一種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-28 05:01:31

一種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構及其製備方法和應用。所述核酸納米結構是通過DNA摺紙技術構建的任意二維和/或三維納米結構，具體是腳手架鏈與輔助摺疊的訂書釘鏈通過鹼基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結構。所述核酸納米結構作為抗腫瘤藥物的載體不但能夠保證其運載的抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，而且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集，顯著降低抗腫瘤藥物由於非特異性而產生的全身毒性。其製備方法工藝簡單、成本低且方便易行。
【專利說明】-種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構及其製備方法和 應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物載體【技術領域】，具體而言，本發明涉及一種用於運載抗腫瘤藥物 的核酸納米結構及其製備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一種嚴重危害人類健康的重要疾病。小分子抗腫瘤藥物缺乏特異性， 致使化學治療過程產生極大的副作用，常導致化療失敗。應用納米技術發展抗腫瘤藥物靶 向運輸和可控釋放的藥物運載系統是解決該問題的關鍵，已成為當前腫瘤治療研究領域的 執佔。
[0003] 以納米顆粒作為抗腫瘤藥物載體進行抗腫瘤治療的研究始於上世紀50年代，研 究較多的如高分子納米材料，脂質體或金納米粒子等。大量納米顆粒已被成功用於藥物轉 運和抗腫瘤研究與治療之中，如美國FDA批准的脂質體內包阿黴素（Doxorubicin)和聚乙 二醇（PEG)幹擾素 -a 2a (Pegasys) (Nature Reviews Drug Discovery, 2010, 9, 615-627; Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 145 - 160 ；J.Drug Target. 2006, 14, 301 - 310 ； Nature Review Cancer2006, 6, 688 - 701.)。基於納米技術，雖然有很多藥物運載體系已經 成功應用，但是要進一步解決抗腫瘤藥物缺乏特異性和高毒性的問題，在靶向運輸和可控 釋放抗腫瘤藥物研究領域仍然存在許多關鍵問題尚未解決。因此，探索新的製備方法，獲得 新型納米材料作為抗腫瘤藥物載體並進行細胞及動物水平的抗腫瘤實驗具有重要的理論 意義和潛在的應用價值。要解決上述問題，其核心是構建高效、低毒、靶向、可控的生物大分 子微米或納米結構作為藥物運輸和釋放系統，該藥載系統需滿足形態和粒徑容易控制、化 學結構容易修飾從而實現功能化、生物相容性較好等必要條件。
[0004] 在自然界的各種生命體中，生物大分子脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA)是遺傳信息的載體。而在結構DNA技術（structural DNA nanotechnology)中，DNA 不再作為遺傳信息的載體，而是通過預先進行特定的設計，形成納米結構的基元。DNA摺紙 技術（DNA origami)是一種新穎而獨特的DNA自組裝納米技術，即利用長的單鏈核苷酸序 列與若干條短的寡核苷酸序列通過鹼基互補配對進行雜交形成預先設計的結構，現在被廣 泛用來從DNA自下而上（Bottom-up)地製作各種納米尺度的二維和/或三維的DNA圖案和 形狀（Nature, 2006, 440, 297-302.)。利用DNA摺紙技術構造的納米結構具有結構可控、易 於修飾的特點，具有成為小分子抗腫瘤藥物載體的可能，在藥物運載方面有非常廣闊的潛 在應用前景。基於核酸序列的特性進行分析，可以發現與傳統抗腫瘤藥物運輸載體相比，核 酸納米結構的優勢十分明顯：1)能夠生物降解，具有其它載體不可比擬的良好的生物相容 性；2)沒有明顯的細胞毒性和免疫原性；3)結構具有高度可預測性；4)可以構造出所需要 的圖形結構，進一步構建複雜可控的納米級圖案和形狀；5)可以利用其結構本身直接裝載 與DNA分子相互作用的抗腫瘤藥物，也可利用其形成的納米結構包載藥物；6)內部可以進 行功能化修飾，因此能夠有效裝載多種藥物或成像試劑，從而實現載體的多功能性，以達到 多種藥物聯合給藥、治療與檢測同時完成的功能；7)具有良好的穩定性，對於內部裝載的藥 物將起到很好的保護作用；8)可在選擇的部位進行靶向性功能基團的修飾，增強載藥系統 的靶向性；9)可通過修飾使得結構在特定條件下能夠可控的開啟和關閉，從而達到控制藥 物釋放的目的。
