治療性促凋亡bh3樣分子和用於產生和/或選擇它的方法

2023-05-27 23:40:16 5

專利名稱：：治療性促凋亡bh3樣分子和用於產生和/或選擇它的方法治療性促凋亡BH3樣分子和用於產生和/或選擇它的方法發明背景發明領域本發明通常涉及用於調節靶細胞或細胞群體中的凋亡的治療性分子。更特別地，本發明提供了抑制促存活分子的和能夠誘導或促進靶細胞或細胞群體例如癌細胞的凋亡的治療劑。本發明還提供了用於產生或選擇該治療分子和包含所述治療分子的藥物組合物的方法。現有技術的描述-說明書中參考的現^孜盡不7反和不膽當眠當1T町"^任何國家形成了共同的一般知識的承認或任何形式的暗示。本申請中提供的資料的詳細目錄列於本申請書的結尾。癌症是發達國家中的第二大死亡原因。除了它使患者和其家庭遭受痛苦外，其也是治療花費最昂貴的疾病之一(Zhang，#WWeK//"or厶101-102，2002)。因此，雖然對人生活產生極大的代價，但如果考慮到治療費用和減少的經濟生產率的代價，對社會的年經濟負擔預期到2010年時大約為2000至50D0億美元。對編程性細胞死亡(凋亡)的千擾是許多主要疾病包括癌症的發展中的中心步驟。凋亡的至關重要的調節物的一個家族是Bcl-2蛋白家族。研究已顯示人濾泡性淋巴瘤中增強的Bcl-2家族的過度表達抑制了凋亡和促進腫瘤發生(Vaux等人，Wfl"re440-442，1988;和Strasser等人，^"wre雄331-333，1990)。在高達90°/。的乳腺癌、結腸癌和前列腺癌中發現Bcl-2的過度表達(Zhang，2002，同上)，所述癌症代表了一些最常見的癌症。Bel-2的促存活相關物也在許多腫瘤中過度表達。事實上，現已接受被削弱的凋亡為大多數惡性腫瘤發生的中心步驟(Cory等人，iVa"e"a"cer麼.647-656，2002)。被削弱的凋亡也是細胞毒性癌症治療功效的主要障礙(Cory等人，2002，同上；Johnstone等人，Ce//153-164，2002)。大多數細胞毒性劑，包括許多化療藥物和放射性藥物，通過分子例如腫瘤抑制劑p53間接觸發凋亡(Cory等人，2002，同上)。然而，在大多數腫瘤中，p53途徑被失活，這阻止了啟始凋亡。因此p53功能的喪失或Bcl-2的過度表達可引發藥物抗性，是治療失敗的共同原因。促進細胞存活的Bcl-2蛋白家族的成員，包括哺乳動物Bcl-2、Bc卜Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al,包含3或4個序列相似的BH(Bcl-2同源性)區，並且持續作用直至被其唯一的BH3only相關物中和。這些促細月包凋亡拮抗劑，包括哺乳動物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa相互相關，並且是只被短的BH3結構域識別的廣泛家族(Huang和Strasser，Ce777W:839-842，2000)。相反地，Bax和Bak(促細胞凋亡家族成員的亞組)與Bel-2共有3個BH結構域，並且可能在胞內膜的透化中具有基本的下遊功能(Wei等人，Sc/e/2ce"麼.727-730，2001)。BH3-only蛋白監控細胞正常，而破壞信號觸發它們對促存活Bel-2樣蛋白的給合，從而起始細胞死亡(Cory等人，0/2coge"e":8590-8607，2003;Huang和Strasser，2000，同上)。其由轉錄信號(例如Bim、Puma、Noxa)或不同翻譯後機制(例如Bim、Braf、Bad、Bid)誘導的差異激活提供了一些信號轉導特異性(Puthalakath等人，Ce〃/^7Ter久'505-512，2002)。然而，一旦被激活，通常認為不同的BH3-only蛋白通過靶向所有促存活Bcl-2樣蛋白類似地起作用(Adams等人，6^2<^"ey77:2481-2495，2003;Cory等人.2003同上；Huang和Strasser,2000，同上)。直到最近其相互作用才得到系統性表徵，少數研究局限於Bel-Xl或Bc卜2(Letai等人，Ce//麼."3-192，2002;Petros等人，2000，同上；Sattler等人，1997，同上)。現已出版了揭示一些BH3only蛋白是泛宿主性結合劑而其他為更具選擇性的結合劑的詳盡研究(Chen等人，Ce7/777.'393-403，2005)。確定不同的BH3-only蛋白和促存活家族成員是選擇性地相互作用還是泛宿主性地相互作用對於闡明細胞死亡啟動的機制(Adams，2003，同上；Cory等人，2003，同上；Danial和Korsmeyer，Ce//"^;205-219，2004)是非常重要的並且對發展模擬BH3-only蛋白的作用、作為新抗癌藥的化合物的當前努力是緊密相關的。根據對具有更少的毒性和更好的被靶向的抗癌療法的需要，存在對鑑定與Bcl-2樣蛋白相互作用以抑制其促存活功能的分子的明確需要。發明概述本發明涉及用於調節細胞或細胞群體的凋亡的分子。特別地，本發明提供了促存活分子的拮抗劑，特別是促存活Bcl-2蛋白家族的一個或多個成員的拮抗劑。受試促存活Bcl-2相互作用分子的產生和/或選擇基於BH3-only促凋亡蛋白內的胺基酸殘基的鑑定，所述胺基酸殘基是發生BH3-only蛋白和促存活Bel-2蛋白之間的BH3結構域結合所必需的。可在與其相互作用的促存活Bcl-2蛋白i普方面從功能上區分BH3-only蛋白。通過鑑定特定BH3-only蛋白與特定促存活Bcl-2蛋白之間發生結合所必需的胺基酸，可產生或選擇特異性與促存活Bcl-2蛋白相互作用和抑制其功能的拮抗劑。此類拮抗劑與耙細胞或細胞群的接觸阻止了促存活Bel-2蛋白的活性，從而在把細胞或耙細胞群體中誘導凋亡。可選擇地，這些靶的鑑定導致用於抑制凋亡分子分子用於治療退行性疾病(degenerativedisease)。因此，本發明的一個實施方案涉及試劑，所述試劑拮抗特定促存活Bel-2蛋白，從而使得能夠在選擇的類型的細胞或細胞群體例如但不限於與癌細胞或過度增殖性疾病相關的細胞中誘導凋亡。特別地，本發明涉及用於產生促存活Bcl-2家族成員的方法，該方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結構域的一個或多個胺基酸殘基；b.將突變的BH3結構域與促存活Bcl-2家族成員接觸；c.檢測突變的BH3結構域與促存活Bcl-2家族成員之間的結合的存在，從而鑑定促凋亡蛋白的BH3結構域中與BH3結構域和促存活Bel-2家族成員之間的結合相互作用相關的胺基酸殘基；和d.產生拮抗劑，其模擬在BH3結構域與Bcl-2蛋白之間發生結合所必需的胺基酸處的野生型BH3結構域的。上述部分c)中的"檢測"包括通過促存活蛋白或促凋亡蛋白的效應進行的間接檢測和結合的直接檢測。方便地，所述拮抗劑是結合促存活蛋白並且抑制其功能的肽。因此，在一個特定的實施方案中，所述拮抗劑是基於經修飾的BH3-only促凋亡蛋白的肽拮抗劑或肽模擬物。本發明的肽拮抗劑對於一種或多種促存活分子(包括但不限於Bcl-2、Bc1-Xl、Bc1-w、Mcl-l或Al)可以是特異性的。通過突變促凋亡蛋白例:ft口但不卩艮於Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid中的一種或多種中的殘基來進行拮抗劑的鑑定。在特定的實施方案中，從具有選自SEQIDN0s:1至10的BH3-only結構域序列的促凋亡蛋白衍生本發明的拮抗劑，其中所述BH3-only結構域在一個或多個胺基酸位點和/或在N和/或C末端部分具有一個或多個胺基酸置換、缺失或添加。促凋亡分子的特定突變體包含選自下列的突變Bim:D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、18A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、115A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A;Bad:N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E;Bid:Q1A、E2A、D3A、I4A、15A、R6A、N7A、18A、A9E、R10A、H1U、L12A、A13E、Q14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、123A、P24A、P25A和G26E;邁NoxaA:R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q1U、L12A、R13A、K14A、115A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C2U、T22A、W23A、S24A、A25E和D26ABak:P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、115A、G16E、D17A、D18A、119A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。在上面的突變的目錄中，"XnY"代表在殘基編號n上用胺基酸殘基X置換胺基酸殘基Y。殘基編號對應於BH3結構域的胺基酸序列。對於任何給定的促凋亡分子，可存在一個或多個突變。可通過方法例如但不限於計算;f幾篩選方法(silicoscreening)、高通量化學篩選法、基於功能的篩選法或構效關係法(structure-activityrelationship)產生促存活Bcl-2家族成員的拮抗劑。在另一個實施方案中，以藥物形式例如藥物組合物方便地提供本發明的拮抗劑。本發明的拮抗劑特別適用於治療具有癌症或過度增生性疾病或對發生癌症或過度增生性疾病易感的受試者。本發明的促存活分子包括但不限於Bc-2促存活家族蛋白的成員，包括但不限於Bcl-2、Bcl-XL、Bc卜W、Mc卜1和A1。在表l中提供了整個本說明書中使用的序列標誌符的概述。表l淨W標^存襯迷EDNO:描迷1BIM的BH3結構域DMRPEIW1AQELRRIGDEFNAYYARR2Puma的BH3結構域EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYERR3mBmf的BH3結構域-HRAEVQIARKLQCIADQFHRLHTQ-4Bad的BH3結構域NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKG5Bik的BH3結構域-MEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAP6Hrk的BH3結構域RSSAAQLTAARLKAIGDELHQRTMWR7Bid的BH3結構域QEDHRNIARHLAQVGDSMDRSIPPO8Noxa的BH3結構域:PAELEVECATQLRRFGDKLNFRQKLL9mNoxaA的BH3結構域RAELPPEFAAQLRKIGDKVYCTWSAP10邁NoxaB的朋3結構域-PADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKLLN11Bak的BH3結構域PSSTMGQVGRQLADGDDINRRYDSE序列的開始或末尾的"-"表示胺基酸殘基的缺失。發明詳述在詳細描述本發明之前，要理解除非另外指出，本發明不限定於特定組分的製劑、生產方法、劑量或診斷方案等。也要理解，此處使用的術語只是為了描述特定的實施方案而不希望受到限定。除非上下文明確指出，單數形式"a"、"an"和"the"包括複數。因此，例如，"aBH3-only蛋白"包括單個BH3-only蛋白也包括2個或更多個BH3-only蛋白；"an試劑"包括一種試劑，也包括2種或更多種試劑；"the製劑"包括單種製劑或多種製劑；等等。此處參考的所有科學引述、專利、專利申請和廠商技術說明書在此以其全文引用作為參考。序列的開始或結尾的"-"表示胺基酸殘基的缺失。BH3結構域中的突變表示為"XnY",其中胺基酸殘基X在位點編號n上取代胺基酸殘基Y。在描述本發明和要求本發明的權利中，按照下面所示的定義使用下列術語。在整個說明書和其後的權利要求中，除非上下文需要，術語"包括"，和變化形式"包含"和"含有，，，理解為表示包括所述整體或步驟或整體或步驟的分組但不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟的分組。