雙特異性抗體融合物的製作方法

2023-05-28 08:27:31

專利名稱：雙特異性抗體融合物的製作方法
雙特異性抗體融合物本發明涉及新的雙特異性抗體融合蛋白。此類抗體包含針對目的抗原的第一特異性，和對於第二目的抗原的第二特異性，所述第二目的抗原例如為血清載體蛋白，其用於在 延長抗體的體內血清半衰期中使用。還提供了用於產生此類分子的方法和包含它們的藥物 組合物。抗體的高特異性和親和力使得它們成為理想的診斷和治療劑，特別是用於調節 蛋白質蛋白質相互作用。在重組抗體技術領域中的進展已導致產生出抗體片段例如Fv、 Fab、Fab』和F(ab』 )2片段及其他抗體片段。這些更小的分子保留了完整抗體的抗原結合 活性，並且還可以展示出相比於完整免疫球蛋白分子而言經改善的組織滲透和藥物代謝 動力學特性。事實上，抗體片段被證明是多用途的治療劑，如通過產品例如ReoPro 和 Lucent is 的近期成功而可見的。儘管此類片段看起來展示出超過完整免疫球蛋白的 許多優點，但它們還遭受了增加的從血清中的清除率，因為它們缺乏賦予長的體內壽命的 Fc 結構域(Medasan 等人，1997，J. Immunol. 158 :2211-2217)。先前已描述了具有雙特異性即與兩種不同的抗原相結合的抗體(關於綜述， 參見 Segal 等 A,1999, Curr. Opin. Immunol. 11 558-562 ；Plukthun & Pack，1997， Immunotechnology, 3 83~105 ；Fischer 禾口 Leger,2007, Pathobiology,74,3-14)。 在 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了雙 特異性抗體。用於製備基於異雙特異性抗體的分子的先前方法一般採用化學交聯或者蛋白 質改造技術。化學交聯遭受了異和同二聚體形成的產率差以及要求進行其後續的色譜法分 離。蛋白質改造方法已高度地進行了詳細闡述(例如，杵-臼(knobs-into-holes)改造； Ridgway等人，1996，Protein Eng. 9 (7) =617-621)或已使用了具有不合適的穩定性特徵的 分子(例如，雙抗體，scFv) 0在某些情況下，雙特異性抗體還可以遭受位阻問題，從而使得 兩種抗原無法同時與每條抗體臂相結合。單可變結構域抗體也稱為單結構域抗體或dAbs，其相應於抗體的重鏈可變區 (VH)或輕鏈可變區(VL)。Ward等人，1989，Nature，341，544-546描述了鼠類單結構域抗 體。人單結構域抗體和『駱駝化的(camelised)』人單結構域抗體也已得到描述(Holt等 人，2003，Trends in Biotechnology，21，484-490)。還已從駱駝科動物(駱駝和美洲駝) 和軟骨魚(鬚鯊和鉸口鯊)中獲得了單結構域抗體。這些生物已進化出了安裝在Fc-等價 恆定結構域構架上的高親和力單V-樣結構域(在駱駝科動物中稱為VhH，和在鯊魚中稱為 V-NAR)，以作為其免疫系統的完整且至關重要的組分(關於綜述，參見Holliger &Hudson ； 2005, Nature Biotechnology,23(9) :1126_1136)。在EP0368684中描述了單結構域抗體-酶融合物。在W02004/058820中還描述了 單結構域-效應子基團融合物，其包含單個可變結構域。在W02007/024715中描述了雙重 可變結構域免疫球蛋白。在EP1517921中描述了包含兩個具有不同特異性的單結構域抗體 的雙特異性配體。用於改善抗體片段例如Fv、Fab、Fab\ F(ab' )2和其他抗體片段的半衰期的手 段是已知的。一種方法使所述片段與聚合物分子相綴合。因此，已通過綴合至聚乙二醇(PEG)而改善了 Fab，、F(ab，)2片段在動物中的短的循環半衰期(參見例如，W098/25791、 W099/64460和W098/37200)。另一種方法通過綴合至與FcRn受體相互作用的試劑來修 飾所述抗體片段(參見例如，W097/34631)。延長半衰期的另外一種方法使用結合血清白 蛋白的多肽(參見例如，Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem. 12 :750_756 ；EP0486525 ； US6267964 ；W004/001064 ；W002/076489 ；和 W001/45746)。然而，仍然需要產生具有長的體 內半衰期的抗原結合性免疫球蛋白蛋白質，以作為因為與FcRn受體相互作用而具有長的 半衰期的那些的備選方案，其中沒有通過綴合至PEG來進行化學修飾或者綴合至人血清白 蛋白。各種蛋白質存在於血漿中，並且包括甲狀腺素結合蛋白、運甲狀腺素蛋白、a 1-酸 性糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或者它們中的任何的片段。血清載體蛋白在機 體內循環，具有以天測量的半衰期，例如對於甲狀腺素結合蛋白來說為5天或者對於運甲 狀腺素蛋白來說為 2 天(Bartalena & Robbins，1993，Clinics in Lab. Med. 13 :583_598)， 或者在碘化的a 1-酸性糖蛋白的周轉的第二個階段中為65小時(Bree等人，1986，Clin. Pharmacokin. 11 :336_342)。來自 Gitlin 等人(1964，J. Clin. Invest. 10 :1938_1951)的數 據暗示，在孕婦中，a 1-酸性糖蛋白的半衰期為3. 8天，對於轉鐵蛋白為12天，和對於纖維 蛋白原為2. 5天。血清白蛋白是在血管和血管外區室中都豐富的蛋白質，其在人中的半衰 期為大約 19 天(Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37 161-245)。這與為大約 21 天的 IgGl 的半衰期相似(Waldeman & Strober，1969，Progr. Allergy，13 :1_110)。本發明提供了經改善的雙特異性抗體融合蛋白，其可以重組地產生並且能夠同時 結合兩種抗原。因此，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的第一特 異性的免疫球蛋白部分，並且進一步包含具有對於第二目的抗原的特異性的單結構域抗體 (dAb)。本發明還提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的第一特異性 的免疫球蛋白部分，並且進一步包含至少一個具有對於第二目的抗原的特異性的單結構域 抗體。本發明的雙特異性抗體融合物將能夠與兩種目的抗原選擇性地相結合。在一個實施方案中，由所述Fab或Fab，片段所結合的目的抗原可以是細胞關聯蛋 白，例如在細胞例如細菌細胞、酵母細胞、T-細胞、內皮細胞或腫瘤細胞上的細胞表面蛋白， 或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何在醫學上相關的蛋白質，例如在疾病或 感染期間上調的那些蛋白質，例如受體和/或其相應的配體。細胞表面蛋白的具體例子包 括粘附分子，例如整聯蛋白例如0 1整聯蛋白例如VLA-4，E-選擇蛋白，P選擇蛋白或L-選 擇蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD 134 (0X40), I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11，DTD,癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和 VEGF，以及適當時，它們的受體。