具有多拷貝目的基因和可篩選標記而不具選擇性標記的產蛋白質細胞的製作方法

2023-05-28 13:18:46 2

專利名稱：：具有多拷貝目的基因和可篩選標記而不具選擇性標記的產蛋白質細胞的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種構建不含有插入選擇性標記基因的微生物多拷貝產蛋白質細胞的方法；通過該方法可獲得的微生物多拷貝產蛋白質細胞；以及使用這種微生物多拷貝產蛋白質細胞生產目的蛋白質的方法。
背景技術：
：本領域描述了大量製備能夠表達高產量目的蛋白質的微生物菌株的方法。這些方法通常是基於多拷貝菌株的構建，即該菌株含有多於一個拷貝的編碼目的蛋白質的基因。這些多拷貝菌株通常按如下策略構建1)將一段序列導入微生物細胞的染色體中，由此使該細胞染色體含有DNA結構A-P-M-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質的DNA序列，M表示編碼選擇性標記的DNA序列(如抗生素抗性)，2)在對選擇性標記增加的選擇壓力下增殖所述細胞；3)鑑定通過同源序列A的同源重組獲得了增加的抗性的細胞。構建的多拷貝菌株然後含有結構---A-P-M-A-P-M-A-P-M-A---專利US4959316，US5695976，US5733753和WO94/14968，描述了這些構建多拷貝菌株的方法，此外引入的參考提供了更多的細節。發明概述基於環境的考慮，在蛋白質工業生產中選擇性標記尤其是抗生素抗性標記用於細胞中，在各種方法中不是優選的。因此，本發明要解決的問題是提供一種在實際多拷貝分離過程中不使用任何選擇性標記的多拷貝細胞構建新方法，由此提供了獲得不含有插入選釋性標記基因，尤其是沒有插入抗生素抗性標記基因的多拷貝細胞的可能性。問題的解決基於本發明人證實，可以使用可篩選蛋白質(screenableprotein)作為標記替代本領域中已知的使用選擇性蛋白質(selectableprotein)作為標記來構建多拷貝菌株。因此，本發明第一部分涉及一種構建不含有插入選擇性標記基因的微生物多拷貝產蛋白質細胞的方法，包括a)將一段序列導入微生物細胞的染色體中，由此使該細胞染色體含有DNA結構A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質的DNA序列，S表示編碼可篩選蛋白質的DNA序列b)增殖所述細胞；c)篩選產生增加量的選擇性蛋白質的細胞；以及c)回收c)所鑑定的細胞；以及任選地d)使用步驟d)中回收的細胞作為起始材料重複步驟b-d。術語「可篩選蛋白質」表示一種蛋白質不是細胞生長所必需的，即如果它被從細胞中去除，那麼在類似的生長條件下，與所述細胞中包含可篩選蛋白質時相比，該細胞仍然能夠以基本上相同的生長速率生長。一個合適的「可篩選蛋白質」可以是在適宜暴露下發螢光的蛋白質，比如綠色螢光蛋白質(GFP)或其變體(更多細節見下)。這一術語是與此處定義為「選擇性蛋白質」的蛋白質相對應而言的；「選擇性標記蛋白質」或「選擇標記蛋白質」表示一種是細胞生長所必需的蛋白質，即如果它被從細胞中去除，那麼那麼在類似的生長條件下，與所述細胞中包含「選擇性蛋白質」相比，該細胞將不能在以基本上相同的生長速率生長。這種「選擇性標記蛋白質」通常可以是一種抗生素抗性蛋白質。因此，當一個細胞生長於含相應抗生素的培養基中時，細胞內抗生素抗性蛋白質的量可以基本上影響細胞的實際生長速率。術語「不含有插入選擇性標記基因的多拷貝產蛋白質細胞」表示一個細胞不含有在製備多拷貝產蛋白質細胞過程中被插入細胞的選擇性標記基因。本領域中製備含有這種插入選擇性標記基因多拷貝產蛋白質細胞的已知方法的討論見上述「背景」部分。術語「基因」表示編碼具特異活性的多肽的DNA序列，即術語「選擇性標記基因」表示編碼具選擇性標記活性的多肽的DNA序列。根據本發明的方法鑑定的多拷貝細胞，通過同源序列「A」的自發同源重組在染色體中獲得了增加數目的可篩選蛋白質「S」基因。自發同源重組通常是相當稀有的事件。然而，通過根據本發明的方法篩選合適數量的細胞(優選多於105個細胞)，本發明人證實可以鑑定出這種細胞。根據本發明所最終構建的多拷貝細胞，含有---A-P-S-A-P-S-A-P-S-A---結構，由此含有多拷貝的目的蛋白質「P」。根據本發明的方法製備的多拷貝細胞的一個好處是，它不含有插入的選擇性標記基因「M」(本領域中已知方法的描述見「背景」部分，其中最終構建的多拷貝細胞的特徵是含有這種插入的選擇性標記基因)。這些基因特別是抗生素抗性基因的存在，從環境角度和產品獲準角度考慮是不希望有的。本發明的第二部分涉及通過本發明的任一種方法可獲得的微生物多拷貝產蛋白質細胞，其特徵是該細胞含有多拷貝表達的目的蛋白質的基因(「P」)和表達可篩選蛋白質的基因(「S」)。