[0005] 雖然，通過分析可知核酸納米結構具有上述優勢，但是目前尚無將核酸納米結構 作為抗腫瘤藥物的載體應用於人或動物腫瘤治療的報導。主要是因為核酸納米結構作為抗 腫瘤藥物的載體對抗腫瘤藥物的動物水平上的特異性及全身毒性的影響還缺乏認識。換句 話說，目前還沒有研究能夠證明核酸納米結構作為抗腫瘤藥物的載體是否能夠促進抗腫瘤 藥物在腫瘤組織中的富集以及是否能夠顯著降低抗腫瘤藥物對動物的全身毒性。
[0006] 因此，本領域亟需相關研究以證明核酸納米結構作為抗腫瘤藥物載體的價值的大 小。


【發明內容】

[0007] 針對現有技術的缺陷，本發明人經過大量試驗和創造性的勞動，預料不到地發現 核酸納米結構作為抗腫瘤藥物的載體不但能夠保證其運載的抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，而 且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集，顯著降低抗腫瘤藥物 由於非特異性而產生的全身毒性。因此，本發明的目的在於提供一種用於運載抗腫瘤藥物 的核酸納米結構及其製備方法和應用。
[0008] 為實現本發明的目的，採用以下技術方案：
[0009] 在第一方面，本發明提供一種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構，所述核酸納 米結構是通過DNA摺紙技術（DNA origami)構建的任意二維和/或三維納米結構，具體是 腳手架鏈（scaffold chains)與輔助摺疊的訂書釘鏈（staple strands)通過鹼基互補配對 原則進行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結構；優選地，所述抗腫瘤藥物為順鉬、環磷醯 胺、紫杉醇和阿黴素中的一種或多種，優選阿黴素。
[0010] 在本發明一個具體實施方案中，發明人研究了阿黴素作為抗腫瘤藥物由本發明的 核酸納米結構運載進入動物細胞及動物體後的藥理學或毒理學方面的效果。本領域的技術 人員能夠知曉，目前的抗腫瘤藥物及以後研發出來的抗腫瘤藥物均可以本發明的核酸納米 結構作為載體。
[0011] 本發明的核酸納米結構可以是M13噬菌體基因組DNA、基於M13噬菌體基因組DNA 進行改造的各種單鏈環狀DNA、Lambda噬菌體基因組DNA、通過PCR得到的M13噬菌體基因 組DNA片段或Lambda噬菌體基因組DNA片段和/或利用體外轉錄得到的RNA片段與人工 合成的寡核苷酸序列通過鹼基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成的，優選M13噬菌 體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過鹼基互補配對原則進行雜交完成自組裝而 形成的。
[0012] 本發明對腳手架鏈和輔助摺疊的訂書釘鏈的序列沒有特別要求，只要滿足特定位 點上的鹼基互補配對，使得訂書釘鏈能夠輔助腳手架鏈進行摺疊自組裝形成核酸納米結構 即可。
[0013] 本發明的核酸納米結構形狀可以是三角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、 納米片狀、帶狀或籠狀，優選為三角形。
[0014] 在第二方面，本發明提供一種如第一方面所述的核酸納米結構的製備方法，將輔 助摺疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻後，從溫度90?100°C、優選92?98°C、更 優選95°C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25°C、優選18?22°C、更優選20°C，降溫退火即 孵育時間為8?28h、優選10?26h、更優選12?24h，得到所述核酸納米結構；優選地，所 述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2?1:50,優選1:5?1:30,更優選1:10?1:25， 特別優選1:20。
[0015] 在本發明的核酸納米結構的製備方法中，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比 可以是 1:2、1:3、1:4、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:28、1:32、1:35、1:38、 1:40、1:42、1:45、1:48 或 1:49。
[0016] 在本發明的核酸納米結構的製備方法中，降溫起始溫度可以是90°C、91°C、92°C、 93°C、94°C、95t：、96t：、97t：、98t：、99t：*l(KrC。
[0017] 在本發明的核酸納米結構的製備方法中，降溫終止溫度可以是15°C、16°C、17°C、 18°C、19°C、2(rC、2rC、22t：、23t：、24t：*25t：。