術語"試劑"、"化合物"、"藥物活性劑"、"藥物"和"活性的"在此處可互換使用，表示誘導想要的藥理學和/或生理學效應的物質。所述術語也包括其藥學上可接受的形式和藥學活性形式，包括但不限於鹽、酯、醯胺、前體藥物、活性代謝物、類似物等。在一個實施方案中想要的效應是抑制或拮抗促存活分子，從而誘導細胞凋亡。在另一個實施方案中，想要的效應是通過拮抗促凋亡分子來促進細胞存活。"藥劑"、"藥物活性劑"、"藥物，，可包括兩種或更多種此類物質例如兩種或更多種促存活拮抗劑的混合物。"混合物"也包括多部分混合物例如兩部分組合物，其中在分配之前分開地提供和分開地給予或分配所述藥劑或將其混合在一起。例如，多部分藥物包裝可具有分開保存的針對兩種或更多種促存活蛋白的兩種或更多種拮抗劑。包括使用促存活拮抗劑和抗癌劑(即化學治療劑)的組合療法也形成了本發明的部分。此處使用的術語"有效量"和"治療有效量"是指足以提供想要的治療或生理學效應或效果例如抑制促存活蛋白的活性或誘導把細胞凋亡的藥劑的量。此外，所述效應可以是細胞病症例如癌症的症狀的改善。同時再次要提出的是，想要的效應可以是在例如退行性疾病的情況下促進細胞的存活。不想要的效應，例如副作用，有時隨想要的治療效應一起表現；因此，醫生在確定什麼是恰當的"有效量，，中要平衡潛在的益處對潛在的風險的平衡。藥劑的確切量隨受試者的不同而不同，依賴於物種、年齡和受試者的一般狀況、施用的模式等。因此，不可能確定確切的"有效量"。然而，通過使用常規實驗本領域技術人員可確定任何個體情況下的合適的"有效量，，。例如，可容易地在體外或動物模型中確定促存活蛋白的拮抗劑發揮作用的能力。關於後者，本領域技術人員能夠基於這樣的因素例如動物的，動物的症狀的嚴重度和選擇的特定組合物或施用途徑確定所需量。然後將該信息外推至更大型的動物例如人。在本發明的一個實施方案涉及蛋白或肽的用途的範圍內，有效量包括大約10yg/kg體重的抗體至20mg/kg體重的抗體例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100jag/kg體重、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000jig/kg體重或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg體重。為單一治療或組合治療提供相似的量。"藥學上可接受的"栽體和/或稀釋劑是由非生物或想要的材料即可與選擇的活性劑一起施用但不導致任何或顯著不利反應的材料組成的藥物媒介物。栽體可包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、用於調節張力的試劑、緩衝劑、螯合劑和吸收延遲劑等。類似地，此處提供的化合物的"藥學上可接受的"鹽、酯、醯胺、前體藥物或衍生物是非生物的或不想要的的鹽、酯、醯胺、前體藥物或4汙生物。此處使用的術語"治療"和"醫治"是指治療性處理和預防性或防護性措施。例如，治療可導致癌症的症狀的嚴重度和/或頻率的減少、癌症的症狀和/或背後的病因的消除、癌症和/或其背後病因的發生的預防以及患癌症後的損傷的改善、補救或好轉。因此，治療可以不導致症狀的"治癒，，但可以導致症狀的改善。此外，治療可以不是原發性癌症的治療但可以是續發性癌症或轉移癌的治療。術語"病狀"和"疾病"在整個本說明書中可互換使用。此處使用的"受試者"是指動物，優選哺乳動物和更優選可從本發明的藥物組合物和方法受益的人。不存在對可從本發明描述的藥物組合物和方法受益的動物類型的限定。無論是人或非人動物的受試者可稱作個體、患者、動物、宿主或接受者以及受試者。本發明的組合物和方法用於人的藥物和獸醫藥物。優選哺乳動物是人、實驗室實驗動物和參與賽跑和耐力行業的動物。實驗室實驗動物的實例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、倉鼠、貓和狗。賽跑和耐力行業的動物的實例包括馬、狗、牛和駱駝。本發明涉及用於產生促存活蛋白的拮抗劑的方法。所述拮抗劑誘導或促進凋亡。基於促凋亡分子中參與本發明的拮抗劑BH3-only促凋亡蛋白家族的成員和Bcl-2蛋白的促存活家族的成員之間的結合的胺基酸殘基的鑑定產生本發明的拮抗劑。因而本發明涉及用於調節細胞或細胞群體的凋亡的分子。特別地，本發明在一個實施方案中涉及Bcl-2蛋白家族的促存活成員的拮抗劑。此處的"凋亡，，是指其中程序化的事件順序導致細胞的死亡和消除的細胞死亡形式。凋亡細胞經歷獨特的形態學變化。凋亡的標誌包括細胞皺縮、細胞核和細胞質凝縮以及質膜拓樸學的改變。在生物化學上，凋亡細胞的特徵在於增加的細胞內鈣濃度、染色體DNA的片段化和新的細胞表面組分的表達。因此，在本發明的一個實施方案，產生一個或多個Bcl-2蛋白家族成員的拮抗劑，使得能夠在選擇的細胞或細胞群體例如但不限於癌細胞和正在經歷不想要的過度增殖的細胞中誘導凋亡。此處的"癌細胞"是指展示非正常生長和傾向於以不受控制的方式增殖的和在一些情況下導致腫瘤和/或轉移的細胞。涉及使用本發明的拮抗劑治療的癌症包括，但不限於ABL1原癌基因、AIDS相關性癌症、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、嚢性腺樣癌、腎上腺皮質癌、特發性骨髓外化生、斑禿、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星形細胞瘤、共濟失調性毛細血管擴張症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦幹神經膠質瘤、腦和兒童中樞神經系統腫瘤(brainandenstumor)、乳腺癌、兒童中樞神經系統腫瘤(enstumor)、類癌瘤、子宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌(childhoodcancer)、兒童期非白血性白血病(childhoodleukemia)、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、結腸直腸癌、皮膚T淋巴細胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、結締組織增生性小圓細胞肺瘤、導管癌、內分泌癌(endocrinecancer)、子宮內膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、眼癌、目艮黑素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、範可尼貧血、纖維肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸癌、胃腸類癌瘤、泌尿生殖器腫瘤、生殖細胞腫瘤、妊娠性滋養層細胞病、神經膠質瘤、婦科癌症(gynaecologicalcancer)、血液胂瘤(hematologicalmalignancy)、毛細胞性白血病、頭頸癌(headandneckcancer)、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細胞增多病、何杰金病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高血鈣症、喉咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯細胞組織細胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、非白血性白血病、李弗勞明症候群、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、腎的惡性棒狀腫瘤(malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney)、成神經管細胞瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、轉移癌、口腔癌、多發性內分泌腺瘤症候群、覃樣肉芽腫、骨髓增生異常症候群、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎胚細胞瘤、成神經細胞瘤、神經纖維瘤病、nijmegen染色體斷裂症候群(breakagesyndrome)、非黑素瘤(醒-mela廳a)皮膚癌、非小細胞肺癌(麵-smal卜cel卜lung-cancer)-(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌(oropharynxcancer)、骨肉瘤、造瘻術卵巢癌(ostomyovariancancer)、胰腺癌、鼻旁癌(paranasalcancer)、曱狀旁腺腫瘤、腮腺癌、陰莖癌、原始神經外胚層腫瘤(peripheral-neuroectodermal-tumors)、腦下垂體癌(pituitarycancer)、真性紅細胞增多症、前列腺癌、rare-cancers-and-associated-disorders、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、先天性血管萎縮性皮膚異色病、涎腺惡性肺瘤、肉瘤、神經鞘瘤、惡性皮膚網狀細胞增多症候群、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髄瘤、皮膚鱗狀細胞癌(squamous-cell-carcinoma-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌(thymuscancer)、甲狀腺癌、移行細胞癌(膀胱)(transitiona卜cel卜cancer-(bladder))、移行細胞癌(腎臟-骨盆-/-輸尿管)、滋養細胞腫瘤、輸尿管癌、泌尿系統腫瘤、異地排尿(uroplakins)、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血症和維爾姆斯氏腫瘤。作為本發明的特定靶的癌症是產生過量Bcl-2蛋白或促存活蛋白相關蛋白和/或減少量的抑制Bcl-2成員的促凋亡分子的癌症。按照本發明，促存活分子包括但不限於Bcl-2蛋白。Bc卜2蛋白家族以及其他細胞質蛋白是凋亡的至關重要的調節因子。目前已鑑定了3個亞家族內的至少15個Bel-2家族成員。已在哺乳動物細胞和病毒中鑑定了此類蛋白，並且所述蛋白各自具有高度保守的4個Bcl-2同源結構域(BH1至BH4)中的至少一個結構域。Bcl-2家族蛋白包含在促存活亞家族的成員中發現的BH1和BH2結構域，然而與Bcl-2最相似的蛋白具有所有4個保守的結構域，這使得能夠在遇到多種細胞毒性挑戰時抑制細胞的凋亡。在哺乳動物中促存活亞家族的成員包括Bcl-2、Bc卜Xl、Bcl-w、Mcl-1和A1(在哺乳動物中);NF-13(雞);CED-9(秀麗隱杆線蟲)；和病毒蛋白BHRFl、LMW5-HL、ORF16、KS-Bcl-2和E1B-19K。BH3結構域是促凋亡亞家族蛋白的功能所必需的。兩個促凋亡亞家族Bax和BH3分別包括Bax、Bak和Bok(也稱為Mtd);和Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bad、Bid和Egl-l(秀麗隱杆線蟲)。Bax亞家族的成員包含BH1、BH2和BH3結構域，並且與Bel-2非常相似。相反地，BH3亞家族的成員只具有9-16個殘基的BH3結構域，或與任何已知的蛋白不相關，只有Bik和Blk共有序列相似性。兩種促凋亡亞家族的蛋白可以是促存活亞家族蛋白的拮抗劑。在秀麗隱杆線蟲中對此進行了說明，在所述秀麗隱杆線蟲中，進行凋亡所需的Egl-l結合至CED-9並通過其起作用(關於綜述，參見，Adams,J.M.和S.CorySc/e腳息.1322—1326，1998)。促凋亡和抗凋亡亞家族蛋白之間的異二聚體對這些蛋白亞家族具有滴定效應，這表明各亞家族成員的相對濃度可用於調節凋亡。Bcl-2蛋白具有2種通過選擇性剪接形成的同種型ot和p。其形成了同型二聚體和與Bax和Bak蛋白以及Bcl-XL同種型Bcl-Xs形成異二聚體。與Bax的異二聚化需要完整的BH1和BH2結構域，並且對於促存活活性是必需的。BH4結構域似乎也參與促存活活性。