可溶性抗原包括白介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，幹 擾素例如幹擾素α、幹擾素β或幹擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺 激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及適當 時，它們的受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原，細菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B 和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。在一個實施方案中，本發明的抗體融合蛋白可以用於在功能上改變目的抗原的活 性。例如，所述抗體融合蛋白可以直接地或間接地中和、拮抗或激動所述抗原的活性。 在一個實施方案中，由本發明的雙特異性抗體融合蛋白中的所述單結構域抗體所 結合的第二目的抗原可以是細胞關聯蛋白，例如在細胞例如細菌細胞、酵母細胞、T-細胞、 內皮細胞或腫瘤細胞上的細胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任 何在醫學上相關的蛋白質，例如在疾病或感染期間上調的那些蛋白質，例如受體和/或其 相應的配體。細胞表面蛋白的具體例子包括粘附分子，例如整聯蛋白例如β 1整聯蛋白例 如 VLA-4, E-選擇蛋白，P 選擇蛋白或 L-選擇蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134(0X40)， I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCRl, DPCRl, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCCl, ΡΤΚ7, RAIG1, TCAMl, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPl 1, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白 (HMFG1和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和VEGF，以及適當時，它們的受體。可溶性抗原包括白介素例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、 IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，幹 擾素例如幹擾素α、幹擾素β或幹擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺 激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及適當 時，它們的受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原，細菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B 和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。可以由所述單結構域抗體所結合的其他抗原包括血清載體蛋白、使得能夠進行細 胞介導的效應子功能募集的多肽以及核素螯合劑蛋白質。因此，在一個實例中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，並且進一步包含具有對於第二種蛋白質的特異性的 單結構域抗體，後者提供了募集效應子功能(例如補體途徑激活和/或效應細胞募集)的 能力。此外，由於與核素螯合劑蛋白質相結合的單結構域抗體，本發明的融合蛋白可以用於 螯合放射性核素。此類融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法(以進行治療)中使用。因此，在一個實例中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於募集多肽的特異性的 dAb相融合，所述dAb通過與所述募集多肽相結合而提供了直接地或間接地募集細胞介導 的效應子功能的能力。效應子功能的募集可以是直接的，因為效應子功能與細胞相關聯，所述細胞在其 表面上攜帶有募集分子。當dAb與募集分子的結合引起例如下述因子的釋放時，可以發生 間接募集所述因子可以直接地或間接地募集效應子功能，或者可以經由信號傳導途徑的 激活。例子包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN γ、組胺、Clq、調理素以及經典和旁路補體激活級聯的其他成員，例如C2、C4、C3-轉變酶和C5至C9。如本文所使用的，「募集多肽」包括FcyR例如Fc y RI、Fc yRII ^P Fey RIII，補體 途徑蛋白例如但不限於Clq和C3，CD標誌蛋白(分化群(Cluster of Differentiation) 標誌物)例如但不限於 CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、 ⑶28、⑶45、⑶19、⑶20和⑶22。為⑶標誌蛋白的進一步的募集多肽包括⑶1、⑶Id、⑶2、 CD5、CD8、CD9、CD10、CDll、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、 CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、 CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、 CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、 CD94、CD95、CD98、CD106、CD114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、 CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、 CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、 ⑶282、⑶283和⑶3o4，或它們中的任何的片段，所述片段保留了直接地或間接地募集細胞 介導的效應子功能的能力。募集多肽還包括具有效應子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgE 和 IgA。在一個實施方案中，dAb對於其具有特異性的第二種蛋白質是補體途徑蛋白，其中 Clq是特別優選的。在優選的實施方案中，dAb對於其具有特異性的第二種蛋白質是CD標誌蛋白，其 中 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35 是特別優選的。因此，還提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的特異 性的抗體片段，所述片段與至少一個dAb相融合，所述dAb具有對於選自下列的CD分子的 特異性CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。