術語「多拷貝表達目的蛋白質的基因(「P」)」表示所述細胞含有至少2個拷貝的表達該目的蛋白質的基因；更優選所述細胞含有至少4個拷貝表達該目的蛋白質的基因；最優選所述細胞含有至少7個拷貝表達該目的蛋白質的基因。術語「多拷貝表達可篩選蛋白質的基因(「S」)」表示所述細胞含有至少2個拷貝的表達該可篩選蛋白質的基因；更優選所述細胞含有至少4個拷貝表達該可篩選蛋白質的基因；最優選所述細胞含有至少7個拷貝表達該可篩選蛋白質的基因。本發明的第三部分涉及在微生物細胞中產生至少一個目的蛋白質基因的方法，方法包括1)在許可產生目的蛋白質的條件下培養的根據權利要求9)微生物多拷貝產蛋白質細胞；及2)從獲得的培養液或微生物多拷貝產蛋白質細胞中回收該目的蛋白質。本發明的實施方案僅通過實施例描述如下。附圖這些圖顯示了根據本發明，在工作實施例1和工作實施例2中，通過構建微生物多拷貝產蛋白質細胞的方法，製備多拷貝產蛋白質細胞時使用的質粒。隨後在實施例1和實施例2中提供了對該質粒的更多描述。發明詳述將序列導入微生物細胞的染色體中以使細胞染色體含有DNA結構A-P-S-A將序列導入微生物細胞的染色體中以使細胞染色體含有DNA結構A-P-S-A(步驟a))可以通過本領域中已知的將含有A-P-M-A(「M」是選擇性標記基因)結構的DNA結構構建到微生物細胞染色體中的類似策略進行。將這種DNA結構構建到微生物細胞染色體中可以進行如下，將含有結構A-P-S-A，或更優化含有結構A-P-S的載體，導入微生物細胞，隨後該結構整合入該微生物細胞的染色體中。或可以以類似的方法將一個含有可篩選蛋白質「S」的DNA片段直接導入已含有A-P-A結構的染色體中，以在染色體上產生DNA結構A-P-S-A。對本領域中的技術人員來說，選擇一個特別合適的策略將A-P-S-A結構導入微生物細胞的染色體中是常規工作。WO94/23073，US5695976，US5733753，和US4959316非常詳盡地描述了這些策略，這些文獻此處引入作為將這種DNA結構導入微生物細胞染色體的詳細描述。再者，此處的工作實施例描述了合適策略的例子(見下文)。另外，術語「將序列導入微生物細胞的染色體中以使細胞染色體含DNA結構A-P-S-A」可以定義為「將含有結構A-P-S-A的DNA構造導入微生物細胞的染色體中」。篩選產生增加量的可篩選蛋白質的細胞根據本發明為了鑑定多拷貝細胞，優選篩選大量細胞。優選(在步驟c)中)至少篩選105個細胞，更優選篩選至少106個細胞，以及更優選篩選107至少個細胞。在本發明的一個實施方案中，在步驟c)中的可篩選蛋白質是一種在合適暴露下發螢光的蛋白質，該螢光蛋白質特別是綠色螢光蛋白質(GFP)或其變種。本領域描述了綠色螢光蛋白質(GFP)或其變種在本領域中已有描述，更多細節見Crameri等，NatureBiotechnology14315-319(1996)；Cormack等，GENE17333-38(1996)；WO97/11094。GFP在合適曝光下發螢光。另一例可供選擇的合適的可篩選蛋白質是β-半乳糖苷酶，可以根據本領域已知方法，用合適的發螢光酶底物檢測它。篩選可以使用任何可測定螢光蛋白質量的標準篩選系統進行。基於實施這一方法的高篩選能力和商業上可獲得的儀器，優選使用具細胞分選能力的流式細胞計通過已知的流式細胞計技術進行步驟C)的篩選(Cormack等，「FACS-優化的綠色螢光蛋白質(GFP)突變體」GENE17333-38(1996))。這種流式細胞計的一個例子是BectonDickinsonand公司生產的FACSCalibur流式細胞計。因此，在本發明進一步的實施方案中，通過使用有細胞分選能力的流式細胞計完成步驟c)的篩選，篩選具增加量的發螢光可篩選蛋白質的細胞，此處該發螢光蛋白質特別是綠色螢光蛋白質(GFP)或其變種，在篩選過程中，GFP或其變種在合適的曝光下發出螢光。在本發明更進一步的實施方案中，本發明的微生物細胞是細菌細胞，特別地此處該細菌細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)的細胞，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)，短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)，嗜熱芽孢桿菌(Bacillusstearothermophus)，嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophlus)，解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)，燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)，蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，幽閉芽孢桿菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的細胞。