一種基於液相晶片檢測禽流感病毒h5n1亞型的方法
2023-05-28 04:42:36
專利名稱：一種基於液相晶片檢測禽流感病毒h5n1亞型的方法
技術領域：
本發明涉及一種基於液相晶片檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法。
背景技術：
流行性感冒是常見急性呼吸道傳染病之一，由於流感病毒極易變異，常常引起全國甚至世界性大流行。尤其近段時間國內外部分地區禽流感的流行及人禽流感病例的出現等突發公共衛生事件，都迫切要求對上述疾病做出早期快速的實驗室診斷。
流行性感冒病毒屬於正粘病毒科，可分為甲、乙、丙三型。根據甲型流感病毒表面抗原血凝素抗原(HA)和神經氨酸酶抗原(NA)的結構及基因特性的不同又可分為若干亞型，至今已經發現甲型流感的HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(N1-N9)。由於HA和NA的抗原性容易發生變異，所以造成了流感病毒的不斷流行，因此在流感病毒的檢測過程中對於其型別的鑑定是十分重要的。
流感病毒的檢測主要有四大部分病毒培養分離、血清學診斷、病毒抗原檢測、病毒核酸檢測。其中病毒培養分離、血清學檢測和分型是常規的方法，但此類方法花費時間比較長，無法快速的對流感病毒進行檢測和分型；而在病毒核酸的檢測和分型中，出現了很多快速特異的方法。特別是PCR技術的應用，對於流感病毒鑑定和分型發揮著越來越大的作用。這些方法如逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、多重逆轉錄聚合酶鏈反應(multiplex reverse transcription-PCR，MRT-PCR)、酶免PCR(PCR-enzymeimmunoassay，PCR-EIA)、實時PCR(real-time PCR，RT-PCR)等提高了檢測的速度和靈敏度，然而，儘管越來越多的方法用於檢測流感病毒，但尚未有一種方法能夠對流感病毒各種亞型進行快速準確的分型。因此建立一種對流感病毒各種型別進行快速鑑定的方法就十分重要了。
液相晶片(Multi-Analyte Suspension Array，MASA)技術是一種新型基因晶片技術。該技術的核心是把螢光編碼的乳膠顆粒分別與特異性的檢測探針偶聯，然後在懸液中加入微量標本與特異性檢測微粒進行結合，結合的結果經雷射判讀後由電腦以數據形式記錄下來。該技術具有高通量、靈敏度高、速度快的特點，且所需要的標本量少，已經在基因分型、組織分型、感染性疾病檢測等方面廣泛應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是運用液相晶片技術，提供一種用於檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，以便對禽流感病毒H5N1亞型進行快速檢測和進行早期診斷，為控制禽流感的流行及控制和消滅人禽流感互相感染做出貢獻。
本發明所採用的技術方案是利用液相晶片技術，運用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對在核酸序列庫中能夠檢索到的所有的H5、N1血清亞型核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對禽流感病毒H5和N1基因片斷的簡併引物和特異性探針，簡併引物包括特異性檢測引物和生物素修飾的通用引物，特異性探針通過與螢光編碼微球進行偶聯製成特異性檢測微球，即液相晶片。液相晶片能夠特異性的識別禽流感病毒H5和N1基因片斷，通過兩輪PCR反應，並通過液相晶片檢測儀(Luminex)讀出檢測結果。
本發明的主要效果如下我們設計了針對禽流感病毒H5N1血清亞型的四對特異性引物和探針，其中H5和N1分別分為兩個組別(H5-1和H5-2、N1-1和N1-2)；使用四種螢光編碼微球，利用液相晶片技術對H5N1亞型和其它常見亞型(A1、A2、A3、H9N2)標本進行了檢測分析。發現基於液相晶片技術研製的禽流感病毒H5N1亞型檢測試劑盒具有較高特異性、靈敏度和快速的特點，在對禽流感病毒H5N1亞型進行快速檢測和進行早期診斷方面具有重要的應用價值。
利用一種新型的基因晶片技術——液相晶片技術，建立一種對禽流感病毒H5N1亞型進行快速診斷的新方法，並製成檢測試劑盒等生物用品。由於該生物用品具有快速和較高特異性的特點，能夠快速檢測出禽流感H5N1亞型，因而能夠為控制禽流感的流行，以及為控制和消滅人禽流感互相感染做出貢獻。
鑑於目前用於禽流感檢測的方法無法快速簡便的對流感病毒各種亞型進行區分，基於上述效用，本發明為開發出檢測H5N1亞型和其它各種亞型流感病毒更為快速有效的方法提供了一條更為廣闊的前景。
圖1是一例H5N1亞型的RT-PCR和PCR產物的示意圖。圖中DL2000為Marker，各個電泳條帶代表了各自的PCR產物。
圖2至圖5是採用Luminex 100系統對混合引物擴增產物雜交檢測結果的示意圖，其中圖2為gate value的確定，使檢測螢光的峰值位於確定的gate值之間；圖3標明了四種混合微球所對應的位置；圖4為檢測的一例H5N1亞型標本；圖5為A1亞型標本。
圖4和圖5兩圖中橫坐標表示雜交產物的平均螢光強度，縱坐標表示所使用的探針偶聯的微球，其中有一個內源性Control。
具體實施例方式
