的氫鍵受體和 供體外，還是自裝配的主要構造模塊；(3)—個可斷裂的基團(例如二 丁酸、二膦酸鹽、磷酸、糖類等)，該基團能夠通過化學鍵(共價的或 非共價的)與片段共價連接，酶或酶促轉換能夠破壞該鍵來調節疏水 作用和親水作用的平衡並在沒有酶促反應發生時阻止la水凝膠化。20 為了鑑定la的性質，已證實一種酯酶可將la轉變為2a、促使納米纖維的形成並誘發水凝M/f匕。在pH~8.0時，在0.9 mL la (0.5 mg) 溶液中加入0.1 mL酯酶(1 mL蒸餾水中含有7 U酯酶，調節pH到 8.0),將該溶液置於37。C約6分鐘可促^f吏水凝膠形成，即使加熱到近 100。C仍可保持穩定。流變學試驗(圖2A)表明水凝膠在IO分鐘內開25 始形成，存儲模量(G')大於損耗模量(G")也表明這一點。存儲模量(G') 達到平臺表明，這種酶催化的水凝膠化反應在100分鐘內完成。]H NMR表明在這一階段68%的la轉化成2a。 2a形成的水凝膠是透 明的(插圖，圖2B),這表明在水凝膠中沒有微晶體聚集物散射可見光，這與水凝膠的傳導電子顯微鏡照片(TEM)—致(圖2B)。此外，TEM表 明通過2a自裝配形成的納米纖維的大小是 10nm，儘管納米纖維束 的大小能夠達到 60nm寬。在證實了酯酶可以將la轉變為2a並使2a水凝膠化後，監測培5養液和Hela細胞中萘基的特徵吸收峰來確定細胞吸收前體的數量。 在與Hela細胞一起培養3天後(培養液中la的初始濃度為0.08 wt%),培養液中萘基的吸收降低了 32%(支持信息)。與此同時，Hela 細胞中出現了萘基吸收峰。吸收峰的形狀和位置與通過酯酶將la轉 變為2a形成的水凝膠的吸收峰是一致的，這表明細胞內水凝膠化。io 此外，因為細胞的體積不到培養基體積的1°/。，細胞內la的濃度很容 易超過2a的mgc。 一旦la分子通過內源性的酯酶轉變成2a,將會自 裝配為納米纖維。為了證實這一推斷，收集與培養液表面脫離的死亡 Hela細胞。離心去掉細胞外的水份後破壞細胞並觀察其中水凝膠的形 成(插圖，圖2D)。透射電子顯微圖(圖2D)顯示了 25nm寬納米纖15 維的形成，其形態與單獨通過2a形成的納米纖維相似。收集黏附在 培養皿表面的活Hela細胞，超聲石皮碎後，在透射電子顯微鏡下觀察， 細胞碎片既不形成水凝膠也沒有長納米纖維出現。這些結果證實了細 胞的死亡與胞內納米纖維的形成和水凝膠化有關。在證實了水凝膠化能夠如細胞內設計的進行後，檢測 一 系列濃度20的前體la以確定引起細胞死亡所需要的有效濃度(圖3)。當[la]= 0.02wt。/。時，細胞正常生長。在[la] = 0.04 wt。/。時，儘管第一天細胞 數量增長，但第二天細胞就開始死亡，培一底部黏附的細胞減少可 以證明這一點；第三天幾乎沒有活細胞存在。當[la]-0.08wt。/。時， 第一天細胞數量降j氐；第二天與[la] = 0.04 wt。/。相比更少的細胞黏附25 在培養皿表面；第三天幾乎所有的細胞都變圓(rounds up)並脫離培養 皿表面，表示細胞已經死亡。細胞的逐漸死亡與2a濃度增加是一致 的，這對於納米纖維的形成和水凝膠化是必要的。這種現象也表明 2a的靶點就是胞質水。為了進一步證實酯酶對Hela細胞的選擇性，la與纖維母細胞(MH3T3)—fe培養。如圖3所示，當[la] = 0.04 wt% 時細胞持續增長，這證明la對於正常細胞林沒有毒害作用。