Bel-2位於線粒體內膜和線粒體外膜內，以及位於核膜和內質網內，並在多種組織中表達。在染色體易位T(14;18)(q32;q21)中看到其參與產生濾泡性淋巴瘤(II型慢性淋巴性白血病)，並且其參與產生濾泡性淋巴瘤涉及免疫球蛋白區域。Bc1-Xl蛋白是編程性細胞死亡的主要調節者。選擇性剪接導致產生3種同種型，Bc卜xB、長同種型和短同種型。長同種型展示細胞死亡阻抑物活性，而短同種型促進凋亡。Bc卜Xl與Bax和Bak形成異二聚體，儘管與Bax的異二聚化似乎對於促存活(抗凋亡)活性不是必需的。Bcl-Xs與Bcl-2形成異二聚體。在線粒體膜和核周膜中發現Bcl-x。Bel-Xs以高水平在發育中的淋巴細胞和經歷高循環率(highrateofturnover)的其他細胞中表達。在成人腦和其他組織的長壽命有絲分裂後細胞中發現Bcl-X"至於Bcl-2，BH1、BH2和BH4結構域參與促存活活性。在幾乎所有骨髓細胞系和多數組織中的細胞質中發現Bc卜w蛋白，其在腦、結腸和唾液腺中表達水平最高。該蛋白以低水平在睪丸、肝、心臟、胃、骨骼肌和胎盤以及淋巴樣細胞系中表達。Bcl-w包含BHl、BH2和BH4結構域，所述結構域都是其細胞存活促進活性所需要的。儘管其中Bcl-w基因功能被同源重組破壞的小鼠是可存活的、健康的和外表正常的，並且成年雌性具有正常的生殖功能，但成年雄性是不育的。在這些雄性中，在初始的青春前期前精子發生未受到明顯影響並且睪丸發育正常。然而，曲細精管被破壞，包含大量凋亡細胞，從而不能產生成熟精子。該小鼠模型可用於人男性不育的一些情況，暗示著睪丸中程序化細胞死亡的改變可用於調節生育力(Print等人tY"/Jcaf/5W咖化12424-12431，1998)。大鼠局部缺血大腦中的研究發現Bcl-w相對於其在非局部缺血的大腦中的低組成型水平表達為過度表達。此外，檢查Bcl-w的作用機制的體外研究顯示，當Bcl-w也存在時，分離的大鼠腦線粒體不能對重組Bax或高濃度的鈣的加入起反應。正常反應是從線粒體釋放細胞色素c。此外，發現重組Bcl-w蛋白抑制鈣誘導的線粒體跨膜電位的喪失，這表示通透性轉換。這些發現一起表明Bcl-w可以是抗局部缺血神經元死亡的神經保護劑和可通過線粒體死亡調節途徑獲得該保護(Yan等人，/Cere6W/oocT/Vow2^620-630，2000)。Bfl-l基因是Bc卜2家族的另外的成員，其也是凋亡的阻抑物。Bfl-l蛋白具有175個胺基酸，並且包含Bcl-2家族成員中發現的BH1、BH2和BH3保守結構域。其也包含富含Gln的NH2末端區域和缺少BH結構域1，與其他Bcl-2家族成員不同。小鼠Al蛋白共有與Bfl-l的高序列同源性並且具有3個Bfl-l中發現的保守結構域。類似於Bel-2、Bel-Xl和EBV-BHRF1的作用，由p53腫瘤阻抑蛋白誘導的凋亡被Bf卜l抑制QySa-Eipper，C.等人.Ca刀cerWe義i"(5;3879-3882，1996)。Bfl-l經發現存在於細胞內，在造血區室(hematopoieticcompartment)即血液、脾和骨髓中表達最高；在肺、小腸和睪丸中表達中等；在其他組織中表達最低。也在血管平滑肌細胞和血液腫瘤(hematopoieticmalignancy)中發現其。已注意到Bfl-l的表達7jc平和胃癌發生之間的相關性，這表明Bfl-l蛋白在促進癌性細胞存活中和在癌症中參與胃癌的發展(Choi等人.Oncogene11:1693-1698，1995)。在某些實施方案中，促存活分子包括但不限於Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、McH和Al。本發明涉及的促凋亡分子包括但不限於BH3-only蛋白家族的成員。在一些實施方案中，BH3-only蛋白包括但不限於Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid。本發明提供了可選擇性結合Bcl-2、BC1-x"Bel-w、Mcl-1和A1中的一種或多種的拮抗劑，從而導致靶細胞或細胞群體的凋亡。因此，本發明提供了產生促存活Bcl-2家族成員的拮抗劑的方法，所述方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結構域的一個或多個胺基酸殘基；b.將突變的BH3結構域與促存活Bcl-2家族成員接觸；c.檢測突變的BH3結構域與促存活Bcl-2家族成員之間的結合的存在或不存在，從而鑑定促凋亡蛋白的BH3結構域中與BH3結構域和促存活Bcl-2家族成員之間的結合相互作用相關的胺基酸殘基；和d.產生在BH3結構域與Bel-2蛋白之間發生結合所必需的胺基酸上模擬野生型BH3結構域的拮抗劑。"突變"是指BH3結構域序列內的一個或多個殘基的置換或缺失。所述突變的實例公開於SEQIDNOs:l-lO。插入胺基酸序列突變體是其中一個或多個胺基酸殘基被導入蛋白中預先確定的位點的突變體，儘管在對所得的產物進行合適的篩選的情況下也可能進行隨機插入。缺失突變體的特徵在於從序列除去一個或多個胺基酸。置換型胺基酸突變體是其中序列中的至少一個胺基酸被除去而不同的殘基在其位置上插入的突變體。置換型胺基酸突變體的實例是保守性胺基酸置換。保守性胺基酸置換通常包括下列組內的置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和穀氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。對胺基酸序列的加入包括與其他肽、多肽或蛋白的融合。特定的突變體選自Bim:D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、18A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、115A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A;Bad:N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、Q6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E;Bid:Q1A、E2A、D3A、I4A、15A、R6A、N7A、18A、A9E、R10A、19H11A、L12A、A13E、(J14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、123A、P24A、P25A和G26E;mNoxaA:R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q11A、L12A、R13A、K14A、115A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C21A、T22A、W23A、S24A、A25E和D26ABak:P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、115A、G16E、D17A、D18A、119A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。上面c)部分中使用的"檢測，，是指結合的直接檢測或通過促存活或促凋亡分子的功能進行的間接檢測。在一個實施方案中，對BH3結構域內的胺基酸殘基進行系統性突變。在本發明的某些方面，用丙氨酸置換胺基酸殘基，或在其中丙氨酸或甘氨酸存在於野生型序列中的情況下，置換具有不同性質的胺基酸。例如，穀氨酸，當與丙氨酸或甘氨酸相比時，大小更大並且帶電荷。可使用篩選測定法確定突變的BH3結構域與促存活Bcl-2蛋白家族的成員之間的結合存在或不存在。該篩選測定法的實例包括但不限於ELISA、酵母雙雜交篩選測定法或能夠鑑定兩種靶蛋白之間相互作用的任何其他測定法。例如，在一個篩選測定法中，將突變的BH3結構域融合至M13噬菌體的基因-3次要包衣蛋白(minorcoatprotein)序列。然後將促存活蛋白例如Bc卜2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l或Al以不同的濃度與固定稀釋度的展示突變的BH3蛋白的噬菌體一起溫育。然後就給定的BH3突變體與促存活Bcl-2蛋白家族的成員之間的結合相互作用確定IC5。。不結合或顯示減少的對一個或多個Bcl-2蛋白家族成員的結合的能力的BH3突變體鑑定了與BH3-only蛋白對Bcl-2蛋白的結合相關的胺基酸殘基。結合測定法可簡單地檢測受試化合物對多肽的結合，其中通過焚光基團、放射性同位素、酶綴合物或其他可檢測標記檢測結合。例如，測定可包括將至少一種BH3突變體與至少一種存在於溶液中或附著至固體支持物的Bc卜2蛋白混合，然後檢測Bcl-2對BH3突變體的結合的步驟。可選擇地，測定可檢測或測量在標記的竟爭者存在的情況下BH3突變體的結合。此外，可使用無細胞製劑、化學文庫或天然產物混合物進行測定，BH3突變體可以在游離於溶液中或附著至固體支持物。這樣的測定的實例包括放射性標記測定法例如美國專利5，914，236和美國專利6,372,724中描述的測定法。突變的BH3結構域或突變的BH3結構域片段可用於篩選調節Bcl-2蛋白的活性的化合物。此類化合物可包括激動劑、拮抗劑或部分激動劑或反激動劑。在一個實施方案中，在允許BH3對Bcl-2結合的條件下進行測定，其中將BH3結構域與至少一種受試化合物混合，然後將BH3結構域在受試化合物存在的情況下誘導凋亡的能力與BH3結構域在所述受試化合物不存在的情況下誘導凋亡的能力比較。在受試化合物存在的情況下凋亡水平的改變表示調節Bel-2的活性的化合物。可選擇地，將受試化合物在適合於BH3對Bel-2結合的條件下與包含BH3的體外或無細胞體系混合，進行測定。在這些測定中的任一測定中，調節BH3誘導凋亡的能力的受試化合物可以間接地進行調節，並且不必直接與受試化合物接觸。可篩選至少一種或多至多種受試化合物。如此處所用的，"BH3結構域蛋白"可包括全長BH3結構域或其部分。全長BH3結構域可以存在於完整的BH3-only蛋白的背景中，或可以以分離的形式使用。本發明的BH3蛋白可以是天然發生的蛋白、重組產生的蛋白或可以是合成的肽。"片段"是BH3結構域的獨特部分或編碼可在序列上對親本序列同一但在長度上比親本序列更短的BH3結構域的多核苷酸。片段可包含大約5至大約1000個連續核苷酸或胺基酸殘基。用作探針、引物、抗原、治療性分子或用於其他目的的片段在長度上可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或至少500個連續核苷酸或胺基酸。片段優選選自分子的某些區域。很明顯這些長度是示例性的，本說明書支持的任何長度，包括序列目錄、列表和圖表，可包括在本實施方案中。本發明部分地涉及調節Bel-2蛋白功能從而用於增加凋亡的試劑的產生。如此處所用的"拮抗劑"是指抑制或減弱Bcl-2蛋白的生物學活性的分子。拮抗劑可包括蛋白例如抗體、抗鈣素(anticalin)、核酸、糖類、小分子或任何其他化合物或組合物，所述任何其他化合物或組合物通過直接與Bcl-2相互作用或通過對其中BH3-only蛋白和/或Bcl-2蛋白參與的生物途徑的組分作用增加細胞或細胞群體對凋亡的易感性。此處的"試劑"應當理解為是指來源於天然的、重組或合成來源的任何蛋白質性質的分子或非蛋白質性質的分子。有用的來源包括天然產生的文庫、化學文庫以及組合文庫、噬菌體文庫和基於體外翻譯的文庫的篩選。特別有用的來源是修飾泛宿主性BH3only結構域以產生拮抗或刺激它們之間的相互作用的分子。在特別有用的實施方案中，試劑是基於BH3-only促凋亡蛋白(所述促凋亡蛋白在SEQIDNO:1至10中的一個中所列的胺基酸序列中具有至少一個突變)的肽或蛋白。在一個實施方案中，用於完全抑制或顯著減少Bel-2或促存活相關蛋白的促存活功能的水平或活性的本發明的試劑可以是蛋白質性質的分子或化學分子。術語"拮抗劑"或"拮抗作用"或"對抗"包括Bcl-2家族蛋白促存活活性的所有這些降低、抑制、減少和下調。這些試劑的結果是誘導或使細胞或細胞群體對凋亡易感。關於為蛋白質性質的分子的試劑，此類分子包括肽、多肽和蛋白。此外，術語突變體、部分、衍生物、同源物、類似物或模擬物是指包括各種形式的試劑，所述試劑完全抑制或顯著減少Bcl-2家族蛋白的促存活功能。所述試劑可以是天然發生的或人工產生的分子。