[0018] 在本發明的核酸納米結構的製備方法中，孵育時間可以是9h、llh、13h、14h、15h、 18h、20h、21h、22h、23h、25h 或 27h。
[0019] 在第三方面，本發明提供一種載藥核酸納米結構，所述載藥核酸納米結構包括如 第一方面所述的核酸納米結構及嵌入所述核酸納米結構中的抗腫瘤藥物；優選地，所述抗 腫瘤藥物為順鉬、環磷醯胺、紫杉醇和阿黴素中的一種或多種，優選阿黴素。
[0020] 在第四方面，本發明提供一種如第三方面所述的載藥核酸納米結構的製備方法， 將所述核酸納米結構與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結構；優選地，將所述 核酸納米結構的溶液與所述抗腫瘤藥物的溶液混合，振蕩孵育，離心，棄上清，得到所述載 藥核酸納米結構；更優選地，將所述核酸納米結構與所述抗腫瘤藥物按照摩爾比為1: IO7? I: IO5數量級、優選I: IO6數量級混合於溶液中，在溫度20?30°C、優選22?28°C、更優選 24?26°C，轉速30?120rpm、優選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優選24?48h， 然後在溫度20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C條件下，轉速5000?lOOOOrpm、 優選7000?8000rpm離心5?20min、優選10?15min，棄上清，得到所述載藥核酸納米結 構。
[0021] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，所述核酸納米結構與所述抗腫瘤 藥物按照摩爾比可以是 1: 1〇7、1:2 X 107、1:4 X 107、1:5 X 107、1:8 X 107、1:9 X 107、1:106、 1:2 X 106、1:4 X 106、1:5 X 106、1:8 X 106、1:9 X IO6 或 1:105。
[0022] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，振蕩孵育的溫度可以是20°C、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0023] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，振蕩孵育的轉速可以是30rpm、 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、IlOrpm 或 120rpm〇
[0024] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，振蕩孵育的時間可以是20h、22h、 24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h 或 50h。
[0025] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，離心的溫度可以是2 (TC、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0026] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，離心的轉速可以是5100rpm、 5200rpm、5500rpm、5800rpm、6200rpm、6500rpm、6800rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、 8200rpm、8500rpm、8900rpm、9100rpm、9500rpm 或 9800rpm〇
[0027] 在本發明的載藥核酸納米結構的製備方法中，離心的時間可以是5min、6min、 7min、8min、9min、lOmin、llmin、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min 或 20min〇
[0028] 本領域的技術人員將會理解，本發明載藥核酸納米結構的製備方法並不必然依賴 於上述詳細工藝及參數，此處給出的僅僅是較優的技術方案。本領域技術人員可以根據其 經驗將所述核酸納米結構與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結構。
[0029] 在本發明一個具體實施方案中，載藥核酸納米結構的製備方法包括以下步驟：
[0030] (1)將M13噬菌體基因組DNA與所述人工合成的寡核苷酸序列按摩爾比為1:2? 1:50、優選1:5?1:30、更優選1:10?1:25、特別優選1:20混合於溶液中，從90?100°C、 優選92?98 °C、更優選95 °C開始，逐漸降溫退火至15?25 °C、優選18?22 °C、更優選 20°C，降溫退火即孵育時間為8?28h、優選10?26h、更優選12?24h，得到核酸納米結 構；