實施例2:設計併合成一種激酶/磷酸酶轉換調節超分子水凝膠並 在體內形成超分子水凝膠5 將Nap-FFGEY(l，方案2)設計成既是激酶的底物又是水凝膠因子，這是由於(i) FF易於自裝配，17 (ii) Nap-FF能有效的將水凝膠化 (濃度為0.8 wt %18) ; (iii) Glu-Tyr (EY)殘基在酪氨酸激酶存在時可用萘(Nap)而不用N-(芴基-曱氧羰基)(FMOC)的一個原因是萘的 io生物相容性更好，這一點已被含有萘基模塊的臨床藥物所證實(即普 萘洛爾、萘唑啉、萘呋胺酯)。用甘氨酸(G)連接Nap-FF和EY是因 為甘氨酸是最簡單的胺基酸。與其他的五肽不同，4ffgey不是任何 蛋白的已知抗原表位，但是它具有作為酪氨酸激酶底物所需的基本結 構。在通過固相合成獲得1後2檢測1凝膠化的能力。通過略微調節 15pH (從7.8到7.5)， 1在濃度為0.6 wt %時在水中形成了一種透明的 水凝膠。2G 1成功的水凝膠化暗示著Nap-FF也可以作為一個與其他 胺基酸殘基結合的可用模塊來構建水凝膠。 實施例3:酶的轉換調控水凝膠的相轉變在證實了 1確實是一種有效的水凝膠因子後，檢測用激酶/磷酸 20 酶轉換調控水凝膠的相轉變。在緩沖液中(0.5 mL，包含10 mM的ATP) 加入l(3mg)可在5分鐘內生成透明的水凝膠(凝膠I，圖4A)。然後， 在凝膠I的頂端加入3 U (50 ^L)酪氨酸激酶使1開始磷酸化。24小 時之後，凝膠I轉變成為透明的溶液(圖4B)。用HPLC檢測溶液表 明 46%的1已經轉變成為了 2。由於2的磷酸基之間的相互排斥作用 25 減弱了納米纖維的自裝配，這樣使2的親水性較溶液1強得多，產生 凝膠-溶膠相轉變。在該溶液中加入 200 U的鹼性磷酸酶(IO pL)可使 水凝膠(凝膠II，圖4C)在1小時內復原。4小時後，HPLC分析表明 99.1%的2又重新轉變為1。由於在該實驗中所用的磷酸酶的催化活性比激酶高出大約1000倍，凝膠-溶膠-凝膠相轉變這一循環才得以 完成。如果想要使這種轉化循環多次，需要調節具有相似活性的一對 酶的相對含量。而且，結果表朋通過酶促轉換調節超分子水凝膠是有 效的。此外，細胞信號傳導動力學的最新研究表明一種刺激通過同時5活激PKs並使PPs失活觸發蛋白激酶(PK) /蛋白磷^M (PP)的平衡。膠的相轉循環變得更加容易，這有可能形成對組織生物活性產生應答 的給藥體系。實施例4:流變學研究10 為了評價凝膠的粘彈性，首先用動態應變掃描法去確定凝膠I的動態頻率掃描的合適條件。如圖5A，所示，存儲;漠量(G')和損耗模 量(G")數值在0.1%到1.0。/。應變力時表現出較弱的依存性((G')大 於(G"))，這表明樣品就是水凝膠。在設置了應變振幅為0.8%後(在 應變振幅的線性響應內)，用動態頻率掃描研究凝膠I。圖5B表明，15 隨著頻率從O.l增加到100rad/sG'和G"均有緩慢增加。在整個頻 率範圍內(0.1-100 rad/s)G'值大約是G"值的5倍，這表明凝膠I對外 部壓力有一定的耐受力。為了研究凝膠II的酶促形成,選擇動態時間掃描模型檢測加入磷 酸酶時含有1和2的配比是1: 1的溶液的粘彈性的變化。在含0.3 wt%20 的1和0.3 wt。/。的2的溶液中加入石威性磷酸酶(400U/mL)用於流變學檢 測。如圖5C所示，在剛加入酶的時候，混合物G'和G"的量都非常 小，這表明當1和2等量時，1和2的混合液已表現出低黏性流體的 行為。此後，G'和G"都會隨著時間的延長而增加，加入磷酸酶大約 30分鐘後，G'值開始超過G",這表明接近了凝膠點。