所述試劑可以是包含一個或多個胺基酸置換、缺失或添加的BH-3only蛋白或其BH3結構域或片段。可通過誘變或其他化學方法或重組產生或合成產生所述試劑。丙氨酸掃描是用於鑑定重要胺基酸的有用技術(Wells，#eMo&i""zy邁o/2M.'2699-2705，1991)。在該技術中，用丙氨酸替代胺基酸殘基，然後確定其對多肽活性的影響。以該方式分析試劑的各胺基酸殘基以確定重要的結構和/或電荷和/或構象和/或疏水/親水區。就其對Bcl-2的結合的能力和其他性質例如壽命、結合親和力、離解速率、穿膜能力或誘導凋亡的能力檢測試劑。本發明的試劑也包括全長BH3-only蛋白的Bel-2結合部分。部分是界定Bcl-2結合片段例如兩親性a螺旋結構的至少l個、至少10個、至少20個和至少30個連續胺基酸，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個胺基酸。有人提出該結構與Bcl-2蛋白的疏水溝相互作用。可通過使用標準的重組核酸技術獲得或使用常規液相或固相合成技術合成該類型的肽。例如，可參考由Nicholson編著和由BlackwellScientificPublication的出版的標題為"SyntheticVaccines"的出版物中包括的Atherton和Shephard編寫的標題為"PeptideSynthesis"的第9章中描述的溶液合成或固相合成。可選擇地，可通過用蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶降解本發明的胺基酸序列來產生肽。可通過例如高效液相色譜(HPLC)技術純化降解的片段。任何這樣的片段，無論其產生的方法，要理解為此處使用的術語"拮抗劑"所包含的意義。因此拮抗劑可包括BH3結構域的衍生物。這樣的衍生物包括BH3結構域或BH3-only蛋白的部分、突變體、同源物、片段、類似物以及雜交分子或融合分子和糖基化變體。衍生物也包括在最優比對後在比較窗口上具有百分比胺基酸序列同一性的分子。優選地，特定序列和參照序列之間的百分比相似性是至少大約60%或至少大約70%或至少大約80%或至少大約90%或至少大約95%或更高例如至少大約96%、97%、98%、99%或更高。優選地，本試劑的種間、功能或結構同源物之間的百分比相似性是至少大約60%或至少大約70°/。或至少大約80%或至少大約90%或至少大約95%或更高例如至少大約96%、97%、98%、99%或更大。60%和100%之間的相似性或同一性的百分比也包括例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。此處涉及的蛋白拮抗劑例如BH3-only蛋白或BH3結構域的4汙生物中的殘基的類似物包括但不限於對側鏈的修飾、在肽、多肽或蛋白質合成期間非天然胺基酸和/或其衍生物至肽中的整合、以及對蛋白性質的分子或其類似物施加構象限制的交聯劑和其他方法的使用。該術語也不排除多肽的修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等。包括在該定義中的是例如包含胺基酸(包括，例如，非天然胺基酸例如表2中給出的胺基酸)的一種或多種改變的多肽或具有取代鍵的多肽。這樣的多肽可能需要能夠進入細胞。本發明涉及的側鏈修飾的實例包括氨基的修飾，例如通過還原烷基化(通過與醛基反應，然後用NaBH4還原)；使用曱基乙醯亞胺酯的二次胺化(amidination);使用醋酸酐的醯化；使用氰酸鹽的氨基的氨甲醯化；使用2，4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基的三硝基苄基化；使用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐的氨基的醯化；和使用吡哆醛-5-磷酸，然後用NaBH4還原的賴氨酸的吡醇羥乙醯化(pyridoxylation)。可通過使用試劑例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成雜環縮合物來修飾精氨酸殘基的胍基。可通過形成O-acylisourea，然後進4於隨後的^t生4匕例如形成對應的醯胺來通過碳化二亞胺活化修飾羧基。可通過方法例如使用碘乙酸或碘乙醯胺的羧甲基化；對磺基丙氨酸的過甲酸氧化；使用其他巰基化合物形成的混合二硫鍵；與馬來醯亞胺、馬來酸酐或其他取代馬來醯亞胺的反應；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞酚磺酸(chloromercuriphenylsulphonicacid)、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基盼和其他汞製劑的汞衍生物的形成；在鹼性pH下使用氰酸鹽的氨甲醯化來修飾巰基。可通過例如使用N-溴代琥珀醯亞胺的氧化或使用2-羧基-5-硝基溴化節或磺醯滷的吲哚環的烷化修飾色氨酸殘基。另一方面，可通過使用四硝基甲烷硝化來改變酪氨酸殘基，從而形成3-硝基酪氨衍生物。可通過使用碘乙酸衍生物的烷化或使用焦碳酸二乙酯的N-乙氧羰基化(carbethoxylation)進行組氨酸殘基的咪唑環的修飾。在肽合成期間將非天然胺基酸和衍生物整合入肽中的實例包括但不限於正亮氨酸、4-氨丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、6-氨己酸、叔-丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸2-噻吩基丙氨酸和/或胺基酸的D-異構體的使用。此處涉及的非天然胺基酸的目錄示於表2。此類非天然胺基酸可用於提供類似於BH3結構域的三級結構。表2:非常規胺基酸的代碼tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28鐧L-cx-曱壯纈城MnvaL-cc-曱^4艦MornMpheL-cc-曱細艦MproL-a-甲絲絲MscrL-cx-甲基^mMthrL-a-甲基色WMtrpL-oc-甲絲城MtyrL-a-曱絲絲MvalL-N-曱基高苯丙mNmhpheN-(N-(2'2-4乙_|0NnbhmN-(N-(3，3-4丙&隱e氨甲錄甲射械氨甲絲甲&甘城1-(2,2-二苯乙基-Nmbc乙^^環丙烷可以例如使用交聯劑穩定3D構象，使用同質雙功能(homo-bifunctional)交聯劑例如具有n=l至n=6的(CH》n間隔基團的雙功能亞胺酯、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯和通常包含氨基反應部分例如N-羥基琥珀醯亞胺酯和另一個基團特異性反應部分例如馬來醯亞胺基或二硫代部分(SH)或碳化二亞胺(COOH)的異質雙功能(hetero-bifunctional)試刑。此夕卜，可通過例如整合C。和N。一甲基胺基酸，在胺基酸的"和Ce原子之間引入雙鍵和通過引入共價鍵(例如在N和C末端之間、兩個側鏈之間或側鏈和N或C末端之間形成醯胺鍵)形成環肽或類似物來在限制肽的構象。BH3結構域的模擬物包括在結構和/或功能水平上的靶結合劑(即BH3-only蛋白)並且其抑制促存活Bc卜2蛋白。根據本發明的一個實施方案，提出產生選擇的BH3結構域模擬物。基於BH3結構域(所述結構域具有阻止對Bcl-2蛋白結合的突變)之間的結構差異設計BH3結構域模擬物。肽模擬物可以是包含肽的模擬蛋白二級結構的元件的分子(Johnson等人，PeptideTurnMimeticsinBiotechnologyandPharmacy,Pezzuto等人，Eds.，ChapmanandHal1，NewYork,1993)。促進分子相互作用例如促進抗體和抗原、酶和底物或支架蛋白(scaffoldingprotein)的相互作用的方式確定胺基酸側鏈的方向而存在。設計肽模擬物以允許類似於天然分子的分子相互作用。BH3結構域的肽或非肽模擬物可作為減少Bcl-2的促存活功能從而誘導或使細胞或細胞群體對凋亡易感的試劑用於本發明。將模擬物設計為藥物活性化合物是已知的產生基於"先導"化合物的藥物的方法。當活性化合物難以合成或合成代價昂貴時或當其不適合用於特定的施用方法(例如肽是不適合於口服組合物的活性劑，因為其傾向於被消化道內的蛋白酶降解)時，這可以是想要的。模擬物的設計、合成和檢測通常用於避免就耙性質隨機篩選大量分子。在從具有給定的靶性質的化合物設計模擬物中通常要進行幾個步驟。第一，確定在確定靶性質中是至關重要和/或重要的化合物的特定部分。在肽的情況下，這可以通過例如依次置換各殘基，系統性改變肽中的胺基酸殘基來進行。如上文中所描述的，肽的丙氨酸掃描通常用於精煉(refine)此類肽基元。這些構成化合物的活性區的部分或殘基稱為其"藥效團"。當發現藥效團後，根據其物理性質例如立體化學、鍵合、大小和/或電荷，使用來自許多來源例如分光鏡技術、X射線衍射和NMR的數據對其結構建模。可在該建模過程中使用計算機分析、相似性作圖(其建立藥效團的電荷和/或體積而非原子之間的鍵的模型)，可將其他技術用於該建模方法。在該方法的變異中，建立配體和其結合伴侶的三維結構模型。當配體和/或結合伴侶在結合時改變構象，從而允許模型在模擬物的設計中考慮該現象時，這可以是特別有用的。建模可用於產生與線性序列或三維構型相互作用的抑制劑。然後選擇可將模擬藥效團的化學基團嫁接至其上的的模板分子。可方便地選擇所述模板分子和嫁接至其上的化學基團以使模擬物容易合成，所述模板分子可能是藥學上可接受的，並且在體內不降解，同時保持先導化合物的生物學活性。可選擇地，當模擬物基於肽時，可通過環化肽增加其剛性來獲得進一步的穩定性。然後可篩選通過該方法發現的模擬物以看其是否具有靶性質或看它們展示其的程度。然後可進行進一步的最優化或修飾以獲得一種或多種用於體內或臨床試驗的終模擬物。本發明的推理性藥物設計的目的是使用計算機方法產生和/或選擇限制性BH3-only蛋白的結構類似物以產生藥物，所述藥物是例如多肽的更具有活性或穩定的形式和具有限制性結合鐠。在一個方法中，人們首先通過X射線衍射晶體分析法、通過計算機建模或最常見地方法的組合確定目的蛋白的三維結構。也可通過基於同源蛋白的結構建模獲得關於多肽結構的有用信息。推理性藥物設計的實例是HIV蛋白酶抑制劑的產生(Erickson等人，Science249:527-533，1990)。藥物篩選的一個方法優選在竟爭結合測定中使用用重組多核普酸轉化的表達多肽或片段的真核或原核宿主細胞。此類細胞(以活的或固定的形式存在)可用於標準結合測定法。可測量例如靶或片段和受試試劑之間的複合物的形成，或檢查受試試劑促進或幹擾靶或片段和已知的配體之間的複合物的形成的程度。篩選方法包括測定(i)藥物和靶之間的複合物的存在，(ii)編碼所述靶的核酸分子的表達水平的改變。測定的一種形式包括竟爭結合測定法。在該竟爭結合測定中，通常標記乾。將游離耙與任何假定的複合物分離，游離(即未複合的)標記的量是受試試劑對靶分子的結合的量度。也可測量結合的靶而非游離的靶的量。也可能標記化合物而不是靶，然後測量在受試藥物存在和不存在的情況下結合靶的化合物的量。用於藥物篩選的另一種技術提供了針對具有對靶的合適結合親和力的化合物的高通量篩選，在Geysen(國際專利公開號W084/03564)中詳細地描述了該技術。簡而言之，在固體基質例如塑料針(plasticpin)或一些其他表面上合成大量不同的小肽受試化合物。將所述肽受試化合物與靶反應，然後進行洗滌。之後使用本領域中熟知的方法檢測結合的靶分子。該方法可適合用於篩選非肽、化學實體。因此該方面擴展至篩選靶拮抗劑或激動劑的組合方法。可將純化的靶直接包被在上述藥物篩選技術中使用的板上。然而，也可使用針對靶的非中和抗體將靶固定在固相上。可選擇地可以以與方便選擇的標記的融合蛋白形式表達耙以有利於結合和鑑定。在另一個實施方案中，可進行Bcl-2蛋白和Bcl-w的抑制劑的高通量化學篩選(HTCS)。假定BH3-only蛋白如Bim與促存活Bcl-2分子的相互作用參與凋亡，那麼可就有機小分子(所述有機小分子以這樣的方式如阻止BH3結合的方式結合促存活蛋白)篩選文庫。為了鑑定靼向一種或兩種抗凋亡分子的化合物，可進行多個篩選過程。可在細菌中產生高容量測定所必需的蛋白，使用光學生物傳感器(BiaCore)的初步研究顯示生物素化的BH3肽以高親和力(Kd~11nM)結合His6標記的Bcl-2蛋白(Hinds等人，^￥^7/owr/7a/1497-1507，2003)。