[0031] (2)將步驟（1)得到的核酸納米結構與阿黴素按照摩爾比為I: IO7?I: IO5數量級、 優選I: IO6數量級混合於溶液中，在20?30°C、優選22?28 °C、更優選24?26 °C，30? 120rpm、優選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優選24?48h ;
[0032] (3)將步驟（2)得到的溶液在20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C條件 下，5000?lOOOOrpm、優選7000?8000rpm離心5?20min、優選10?15min，棄上清，得 到所述載藥核酸納米結構。
[0033] 在第五方面，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括如第三方面所述 的載藥核酸納米結構，任選地，還包括藥學上可接受的載體；優選地，所述藥物組合物的活 性成分為所述載藥核酸納米結構或其在藥學上可接受的鹽、酯或溶劑合物，用於治療和/ 或預防腫瘤，或者抑制腫瘤細胞增殖。
[0034] 在第六方面，本發明提供一種如第一方面所述的核酸納米結構作為抗腫瘤藥物的 載體的應用，優選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺 細胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
[0035] 在第七方面，本發明提供一種如第一方面所述的核酸納米結構或如第三方面所述 的載藥核酸納米結構在製備用於治療和/或預防腫瘤或者抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的 應用，優選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細胞癌、 前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
[0036] 本發明中，術語"訂書釘鏈"、"寡核苷酸序列"和"短鏈核苷酸序列"雖然是不同 的名詞，但其含義和其所指對象的功能是相同的，即均指通過鹼基互補配對原則對腳手架 鏈起到輔助摺疊作用以使其自組裝形成特定二維和/或三維結構的短的核苷酸序列，稱為 "訂書釘鏈"是一種形象的表達，意指其像訂書釘一樣將腳手架鏈的不同位點釘在一起。
[0037] 本發明中，術語"腳手架鏈"是指長的DNA或RNA序列，尤其是指單鏈DNA序列，其 是形成核酸納米結構的主體原料，在訂書釘鏈的輔助摺疊作用下自組裝形成特定二維和/ 或三維結構。
[0038] 本發明中，術語"核酸納米結構"是指腳手架鏈在訂書釘鏈的輔助摺疊作用下自組 裝形成的特定二維和/或三維結構，需要說明的是，該名稱雖然含有"納米"一詞，但其實際 所指的對象並不一定要限定為納米級別，本領域的技術人員將會理解，雖然納米級別的顆 粒作為藥物載體是常見的，但也有些藥物載體能夠達到微米的級別，因此，本發明納米只是 一個統稱，核酸納米結構實際上代表納米或微米級別的具備本發明技術特徵的結構。
[0039] 本發明中，術語"載藥核酸納米結構"是指核酸納米結構負載和/或嵌入相應藥物 (本發明特指抗腫瘤藥物）或其活性成分形成的結構複合體。
[0040] 本發明的有益效果為：本發明通過DNA摺紙技術，即腳手架鏈與輔助摺疊的訂書 釘鏈通過鹼基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成核酸納米結構，該核酸納米結構可 作為抗腫瘤藥物的載體，細胞水平和動物水平的實驗證明其不但能夠保證其運載的抗腫瘤 藥物的抗腫瘤活性，而且能夠提高抗腫瘤藥物的靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織中富集， 顯著降低抗腫瘤藥物由於非特異性而產生的全身毒性。本發明製備所述核酸納米結構的方 法，只需要按照合適的比例將輔助摺疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻後，在適宜 的溫度範圍內降溫以實現自組裝，不需要太多的人為幹預，因此工藝簡單、成本低且方便易 行。本發明製備的核酸納米結構嵌入抗腫瘤藥物可以製成載藥核酸納米結構，作為抗腫瘤 藥物組合物的活性成分，用於治療和/或預防腫瘤或者抑制腫瘤細胞增殖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為三角形的未裝載阿黴素的核酸納米結構及裝載阿黴素的載藥核酸納米結 構的原子力顯微鏡照片，標尺為lOOnm。
[0042] 圖2為阿黴素組及裝載阿黴素的載藥核酸納米結構組對MDA-MB-231細胞增殖的 抑制效果的對比圖，其中藥物濃度均指阿黴素的濃度。
[0043] 圖3為阿黴素組及裝載阿黴素的載藥核酸納米結構組在移植瘤中匯聚的對比圖， 標尺為50 μ m。