1.5小時後，25G'的平臺值大約是G"的十倍，這表明在水凝膠中廣泛形成三維結構 基質。混合樣品到達凝膠點所需的時間顯著小於單獨樣品(大約lh), 這可能是由於流變學的測量？ 1起的機械幹擾加速了酶促脫磷酸反應。 實施例5:形態學和光譜學研究由於凝膠I和凝膠II是通過不同過程形成的，它們可用於評價酶對自裝配的影響。跟據凝膠的crvo-TEM(圖6)圖象，1在凝膠I中 自裝配成不同大小的納米纖維(直徑28 ± 5nm)，在凝膠II中裝配成 均一的納米束(直徑18± 1.5 nm,壁的厚度為6 nm)，這表明酶轉換5 調節的自裝配過程能形成更好的納米纖維。可能有兩個因素影響纖維 形成的自裝配動力學以形成圖6B中更好的纖維。首先，與圖6A中 凝膠I pH值的變化相比，磷酸酶對2的脫磷酸作用使得納米纖維的 形成更加緩慢，這就使得自裝配的納米結構更加有序。第二，在形成 凝膠II時，成對的酶既催化磷酸化也催化脫磷酸化，這表明與規則區io域相比酪氨酸激酶更容易磷酸化納米纖維中的不規則區域。因此，激 酶通過將1轉化成2以助於去除不規則的部分，磷酸酶將2轉化為1 來實現重組裝。這種平衡有助於^吏納米纖維形成更加均勻的納米束。 也就是說，酶轉換有助於去除在凝膠II中形成1納米束自裝配過程中 的缺陷。15 為了 了解1在最小凝膠化濃度以下和圖4B中所示階段的行為，用透射電子顯微鏡檢查凍幹的溶液1(0.3 wt %)及含有1(0.3 wt %)和 2(0.28 wt。/。)的混合溶液的形態。如圖6C和3D所示，透射電子顯微 圖證實在兩種溶液中沒有廣泛地形成納米纖維，多數是無定型固體還 有少數的短纖維結構，這表明以上兩種情況中的水凝膠因子的濃度過20 低以至於不能夠自裝配成納米纖維網狀結構以形成水凝膠。這個結果 與以1: 1混合的1和2的溶液的流變學行為相一致。為了進一步了解1的水凝膠的分子排布，檢測凝膠I和凝膠II 的圓二色譜和發射光譜。凝膠I和凝膠II的圓二色語(圖7A)基本上 是相同的，在196nm(兀兀"夭遷)附近都出現了陽性帶，在215nm附25 近也都出現了陰性帶(rm*躍遷)，287 nm附近出現了陰性帶(萘基 芳香化合物的兀兀*躍遷)，與寡肽6納米纖維的圓二色譜一致，顯示出 (3-摺疊特徵。溶液l的焚光光譜(圖7B)在338nm處有一吸收峰，凝 膠I的不對稱吸收峰在340 nm處有最大吸收，凝膠II在342 nm處有最大吸收峰，2表明為單體萘部分。雖然缺乏萘的明顯準分子風(大約在450 nm21)排除了凝膠I和II中的萘基團強烈的7r-7r相互作用， 400nm以上的小寬肩峰表明苯基和萘基之間存在較弱的兀-ti相互作 用。這一結果與Nap-FF的晶體結構相一致。2G 5 實施例6:分子排布基於水凝膠1的TEM、 CD、螢光光譜以及Nap-FF的X-射線衍 射結構，本發明認為納米束中l的分子排列為氫鍵和疏水性相互作 用(圖8A)協同誘導1自裝配產生超分子聚合物，該聚合物的分子堆積 (圖8B)暴露出來源於Glu-Tyr片段(圖8C)的氬鍵供體和受體並促使它 io們進一步聚合形成納米單位(圖8D)。儘管不可能完全排除其他模式的分子堆積，圖8中的高級結構是 可能性最大的一種，因為該結構與NAP-FF片^:的結構相符、與水凝 膠中1的發射光i普和圓二色譜相一致，還使Glu-Tyr基團更易受到酶 的作用。15 實施例7:活體內水凝膠因子的生物相容性和酶促水凝膠化用MTT法來分析1或2存在時的細胞活性來說明水凝膠因子的 生物相容性。