已使用AlphaScreen(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)技術發展了進行HTCS所必需的高容量結合測定法(Glickman等人，/"/o/zo7Scree"7:3-10，2002)。通過顯示作為兩個伴侶蛋白相互作用的螢光輸出的變化，其可以敏銳的靈敏性監控蛋白的相互作用。AlphaScreenTM非常適合用於HTCS，因為其非常強大並且可作為具有很大動態範圍的均相測定法在小體積中容易地進行。在一個實施方案中，將HiSeBel-2結合至鎳包被的受體小珠和將生物素化的BH3肽結合至鏈黴抗生物素包被的供體小珠。然後將小珠與受試化合物在384孔微量滴定板的小孔(每孔一種受試化合物)一起溫育，然後使用Fusionalpha板讀出器讀出測定結果。可就蛋白伴倡和小珠的濃度、溫育時間和測定體積最優化結合測定法以使測定通常產生大於30:1的信號背景比。已驗證所述測定法是有效的，因為獲得的系列肽的ICs。值與使用光學生物傳感器獲得的相當。儘管肽的親和力橫跨3個數量級(8nM-35|aM),但兩組結果之間的強相關性(R2=0.9983)顯示所述測定法測量相同的相互作用。也可最優化用於His6Bel-2A/BH3的結合測定法。在最優化測定法後，可使其接受嚴格的質量控制以評估板對板和天對天的重現性。然後使用各測定法篩選獨特的發現文庫。為消除假陽性，可在第二竟爭測定(AlphaScreenTM，螢光偏振和BiaCore光學生物傳感器)中驗證滿足靼潛能(IC5。<25mM)的所有抑制性化合物。光學生物傳感器幫助定量Bel-2家族成員之間的相互作用，和可進行強候選物對通過BH3-only蛋白產生的生理結合的親和力之間的容易的比較。可通過，除其他以外，液相色鐠-質語光鐠測定法(liquidchromatography-massspectrometry)就本體(identity)和純度檢查通過這些初步檢測的化合物，然後就其乾特異性即對於Bcl-2、Bel-xL、Bel-w、Mcl-l或Al的親和力對其進行檢測。也可在設計用於預測腸吸收(Wohnsland等人，/#edC力e邁923-930，2001)和肝毒性的測定法中檢測活性化合物。此外，可使用y/7s27/co法(method)預測其生物分布特性，和排除可提供於代謝或毒性問題的藥/"r2'/g/rwgZes/g/7s/tf/e「e/o/7/z/e/^，EdErhardt，BlackwellScience,Maiden,MA，USA，1999)。可通過結合測定法中的效能、靶選擇性、有利的預測的ADMET(吸收、分配、代謝、排洩和毒性)性質(vandeWaterbeemd和Gifford，"rwg飽c麼.192-204，2003)和化學易處理性(chemicaltractabi1ity)對關於所有活性化合物的數據進行分級。然後，可獲得頂部化合物的所有可獲得的相近的結構類似物並就結合和殺傷測定中的抑制性活性檢驗其以確定各結構系列的初步構效關係。關於就生物學活性對先導化合物進行的測定法，當發現有前景的先導化合物時，可估量其對細胞存活率的活性。可在成組的培養的致瘤性細胞系和非致瘤性細胞系以及原代小鼠和人細胞群體例如淋巴細胞中檢驗多至50種根據上述標準最優化的化合物。可在與lnM至100juM的所述化合物一起溫育的3至7天中監控細胞存活率。當然將對比其正常細胞對應物更有效殺死腫瘤細胞的化合物投入是大的關注。可就其靶的特異性和作用模式評價在低於IOmM的濃度上發生殺死作用的化合物。驗證其作用模式是非常重要的，因為受試化合物可間接殺死細胞。例如，如果先導化合物以高選擇性結合Bcl-2，其不應當殺死缺乏Bcl-2的細胞。因此可通過將野生型細胞中的化合物的活性與缺乏Bcl-2的細胞中的比較來確認作用的特異性。可將最有前景的候選物在小鼠模型中接受其抗腫瘤功效的全面分析。在之前已完全表徵的兩個模型中，用B細胞淋巴瘤注射的、來源於myc轉基因小鼠(Adams等人，J/》；533-538，1985)或/Z7j^/6c7-2雙轉基因動物(Strasser等人，同上)的免疫活性小鼠快速死亡並重現白血病/淋巴瘤症狀。儘管兩種腫瘤都對標準的化學療劑(環磷醯胺)起反應，但用邁/c/6c/"v腫瘤細胞注射的小鼠不可避免地復發。這兩種可移植肺瘤將允許在治療這些惡性腫瘤中檢驗單獨提供的或與環砩醯胺一起提供的任何化合物，所述惡性腫瘤是非常接近人淋巴瘤的模型。關於先導化合物的構效關係(SAR)和其最優化，選自初步篩選的先導物可要求相當多的修飾以增強其生物化學、生物學和藥理學橫,(Bleicher等人，"/"ok麼.369-378，2003)。為伋進這些化合物的最優化，可在生物化學和結構研究中驗證其作用模式。成的複合物。因為NMR可檢測低親和力的配體和顯示其在靶蛋白上的結合位置，所以其可大大地幫助結合的最優化，從而加速藥物發現過程(Hajduk等人，/C力e邁W,2315-2317，1999;Pellecchia等人，Ae7Zri^"/、cor丄'211-219，2002)。通過使用技術例如化學位移作圖，可監控受試化合物對Bcl-2蛋白的結合和可選擇模擬BH3結構域的分子進行最優化。在相關方法中，可使用適合的DOCK程序(Kuntz，i^/e"ce^57.'1078-1082，1992)進行先導試劑的分子建模以在矽片上(s/7/co)估量其結合。可對先導物結合至耙Bcl-2的溝進行建模，然後對使用的功能評分以預測最可能的結合模式。這可指導提供額外的相互作用以增強結合的衍生物的設計。NMR產生的實驗數據的可獲得性也〗吏得可能如意地停靠配體和耙以預測改進的配體(Lugovskoy等人，/J/Z7Soc"《'1234-1240，2002)。該信息和來自生物學測定的信息可用於合成用於進一步檢驗的衍生化合物。對於各類先導化合物，存在用於合成衍生物的策略。例如，典型的擊中化合物(hitcompound)由兩個或三個連鎖的環系統組成，所述各環系統可被許多種官能團取代。通過系統性地取代各官能團，可產生和檢測具有廣泛的化學特性的化合物。根據本發明鑑定的試劑用於治療癌症或過度增生性疾病或病症。此處的"改善"可以是指當前狀況的嚴重度的減輕。術語"好轉"也用於包括預防病症發生的"預防性措施"。術語"好轉"不必表示將受試者治療至完全康復。類似地，"預防"不必指受試者最終不感染病症。此處使用的受試者是指可受益於本發明的試劑的人和非人靈長類動物(例如大猩猩、獼猴、狨猴)、家畜類動物(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、伴侶動物(例如狗、貓)、實驗室試驗動物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、倉鼠)、俘獲的野生動物(例如狐狸、鹿)、爬行類動物或兩棲動物(例如蟾蜍(canetoad))、魚(例如斑馬魚)和任何其他生物(例如，線蟲)。對可受益於目前描述的試劑的動物類型沒有限制。本發明的最優選受試者是人。受試者，無論其是人或非人生物，可稱為患者、個體、動物、宿主或接受者。因此，本發明的另一個方面提供了在受試者中預防或減少癌症或過度增生相關性疾病的方法，所述方法包括在一段時間內和在足以預防或減少癌症或過度增生病症的條件下給所述受試者施用有效量的Bcl-2蛋白的拮抗劑。能夠拮抗Bcl-2和誘導凋亡的試劑的鑑定提供了用於癌症的治療性治療的藥物組合物。可將本發明的試劑與一種或多種藥學上可接受的栽體和/或稀釋劑混合，從而形成藥物組合物。藥學上可接受的載體可包含生理上可接受的化合物，所述化合物用於例如穩定或增加或減少本發明的藥物組合物的吸收或清除率。生理可接受的化合物可包括例如糖類例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化劑例如抗壞血酸或谷光苷肽、螯合劑、低分子量蛋白、減少肽或多肽的清除或水解的組合物、或賦形劑或其他穩定劑和/或緩沖劑。去垢劑也可用於穩定或增加或減少藥物組合物包括脂質體載體的吸收。用於肽和多肽的藥學上可接受的載體和製劑中，參見例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，MackPublishingCompany,Easton，PA，1990("Remington's")。其他生理可接受化合物包括溼潤劑、乳化劑、分散劑或特別地用於預防微生物的生長或作用的防腐劑。不同的防腐劑是熟知的，包括例如酚和抗壞血酸。本領域技術人員將認識到藥物可接受的栽體包括生理可接受的化合物的選擇依賴於例如本發明的調節劑的施用途徑和其特定的物化特性。可通過本領域技術人員已知的任何方便的方法以藥物組合物的形式施用試劑。施用途徑包括但不限於經呼吸、氣管內、經鼻咽、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、皮內、肌內、眼內、鞘內、大腦內、鼻內、輸注、口服、經直腸、貼附和植入施用途徑。對於口服施用，可將化合物配製成固體或液體製劑例如膠嚢、丸劑、片劑、錠劑、粉劑、懸浮劑或乳劑。在製備以口服劑型存在的組合物中，在口服液體製劑(例如懸浮劑、酏劑或溶液)的情況下，可使用任何常用的藥物介質，例如，水、乙二醇、油、乙醇、調味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等；或在口服固體製劑(例如粉劑、膠嚢劑和片劑)的情況下可使用載體例如澱粉、糖、稀釋劑、顆粒化試劑(granulatingagent)、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。因為其施用的容易性，片劑和膠嚢劑代表了最有利的口服劑量單位形式，在該情況下，很顯然使用固體藥物載體。如果想要，可使用標準技術對片劑進行糖包被或腸溶衣包被。可將活性劑封裝入膠嚢以使其穩定地通過胃腸道，同時允許通過血腦屏障，參見，例如，國際專利公開號WO96/11698。本發明的試劑，當口服施用時，可獲得保護免受降解。可通過將核酸、肽或多肽與組合物複合以使其對酸和酶水解產生抗性或通過將核酸、肽或多肽封裝入合適的抗性栽體例如脂質體來實現該目的。保護化合物免受降解的方法在本領域內是熟知的，參見，例如Fix,戶力ar邊"..1760-1764,1996;Samanen等人，/戶力，Wzll9-135，1996;美國專利5,391,377,描述了用於口服遞送治療劑的脂質體組合物(在下文中更詳細地描迷脂質體遞送)。適合用於注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(當可溶於水時)或用於無菌注射液或分散體的臨時製備的分散體和無菌粉劑或可以乳骨的形式或適合用於局部施用的其他形式存在。其必須在生產和貯上的條件下是穩定的並且必須保持免受微生物例如細菌和真菌的汙染作用。栽體可以是溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。可以例如通過使用包衣例如卵砩脂，在分散體的情況下通過保持顆粒大小和通過使用表面活性劑保持恰當的流動性。可使用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等預防微生物的作用。優選包含等滲劑例如糖或氯化鈉。可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠產生可注射組合物的延遲吸收。通過將試劑以需要的量按要求與上面列舉的各種其他組分一起整合入合適的溶劑中，然後進行過濾滅菌來製備無菌注射液。一般地，通過將各種無菌活性組分整合入包含基本分散介質和所需的來自上面列舉的組分中的其他組分的無菌媒介物中。在用於製備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，製備的優選方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，所述技術用於產生活性組分和來自其之前無菌過濾的溶液的任何額外想要的組分的粉劑。對於胃腸外給藥，可將試劑溶解在藥物載體中，然後以溶液或懸浮液施用。合適的載體的實例是水、鹽水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇或動物、植物或合成來源的油。栽體也可包含其他組分，例如防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩衝劑等。當向鞘內施用試劑時，也可將其溶解在腦脊液中。