在一個實施方案中，所述單結構域抗體為具有第一特異性的免疫球蛋白部分提供 了延長的半衰期。因此，在一個實施方案中，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗 原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於血清載體蛋白、循環免 疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結構域抗體相融合，所述單結構域抗體通過與所 述血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結合而為具有對於所述目的抗原的 特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。在一個實施方案中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於血清載體蛋白、循環 免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結構域抗體相融合，所述單結構域抗體通過與 所述血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結合而為具有對於所述目的抗原 的特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。如本文所使用的，「血清載體蛋白」包括甲狀腺素結合蛋白、運甲狀腺素蛋白、 a 1-酸性糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或它們中的任何的片段。如本文所使用的，「循環免疫球蛋白分子」包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM 和IgD、或它們中的任何的片段。
⑶35/CR1是存在於紅細胞上的蛋白質，其具有36天的半衰期(正常範圍為28至 47 天；Lanaro 等人，1971，Cancer, 28 (3) :658_661)。在優選的實施方案中，dAb對於其具有特異性的第二種蛋白質是血清載體蛋白，其 中人血清載體蛋白是特別優選的。在最優選的實施方案中，所述血清載體蛋白是人血清白 蛋白。 因此，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的特異性的抗體 Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於人血清白蛋白的特異性的單結構域抗體相融合。在一個實施方案中，本發明提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對 於目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於人血清白蛋白 的特異性的單結構域抗體相融合。在一個實施方案中，具有對於目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab片段。在 另一個實施方案中，具有對於目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab』片段。因此，在一個最優選的實施方案中，本發明的抗體融合蛋白是翻譯融合蛋白，即基 因融合物，其各自的序列由表達載體編碼。備選地，所述抗體融合蛋白組分通過使用化學手 段，即通過化學綴合或化學交聯進行融合。此類化學手段是本領域已知的。在一個實例中，所述抗體片段是Fab』片段，其具有天然的或經修飾的鉸鏈區。當 用於在製備本發明的雙特異性抗體融合蛋白中使用的抗體片段是Fab』片段時，所述片段一 般在重鏈的C-末端處延長一個或多個胺基酸。因此，本發明的抗體融合物可以包含直接地 或經由接頭與dAb相翻譯融合(或化學融合)的Fab』片段。此外，合適的抗體Fab』片段 的例子包括在W02005003170和W02005003171中描述的那些。在另一個實例中，所述抗體片段是Fab片段。因此，本發明的抗體融合物可以包含 與接頭序列相翻譯融合(或化學融合)的Fab片段，而所述接頭序列與dAb相翻譯融合(或 化學融合)。優選地，所述Fab片段是在鏈間半胱氨酸處終止的Fab片段，如W02005/003169 中所描述的。在本發明中有用的抗體Fab或Fab』片段可以來自任何物種，但優選地源自單克隆 抗體、人抗體，或者是人源化的片段。用於在本發明中使用的抗體片段可以源自免疫球蛋白 分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類，並且可以獲自任何物種，包括例 如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人。在一個實施方案中，所述抗體Fab或Fab』片段是單克隆的、完全人的、人源化的或 嵌合的抗體片段。在一個實施方案中，所述抗體Fab或Fab』片段是完全人的或人源化的。單克隆抗體可以通過本領域已知的任何方法來製備，例如雜交瘤技術(Kohler & Milstein, Nature，1975，256，495-497)、三源雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor 等人，Immunology Today, 1983,4,72)和 EBV-雜交瘤技術(Cole 等人，「Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，，,第 77-96 頁，Alan R. Liss, Inc. , 1985)。用於在本發明中使用的抗體還可以使用單淋巴細胞抗體方法來產生，所述單淋 巴細胞抗體方法通過克隆且表達從被選擇用於產生特異性抗體的單個淋巴細胞中產生的 免疫球蛋白可變區cDNAs，其中通過例如由Babcook，J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93(15) ,7843-7848 ；WO 92/02551 ；W02004/051268 ；和 W02004/106377 所描述的方法來進行。人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其具有一個或多個來自非人物種的互補 性決定區(⑶Rs)和來自人免疫球蛋白分子的構架區(參見例如US 5，585，089)。用於在本發明中使用的抗體還可以使用本領域已知的各種噬菌體展示方法來 產生，並且包括由下列文獻所公開的那些Brinkman等人，J. Immunol. Methods, 1995, 182，41-50 ；Ames 等人，J. Immunol. Methods, 1995，184，177-186 ；Kettleborough 等人， Eur. J. Immunol.，1994，24，952-958 ；Persic 等人，Gene，1997187，9-18 ；和 Burton 等人， Advances in Immunology,1994,57,191-280 ；W090/02809 ；W0 91/10737；W0 92/01047 ； W0 92/18619 ；W0 93/11236 ；W0 95/15982 ；和 W0 95/20401 ；和 US 5，698，426 ；5，223，409 ； 5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ； 5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 ；和 5，969，108。