在本發明更進一步的實施方案中，目的蛋白質(步驟a)中的「P」)是一種酶，特別是蛋白質酶，脂酶，澱粉酶，半乳糖苷酶，支鏈澱粉酶(pullanase)，纖維素酶，葡萄糖異構酶，蛋白質二硫鍵異構酶，環化糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基轉移酶，漆酶，或木聚糖酶。根據本發明的任何方法可獲得的微生物多拷貝產蛋白質細胞如上所述，該多拷貝產蛋白質細胞的特點是含有多個拷貝的表達目的蛋白質(P)的基因和多個拷貝表達可篩選蛋白質(「S」)的基因。如上所進一步顯示的，該多拷貝產蛋白質細胞進一步的特徵是它不含有在製備多拷貝產蛋白質細胞過程中插入細胞的選擇性標記基因。在微生物細胞中產生至少一個目的蛋白質的方法培養微生物多拷貝產蛋白質細胞的培養基可以是任何傳統的適於所研究的細胞生長的培養基。表達的目的蛋白質可常規地分泌到培養基中，然後通過眾所周知的方法從中回收，包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，通過硫酸銨等鹽沉澱蛋白質性物質，接著通過諸如離子交換層析，親和層析等層析方法分離蛋白質。本發明通過下面的非限制性實施例作進一步說明。再者，該申請要求優先權的丹麥專利申請DK0792/97的內容，和伴隨該申請的摘要此處引入作為參考。材料和方法普通分子生物學方法除非另外提及，DNA操作和轉化按照標準的分子生物學方法進行(Sambrook等，(1989)分子克隆---實驗手冊，冷泉港實驗室，冷泉港NY；Ausubel，F.M.等(eds)，「currentprotocolsinMolecularBiology」.JohnWileyandSons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(eds)，芽孢桿菌的分子生物方法.JohnWileyandSons1990).除非另外提及，PCR操作使用標準方法和PCR反應數據進行，可參見例如教科書(PCR實用方法IRL出版社，(1991))。DNA操作所用的酶根據供應商的說明等使用。DNA操作所用的酶除非另外提及，所有的酶，例如限制性內切酶，連接酶等，均獲自新英格蘭Biolabs公司。流式細胞計流式細胞術使用BectonDickinson公司生產的FACSCalibur流式細胞計進行。在FACSCalibur流式細胞計上根據供應商的指導，例如1996年8月的FACSCaliburTM系統用戶指導的描述進行流式細胞術。流式細胞術術語學依該FACSCaliburTM系統用戶指導使用。培養基TY，BPX和LB瓊脂已在EP0506780中描述，LBPSG瓊脂是添加了磷酸鹽(0.01MK3PO4)，葡萄糖(0.4％)和澱粉(0.5％)的LB瓊脂。實施例1含有可擴增盒的細菌菌株的構建，該盒包含有經典的抗生素抗性標記基因，和編碼綠色螢光蛋白的可篩選基因。質粒的構建A)pSJ2773美國專利57333753描述了質粒pSJ2059和它作為產生插入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的amyL位點的基因擴增的工具。為使質粒能通過接合而轉移，質粒pUB110的oriT區被插入pSJ2059以產生質粒pSJ2773(圖1)。如WO96/23073所描述的，pUB110的轉移依賴於位於5』到(orfβ)的順式作用區oriT(Selinger，L.B.，McGroger，N.F.，Khachatourians，G.G.，和Hynes，M.F.(1990)等，通用芽孢桿菌質粒pXO503密切相關的質粒pUB110和pBC16的轉移需要反式作用開放讀框β.J.Bacteriol.，172，3290-3297)。使用引物LWN5232和LWN5233進行PCR擴增pUB110序列中pos.1020到pos.1575的550bp的片段(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.，Sueoka，N.(1986).pUB110的核苷酸序列一些突出的與複製和其調節有關特徵.Plasmid，15，93-103)。