對於透黏膜給藥或透皮給藥，可使用適合於待穿透的屏障的穿透劑遞送試劑。此類用於透黏膜給藥的穿透劑在本領域內通常是已知的，例如膽汁酸鹽和夫西地酸衍生物。此外，去垢劑可用於促進滲透。透黏膜給藥可通過鼻腔噴霧或使用栓劑進行，例如Sayani和Chien，Cr/fT力erCarr/erS/sf85—184，1996。對於局部透皮給藥，可將試劑配製成軟骨、乳骨、藥骨、粉劑和凝膠。透皮給藥系統也可包括貼劑。對於吸入，可使用本領域內已知的任何系統包括無水煙霧劑、液體遞送系統、空氣噴射霧化器、噴射系統等遞送本發明的試劑，參見，例ft口，Patton，"2'ofec力J&'141-143，1998;4吏用例^tDuraPharmaceuticals(SanDiego,CA)、Aradigra(Hayward，CA)、Aerogen(SantaClara,CA)、InhaleTherapeuticSystems(SanCarlos,CA)等的多肽大分子的產品和吸入遞送系統。例如，可以煙霧劑或水劑(mist)的形式施用藥物製劑。對於煙霧劑施用，可以以精細^L粒的形式與表面活性劑和噴射劑一起提供製劑。在另一個方面，用於遞送製劑至呼吸組織的裝置是其中使製劑蒸發的吸入器。其他液體遞送系統包括，例如，空氣噴射霧化器。本發明的試劑也可以持續遞送或持續釋放的機制(所述機制可在內部遞送製劑)施用。例如，可將能夠持續遞送肽的生物可降解的微球或膠嚢或其他生物可降解的聚合物結構包含在本發明的製劑中(例如，Putney和Burke，yVa"/"ec力16:153-157，1998)。在製備本發明的藥物中，可使用和操作多種製劑修飾來改變藥物動力學和生物分布。用於改變藥物動力學和生物分布的許多方法對於本領域技術人員來說是已知的。此類方法的實例包括在由物質例如蛋白質、脂質(例如，脂質體，參見下面)、糖或合成的聚合物(上面描述的)組成的栽體中保護本發明的組合物。關於藥物動物學的一般描述，參見例如，Remington's。在一個方面，將包含本發明的試劑的藥物製劑包裝入脂質單層或雙層例如脂質體中，參見，例如，美國專利6，110,490、6,096,716、385，283，185和5，279,833。本發明也提供了其中已將本發明的水溶性調節劑附著至單層或雙層的表面的製劑。例如，可將肽附著至含有醯肼-PEG-(二硬酯酸磷酸脂醯)乙醇胺的脂質體(例如Zalipsky等人，5/0co/yi^C力e/z^705-708,1995)。可使用脂質體或任何形式的脂質膜例如平面脂質膜或完整細胞例如紅細胞的細胞膜。可使用任何方法包括通過靜脈內、透皮(Vutla等人，/屍/ar邊5W《乂'5-8，1996)、透黏膜或口服途徑施用脂質體製劑。本發明也提供了其中本發明的核酸、肽和/或多肽被整合入微團和/或脂質體的藥物製劑(Suntres和Shek，/力ar邁":23-28，1994;Woodle等人，戶AaiTBk義'260-265，1992)。可按照標準方法製備脂質體和脂質體製劑，所述製劑在本領域內也是熟知的，參見例如，Remington's;Akimaru等人，CWoh'膽#。/7力er丄'197-210，1995;Alving等人，齡5-31，1995;Szoka和Papahadjopoulos,ieK"/o/7力"A/oe/7g義'467-508，1980，美國專利4，235，871、4，501，728和4，837，028。依賴於施用的方法，可以多種單位劑型施用本發明的藥物組合物。用於常規的藥物組合物的劑量對於本領域技術人員來說是熟知的。這樣的劑量在自然狀況下通常是建議性的，依賴於特定的治療背景、患者耐受力等對其進行調整。足以實現該用途的試劑的量定義為"有效量"。用於該用途的劑量方案和有效量即"給藥方案"將依賴於多種因素，包括疾病或病症的階段、疾病或病症的嚴重度、患者健康的一般狀況、患者生理狀況、年齡、藥物製劑和活性劑的濃度等。在計算用於患者的劑量方案中，也考慮施用的模式。劑量方案也必須考慮藥物動力學，即藥物組合物的吸收率、生物利用度、代謝、清除等。參見，例如，Remington's;Egleton和Davis，〃1431-1439，1997;Langer，5We/ce雄1527-1533，1990。根據這些方法，本發明定義的試劑和/或藥物組合物可與一種或多種其他試劑共施用。此處的"共施用"是指在相同的製劑中同時施用不同的途徑相繼施用。此處的"相繼"施用是指兩種類型的試劑和/或藥物組合物的施用之間的從秒至分鐘、小時或天的時間差異。可以任何順序進行試劑和/或藥物組合物的共施用。可選擇地，通過使用靶向性系統例如抗體或細胞特異性配體或特異性核酸分子，可將靶向療法用於更特異地將活性劑遞送至某些類型的細胞。因為許多原因例如如果試劑具有不可接受的毒性或如果其不能夠進入把細胞，那麼粑向可以是想要的。不用直接施用試劑，可在靶細胞中例如在病毒載體例如上述栽體或在基於細胞的遞送系統例如美國專利5，550，050和國際專利公開號W092/19195、W094/25503、W095/01203、W095/05452、W096/02286、W096/02646、W096/40871、W096/40959和WO97/12635中描述的系統中產生其。可將栽體靶向靶細胞。設計基於細胞的遞送系統以在想要的靶位點植入患者體內，所述遞送系統包含靶試劑的編碼序列。可選擇地，可以前體形式施用所述試劑，所述前體形式可被待治療的細胞中產生的活性劑或被靶向所述細胞的激活劑轉化成活性形式。參見，例如，歐洲專利申請號0425731A和國際專利/>開號WO90/07936。在另一個方面，本發明提供了包含本發明的組合物例如試劑的試劑盒。所述試劑盒也可包括教導此處所描述的本發明的方法和用途的說明材料。的變化外的改變和修飾。要理解本發明包括所有此類變化和修飾。本發明也包括本說明書中單個地或一起提及的或指出的所有步驟、特徵、合。通過下列非限定性實施例更詳細地描述本發明實施例1BH3結構域突變體重組蛋白和合成得多肽使用標準技術在大腸桿菌(E.coli)中表達所有重組蛋白。以GST融合蛋白的形式表達在其C末端具有25個胺基酸截斷的重組人Bel-Xl(Bc1-XlAC25)和在其N末端具有151個胺基酸截斷以及在其C末端具有23個胺基酸截斷的小鼠Mcl-l(Mcl-1AN151AC23)，然後如之前所描述的(Day等人Ce//Ze"Afl"dZ277ei"e"〃a〃0/7"125-1132，1999;Hinds等人.2003同上)使用PreScission蛋白酶將其從谷光苷肽-瓊脂糖柱上切離，然後對其進行純化。使用模擬位(Mimotope)(Victoria,Australia)分析合成的肽，通過反相HPLC進行純化，純度大於90%。除非另外指出，所有肽對應於人BH3結構域序列。使用電噴射質語測定法確證其本體。稱取肽的重量，以1-2mM的貯液形式將其溶解在水中，在檢測之前通過測量其在280nm處的吸光率確定其濃度。^蓊#j^種建伴使用互補寡核苷酸通過連接體序列(GGGT)將包含Bim(DMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARR)(SEQIDNO:1)或Bad(NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKG)(SEQIDNO:4)或mNoxaA(SEQID9)或Bid(SEQID7或Bak(SEQID11)的BH3結構域的26個胺基酸長的肽融合至M13噬菌體基因3(殘基249至406)序列的氨基末端，所述寡核苷酸也分別在5'和3'末端產生用於克隆入Fairlie等人屍T0fe//2fA77ress/0/7a/ztfPur/ZVcaf/o"26.171—178，2002之前4笛述的噬菌粒載體的)VC0/和if/7i2/限制性內切酶位點。此後上述肽序列中的殘基參照其在26聚體中的序列位置。為了產生序列的FLAG標記形式，使用Kunkel誘變方法(Kunkel等人.紐，/M心125-139，1991)將編碼FLAG表位的寡核苷酸在已融合至上述的基因3的肽序列的N末端環入(loop-in)所需的序列。對於BimBH3或其他BH3序列的丙氨酸掃描構建體和其他點突變，在對FLAG-BimBH3或FLAG-BadBH3模板進行的Kunkel誘變反應中使用具有想要的密碼子錯配的寡核苷酸。通過化學方法將誘變反應物轉化入SS320大腸桿菌菌株，然後在M13K07輔助噬菌體存在的情況下培養過夜後，使用之前描述的鹽/聚乙二醇沉澱法(Sidhu等人#e^o&i"/z/邁(7"《333-363，2000)從細胞上清液分離噬菌體顆粒。實施例2噬菌體如之前所述(Fairlie等人./j/o/C/e/zz27義'2125-2134，2004)進行所有ELISA。在各情況下，在4C下將促存活Bcl-2樣家族蛋白(5yg/mL)或M2抗FLAG抗體(0.5mg/mL)包被在Maxisorp96孑L板上過夜。在用6%(w/v)的PBS中的脫脂奶粉封閉後，以合適的稀釋度在PBS/0.1%(v/v)Tween-20/1%(w/v)脫脂奶粉中加入嗟菌體，在振蕩條件下在室溫下溫育1.5小時。在用PBS/Tween洗滌後，使用過氧化物酶綴合的抗M13抗體檢測結合的噬菌體。對於竟爭測定法，使用不同濃度的Bc卜2樣蛋白溶液，通過在室溫下共溫育1.5小時來取代固定的亞飽和稀釋度(sub-saturatingdilution)的嗟菌體展示BimBH3或其他BH3肽對固定的Bcl-2樣蛋白的結合。為了確定相對於天然序列，結合親和力是減少還是增加，用野生型BimBH3或BadBH3的ICs。值除以促存活蛋白的丙氨酸掃描突變體的ICs。值。表面爭岸f傳^孩fi5i/r/"ace//as邁o/7Teso/2a/2ceJ使用表面等離子體共振在Biacore3000生物傳感器(以HBS(10mMHEPESpH7.2，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005%Tween20)作為電泳緩衝液)上確定促存活Bcl-2蛋白的野生型和突變BimBH3肽的相對親和力。使用胺偶聯化學物質(Wilson-Annan等人，同上)固定26聚體BimBH3和對照非結合BimBH3突變體。通過將固定的亞飽和濃度(大約10nM)的促存活Be1-2與不同量的竟爭BH3蛋白在冰上在HBS中溫育超過2小時，比較其與固定的BimBH3肽竟爭對Bcl-2樣蛋白的結合的能力來估量BH3肽對促存活Bel-2樣蛋白的相對親和力(Wilson-An醒等人.o,CW/》/0/0g/嵌877-888,2003;Chen等人.Ce/777:393-403，2005)。然後在包含槽(在其上固定有野生型BimBH3)和對照槽(固定有非結合BimBH3突變體)的CM5傳感器晶片上注射所述混合物。減去基線反應(對照槽)，從而獲得絕對結合反應。然後如之前所述(Chen等人.2005同上)分析數據。逆掙錄病毒浙定法使用Lipofectamine(Invitrogen)將親本pMIG質粒DNA或包含編碼Bim或Bim突變體的插入片段的pMIG瞬時轉染入PhoenixEcotropic包裝細胞(http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral-systems/phx.html)(Kinesella和Nolan,1996)。通過旋轉接種(在4jig/mL聚凝胺(Sigma)存在的情況下在32。C下以2，500rpm離心"分鐘)使用經過濾的包含病毒的上清液感染感染3T9小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)。常規地獲得超過90%的感染效率。從StanleyKorsmeyer教授獲得SV40大T抗原固定的野生型和Bax+Bak+MEFS並將其保持在完全DME中。使用被感染的細胞(GFP+ve;FL-1)的流式細胞計數分析確定細胞的存活率(對於短期存活測定)，通過使用FACScan(BectonDickinson)分析，所述被感染的細胞排除5Hg/mL碘化丙啶(Sigma)(FL-3)。實施例3萬/yz7和^AW潛^誠4^霧伴丄#^3和^#傻存活家族蛋^的潛合在進行BimBH3和其他BH3結構域的任何結構-功能分析之前，首先必需確定序列是否可在噬菌體上展示，和確定其是否以這樣的方式起作用，所述方式與觀察到的例如BimBH3或BadBH3合成肽在其他生物化學測定中對促存活Bcl-2蛋白的結合方式相似。在初步測定中，就其對固定的Bel-Xl和Mcl-1的直接結合的能力檢測BimBH3和其他BH3噬菌體。