此外，轉基因小鼠或其他生 物(包括其他哺乳動物)可以用於產生人源化抗體。完全人的抗體是這樣的那些抗體，在所述抗體中重鏈和輕鏈的可變區和恆定區 (當存在時)都是人起源的，或者基本上等同於人起源的序列，不必來自相同的抗體。完全 人的抗體的例子可以包括例如通過上文所描述的噬菌體展示方法而產生的抗體，和由其中 鼠類免疫球蛋白可變區和恆定區基因已被其人對應物替代的小鼠所產生的抗體，例如如在 EP0546073BUUS 5, 545, 806,US 5, 569, 825,US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5,661,016、 US 5, 770, 429, EP 0438474B1 和 EP0463151B1 中所概括性地描述的。用於在本發明中使用的抗體Fab或Fab，片段起始材料可以獲自任何完整的抗體， 尤其是完整的單克隆抗體，其中使用任何合適的酶促切割和/或消化技術，例如通過用胃 蛋白酶進行處理。備選地或者另外地，抗體起始材料可以通過使用重組DNA技術來製備，其 中牽涉編碼抗體可變區和/或恆定區的DNA的操作和再表達。標準分子生物學技術可以用 於修飾、添加或刪除胺基酸或結構域，如所希望的。對於可變區或恆定區的任何改變仍然包 括在本文所使用的術語「可變區」和「恆定區」的範圍內。所述抗體片段起始材料可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、 美洲駝、山羊或人。所述抗體片段的部分可以獲自超過一個物種，例如所述抗體片段可以 是嵌合的。在一個實例中，恆定區來自一個物種，而可變區來自另一個物種。所述抗體片 段起始材料也可以是經修飾的。在另一個實例中，所述抗體片段的可變區通過使用重組 DNA改造技術來形成。此類經改造的變化形式包括例如通過對於天然抗體的胺基酸序列 進行插入、缺失或改變而從天然抗體可變區形成的那些。這種類型的具體例子包括這樣的 那些經改造的可變區結構域，其包含來自一種抗體的至少一個CDR和任選地一個或多個構 架胺基酸，以及來自第二種抗體的該可變區結構域的其餘部分。用於形成和製備這些抗體 片段的方法是本領域眾所周知的(參見例如，Boss等人，US 4，816，397 ；Cabilly等人，US 6，331，415 ；Shrader 等人，W0 92/02551 ；Ward 等人，1989，Nature，341，544 ；Orlandi 等人， 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，3833 ；Riechmann 等人，1988，Nature, 322，323 ；Bird 等人，1988，Science, 242,423 ；Queen 等人，US 5，585，089 ；Adair, W091/09967 ；Mountain 禾口 Adair，1992，Biotechnol. Genet. Eng. Rev,10，1—142 ；Verma 等人，1998，Journalof Immunological Methods,216,165-181)。在本發明中，與Fab或Fab』片段相融合的每個單結構域抗體可以直接地或經由接頭進行連接。用於使dAb與Fab或Fab』相連接的合適的接頭區的例子包括但不限於，柔性接 頭序列和剛性接頭序列。柔性接頭序列包括在下列文獻中所描述的那些=Huston等人， 1988，PNAS 85 :5879_5883 ；Wright &Deonarain, Mol.Immunol. ,2007,44(11) 2860-2869 ； Alfthan 等人，Prot. Eng. , 1995,8(7) :725_731 ；Luo 等人，J. Biochem.，1995，118 (4) 825-831 ；Tang 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (26) 15682-15686 ；和 Turner 等人，1997， JIMM 205，42-54 (關於代表性的例子參見表1)。表1.柔性接頭序列 剛性接頭的例子包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO 34)、PPPP (SEQ ID NO 35) 禾口 PPPo在一個實施方案中，將抗體鉸鏈序列或其部分用作接頭，例如上部鉸鏈序列。通 常，用於在本發明中使用的抗體Fab，片段具有天然的或經修飾的鉸鏈區。將此類鉸鏈區用 作關於所述dAb部分的天然接頭。所述天然鉸鏈區是通常與抗體分子的ChI結構域相關聯 的鉸鏈區。經修飾的鉸鏈區是在長度和/或組成方面與天然鉸鏈區不同的任何鉸鏈。此類 鉸鏈可以包括來自任何其他物種的鉸鏈區，例如人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、美洲駝或山 羊鉸鏈區。其他經修飾的鉸鏈區可以包括源自具有與所述ChI結構域不同的類別或亞類的 抗體的完整的鉸鏈區。因此，例如，Yl類別的ChI結構域可以附著至類別的鉸鏈區。 備選地，經修飾的鉸鏈區可以包括天然鉸鏈的部分或重複單元(其中在所述重複中的每個 單元源自天然鉸鏈區)。在進一步的備選方案中，通過將一個或多個半胱氨酸或其他殘基轉 變成中性殘基例如丙氨酸，或者通過將處於合適位置的殘基轉變成半胱氨酸殘基，可以改 變天然鉸鏈區。通過此類手段，可以增加或減少鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的數目。此外，可 以控制鉸鏈的其他特徵，例如鉸鏈半胱氨酸與輕鏈鏈間半胱氨酸的距離、鉸鏈半胱氨酸之 間的距離、以及鉸鏈中可能影響鉸鏈的特性(例如柔韌性)的其他胺基酸的組成，例如可以 將甘氨酸摻入到鉸鏈中以增加旋轉柔韌性，或者可以摻入脯氨酸以減少柔韌性。備選地，可 以將帶電荷的或疏水性的殘基的組合摻入到鉸鏈中以賦予多聚化(multimerisation)特 性，關於帶電荷的或離子性的尾(例如酸性尾)作為接頭的使用，參見例如Richter等人， 2001，Prot. Eng. 14(10) =775-783 ；和關於亮氨酸拉鏈序列，參見例如Kostelny等人，1992， J. Immunol. 5(1) :1547_1553。其他經修飾的鉸鏈區可以是完全合成的，並且可以被設計為 具有所希望的特性例如長度、組成和柔韌性。許多經修飾的鉸鏈區已例如描述在US5, 677，425、US6642356、W09915549、 W02005003170、W02005003169、W02005003170、W09825971 和 W02005003171 中，並且這些專
利文獻通過提及而合併入本文。此類鉸鏈一般緊跟在所述CHl區之後，但也可以摻入至輕 鏈κ或λ片段的恆定區的末端處；關於例子參見表2。