LWN52325』-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3』LWN52335，-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3』擴增的片段用SacI酶消化，先克隆到大腸桿菌質粒(pUC19衍生物)的SacI位點。接著又用SacI酶切下該片段，克隆到pUC19衍生物pDN3000SacI位點(Diderchsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990).編碼一個從短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)來的胞外酶，乙醯乳酸脫羧酶的aldB的克隆J.Bacteriol.，172，4315-4321)上，得到pSJ2742(圖2)。然後OriT片段被從質粒pSJ2742上以0.5kb的BamHI-BglII片段切下，連接到BamHI酶消化的pSJ2059質粒上，連接混合物轉化入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DN1885的感受態細胞中，在30℃篩選對紅黴素(5μg/ml)和卡那黴素(10μg/ml)的抗性。獲得的一個轉化體是含有pSJ2773的SJ2773。B)pSJ4574如WO97/11094所述獲得編碼「F64L-S65T-GFP」，一個綠色螢光蛋白突變品種的基因。該基因是使用引物#109563和#128360經PCR擴增的。#1095635』-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3』#1283605』-CGTGAATTCGAGCTCTGCAGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3』用EcoRI和BspHI酶消化PCR擴增的片段。使用從解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-澱粉酶基因amyQ的啟動子和核糖體結合位點以使「F64L-S65T-GFP」的編碼基因得以表達，使用引物LWN8741和LWN8742從解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA上通過PCR擴增amyQ啟動子。LWN87415』-GTCACTGATCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3』LWN87425』-GTCACTCATGAGTTTCCTCTCCCTCTC-3』用BclI和BspHI酶消化獲得的PCR片段，將該片段克隆到pUB110衍生的芽孢桿菌(Bacillus)載體上。對插入片段進行測序，發現該序列與發表的amyQ啟動子序列一致(Palva，I.，Pettersson，R.F.，Kalkkinen，N.，Lehtovaara，P.，Sarvas，M.，Soderlund，H.，Takkinen，K.，Kaariainen，L.(1981)解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-澱粉酶基因啟動子和NH2-未端的信號肽區的核苷酸序列。Gene15，43-51)。接著再將啟動子現在以ClaI-BspHI片段從這個載體上切下。用AccI和EcoRI酶消化克隆載體pUC19，載體片段在三片段連接中與含amyQ啟動子的ClaI-BspHI片段及含有「F64L-S65T-GFP」編碼基因的BspHI-EcoRI片段相連接。用此連接混合物轉化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等，1990)獲得的轉化體具很強的綠色螢光。其中一個轉化體是含有pSJ4574的SJ4574。C)pSJ4621通過下列步驟將從amyQ啟動子表達的「F64L-S65T-GFP」編碼基因插入到擴增載體質粒pSJ2773中(i)用HindIII和AflIII酶消化pSJ2773質粒，純化3.95bp的片段。(ii)用AflIII和EcoRI酶消化pSJ2773質粒，純化4.25bp的片段。(iii)用EcoRI和HindIII酶消化pSJ4574質粒，純化1.0bp的片段。連接三個純化的片段，將混合物轉化到枯草芽孢桿菌(B.subtilis)DN1885中，在30℃選擇對卡那黴素(10μg/ml)和紅黴素(5μg/ml)的抗性。保存的兩個發螢光的轉化體是含有pSJ4621的SJ4621菌株(圖4)和含有pSJ4622的SJ4622菌株。