觀察到兩種BH3結構域對Bel-^的相對強的可滴定的結合，同時只有BimBH3結合Mcl-l。這與之前顯示Bim可以以高親和力結合所有促存活蛋白同時Bad對於Bcl-x。Bcl-2和Bcl-w是特異性的數據一致(Chen等人，2005同上)。使用竟爭測定法進一步估量相互作用的特異性，在所述竟爭測定法中，在溶液中用對應的重組蛋白竟爭噬菌體對固定的蛋白的結合。獲得的IC5o值顯示於表3中，其與在表面等離子共振BIAcore儀(Chen等人2005同上)上使用表面等離子共振和使用等溫量熱術(isothermalcalorimetry)(數據未公開)測量的BimBH3和BadBH3合成肽的ICs。值非常相似。表3噬菌體展示的BH3-only蛋白的BH3結構域對促存活Bcl-2樣蛋白的結合親和力tableseeoriginaldocumentpage44為了研究BimBH3或BadBH3結構域序列中的特定殘基對結合Bcl-2樣促存活蛋白的重要性，產生成組的突變構建體，在所述構建體中將各殘基單個地突變成丙氨酸，或在其中丙氨酸或甘氨酸是野生型殘基的位置上，將其突變成穀氨酸。將各突變體作為融合至M13噬菌體上的g3的N端的融合物單價地在M13噬菌體上表達，然後就其對固定的促存活蛋白以及對抗FLAG抗體的結合的能力對其進行檢測。產生在氨基末端都具有FLAG表位的所有構建體，因為對抗FLAG抗體的結合提供了可用於估量各肽之間表達水平的差異的方法。為了確定用於竟爭ELISA中的各突變噬菌體的亞飽和稀釋度，進行初步滴定測定。為了確定突變肽對促存活蛋白的結合親和力，則在竟爭ELISA中使用在滴定測定法中確定的亞飽和稀釋度的噬菌體檢測噬菌體突變體。噬菌體展示的BH3突變體對Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-2和/或Mcl-l中的一種或多種的結合的親和力顯示於表4a至4e中。表4a噬菌體展示的BimBH3突變體對Bc1-Xl、Bcl-w、Bcl-2和Mc卜l的結合的親和力tableseeoriginaldocumentpage45NB-無結合倍數/wt=每野生型倍數表4b噬菌體展示的BadBH3突變體對Bcl-XL、Bcl-w和Bcl-2的結合的親和力tableseeoriginaldocumentpage46表4ctableseeoriginaldocumentpage47表4dtableseeoriginaldocumentpage48表4etableseeoriginaldocumentpage48tableseeoriginaldocumentpage49參考表4a.三種突變體A9E、G16E和D1A，即使對抗FLAG抗體的結合可與所有其他突變體相當，但在最初的滴定中顯示不結合Bel-xu這表明觀察到的效應不是異常表達的結果。對於幾乎5種受試突變體，在BimBH3結合上ICs。值的變化只隨小於4的因數而改變。由於A9E、G16E和D17A的結合很弱，不能獲得這些突變體的實際定量親和數據，然而，L12A和F19A的結合大約分別比野生型BimBH3弱50和20倍(ICs。=130nM和60nM)。根據可獲得的不同BH3-only蛋白和促存活Bcl-2樣蛋白之間的複合物的結構了解到BH3結構域的袋中。因此預期這些殘基可明顯促成兩個家族的蛋白之間的結合能(如對於上述L12A和F19A突變體所看到的)的產生。從而基於竟爭測定的結果，有趣地注意到將其他兩個疏水殘基突變(除了L12和F19)，18和115突變成丙氨酸不表現具有對其對Bcl-XL的結合的任何顯著影響049BimBH3對Mc卜l參考表4a。大多數針對Mcl-1的受試BimBH3丙氨酸突變體與它們對Bcl-Xt的結合能力相比，未表現具有對結合的顯著影響。只有兩個突變，G16E(38倍)和D17A(15倍)對與Mcl-l的結合具有顯著的影響，儘管這些影響不如觀察到的對相同突變體與Bcl-XL的結合的影響大。此外，與它們和Bc1-Xl的相互作用相反，L12A突變和F19A突變都不具有對結合的任何可檢測的影響。再一次地，通過檢測對FLAG抗體的結合來驗證不同突變體在噬菌體表面的表達。表4a中的結果總地表明Bim雙突變體L12A/F19A，與任何天然發生的BH3only蛋白不同，應當對於Mcl-l是有選擇性的。實施例5中顯示了該關係。BadBH3對Bcl-xBc卜w和Bcl-2:參考4b。類似地，提供的數據表明具有突變F19A的BadBH3結構域對於Bel-xL是有選擇性的，具有D17A或F23A的BadBH3結構域對於Bel-Xl和Bel-w是有選擇性。BidBFD對Bc卜Xl、Bc卜w和Mc卜1:參考表4c。類似地，提供的數據表明具有突變18A或A13E的BidBH3結構域對於Bcl-w是有選擇性的。BakBH3對Bc卜xL和Mc卜l參考表4e。具有突變V8A或I19A的BakBH3對於Mcl-1是有選擇性的。類似地雙突變R10A/Q11A對於Mcl-l是有選擇性的。如表4a至4e中所示的數據所反映的，很清楚對保持(或形成)複合物具有重要作用的殘基在不同的BH3-only蛋白和促存活蛋白配體之間是不同的。例如BimBH3和Bel-x^之間的相互作用涉及許多殘基包括L12、F19和特別是D17，同時BadBH3/Bcl-xl相互作用更依賴於L12的接觸。實施例4L12,D17,F19的詳細結構－功能分析在通過研究例如上述丙氨酸掃描誘變鑑定了BH3結構域-促存活相互作用的至關重要的殘基後，則可進行這些殘基的系統性替代以確定在這些位點的各位點上可被耐受的胺基酸殘基的物理化學性質。例如，在BimBH3中的對於對Bc卜Xl的結合非常重要的L12的情況下，可估量用其他更大的疏水殘基例如異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸或更小的胺基酸例如纈氨酸取代其的影響。然後將這些結合親和力與前面描述的野生型序列比較。可在小分子擬肽類藥物設計中利用來源於所述實驗的數據。在上述實施例中，如果在用酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸取代後觀察到非常弱的結合，那麼經設計模擬亮氨酸相互作用的小分子可避免使用上述胺基酸側鏈中發現的環狀基團。可選擇地，如果耐受上述殘基而在親和力上無顯著減少，那麼可包含相似大小的環狀化合物。在BimBH3對Bcl-xL的結合的情況下，當側鏈的大小從苯丙氨酸增加至色氨酸，觀察到5至22倍的結合親和力的累進減少(表5)。類似地，側鏈長度從纈氨酸至丙氨酸的減少導致親和力減少大約50至80倍。表5具有在BimBH3位點12、17和19上的置換，所述置換不引起低於100nM的對於4種促存活分子的親和力的減少。tableseeoriginaldocumentpage52表5在L12、D17和F19處的BimBH3突變體這些結果連同結構分析一起提供了用於設計模擬Bim在對Bc1-Xl、Bcl-2、Bcl-w和Mcl-l的結合上的作用的小分子化合物的合適構架。w"-oox逸.2vt.2■2tm.S絮奪龍ss一-，智表5中的數據教導如何產生促存活特定BH3序列的方法。因此，包含L12A、L12Q、L12H、D17R、F19D、F19K中的任一個突變的BimBH3對於Mcl-1是特異性的，對於上述突變的組合的選擇也具有相同的效果。實施例5為進一步驗證噬菌體展示篩選結果，在竟爭測定法中使用在BIAcore裝置上進行的表面等離子體共振分析和檢測許多對應於目的序列的肽。在這些實驗中，確定所述肽對促存活家族的所有成員(即Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al)的親和力，這些測定的結果顯示於表6中。就其結合不同促存活Bcl-2樣蛋白的能力檢測4種其中4個保守性疏水殘基(18、L12、115和F19)中的每一個^L單個地突變成丙氨酸的合成肽。I8A和I15A突變體保持野生型對促存活蛋白的結合親和力，這與從噬菌體ELISA獲得的結合相當一致。L12A突變體對Bcl-2、Bcl-w和Bcl-x^的結合親和力減少了30至70倍，同時對其餘兩種促存活蛋白Mcl-1和A1的結合只受到輕微影響，觀察到的結合親和力分別減少2和7倍。這些結果再次與之前描述的^菌體ELISA結果相當一致。F19A突變肽對不同促存活Bcl-2樣蛋白的結合似乎只受到輕微影響，其對Bcl-w的結合受到的影響最大，觀察到結合親和力減少8倍。對其餘促存活蛋白的結合親和力的減少低於3倍。表6在Biacore儀器上通過表面等離子共振測量的BimBH3突變合成肽對促存活Bel-2樣蛋白的結合親和力相對野生型BimBH3肽對Bcl-2樣蛋白的結合親和力的差異。tableseeoriginaldocumentpage54使用來自噬菌體分析和Biacore的數據，設計可對於特定促存活蛋白是特異性的序列。因為與其他促存活蛋白相比，Mcl-l似乎耐受大多數丙氨酸突變，因此其提供了適合檢測該想法的靶。組合Bim上的L12和F19的丙氨酸置換，因為這些置換似乎都不影響對Mcl-l的結合，但對Bcl-x^Bcl-2和Bel-w結合具有中等影響。如所預期的，包含這些突變的BimBH3結構域合成肽對與Bel-x"Bcl-2和Bel-w的結合具有顯著的破壞效應(在親和力上大於500倍的減少)但基本上保持對Mcl-l的野生型親和力。實施例6勿應縱迄今已檢測了26個胺基酸長度的BimBH3肽內的不同突變(當在噬菌體顆粒上展示時或作為合成肽時)對與不同促存活蛋白的結合的影響。因此接下來重要的是驗證當整合入全長Bim蛋白時觀察到的效應是可重現的，以及使數據與不同突變的生物學結果發生相關性。因此將各個至關重要的突變體整合入通過逆轉錄病毒導入哺乳動物細胞的BimS表達載體。然後在感染後30小時測量細胞的存活率。用消除對促存活蛋白的結合的Bim突變體感染的細胞預期可保持存活。然而，不影響結合的突變體應當保持致死活性。表7中顯示了來自致死測定的代表性數據。如所預期的，野生型Bim能夠有效地殺死小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)，通過碘化丙啶(PI)排除法測量的細胞存活率為19%。類似地，當將F19A突變整合入全長Bim蛋白並在MEF中表達時，該突變蛋白幾乎與天然Bira—樣有效地殺死細胞，這與該突變體以接近野生型親和力結合所有促存活蛋白的能力一致。G16E突變體在游離的合成肽和噬菌體上展示的背景中已喪失大量的對所有促存活蛋白的親和力，這反映了該突變體不能殺死MEF(93。/。的細胞存活率)。在D17A突變體的情況下，在噬菌體結合實驗中，我們不能檢測到當在噬菌體顆粒的表面表達時該突變體對Bel-Xl的任何結合。與該結果一致，野生型MEF不表現被BimS(D17A)殺死(89X的細胞存活率)，這表明，在一些情況下，使用噬菌體展示的肽獲得的結合數據與游離的合成肽相比可以更準確地反映它們的結合能力。由Willis等人Ce;7esa"f/"e^3/o/7歷e/^7義1294-1305，2005所做的以前的工作已證明Mcl-1和Bcl-XL的失活都足以產生有效的Bak介導的凋亡(Willis等人，2005同上)。A9E和L12A突變體對Bel-w、Bel-2和Bel-xL的結合親和力都具有適度的減少，同時仍保持接近對於Mc卜l和Al的野生型親和力。這與當兩種突變體在野生型MEF中表達時觀察到的中等殺傷一致。當整合入全長Bim蛋白時也檢測18A和I15A突變體的殺死能力。與都表明任一突變都不影響促存活蛋白結合的噬菌體和BIAcore的結果一致，這些突變體能夠殺死野生型MEF，達到與天然Bim蛋白相同的程度。作為對照實驗，檢測不同突變體殺死Bax/Bak雙缺陷型MEF的能力。如所預期的，沒有突變體殺死這些細胞，因為Bax和Bak是促進(commitment)細胞死亡所需要的。表7當在野生型和Bax/Bak雙缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中表達為全長蛋白(BimS)時，永生化的MEF被Bim突變體殺死BlmSi突變體在野生型MEF中的存活％—在Bax-/-Bak-/-MEFs中的存活%wtBlmS19卯BlmSA9E5593BlmSU2A5791B，mSG16E9397BlmSD17A8994BlmSF19A2287本領域技術人員認識到此處描述的發明除了明確描述的實施方案外易於改變和修改。要理解本發明包括所有此類改變和修飾。