將1和2與HeLa細胞一起培養24小時後，125 一的 1和2中細胞的存活量分別為68°/。和46%。從圖9描述的結果可以 看出，1對HeLa細胞的IC50為603 |iM， 2對HeLa細胞的IC50為20 93 joM。雖然2在高濃度時表現出對HeLa細胞增殖的抑制作用，但 是水凝膠因子(l)的生物相容性更高。當水凝膠被用作為生物醫藥的原 料時，1的生物相容性具有重要作用。在初步細胞毒試-驗^i正實1具有細胞相容性之後，給小鼠注射溶液 2以評價活體內1的超分子水凝膠的形成。給各小鼠皮下注射(即皮膚25 下)和腹膜內注射(即注射入腹腔)化合物2 (0.5 mL, 0.8 wt %)。 1 h 後，在皮下注射的位置有水凝膠形成(圖IOA)。水凝膠的HPLC分析 表明80.5(1.2%的2轉變成了 1 (圖IOC))，這對於水凝膠化的意義重 大。儘管在腹腔中沒有水凝膠形成，HPLC檢測腹部體液表明86.2%的2已經轉變成1 (圖IOD)。比較圖10C, D與已知濃度1和2的 HPLC圖譜，注射部位保留的化合物的總量(包括1和2)與最初注射 的2的量有關。對於皮下注射，該數值大約為88.4%;對於腹膜內注 射，該數值約為76.8%。這些結果表明限制組織或器官內水凝膠因子5前體的擴散可確保活體內酶促凝月吏化。注射2後監測小鼠的體重變化以評價2在活體內的細胞毒性。如 圖IIA所示，皮下注射2(0.5 mL, 0.8 wt %)的小鼠第一天體重降低(平 均K).55g,降低2.8%),對照組'卜鼠的體重也降低(平均-0.44g,降 低2.2%)。第二天後，兩組小鼠的體重均開始增加。兩組小鼠體重的10 增加和降低在統計學上是相同的，這表明在試驗劑量下皮下注射2對 小鼠急性毒性很低。如圖IIB所示，腹腔注射2(0.5 mL, 0.8 wt %) 的小鼠第一天體重降低(平均二l.lg，降低5.5%),而對照組小鼠的體 重增力口(平均增加二0.50g, 2.5%)。 ^v第二天到第七天兩組小鼠的體重 幾乎得到了相同比率的增加(0.34 g/天)。這一結果表明儘管腹腔內注15 射試驗劑量的2在第一天引起了急性毒性，24小時後，2到1的轉變 使毒力顯著降低。注射部位的不同反應與2從注射位點擴散的數量及 1和2的體外細胞毒性相一致。由於皮下位點的限制，只有少量的2 能夠循環到血液中並分散到各器官和其他組織，因此，顯著降低了皮 下注射的細胞毒性。因為2最終能夠轉變為1，未觀察到腹腔注射水20 凝膠因子的長期體內毒性。 參考文獻1. 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權利要求
1.一種在細胞或微生物內生產胞內人造納米結構的方法，由以下幾個步驟組成a.在允許前體進入所述細胞或微生物的條件下，將細胞外不能夠自裝配的合適的設計前體與所述細胞或微生物接觸；b.將細胞或微生物置於允許前體轉變為納米結構的條件下。
2. —種在組織或器官內/間生產人造納米結構的方法，由以下幾 個步驟組成)o a.將合適的設計前體導入組織或器官中；b.將組織和器官置於能夠使前體轉變為納米結構的條件下。
3. 權利要求1或2的方法，其中合適的前體能夠轉變為另一種可 在細胞內或在組織或器官內/間聚集的分子或納米物質。
4. 權利要求1或2的胞內人造納米結構，其中它們可以抑制或殺 15 死所述細胞或有機體。
5. 權利要求1或2的胞內納米結構，其中通過它們在組織或器官 內/間的形成控制哺乳動物細胞或糹鼓生物的命運。