接合供體菌株的構建將如WO96/23073實施例4所述的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株PP289-5製成感受態並用質粒pSJ4621(得到菌株SJ4623和SJ4624)和pSJ4622(得到菌株SJ4625和SJ4626)轉化。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃選擇對紅黴素(5μg/ml)和四環素(5μg/ml)的抗性。質粒向地衣芽孢桿菌(Blichenifomis)的轉移菌株SJ4623和SJ4625被用作接合過程的供體菌株以將擴增質粒載體轉入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)受體菌株中，接合過程基本上按WO96/23073所述進行。這些受體菌株含有一個染色體拷貝的α-澱粉酶基因amyL。獲得的轉化接合子具有對紅黴素(5μg/ml)和卡那黴素(10μg/ml)的抗性，轉化接合子菌落的綠色螢光顯示出表達了F64L-S65T-GFP基因。擴增盒的染色體整合將轉化接合子菌落在含紅黴素(10μg/ml)的LBPSG平板上劃線，在50℃培養，長出擴增載體質粒整合入染色體的菌落。然後將這些50℃平板上的單菌落接種到不含抗生素的TY培養基(10ml)中，在30℃生長過夜，以使質粒複製恢復，結果是質粒從染色體上的最終切除，在缺少選擇壓力的情況下，切下的質粒將從細胞中丟失。重複一次在不含抗生素的TY培養基中的生長，將細胞塗布於含卡那黴素(10μg/ml)的平板上。這些細胞然後影印塗布於含紅黴素(5μg/ml)的平板上，分離出具卡那黴素抗性而對紅黴素敏感的菌落。這些菌落一些天后表現出明顯的綠色螢光。具有幾個基因拷貝的菌株的分離從上述構建的菌株中分離含有多個拷貝編碼α-澱粉酶，「F64L-S65T-GFP」和卡那黴素抗性基因的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)菌株。這些菌株是在生長培養基中存在的卡那黴素濃度增加時，通過前面描述的增殖方法分離的，該方法篩選的存活菌株具有多個基因拷貝(見US5,733,753)。因此，篩選的是能在10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml時生長的菌株。測定所獲菌株在搖瓶培養中的澱粉酶產量。同時測定這些培養物細胞「F64L-S65T-GFP」蛋白質的細胞含量，建立起卡那黴素抗性，α-澱粉酶產量和細胞螢光的相關性。在本發明的實驗程序中，分離具有多個基因拷貝的菌株的方法不依賴於基於卡那黴素抗性基因的直接存活選擇，而依賴於對較一般細胞顯示出更高細胞螢光的細胞的物理分離。如果細胞含有的「F64L-S65T-GFP」表達基因的拷貝數增加，該細胞就會具有較高的細胞螢光，因而這種方法就會使具有多個基因拷貝的細胞得以分離。如果用作多基因拷貝細胞分離起點的細胞中不存在抗生素抗性標記基因，那麼獲得的細胞將含有多拷貝的目的基因(如澱粉酶基因)，以及「F64L-S65T-GFP」編碼基因，但是不含有抗生素抗性基因。更多細節見此文實施例2後一部分(見後)。依照如上描述的實驗程序，構建這種細胞的方法是使用一種擴增載體質粒，其中的卡那黴素抗性基因處於位點專一性重組酶識別位點，如質粒pAMbetal的res位點的側翼。一旦細胞獲得整合的擴增盒(由卡那黴素抗性，F64L-S65T-GFP的表達和紅黴素抗性的缺失顯示)，就通過將編碼pAMbetal解離酶蛋白的載體導入細胞來去除卡那黴素抗性基因。WO96/23073詳細描述了使用res位點和解離酶介導整合的抗生素抗性標記基因去除的技術。構建這種細胞的另一個方法在下面的實施例2中描述。實施例2內含擴增盒具有編碼綠色螢光蛋白的可篩選基因，而不具抗生素抗性標記基因的擴增盒的細菌菌株的構建這個實施例中的策略是構建一個擴增載體質粒，其中無啟動子的GFP基因緊隨插入在解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)amyL基因編碼序列的下遊，再接著是一個拷貝的amyL啟動子區。質粒構建A)pSJ4284和pSJ4285使用引物#109561和#109562通過PCR從解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA擴增編碼AmyLC-未端部分的一個大約400鹼基對的amyL基因的片段。#1095615』-GACTGAATTCCAAACATGGTTTAAGCC-3』#1095625』-GACTAAGCTTGGATCCGCATGCCTATCTTTGAACATAAATTG-3』擴增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，連接到EcoRI和HindIII酶消化的質粒pUC19上，產生質粒pSJ4284和pSJ4285(圖5)。