[0044] 圖4為對照組(生理鹽水組)、阿黴素組及裝載阿黴素的載藥核酸納米結構組的荷 瘤鼠腫瘤體積的對比圖。
[0045] 圖5為對照組、阿黴素組、核酸納米結構組及裝載阿黴素的載藥核酸納米結構組 的荷瘤鼠體重的對比圖。

【具體實施方式】
[0046] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理 解，以下實施例僅為本發明的優選實施例，以便於更好地理解本發明，因而不應視為限定本 發明的範圍。對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明， 均為自常規生化試劑廠商購買得到的。下述實施例中的定量實驗，均設置三次重複實驗，結 果取平均值。
[0047] 本發明所用的器材和材料：
[0048] 器材：Mastercycler Pro 梯度 PCR 儀（Eppendorf，德國），5810R 小型高速離心機 (Eppendorf，德國)，UV-2450紫外-可見分光光度計（島津，日本)，全波長酶標儀（TECAN，瑞 士)，Veeco MultiMode8原子力顯微鏡（Veeco,美國），突光顯微鏡（Olympus,日本)。
[0049] 原料：短鏈核苷酸序列（訂書釘鏈，Nature，2006,440, 297-302)購自上海英濰捷基 生物技術有限公司，M13噬菌體基因組DNA購自New England Biolabs公司，阿黴素購自北 京華奉聯博科技有限公司。
[0050] 試劑：實驗中所用的緩衝溶液有TAE/Mg2+緩衝溶液（pH8. 0 )和PBS緩衝溶液 (ρΗ7·4)。其中，ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩衝溶液（ρΗ8·0)的組分為：4Xl(T 2mol I^TrisJXK^mol 171乙酸，2.0父10-3111〇117屯0了4和1.25\10-2111〇117 1醋酸鎂；1\?85緩衝溶液化!17.4)的組 成為：136.9Xl(T3mol 1^(8. OOg ONaCU 68Xl(T3mol rHOJOg Οκα,ΙΤδΧΚΓ^ιοΙ Γ1 (L 56g Γ1) Na2HPO4 ·Η20 和 L 47 X l(T3mol Γ1 ((λ 20g Γ1) KH2PO4 ;這些緩衝溶液所用的試 劑均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司。細胞活力實驗所使用的細胞計數試劑盒購自日 本同仁化學。
[0051] 細胞：人乳腺癌MDA-MB-231細胞系購自中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞 中心。
[0052] 培養基：DMEM高糖培養基，添加10%胎牛血清，細胞接種於IOOmm2培養皿中，置於 5%C0 2培養箱，37°C培養，當細胞生長至融合度80%左右時傳代；所用培養基和胎牛血清購 自 ThermoFisher Scientific 公司。
[0053] BALB/c裸鼠：購自北京大學醫學部。
[0054] 實施例1製備核酸納米結構和載藥核酸納米結構
[0055] 將50 μ L終濃度為5nM的M13噬菌體基因組DNA與100 μ L終濃度為50nM的訂書 釘鏈混合溶液充分混勻在ImL I XTAE/Mg2+ (pH=8. 0)溶液中，從95°C開始，逐漸降溫退火 至20°C，退火孵育時間為12?24h，製備得到具有預先設計幾何外形的核酸納米結構。
[0056] 取5mM的阿黴素溶液ImL加入到5nM的核酸納米結構溶液ImL中，混合均勻，在 22?28°C，70rpm的條件下，振蕩孵育24h裝載阿黴素。
[0057] 將上述裝載阿黴素的混合溶液在22?28°C條件下，7000?8000rpm離心10? 15min，以去除上清液中未裝載的阿黴素，得到裝載阿黴素核酸納米結構，同時通過測定上 清液中未裝載的阿黴素含量，利用如下計算式計算確定已裝載阿黴素的濃度。
[0058] DOX裝載量=DOX總投入量-DOX未裝載量，（D0X為阿黴素）。
[0059] 使用原子力顯微鏡觀察並拍攝上述核酸納米結構和載藥核酸納米結構的照片，由 圖1可見裝載阿黴素的過程對於核酸納米結構沒有明顯的影響。
[0060] 實施例2載藥核酸納米結構對MDA-MB-231細胞增殖的抑制效果
[0061] 培養MDA-MB-231細胞至對數生長期，胰蛋白酶消化，收集細胞，調整細胞懸液濃 度為5 X IO4個/mL，接種96孔板，每孔100 μ L。將96孔板置於二氧化碳培養箱中培養過夜， 吸出培養液，加入不同濃度（阿黴素0. 01，0. 1，1，10,100 μ Μ)的載藥核酸納米結構，每個濃 度組5個復孔,另選5組分別加入不同濃度（0. 01,0. 1,1,10,100 μ Μ)阿黴素。另設一組為 空白對照組(接種細胞，不加藥)。將已加藥處理的MDA-MB-231細胞繼續置於培養箱中培養 24h，吸棄含藥培養基，每孔加入0. 5mg/mL的CCK-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基）-3-(4-硝 苯基）-5-(2, 4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）溶液100 μ L，繼續孵育2h，用酶標儀（450nm) 檢測每孔的OD值。根據OD值計算出腫瘤細胞抑制率，計算公式為