表2.鉸連結頭序列 用於在本發明中使用的單可變結構域(也稱為單結構域抗體或dAbs)可以使 用本領域已知的方法來產生，並且包括在W02005118642 ；Ward等人，1989，Nature, 341, 544-546 ；和 Holt 等人，2003，Trendsin Biotechnology，21，484-490 中所公開的那些。在 一個實施方案中，用於在本發明中使用的單結構域抗體是重鏈可變結構域(VH)或輕鏈結 構域(VL)。每個輕鏈結構域可以是k或\亞組的。用於分離VH和VL結構域的方法已在 本領域中進行了描述，參見例如EP0368684和Ward等人(同上)。此類結構域可以源自任 何合適的物種或抗體起始材料。在一個實施方案中，所述單結構域抗體可以源自齧齒動物、 人或其他物種。在一個實施方案中，所述單結構域抗體是人源化的。在一個實施方案中，所述單結構域抗體源自噬菌體展示文庫，其中使用在例如 W02005/118642 Jespers 等人，2004，NatureBiotechnology, 22,1161-1165 ；和 Holt 等人， 2003，Trends inBiotechnology，21，484-490中所描述的方法。優選地，此類單結構域抗體 是完全人的，但也可以源自其他物種。將會意識到，所述單結構域抗體的序列在分離後可以 進行修飾，以改善單結構域抗體的特徵例如可溶性，如Holt等人(同上)中所描述的。在一個實施方案中，所述dAb是獲自scFv噬菌體展示或者獲自轉基因的Humouse 或Velocimouse 或者人源化的齧齒動物的人序列。在一個實施方案中，所述dAb獲自人或人源化的齧齒動物、駱駝科動物或鯊魚。此 類dAb將優選地是人源化的。在一個實例中，所述單結構域抗體是基於駱駝科動物免疫球 蛋白的VHH結構域，如EP0656946中所描述的。在一個實例中，用目的抗原對駱駝或美洲駝 進行免疫接種，並且在滴度合適時收集血液。可以通過單細胞PCR來克隆編碼所述dAb的基因，或者可以通過EBV轉化或通過與無限增殖細胞系相融合來使編碼所述dAb的B細胞 永生化。如本文上面所描述的，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目 的抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段直接地或經由接頭與至少一個具有對於 第二目的抗原的特異性的單結構域抗體相融合。因此，在一個實施方案中，所述抗體片段例如Fab或Fab』片段直接地或經由接頭 在重鏈或輕鏈可變區的N-末端處與dAb相融合。備選地，所述抗體Fab或Fab』片段直接地 或經由接頭在重鏈或輕鏈的C-末端處與dAb相融合。在另一個實施方案中，所述抗體Fab 或Fab』片段的重鏈和輕鏈各自直接地或經由接頭在C-末端處與dAb相融合。所述連接可 以是化學綴合，但最優選地是翻譯融合，即其中各自的序列順次由表達載體進行編碼的基 因融合。通常，所述單結構域抗體的N-末端將直接地或經由接頭與所述Fab或Fab』片段 的重鏈或輕鏈的C-末端相融合，並且當所述單結構域抗體與所述Fab或Fab』的N-末端相 融合時，它將經其C-末端(任選地經由接頭)進行融合。在一個實施方案中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，或者由具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的N-末端處與具有對於第二目的抗原的特異性的 單結構域抗體相融合。在一個實施方案中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，或者由具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的C-末端處與具有對於第二目的抗原的特異性的 單結構域抗體相融合。在一個實施方案中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，或者由具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段在重鏈或輕鏈的C-末端處與至少一個具有對於第二目的抗原的 特異性的單結構域抗體相融合。在一個實施方案中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，或者由具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段與兩個單結構域抗體相融合，其中每個單結構域抗體以線性順序 彼此融合(任選地經由接頭)，並且所得到的單結構域抗體融合物與所述Fab或Fab』片段 的輕鏈或重鏈的C-末端相融合。在一個實施方案中，本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的 抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，或者由具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或 Fab'片段組成，所述片段與兩個單結構域抗體相融合，其中一個單結構域抗體與所述Fab 或Fab』片段的輕鏈的C-末端相融合，而另一個單結構域抗體與所述Fab或Fab』片段的重 鏈的C-末端相融合，所述單結構域抗體具有對於第二目的抗原的特異性。在一個實施方案中，當所述Fab或Fab』片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含單 結構域抗體時，這兩個單結構域抗體是等同的，即具有相同的對於相同抗原的結合特異性。 在一個實例中，它們結合在相同抗原 上的相同表位。例如，所述單結構域抗體可以均為相同的VHdAb、相同的VHH dAb或相同的VL dAb。優選地，當所述Fab或Fab』片段的重鏈和輕鏈各自在C_末端處包含單結構域抗 體時，這兩個單結構域抗體是協作地結合抗原的互補VH/VL對，即它們是具有相同的結合 特異性的互補VH/VL對。通常，它們將是源自相同抗體的VH/VL對。在一個實施方案中，當本發明的雙特異性抗體融合蛋白包含為互補VH/VL對的兩 個單結構域抗體時，VH單結構域抗體與重鏈恆定區(CH1)的C-末端相融合，並且VL單結 構域抗體與輕鏈恆定區(Ck或CX)的C-末端相融合。在一個實施方案中，當本發明的雙特異性抗體融合蛋白包含為互補VH/VL對的兩 個單結構域抗體時，VL單結構域抗體與重鏈恆定區(CH1)的C-末端相融合，並且VH單結 構域抗體與輕鏈恆定區(Ck或CX)的C-末端相融合。在本發明的雙特異性融合蛋白中，所述單結構域抗體與第二種抗原相結合，所述 第二種抗原與由所述Fab或Fab』片段組分所結合的那種抗原不同。在一個實例中，用於在本發明中使用的dAbs展示出對於補體途徑蛋白、CD標誌蛋 白或FcyR的特異性。在這種情況下，所述dAb優選地對於CD分子是特異的。最優選地， 所述dAb展示出對於選自下列的⑶分子的特異性⑶68、⑶80、⑶86、⑶64、⑶3、⑶4、⑶8、 CD45、CD16 和 CD35。在優選的實例中，用於在本發明中使用的dAbs展示出對於血清載體蛋白、循環免 疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性，所述血清載體蛋白優選地是人血清載體蛋白例如甲 狀腺素結合蛋白、運甲狀腺素蛋白、a 1-酸性糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原或血清白蛋白。 最優選地，所述dAb展示出對於人血清白蛋白的特異性。因此，在一個實例中，用血清載體 蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1 (例如人血清白蛋白)對兔、小鼠、大鼠、駱駝或美洲 駝進行免疫接種，並且在滴度合適時收集血液。可以通過單細胞PCR來克隆編碼所述dAb 的基因，或者可以通過EBV轉化或通過與無限增殖細胞系相融合來使編碼所述dAb的B細 胞永生化。備選地，所述單結構域抗體可以通過如本文上面所描述的噬菌體展示來獲得。在一個實施方案中，所述單結構域抗體結合人血清白蛋白。在一個實施方案中，所 述單結構域抗體結合人血清白蛋白、鼠類血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。