B)pSJ4286和pSJ4285使用引物#109564和#109565通過PCR從解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA擴增從緊接著amyL基因編碼區下遊起始的大約200鹼基對的一個片段。#1095645』-GACTGAATTCGGATCCGCAGAGAGGACGGATTTCC-3』#1095655』-GACTAAGCTTCGATACCGTCATTTTCG-3』擴增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，連接到EcoRI和HindIII酶消化的質粒pUC19上，產生pSJ4286和pSJ4287(圖6)。C)pSJ4294和pSJ4295這些質粒(圖6)通過將從pSJ4286切下的0.2kb的BamHI-HindIII片段插入BamHI+HindIII消化的質粒pSJ4285而創建。C)pSJ4313和pSJ4314編碼「F64L-S65T-GFP」的基因。使用引物#109563和#18842通過PCR擴增該基因。#1095635』-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3』#188425』-CGTGCTCGAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3』擴增的片段用BamHI和SphI酶消化，連接到BamHI+SphI酶消化的質粒pSJ4295上，產生質粒pSJ4313和pSJ4314(圖8)。E)pSJ4530應用下列步驟構建實際的擴增載體質粒(i)用BglII和HindIII消化PSJ1985(見US5,737,753，實施例1和圖4所描述)，分離1.7kb的片段。(ii)用BamI和HindIII消化pSJ4313，分離3.9kb片段。(iii)將這兩個片段然後混合起來並連接，連接混合物然後EcoRI和HindIII酶消化，從瓊脂糖凝膠電泳中分離2.9kb的片段。(iv)然後將分離的片段連接到PSJ2739(見WO96/23073，實施例6所描述)的5.4kb的EcoRI-HindIII片段上，連接混合物轉化進枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DN1885菌株中，在30℃選擇紅黴素(5μg/ml)。如此分離到含有質粒pSJ4530(圖9)的菌株SJ4530。接合供體菌株的構建將如WO96/23073實施例4所述的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株PP289-5被製成感受態並用質粒pSJ4530轉化，得到菌株SJ4541和SJ4542。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃篩選對紅黴素(5μg/ml)和四環素(5μg/ml)的抗性。質粒向地衣芽孢桿菌(B.lichenifomis)的轉移菌株SJ4541和SJ4542被用作接合過程的供體菌株以將擴增載體質粒轉入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)受體菌株中，接合過程基本上按WO96/23073所述進行。這些受體菌株含有一個染色體拷貝的α-澱粉酶基因amyL。獲得的轉化接合子具有對紅黴素(5μg/ml)的抗性。擴增盒染色體整合將轉化接合子菌落在含紅黴素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線，在50℃培養，長出擴增載體質粒整合入染色體的菌落。然後將這些50℃平板上的單菌落接種到不含抗生素的液體生長培養基中，在30℃增殖，以使質粒複製恢復，結果是質粒從染色體上的最終切除，在缺少選擇壓力的情況下，切下的質粒將從細胞中丟失。在此過程中發生了所需的重組事件，即Amy-LC-未端編碼區的整合和在更下遊區的切除(或相反)，這些細胞含有緊隨amyL基因編碼區的下遊插入的F64L-S65T-GFP基因，能夠基於F64L-S65T-GFP蛋白質的表達而鑑定。這些細胞傳統上使用具細胞分選功能的流式細胞計，比如FASCalibur流式細胞計從其他細胞中分離出。具有幾個基因拷貝的菌株的分離從如上構建的菌株中分離含有幾個拷貝的編碼α-澱粉酶和F64L-S65T-GFP基因的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)菌株。以如上構建的菌株作為起始培養物在F64L-S65T-GFP可以表達的生長培養基中增殖。