[0062] 抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值。
[0063] 由圖2可見核酸納米結構能夠運載抗腫瘤藥物阿黴素，在細胞水平上具有抑制腫 瘤細胞增殖的作用，在相同阿黴素濃度條件下，其抑制效果與單獨阿黴素的抑制效果相當。
[0064] 實施例3載藥核酸納米結構在腫瘤組織中的靶向性富集
[0065] 培養MDA-MB-231細胞至對數生長期，胰蛋白酶消化，收集細胞，調整細胞懸液濃 度為I X IO7個/mL，取100 μ L原位接種於5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，進行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周後，分為3組進行給藥處理，分別為生理鹽水組，阿黴素組(阿黴素 6mg/kg/天)，載藥核酸納米結構組（即裝載阿黴素的核酸納米結構，給藥含量相當於阿黴素 6mg/kg/天，核酸納米結構0. 071mg/kg/天)，靜脈注射藥物。24小時後，摘取腫瘤進行冰凍 切片，在螢光顯微鏡綠光激發（450?520nm激發，優選激發波長為480nm)下，觀察腫瘤組 織切片中藥物的紅色螢光。
[0066] 通過冰凍切片的螢光照片（圖3)，可見阿黴素在腫瘤部分有很弱的螢光信號，說明 小分子藥物本身基本對於腫瘤組織沒有靶向性，載藥核酸納米結構在腫瘤部分有很強的熒 光信號，說明載藥核酸納米結構具有明顯的腫瘤靶向性。
[0067] 實施例4載藥核酸納米結構對荷瘤鼠腫瘤治療的藥效及毒性研究 [0068] 培養MDA-MB-231細胞至對數生長期，胰蛋白酶消化，收集細胞，調整細胞懸液濃 度為I X IO7個/mL，取100 μ L原位接種於5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，進行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周後，分為4組進行給藥處理，分別為生理鹽水組，阿黴素組(阿黴素 6mg/kg/天)，核酸納米結構組(核酸納米結構0. 071mg/kg/天)，載藥核酸納米結構組（即裝 載阿黴素的核酸納米結構組，給藥含量相當於阿黴素6mg/kg/天，核酸納米結構0. 071mg/ kg/天)，連續靜脈注射12天。隔日稱量荷瘤鼠體重，使用遊標卡尺測量腫瘤長度和寬度，計 算腫瘤大小，計算公式為：
[0069] 腫瘤大小=Π XaXb2/6, Π 為圓周率，a為腫瘤長度，b為腫瘤寬度。
[0070] 由圖4可見，對照組(生理鹽水組)荷瘤鼠的腫瘤體積隨時間延長持續增大，單獨阿 黴素組和載藥核酸納米結構組荷瘤鼠的腫瘤體積隨給藥時間延長而縮小，但阿黴素組荷瘤 鼠未能完成全部給藥周期而死亡(實驗平行作3次均是相同結果)，反應出單獨阿黴素嚴重 的副作用。該結果進一步證明載藥核酸納米結構具有良好的抗腫瘤作用，而且能夠降低抗 腫瘤藥物(阿黴素）由於非特異性而產生的全身毒性。
[0071] 實驗結束時，進一步檢測每組荷瘤鼠的血常規指標(表1 )。
[0072] 表1荷瘤鼠血常規指標
[0073]

【權利要求】
1. 一種用於運載抗腫瘤藥物的核酸納米結構，其特徵在於，所述核酸納米結構是通過 DNA摺紙技術構建的任意二維和/或三維納米結構，具體是腳手架鏈與輔助摺疊的訂書釘 鏈通過鹼基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成的核酸納米結構；優選地，所述抗腫 瘤藥物為順鉬、環磷醯胺、紫杉醇和阿黴素中的一種或多種，優選阿黴素。
2. 根據權利要求1所述的核酸納米結構，其特徵在於，所述核酸納米結構是M13噬菌 體基因組DNA、基於M13噬菌體基因組DNA進行改造的各種單鏈環狀DNA、Lambda噬菌體基 因組DNA、通過PCR得到的M13噬菌體基因組DNA片段或Lambda噬菌體基因組DNA片段和 /或利用體外轉錄得到的RNA片段與人工合成的寡核苷酸序列通過鹼基互補配對原則進行 雜交完成自組裝而形成的，優選M13噬菌體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過鹼 基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成的。