本發明也包括本說明書中提及的或指出的所有步驟、特徵、組合物和化合物，包括單個地或集體地步驟、特徵、組合物和化合物，以及任何兩個或更多個所述步驟或特徵的任何和所有組合。formulaseeoriginaldocumentpage57FairiieW。Z.屍ra紐/"fijqw柳/owflfwfPw訴c。"ow抓171-178,2002FixiVwr/n及w":1760-1764，19訴Glickm旭wcr/.,J5/o;wWScr柳7:3-10，2002Hajduke/CAg怖:2315-2317，1999;Hindse/a/.SAfflOJowr"W";1497-1507,2003HuangandStrasser，Ce///仍:839-842,2000Johnson"r/tfer"wA///we/JcjinJWo/ecA加/ogyww/外flrrw。qy,Johnstonew。/.,CW/7站:153-164，2002KunkelefW.她Ao必級125-139,1991KunASc/麵"7:1078-1082,1992Langcr,Sc/幼ce2移:1527-1533,1990Letaiw。/.，C朋ce/"Ce//2:183-192,2002;LugovskoywJj/wCAe加5ocW4:1234-1240，2002PattonMrf5totec/j7&141-143，19卯Pellect;hiaef。Z,，Wotf及evDrMgDtecov:2U-219,2002Pe加sefa"2000,鄉ra;Sttttl欲ef1997,SifproiPezzutoe/a/.,Eds"ChapmanandHaU，NewYork,1993Printw。/.屍rocW"r/5WWWPJ:12424-12431,1998PutneyandBurke,WW所o紐cA/tf:153-157,1998Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEdition^MackPublishingCompany,Easton,PA,l卿Sam咖nrf/屍/w，/Vkww卿/你l19-135,1996Sayani抑dChien,Crtt及evT^er￡>rwgOwrter辦W/3:85-184,1996Sidhue/a/,A/erto必五n^wo/32&'333-363,2000Strassere/a/.,Wflft/re34&331-333,19卯Suntres肌dShek，"Ao/w/Vi。rmaco/你23-28,1994SzokaandPapahadjopoulos,及ev5toengP:467-508，1980vandeWaterbee邁dandOifford,MzfitevZ)rwgZ)tec2:192-204，2003Vauxeffl〖.,Mrfww3":440"442,l卯8VutlaK7/no〖202:2699-2705,1991Willise(G-rtMa"^Z3eve/o/we/rf/P..1294-1305,2005Wilson-Annan"crf.Jb腦a/o/CW/J/o/o幼嵐'877-咖,2003Wohnslande/a/.,JA/fOww^:923-930,2001WoodkiViarw及wP:260265,1992Y助wJC"6說o(w/月ow她似&加'620-630,2000ZalipskyW"/.,JWocwj/wgCAe加(5:705-708,1995Zh旭g,Wo/及ev2tocovJ:101-102，200權利要求1.產生促存活Bc1-2家族成員的拮抗劑的方法，所述方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結構域的一個或多個胺基酸殘基；b.將突變的BH3結構域與促存活Bc1-2家族成員接觸；c.檢測突變的BH3結構域與促存活Bc1-2家族成員之間的結合的存在或不存在，從而鑑定促凋亡蛋白的BH3結構域中與BH3結構域和促存活Bc1-2家族成員的結合相互作用相關的胺基酸殘基；和d.產生拮抗劑，所述拮抗劑模擬在BH3結構域與Bc1-2蛋白之間發生結合所必需的胺基酸處的野生型BH3結構域。2.權利要求l的方法，其中所述拮抗劑對於選自Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al的促存活蛋白是特異性的。3.權利要求1或2的方法，其中所述拮抗劑基於選自Noxa、Bim、Puma、Bmf、'Bad、Bik、Hrk和Bid的BH3-only蛋白的結構。4.權利要求1的方法，其中所述Bcl-2拮抗劑抑制癌症細胞的促存活蛋白。5.權利要求4的方法，其中所述癌症選自ABL1原癌基因、AIDS相關性癌症、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、嚢性腺樣癌、腎上腺皮質癌、特發性骨髄外化生、斑殼、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星形細胞瘤、共濟失調性毛細血管擴張症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦幹神經膠質瘤、腦和兒童中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、兒童中樞神經系統腫瘤、類癌瘤、子宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期非白血性白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、結腸直腸癌、皮膚T淋巴細胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、導管癌、內分泌癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、眼癌、目艮黑素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、範可尼貧血、纖維肉瘤、膽嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸類癌瘤、泌尿生殖器腫瘤、生殖細胞腫瘤、妊娠性滋養層細胞病、神經膠質瘤、婦科癌症、血液腫瘤、毛細胞性白血病、頭頸癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細胞增多病、何杰金病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高血鈣症、喉咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯細胞組織細胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、非白血性白血病、李弗勞明症候群、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、腎的惡性棒狀腫瘤、成神經管細胞瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、轉移癌、口腔癌、多發性內分泌腺瘤症候群、萆樣肉芽腫、骨髄增生異常症候群、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎胚細胞瘤、成神經細胞瘤、神經纖維瘤病、nijmegen染色體斷裂症候群、非黑素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌-(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘻術卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲狀旁腺腫瘤、腮腺癌、陰莖癌、原始神經外胚層腫瘤、腦下垂體癌、真性紅細胞增多症、前列腺癌、rare-cancers-and-associated-disorders、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、先天性血管萎縮性皮膚異色病、涎腺惡性腫瘤、肉瘤、神經鞘瘤、惡性皮膚網狀細胞增多症候群、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髓瘤、皮膚鱗狀細l包癌(squainous-cel卜carci醒a-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌(thymuscancer)、甲狀腺癌、移行細胞癌(膀胱)(transitional-cell-cancer-(bladder))、移行細胞癌(腎臟-骨盆-/-輸尿管)、滋養細胞腫瘤、輸尿管癌、泌尿系統腫瘤、異地排尿(uroplakins)、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血症和維爾姆斯氏腫瘤。6.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述拮抗劑抑制促存活蛋白。7.權利要求6的方法，其中所述哺乳動物是人。8.治療受試者中的癌症的方法，所述方法包括在在足以誘導癌症的凋亡或減輕癌症症狀的時間和條件下給所述受試者施用有效量的通過權利要求1的方法鑑定的促存活Bcl-2蛋白的拮抗劑。9.權利要求8的方法，其中將所述拮抗劑與一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑混合以形成藥物組合物。10.權利要求8或9的方法，其中通過呼吸、氣管內、經鼻咽、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、皮內、肌內、眼內、鞘內、大腦內、鼻內、輸注、口服、經直腸、貼附和植入途徑施用所述拮抗劑。11.預防或改善受試者中的過度增生性疾病的方法，所述方法包括有效量的促存活Bcl-2蛋白的拮抗劑。12.權利要求11的方法，其中將所述拮抗劑與一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑混合以形成藥物組合物。13.權利要求11或12的方法，其中通過呼吸、氣管內、經鼻咽、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、皮內、肌內、眼內、鞘內、大腦內、鼻內、輸注、口服、經直腸、貼附和植入途徑施用所述拮抗劑。14.在SEQIDN0:1至10的一個或多個中所示的至少一個或多個胺基酸殘基上具有非野生型BH3-only結構域序列的拮抗劑。15.權利要求14要求的拮抗劑，其包括具有L12A/F19A、具有對Mcl-l的選擇性的Bini。16.權利要求14的拮抗劑，其包括具有D17A或F23A、喪失對Bcl-2而不是Bcl-xt或Bc1-w的結合的Bad。17.權利要求14的拮抗劑，其包括具有F19A、具有對Bcl-Xt的選擇性的Bad。18.權利要求14的拮抗劑，其包括具有18A或A13E、具有對Bcli的選擇性的Bid。19.權利要求14的拮抗劑，其包括具有V8A或119A、具有對Mcl-l的選擇性的Bak。20.權利要求14的拮抗劑，其包括具有R10A或Q11A、具有對Mcl-l的選擇性的Bak。21.權利要求14的拮抗劑，其包括具有L12至A或G或T或Q或H置換的Bim或具有D17至R置換的Bim或具有F19至D或K置換的Bim、且具有對Mcl-1的選擇性的Bim。22.權利要求14的拮抗劑，其包括具有L12Y和F19至R、H、N或E置換的Bim、且是具有對Bcl-2的選擇性給合的Bim。全文摘要本發明通常涉及用於調節靶細胞或細胞群體中的凋亡的治療性分子。更特別地，本發明提供了抑制促存活分子的和能夠誘導或促進靶細胞或細胞群體例如癌細胞的凋死亡的治療劑。本發明還提供了用於產生或選擇該治療分子和包含所述治療分子的藥物組合物的方法。文檔編號A61P35/00GK101248177SQ200680030608公開日2008年8月20日申請日期2006年6月23日優先權日2005年6月24日發明者D·C·S·黃,E·F·李,P·M·科爾曼,W·D·費爾利申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫學研究院