在一個實施方案中，所述結合血清白蛋白的單結構域抗體是在W02005/118642中 提供的dAb (參見例如圖lc和ld)，或在W02004/041862中提供的VHH，或在W02006/122787 的例如表III中描述的人源化的納米抗體(nanobody)。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 重鏈VH單結構域抗體，其包含下列⑶R中的至少一個具有在圖5(e)SEQ ID NO :56或圖 5 (k) SEQ ID NO 62中給出的關於CDR-H1的序列的CDR，具有在圖5 (f) SEQ ID NO 57或圖 5(1)SEQ ID NO 63中給出的關於CDR-H2的序列的CDR，和具有在圖5 (g) SEQ ID NO 58或 圖5(m)SEQ ID NO 64中給出的關於⑶R-H3的序列的CDR。在另一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體 是重鏈VH抗體，其中VH結構域的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3中的至少兩個選自下列在SEQ ID NO 56 或 SEQ ID NO 62 中給出的關於 CDR-H1 的序列，在 SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO 63中給出的關於⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 58或SEQ ID NO :64中給出的關於⑶R-H3 的序列。例如，所述單結構域抗體可以包含VH結構域，其中⑶R-H1具有在SEQ ID NO 56中給出的序列，並且⑶R-H2具有在SEQ ID NO :57中給出的序列。備選地，所述單結構域抗 體可以包含VH結構域，其中⑶R-Hl具有在SEQ ID NO :56中給出的序列，並且⑶R-H3具有 在SEQ ID NO :58中給出的序列。為了避免疑問，應當理解包括了所有排列。在另一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體 是重鏈VH單結構域抗體，其中所述VH結構域包含有在SEQ ID NO :56中給出的關於⑶R-Hl 的序列，在SEQ ID NO 57中給出的關於⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 58中給出的關於 CDR-H3的序列。在另一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體 是重鏈VH單結構域抗體，其中所述VH結構域包含有在SEQ ID NO :62中給出的關於⑶R-Hl 的序列，在SEQ ID NO 63中給出的關於⑶R-H2的序列，和在SEQ ID NO 64中給出的關於 CDR-H3的序列。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 人源化的重鏈VH單結構域抗體，dAbHl，其具有在圖5(a) (SEQ ID NO 52)中給出的序列。 合適的CHl-dAbHl融合物(包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 68)中給出。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 人源化的重鏈VH單結構域抗體，dAbH2，其具有在圖5(c) (SEQ ID NO 54)中給出的序列。 合適的CHl-dAbH2融合物(包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 69)中給出。根據由Kabat等人設計出的系統，對抗體可變結構域中的殘基常規地進行編號。 這禾中系統在 Kabat 等人，1987, Sequences of Proteinsof Immunological Interest, US Department of Health and HumanServices，NIH，USA (下文中稱為"Kabat 等人(同上)」) 中進行了闡述。除非另有說明，在本說明書中使用這種編號系統。Kabat殘基名稱並不總是與胺基酸殘基的線性編號直接地相對應。實際的線性氨 基酸序列可能包含比在嚴格Kabat編號中更少或額外的胺基酸，這相應於結構組分的縮短 或向結構組分中的插入，無論是基本可變結構域結構的構架還是互補性決定區(CDR)。通過 使抗體序列中的同源性殘基與「標準」 Kabat編號序列進行比對，關於給定的抗體可以確定 殘基的正確的Kabat編號。根據Kabat編號系統，重鏈可變結構域的⑶Rs位於殘基31-35 (⑶R-H1)、殘基 50-65 (CDR-H2)和殘基 95-102 (CDR-H3)處。然而，根據 Chothia (Chothia，C.和 Lesk, A. M. J. Mol. Biol.，196，901-917 (1987))，等價於 CDR-Hl 的環從殘基 26 延伸至殘基 32。因 此，如本文所使用的，「⑶R-Hl 」包括殘基26至35，如由Kabat編號系統和Chothia的拓撲 環(topological loop)定義的組合所描述的。根據Kabat編號系統，輕鏈可變結構域的CDRs位於殘基24-34(CDR-Ll)、殘基 50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)處。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 輕鏈VL單結構域抗體，其包含下列⑶R中的至少一個具有在圖5(h) SEQ ID NO :59或圖 5 (n) SEQ ID NO :65中給出的關於CDR-Ll的序列的CDR，具有在圖5⑴SEQ ID NO :60或圖 5 (ο) SEQ ID NO 66中給出的關於CDR-L2的序列的CDR，和具有在圖5 (j) SEQ ID NO 61或 圖5 (ρ) SEQ ID NO 67中給出的關於CDR-L3的序列的CDR0在另一個實施方案中，用於在本發明中 使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是輕鏈VL抗體，其中VL結構域的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3中的至少兩個選自下列在SEQ ID NO 59 或 SEQ ID NO 65 中給出的關於 CDR-Ll 的序列，在 SEQ ID NO 60 或 SEQ ID NO 66中給出的關於⑶R-L2的序列，和在SEQ ID N0:61或SEQ ID NO :67中給出的關於CDR-L3 的序列。例如，所述結構域抗體可以包含VL結構域，其中⑶R-Ll具有在SEQ ID NO 59中 給出的序列，並且⑶R-L2具有在SEQ ID NO :60中給出的序列。備選地，所述結構域抗體可 以包含VL結構域，其中⑶R-Ll具有在SEQ ID NO :59中給出的序列，並且⑶R-L3具有在 SEQ ID NO :61中給出的序列。為了避免疑問，應當理解包括了所有排列。在另一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體 是輕鏈VL結構域抗體，其中所述VL結構域包含有在SEQ ID NO 59中給出的關於⑶R-Ll 的序列，在SEQ ID NO 60中給出的關於⑶R-L2的序列，和在SEQ ID NO 61中給出的關於 CDR-L3的序列。