3. 根據權利要求1或2所述的核酸納米結構，其特徵在於，所述核酸納米結構形狀呈三 角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、納米片狀、帶狀或籠狀，優選為三角形。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的核酸納米結構的製備方法，其特徵在於，將輔助折 疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻後，從溫度90?100°C、優選92?98°C、更優選 95°C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25°C、優選18?22°C、更優選20°C，降溫退火即孵育 時間為8?28h、優選10?26h、更優選12?24h，得到所述核酸納米結構；優選地，所述腳 手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2?1:50,優選1:5?1:30,更優選1:10?1:25,特 別優選1:20。
5. -種載藥核酸納米結構，其特徵在於，所述載藥核酸納米結構包括如權利要求1至3 中任一項所述的核酸納米結構及嵌入所述核酸納米結構中的抗腫瘤藥物；優選地，所述抗 腫瘤藥物為順鉬、環磷醯胺、紫杉醇和阿黴素中的一種或多種，優選阿黴素。
6. 如權利要求5所述的載藥核酸納米結構的製備方法，其特徵在於，將所述核酸納米 結構與所述抗腫瘤藥物接觸形成所述載藥核酸納米結構；優選地，將所述核酸納米結構的 溶液與所述抗腫瘤藥物的溶液混合，振蕩孵育，離心，棄上清，得到所述載藥核酸納米結構； 更優選地，將所述核酸納米結構與所述抗腫瘤藥物按照摩爾比為1: 1〇7?1: 1〇5數量級、優 選1:106數量級混合於溶液中，在溫度20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C，轉 速30?120rpm、優選60?90rpm條件下，振蕩孵育20?50h、優選24?48h，然後在溫度 20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C條件下，轉速5000?lOOOOrpm、優選7000? 8000rpm離心5?20min、優選10?15min，棄上清，得到所述載藥核酸納米結構。
7. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟： (1) 將M13噬菌體基因組DNA與所述人工合成的寡核苷酸序列按摩爾比為1:2?1:50、 優選1:5?1:30、更優選1:10?1:25、特別優選1:20混合於溶液中，從溫度90?100°C、 優選92?98 °C、更優選95 °C開始，逐漸降溫退火至溫度15?25 °C、優選18?22 °C、更優 選20°C，降溫退火即孵育時間為8?28h、優選10?26h、更優選12?24h，得到核酸納米 結構； (2) 將步驟（1)得到的核酸納米結構與阿黴素按照摩爾比為1:107?1:105數量級、優 選1:106數量級混合於溶液中，在溫度20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C，轉速 30?120rpm、優選60?90rpm條件下，振蕩鮮育20?50h、優選24?48h ; (3) 將步驟（2)得到的溶液在溫度20?30°C、優選22?28°C、更優選24?26°C條件 下，轉速5000?lOOOOrpm、優選7000?8000rpm離心5?20min、優選10?15min，棄上 清，得到所述載藥核酸納米結構。
8. -種藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物包括如權利要求5所述的載藥核酸 納米結構，任選地，還包括藥學上可接受的載體；優選地，所述藥物組合物的活性成分為所 述載藥核酸納米結構或其在藥學上可接受的鹽、酯或溶劑合物，用於治療和/或預防腫瘤， 或者抑制腫瘤細胞增殖。
9. 如權利要求1至3中任一項所述的核酸納米結構作為抗腫瘤藥物的載體的應用，優 選地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細胞癌、前列腺 癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
10. 如權利要求1至3中任一項所述的核酸納米結構或如權利要求5所述的載藥核 酸納米結構在製備用於治療和/或預防腫瘤或者抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用，優選 地，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細胞癌、前列腺癌 和非何金氏淋巴瘤中的至少一種。
【文檔編號】A61P35/00GK104368004SQ201310351835
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】丁寶全, 蔣喬, 王金業, 杜洋, 張倩 申請人:國家納米科學中心, 中國科學院自動化研究所