6. 權利要求l的方法，其中細胞內的水被引發水凝膠化。
7. 權利要求1或2的方法，其中內源細胞活性被阻斷，使細胞或 20 微生物或有機體的行為發生改變。
8. 權利要求1或2的方法，其中細胞或微生物或有機體的死亡是 -故觸發的。
9. 權利要求1或2的方法，其中細胞分化被停止或微生物或有機 體的生長受到抑制。
10.權利要求1或2的方法，其中細胞、組織或器官的分化行為:故改變。
11.權利要求l的方法，其中選擇性抑制或殺死致病細胞或致病 ^f效生物以治療癌症中的多重耐藥性或感染中的抗生素耐藥性。
12. 權利要求2的方法，其中在組織或器官內/間生產人造納米結 構可以控制藥物的釋放、形成新的治療藥物和原位形成水凝膠來治療 慢性疾病。
13. 權利要求12的方法，其中所述慢性疾病是骨關節炎。
14.權利要求1或2的方法，其中在階^殳b,由酶促反應產生人造納米結構。
15. 權利要求14的方法，其中酶促反應是脫磷酸反應或者水解反 應或者是成鍵反應。
16. 權利要求1或2的用於酶^足水凝膠化的一種合適的設計前體， io 其基本結構的組成為a. 疏水基團；b. 親水基團；和c. 可斷裂的基團。
17. 權利要求16的一種合適的設計前體，該前體在細胞外不能夠 15 自裝配並由三個不同的模塊合成a. 提供疏水力以增強在水環境中自裝配的萘基，b. 二肽片段，除了作為與水相互作用的氫鍵受體和供體外還是自 裝配的主要構造模塊，c. 可斷裂的羧酸，它與羥基共價連接形成作為酶促轉換的酯鍵以 20調節疏水和親水相互作用的整體平衡，並在沒有酶促水解反應發生時防止前體的水凝膠化。
18. 權利要求16的前體，其中疏水基團可以是doH7CH2-、萘基、 芳香基、直鏈烴鏈或支鏈烴鏈。
19. 權利要求16的前體，其中所述親水基團可以是苯丙氨醯基-25苯丙氨酸、水溶性的二肽、三肽、四肽、五肽或寡肽、羧酸、氨基糖苷類、抗生素或者是其他水溶性的治療藥物。
20. 權利要求16的前體，其中可斷裂的基團是丁二酸、磷酸、丁 酸、石克酸、銨或者乙二醇。
21. 由權利要求16-20中任一項前體以及合適的載體組成的組合物。
22. —種治療癌症、糖尿病、AJzheimer症、多發性力更化症或骨關 節炎的方法，包括給予受試者有故劑量的前體，該前體能在細胞內、 組織或器官內/間形成納米結構。
23. 權利要求21的方法，其中所述前體是nap-FFGEY型前體。
24. 權利要求16的前體在疾病的不同治療和預防藥物製備中的 用途。
25. —種包含權利要求16所迷前體以及隔室的試劑盒。
全文摘要
本發明提供了通過酶促反應形成胞內納米物質來控制哺乳動物細胞或微生物命運的方法。這種酶促反應能夠觸發胞內自裝配，從而將合適的前體轉變為其它分子或納米結構，進而在細胞內聚集或在組織或器官內/間聚集。此外，本發明還提供了一種在組織或器官內/間生產人工納米結構的方法將設計好的前體注射入組織或器官中，用酶促反應將前體轉化為形成人造納米結構的水凝膠因子同時誘發水凝膠化，在疾病狀態下，另一種酶將水凝膠因子轉化回前體以誘發凝膠-溶膠之間的轉化來釋放藥物。本發明適用於治療細胞功能紊亂或微生物感染引起的疾病，並提供了控制藥物釋放、形成新治療藥物及原位形成水凝膠以治療退行性疾病如骨關節炎的新方法。
文檔編號A61K38/00GK101282739SQ200680037223
公開日2008年10月8日 申請日期2006年3月6日 優先權日2005年8月8日
發明者兵 徐, 徐克明, 楊志謀 申請人:香港科技大學