在另一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體 是輕鏈VL結構域抗體，其中所述VL結構域包含有在SEQ ID NO 65中給出的關於⑶R-Ll 的序列，在SEQ ID NO 66中給出的關於⑶R-L2的序列，和在SEQ ID NO 67中給出的關於 CDR-L3的序列。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 人源化的輕鏈VL單結構域抗體，dAbLl，其具有在圖5(b) (SEQ ID NO 53)中給出的序列。 合適的CHl-dAbLl融合物和Ckl-dAbLl融合物(均包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 70 和 SEQ ID NO 72)中給出。在一個實施方案中，用於在本發明中使用的結合人血清白蛋白的單結構域抗體是 人源化的輕鏈VL單結構域抗體，dAbL2，其具有在圖5(d) (SEQ ID NO 55)中給出的序列。 合適的CHl-dAbL2融合物和Ckl-dAbL2融合物(均包含G4S接頭)的例子在圖6 (SEQ ID NO 71 和 SEQ ID NO 73)中給出。在一個實施方案中，當所述Fab或Fab』片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含 單結構域抗體，並且這兩個單結構域抗體是協作地結合抗原的互補VH/VL對(如本文上面 所描述的)時，VH dAb 是 dAbHl (SEQID NO 52)，並且 VL dAb 是 dAbLl (SEQ ID NO 53)。在一個實施方案中，當所述Fab或Fab』片段的重鏈和輕鏈各自在C-末端處包含 單結構域抗體，並且這兩個單結構域抗體是協作地結合抗原的互補VH/VL對(如本文上面 所描述的)時，VH dAb 是 dAbH2 (SEQID NO 54)，並且 VL dAb 是 dAbL2 (SEQ ID NO 55)。在另一個方面，本發明提供了白蛋白結合抗體或其片段，其包含有在本文上面和 圖5(e-p)中所提供的⑶Rs中的一個或多個。所述⑶Rs可以摻入到任何合適的抗體構架 和任何合適的抗體形式之中。此類抗體包括完整抗體以及其在功能上有活性的片段或衍生 物，其可以是但不限於單克隆的、人源化的、完全人的或嵌合的抗體。因此，此類白蛋白結 合抗體可以包括具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其片段，並且可以是但不限於Fab， 經修飾的Fab，Fab，，F(ab，)2，Fv，單結構域抗體，scFv，二、三或四價抗體，Bis-scFv，雙抗 體，三抗體，四抗體和上述中的任何的表位結合片段(參見例如，Holliger和Hudson，2005， Nature Biotech.23 (9) :1126_1136 ；Adair 禾口 Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2 (3)，209-217)。用於形成和製備這些抗體片段的方法是本領域眾所周知的(參見例如， Verma 等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。多價抗體可以包含多重特異性或者可以是單特異性的(參見例如W092/22853和W005/113605)。將會意識 到，本發明的這個方面還延伸至這些白蛋白結合抗體的變體。將會意識到，此類白蛋白結合抗體，特別是單結構域抗體，可以與任何其他抗體或 蛋白質或其他分子相綴合，如在任何其他合適的情形下所希望或使用的。在一個實例中，在 上文所描述的且在圖5 (a-d)中所顯示的單結構域抗體dAbHl、dAbLl、dAbH2、dAbL2可以摻 入到任何合適的抗體形式中，或者在任何合適的情形(例如融合物或綴合物)下用作單結 構域抗體。
在一個實施方案中，本發明的這個方面的抗體包含有在圖5(e)中給出的關於 CDR-Hl的序列，在圖5(f)中給出的關於CDR-H2的序列，和在圖5(g)中給出的關於CDR-H3 的序列。在一個實施方案中，本發明的這個方面的抗體包含有在圖5(k)中給出的關於 CDR-Hl的序列，在圖5⑴中給出的關於CDR-H2的序列，和在圖5 (m)中給出的關於CDR-H3 的序列。在一個實施方案中，本發明的這個方面的抗體包含有在圖5(h)中給出的關於 CDR-Ll的序列，在圖5⑴中給出的關於CDR-L2的序列，和在圖5(j)中給出的關於CDR-L3 的序列。在一個實施方案中，本發明的這個方面的抗體包含有在圖5(n)中給出的關於 ⑶R-Ll的序列，在圖5(0)中給出的關於⑶R-L2的序列，和在圖5(p)中給出的關於⑶R-L3 的序列。當本發明的雙特異性融合蛋白的單結構域抗體與白蛋白相結合時，所述單結構域 抗體對於白蛋白的結合親和力將足以延長所述Fab或Fab』在體內的半衰期。已報導了， 小於或等於2. 5μΜ親和力的對於白蛋白的親和力將會延長體內半衰期(Nguyen，Α.等人 (2006) Protein Engineering, Design & Selection，19 (7)，291-297)。本發明的單結構域 抗體分子優選地具有適合於其目的和它們所與之結合的抗原的結合親和力。在一個實例 中，所述單結構域抗體具有高的結合親和力，例如PM。在一個實例中，所述單結構域抗體具 有為nM或μ M的對於抗原的結合親和力。親和力可以使用本領域已知的任何合適方法來 測量，包括如在本文實施例中所描述的BIAcore，其中使用天然或重組抗原。優選地，結合白蛋白的本發明的單結構域抗體分子具有大約2 μ M或更好的結合 親和力。在一個實施方案中，本發明的單結構域抗體分子具有大約ΙμΜ或更好的結合親 和力。在一個實施方案中，本發明的單結構域抗體分子具有大約500ηΜ或更好的結合親和 力。在一個實施方案中，本發明的單結構域抗體分子具有大約200ηΜ或更好的結合親和力。 在一個實施方案中，本發明的結構域抗體分子具有大約InM或更好的結合親和力。將會意 識到，使用本領域已知的任何合適方法可以改變由本發明所提供的和本領域中已知的單結 構域抗體的親和力。因此，本發明還涉及本發明的結構域抗體分子的變體，其具有改善的 對於白蛋白的親和力。此類變體可以通過許多親和力成熟方案來獲得，包括使⑶Rs突變 (Yang 等人，J. Mol. Biol.，2M，392-403，1995)、鏈改組(Marks 等人，Bio/Technology，邊， 779-783，1992)、大腸桿菌(E. coli)增變株的使用(Low 等人，J. Mol. Biol.，250，359-368， 1996)、DNA 改組(Patten 等人，Curr. Opin. Biotechnol. ,8,724-733,1997)、噬菌體展示 (Thompson 等人，J. Mol. Biol. ,256,77-88,1996)和有性 PCR(Crameri 等人，Nature, 391,288-291，1998)。Vaughan等人(同上)討論了這些親和力成熟方法。本發明還提供了編碼本發明的雙特異性抗體融合蛋白的分離的DNA序列。本發明的DNA序列可以包括合成DNA (例如通過化學加工而產生的)、cDNA、基因組DNA或其任何組合。編碼本發明的雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列可以通過本領域技術人員眾所 周知的方法來獲得。例如，如所希望的，可以從確定的DNA序列或者基於相應的胺基酸序列 來合成編碼所述抗體片段、接頭和/或dAbs的部分或全部的DNA序列。可以使用分子生物學的標準技術來製備編碼本發明的雙特異性抗體融合蛋白的 DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技術來完全或部分地合成所需的DNA序列。