本發明基於液相晶片技術，建立了一種對H5N1亞型禽流感病毒進行快速檢測的新方法。在對各種標本的檢測中，我們發現基於液相晶片技術研製的禽流感病毒H5N1亞型檢測試劑盒具有較高特異性、靈敏度和快速的特點。
本發明利用液相晶片技術，運用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對在核酸序列庫中能夠檢索到的所有的H5、N1血清亞型核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對禽流感病毒H5和N1基因片斷的簡併引物和特異性探針，簡併引物包括特異性檢測引物和生物素修飾的通用引物，特異性探針通過與螢光編碼微球進行偶聯製成特異性檢測微球，即液相晶片。液相晶片能夠特異性的識別禽流感病毒H5和N1基因片斷，通過兩輪PCR反應，並通過液相晶片檢測儀讀出檢測結果。液相晶片能夠製成試劑盒等生物用品。
下面結合實例及附圖對本發明作進一步說明。
一.序列分析、引物探針的設計合成從NCBI的Genbank上下載所有A型流行性感冒病毒H5和N1片斷核酸序列，篩選出需要的完整的核酸序列。對序列進行比對分析，對於每個片斷根據核酸同源性將檢索的核酸序列分成不同組別。
本發明中我們將H5和N1亞型分別分成兩個組H5-1和H5-2、N1-1和N1-2。對於每個組，分析並找出保守序列，然後根據保守序列設計引物和探針。由於單個核酸變異比較多，我們使用簡併引物。設計的探針要和晶片中使用的微球進行偶聯，5′端需要氨基化處理。
設計引物時，在所有正向引物和反向引物的5′端各加入一段序列(經分析該序列與流行性感冒病毒序列不同源)，即通用引物(Uni-forward)5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc和(Uni-reverse)5′-ctg gtc cgt act tcc gag cg，以便第二輪擴增反應。
第二輪擴增反應使用上面加入的這兩段序列(Uni-Primers)，其中反向通用引物Uni-reverse的5′端用生物素(biotin)進行標記。
最終設計合成如下引物和探針特異性檢測引物如下H5-1For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg gac aat ttt raa rcc raa tg-3′H5-1Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgt tat cgc mcc cay tgg ag-3′H5-2For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tca atg gac aaa gtg gaa gaa t-3′H5-2Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cga agg cata ctr gaa ttt ata g-3′N1-1For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg caa ttc atc tct ttg ycc-3′N1-1Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc acc cac agg aca act c-3′N1-2For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcc tcy cac ttg gar tgc ag-3′N1-2Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc crt tgt att tca ata cag c-3′生物素修飾的通用引物如下Uni-For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc-3′Uni-Rev5′-biotin-ctg gtc cgt act tcc gag cg-3′特異性檢測探針如下H5-1Probe5′-NH2-tat gca tac aaa att gtc aag aar gg-3′H5-2Probe5′-NH2-ccw gaa tat gca tac aag ata gtt aa-3′N1-1Probe5′-NH2-aaa tcc aag ggg gat gtg ttt gtt rt-3′
N1-2Probe5′-NH2-gtt ggt tga caa ttg gwa ttt cyg g-3′。
二.RT-PCR和PCR我們設計了兩輪PCR反應。其中第一輪反應即RT-PCR，利用特異性引物進行一步法RT-PCR。反應體系為25uL，其中5×buffer 5uL、dNTP 1uL、Enzyme 1uL、每個反應中加入RNA酶抑制劑5U、正向和反向引物各(每條引物終濃度為0.6uM)、RNA模板1uL，加水補足25uL體系。使用PTC-200PCR儀，條件設定為逆轉錄50℃30min，變性95℃15min，94℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，進行35個循環，最後72℃延伸5min。第二輪反應是利用Uni-Primers以第一輪反應產物為模板進行的PCR反應。反應體系為50uL，其中10×buffer5uL，dNTP 1uL，TaqDNA聚合酶1U，Uni-forward 1uL，Uni-reverse 1.5uL，加入前一步RT-PCR反應產物1uL，加水補足50uL體系。反應條件設定為變性95℃10min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，進行35個循環，最後72℃延伸5min。反應產物置4℃待雜交檢測。