從培養物中取樣，適當稀釋，通常至5×105和5×106細胞/毫升之間。在FASCalibur流式細胞計上分析稀釋的樣品，其中顆粒由氬離子雷射器在488nm處的暴露明。調整FASCalibur流式細胞計以便能夠根據其前向光散射(FSC)，側向光散射(SSC)，和在大約530nm處綠色/黃綠螢光(FL1)信號檢測細胞。以FSS或SSC為一軸，FL1為另一軸建立點圖。相應於比普通細胞具較高FL1螢光的細胞建立起分選門(sortgate)，而帶有的流式細胞計信號在這個分檢門內的細胞被從全部細胞群中分選出。將分選出的細胞塗布於LBPSG平板上，在37℃培養1-2天。將細胞刮去平板上並收集。這構成了新的中間細胞群。使用新的中間細胞群作為起始材料，整個增殖過程，具有將FL1螢光比普通細胞較高的細胞分選出能力的流式細胞術，培養分選出的細胞以產生另一個中間細胞群體，重複一定次數直至用FASCalibur流式細胞計可測出比起始培養物具顯著高的FL1細胞螢光的細胞群。從這些比起始培養物具顯著高的FL1細胞螢光的細胞群體中分選細胞，在LBPSG平板上塗板，在37℃培養1-2天，分離單菌落。在允許α-澱粉酶和F64L-S65T-GFP表達的生長培養基中培養菌株，單菌落與原起始培養物比較。當FASCalibur上測定的FL1細胞螢光和α-澱粉酶產量都比原起始培養物增加時，就獲得了含有幾個基因克隆的菌株。權利要求1.一個構建不含有插入選擇性標記基因的微生物多拷貝產蛋白質細胞的方法，包括a)將一段序列導入微生物細胞的染色體中，由此使該細胞染色體含有DNA結構A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質的DNA序列，S表示編碼可篩選蛋白質的DNA序列b)增殖所述細胞；c)篩選產生增加量的選擇性蛋白質的細胞；以及d)回收c)所鑑定的細胞；以及任選地e)使用步驟d)中回收的細胞作為起始材料重複步驟b-d。2.根據權利要求1的方法，其中該可篩選蛋白質是在合適暴露下發螢光的蛋白質。3.根據權利要求2的方法，其中該發螢光蛋白質是綠色螢光蛋白(GFP)或其變種。4.根據權利要求2或3的方法，其中的篩選步驟C)是通過使用具細胞分選能力的流式細胞計，篩選發螢光可篩選蛋白質的量增加的細胞進行的。5.根據權利要求4的方法，其中該發螢光蛋白質是綠色螢光蛋白(GFP)或其變種，在篩選步驟中，在合適的暴露下使GFP或其變種發出螢光。6.根據權利要求1-5的任意方法，其中該微生物細胞是細菌細胞。7.根據權利要求6的方法，其中的細菌細胞是芽孢桿菌(Bacillus)屬的細胞，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)，短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)，嗜熱芽孢桿菌(Bacillusstearothermophus)，嗜鹼芽孢桿菌(Baci′lusalkalophlus)，解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)，燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)，蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，幽閉芽孢桿菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的細胞。8.前述任何權利要求的方法，其中該目的蛋白質是一種酶，特別是蛋白質酶，脂酶，澱粉酶，半乳糖苷酶，支鏈澱粉酶，纖維素酶，葡萄糖異構酶，蛋白質二硫鍵異構酶，環化糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基轉移酶，漆酶，或木聚糖酶。9.根據權利要求1-8任何方法可獲得的微生物多拷貝產蛋白質細胞，其特徵是該細胞含有多個拷貝表達目的蛋白質(「P」)的基因和多個拷貝表達可篩選蛋白質(「S」)的基因。10.在微生物細胞中產生至少一個目的蛋白質的方法，這一方法包括(i)在允許目的蛋白質產生的條件下培養根據權利要求9的微生物多拷貝產蛋白質細胞；以及(ii)從獲得的培養液或微生物的多拷貝產蛋白質細胞中回收該目的蛋白質。全文摘要一個構建不含有插入選擇性標記基因的微生物多拷貝產蛋白質細胞的方法;由此法獲得的微生物多拷貝產蛋白質細胞;以及用該微生物多拷貝產蛋白質細胞產生目的蛋白的方法。文檔編號C12N15/90GK1261918SQ9880687公開日2000年8月2日申請日期1998年7月2日優先權日1997年7月3日發明者斯蒂恩·T·喬根森,基姆·B·佩德森申請人:諾沃挪第克公司