三.液相晶片的製備1、探針與微球偶聯取出50uL(1×106個)需要的微球，12000rpm離心1min30sec後棄去上清，加入MES(0.1M，pH 4.5)8uL，混勻。將所用的探針用MES稀釋到20uM，在偶聯體系中加入2uL，加入EDC(10mg/mL)1.25uL第一次，混勻後避光放置30min。重複加入EDC一次。用500uLTween20(0.02％V/V)和SDS(0.1％W/V)各洗滌一次，最後將微球重新懸浮於20uL TE(PH8.0)溶液中，混勻後使用血細胞計數器計數微球數量(計數四角4個大方格的數目後換算為每uL微球個數)。4℃避光保存。混合偶聯好探針的微球，使用1.5×TMAC稀釋至每種微球的濃度是150個/uL。
2、擴增產物的液相雜交將產物與混合微球進行雜交，雜交體系為50uL，其中混合微球33uL，PCR產物5uL，加入TE補充體積至50uL。96℃變性5min後，52℃雜交15min。加入SA-PE 52℃雜交5min，等待上機檢測。
3、多功能流式點陣儀(Luminex 100TM)的設置設置儀器參數為Events100；Min event20。
Gate value的確定使用Luminex 100TM直接讀取本實驗中所使用未偶聯探針的微球，根據儀器讀取的峰值確定gate value大小。
四.標本的檢測1、RT-PCR和PCR對引物的驗證利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，我們分別檢測了兩輪擴增反應的產物。
圖1為一例H5N1亞型標本的RT-PCR產物結果，其中H5-2組中沒有出現擴增產物。其它組中擴增出了與預計片斷大小一致的產物。在應用混合引物進行的RT-PCR結果中，除H5-2組外，其它預計大小片斷產物都出現，同時亦擴增出了一條較大和一條較小的非特異性片斷。
在對利用Uni-Primers進行的第二輪PCR產物檢測中亦得到同樣結果。H5-2組並未得到PCR產物，分析其原因是H5-2組主要為H5N2亞型序列，而我們所用的是H5N1標本。
這次實驗所使用的其它亞型標本經電泳檢測，沒有發現明顯的相應大小擴增產物。證明我們設計的引物具有較好的特異性和可應用性。
2、Gate value的確定使用Luminex 100TM直接讀取本實驗中所使用未偶聯探針的微球，重複三次，從而確定本實驗中需要將gate value設定為9294～18441。儀器檢測結果見圖2。
3、特異性試驗結果如圖3-5，檢測了H5N1標本和其它幾種常見血清亞型標本。在H5N1亞型標本檢測中，四種微球都得到了較高的螢光強度，為陽性結果；在A1亞型標本檢測中，N1-2微球得到了較高的螢光強度(平均螢光強度值為185.07)；在其它亞型標本中，各種微球螢光強度都較低，為陰性結果。
4、靈敏度試驗結果經測定，該方法對H5N1亞型RNA的最低檢出量為10pg。結果見表2，隨著RNA檢測量的遞減，檢測的螢光強度值也逐漸遞減。在10pg時，只有H5-1和N1-2組有較高的螢光強度值(大於100)，為陽性結果。
五.附表靈敏度試驗結果
權利要求
1.一種檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其特徵是一種基於液相晶片檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，具體是利用液相晶片技術，運用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對在核酸序列庫中能夠檢索到的所有的H5、N1血清亞型核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對禽流感病毒H5和N1基因片斷的簡併引物和特異性探針，簡併引物包括特異性檢測引物和生物素修飾的通用引物，特異性探針通過與螢光編碼微球進行偶聯製成特異性檢測微球，即液相晶片；液相晶片能夠特異性的識別禽流感病毒H5和N1基因片斷，通過兩輪PCR反應，並通過液相晶片檢測儀讀出檢測結果，特異性檢測引物為H5-1For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg gac aat ttt raa rcc raa tg-3′H5-1Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgt tat cgc mcc cay tgg ag-3′H5-2For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tca atg gac aaa gtg gaa gaa t-3′H5-2Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cga agg cata ctr gaa ttt ata g-3′N1-1For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcg caa ttc atc tct ttg ycc-3′N1-1Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc acc cac agg aca act c-3′N1-2For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tcc tcy cac ttg gar tgc ag-3′N1-2Rev5′-ctg gtc cgt act tcc gag cgc crt tgt att tca ata cag c-3′，生物素修飾的通用引物為Uni-For5′-tac agt cgg tcg cgt gcc tc-3′Uni-Rev5′-biotin-ctg gtc cgt act tcc gag cg-3′，特異性檢測探針為H5-1Probe5′-NH2-tat gca tac aaa att gtc aag aar gg-3′H5-2Probe5′-NH2-ccw gaa tat gca tac aag ata gtt aa-3′N1-1Probe5′-NH2-aaa tcc aag ggg gat gtg ttt gtt rt-3′N1-2Probe5′-NH2-gtt ggt tga caa ttg gwa ttt cyg g-3′。
2.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其特徵在於所述的兩輪PCR反應，其中第一輪反應是利用合成的特異性檢測引物進行一步法RT-PCR，反應體系為25uL，其中5×buffer 5uL、dNTP 1uL、Enzyme 1uL、每個反應中加入RNA酶抑制劑5U、RNA模板1uL、正向和反向引物，每條引物終濃度為0.6uM，加水補足25uL體系，再使用PTC-200PCR儀，反應條件設定為逆轉錄50℃ 30min，變性95℃ 15min，94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec，進行35個循環，最後72℃延伸5min；第二輪反應是利用生物素標記的通用引物以第一輪反應產物為模板進行的PCR反應，反應體系為50uL，其中10×buffer 5uL，dNTP1uL，TaqDNA聚合酶1U，Uni-forward 1uL，Uni-reverse 1.5uL，加入前一步RT-PCR反應產物1uL，加水補足50uL體系，再使用PTC-200PCR儀，反應條件設定為變性95℃ 10min，94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，進行35個循環，最後72℃延伸5min，反應產物置4℃待雜交檢測。
3.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其特徵在於將特異性檢測探針偶聯到具有螢光編碼號的微球上去，製成液相晶片，具體是取出50uL螢光編碼微球，12000rpm離心1min30sec後棄去上清，加入MES(0.1M，pH4.5)8uL，混勻；將所用的探針用MES稀釋到20uM，在偶聯體系中加入2uL，加入10mg/mL的EDC 1.25uL第一次，混勻後避光保存30min；重複加入EDC一次；再用500uL的濃度為0.02％V/V的Tween20和0.1％W/V的SDS各洗滌一次，然後將微球重新懸浮於pH為8.0的20uLTE溶液中，混勻後使用血細胞計數器計數微球數量；最後，4℃避光保存，混合四種偶聯有特異性檢測探針的螢光微球，使用1.5×TMAC稀釋到每種微球的數量是150個/uL。
4.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其特徵在於該方法用於檢測禽流感病毒H5N1亞型。
5.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其特徵在於將液相晶片製成試劑盒。
全文摘要
本發明是基於液相晶片檢測禽流感病毒H5N1亞型的方法，其利用液相晶片技術，運用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對在核酸序列庫中能夠檢索到的所有的H5、N1血清亞型核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對禽流感病毒H5和N1基因片斷的簡併引物和特異性探針，特異性探針通過與螢光編碼微球進行偶聯製成特異性檢測微球，即液相晶片；液相晶片能夠特異性的識別禽流感病毒H5和N1基因片斷，通過兩輪PCR反應，並通過液相晶片檢測儀讀出檢測結果。本發明能夠對禽流感病毒H5N1亞型進行快速檢測和進行早期診斷，並為開發出檢測H5N1亞型和其它各種亞型流感病毒更為快速有效的方法提供了一條廣闊的前景。
文檔編號C12Q1/68GK1858249SQ20061001860
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月21日 優先權日2006年3月21日
發明者王華林, 夏駿, 袁麗, 鄧菲, 胡志紅 申請人:中國科學院武漢病毒研究所