在合適時，可 以使用位點定向誘變和聚合酶鏈反應(PCR)技術。本發明進一步涉及包含一個或多個本發明的DNA序列的克隆或表達載體。因此， 提供了包含一個或多個DNA序列的克隆或表達載體，所述DNA序列編碼本發明的雙特異性 抗體融合蛋白。在一個優選的實施方案中，所述克隆或表達載體包含編碼整個雙特異性抗 體融合蛋白的單個DNA序列。因此，所述克隆或表達載體順次包含DNA編碼的轉錄單元，從 而使得產生出翻譯融合蛋白。事實上，本領域技術人員將會理解，本發明的融合蛋白可以在N-末端或C-末端處 具有所述dAb，並因此dAb DNA編碼的轉錄單元將會在編碼翻譯融合物的DNA序列內分別處 於開始或最後。因此，翻譯融合物可以包含N-末端dAb和C-末端Fab或Fab』。此外，翻譯 融合物可以包含N-末端Fab或Fab，和C-末端dAb。將會意識到，所述Fab或Fab』的重鏈和輕鏈可以摻入到相同或不同的載體中。在 一個實施方案中，一種載體可以包括包含Fab或Fab』重鏈和C-末端dAb的翻譯融合物，而 另一種載體可以包括包含Fab或Fab』輕鏈和C-末端dAb的翻譯融合物。例如，當希望產生在抗體片段的N-末端處具有dAb部分的雙特異性抗體融合蛋白 時，載體將以順次順序包含下列DNA轉錄單元編碼dAb部分的DNA轉錄單元；任選地，編 碼接頭序列的DNA轉錄單元；和編碼抗體片段的DNA轉錄單元。當希望產生在抗體片段的 C-末端處具有dAb部分的雙特異性抗體融合蛋白時，載體將以順次順序包含下列DNA轉錄 單元編碼抗體片段的DNA轉錄單元；任選地，編碼接頭序列的DNA轉錄單元；和編碼dAb 部分的DNA轉錄單元，所述dAb部分具有對於血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/ CRl(例如人血清白蛋白)的特異性。因此，本發明的翻譯融合物可以以不同的構造，包括 例如但不限於，dAb-接頭-Fab、Fab-接頭-dAb、dAb_Fab、Fab_dAb、Fab，-dAb、dAb_Fab，、 dAb-接頭-Fab』、Fab』 -接頭-dAb。當例如使用兩種載體時，第一種可以包含與dAb相融 合的Fab或Fab』的重鏈，而第二種可以包含與dAb相融合的Fab或Fab』的輕鏈。關於包含在本發明的翻譯融合物中的抗體片段的DNA密碼可以作為轉錄單元摻 入到載體中，其中以本領域技術人員已知的構造，例如轉錄單元可以包含關於輕鏈的密碼， 隨後為重鏈密碼，或者反之亦然；參見，特別是Humphreys等人，2002，Protein Expression andPurifixation, 26 :309_320。優選地，根據本發明的載體包含合適的前導序列，例如抗體前導序列。此類前導序 列是本領域眾所周知的。通過其可以構建出載體的一般方法、轉染和轉化方法以及培養方法是本領域技術人員眾所周知的。在這方面，可參考「CurrentProtocols in Molecular Biology」， 1999, F. Μ· Ausubel (編輯)，Wiley Interscience, New York,禾口由 Cold Spring Harbor Publishing 出品的 Maniatis Manual。還提供了包含一種或多種克隆或表達載體的宿主細胞，所述克隆或表達載體包含 一個或多個編碼本發明的雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列。任何合適的宿主細胞/載體 系統可以用於表達編碼所述雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列。可以使用細菌例如大腸杆 菌和其他微生物系統，或者還可以使用真核生物例如哺乳動物宿主細胞表達系統。合適的 哺乳動物宿主細胞包括NSO、CH0、骨髓瘤或雜交瘤細胞。因此，在一個實施方案中，在大腸 桿菌中表達本發明的融合蛋白。在另一個實施方案中，在哺乳動物細胞中表達本發明的融 合蛋白ο
本發明還提供了用於產生雙特異性抗體融合蛋白的方法，其包括在適合於從編碼 所述雙特異性抗體融合蛋白的DNA序列中表達出蛋白質的條件下培養包含本發明的載體 的宿主細胞。本發明進一步提供了用於分離所述雙特異性抗體融合蛋白的方法。在產生之後，當需要時，通過使用本領域已知的任何合適方法，可以純化出本發明 的雙特異性抗體融合蛋白。可以使用例如但不限於色譜法技術，例如離子交換、大小排阻、 G蛋白或疏水相互作用色譜法。雙特異性抗體融合蛋白的大小可以通過本領域已知的常規方法來證實，例如大小 排阻色譜法和非還原性SDS-PAGE。此類技術可以用於證實，所述蛋白質未二聚化和/或不 具有部分缺失(例如dAb部分)。如果檢測出二聚體，那麼可以通過使用如上所描述的常規 色譜法技術來從二聚體種類中純化出單體的雙特異性抗體融合蛋白。本發明的雙特異性抗體融合蛋白在疾病或病症的治療中有用，所述疾病或病症包 括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、纖維變性病症和癌症。術語「炎性疾病或病症」和「免疫疾病或病症」包括類風溼性關節炎、銀屑病關節 炎、斯蒂爾病、穆-韋病(Muckle Wellsdisease)、銀屑病、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、SLE(系 統性紅斑狼瘡)、哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎、多發性硬化、脈管炎、I型糖尿病、移植和 移植物抗宿主病。術語「纖維變性病症」包括特發性肺纖維化(IPF)、系統性硬化病(或硬皮病)、 腎纖維化、糖尿病性腎病、IgA腎病、高血壓、終末期腎臟病、腹膜纖維變性(不臥床持 續腹膜透析)、肝硬化、年齡相關的黃斑變性(ARMD)、視網膜病變、心臟反應性纖維化 (cardiacreactive fibrosis)、瘢痕形成、瘢痕瘤、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術、冠狀動脈 搭橋手術、關節成形術和白內障手術。術語「癌症」包括起於上皮的、在皮膚中或更通常地在身體器官(例如乳腺、卵 巢、前列腺、肺、腎、胰腺、胃、膀胱或腸)的襯裡(lining)中發現的惡性新生長。癌症趨於 浸潤到相鄰組織中並且擴散(轉移)至遠離的器官，例如至骨、肝、肺或腦。因此，根據本發明的進一步方面，提供了藥物組合物，其包含與一種或多種藥學上 可接受的載體、賦形劑或稀釋劑相聯合的本發明的抗體融合物。還提供了本發明的抗體融 合蛋白在製備用於治療疾病或病症的藥物中的用途。最優選地，所述疾病或病症是炎性疾 病或病症。根據本發明的藥物組合物可以採取適合於口服、頰、腸胃外、皮下、鼻、局部、眼或直腸施用的形式，或者適合於通過吸入或吹入進行施用的形式。當適當時，例如如果所述抗體融合蛋白的單結構域抗體與白蛋白相結合，那麼可 以值得做的是，通過使用本領域已知的任何合適方法，用人或重組血清白蛋白對所述雙特 異性融合蛋白進行預配製。
對於口服施用，所述藥物組合物可以採取例如片劑、錠劑或膠囊的形式，其通過常 規方法用藥學上可接受的賦形劑例如粘合劑(例如預膠化的玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或 羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸 鎂、滑石或矽石)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸鈉)；或潤溼劑(例如月桂基硫酸鈉) 來製備。片劑可以通過本領域眾所周知的方法進行包衣。用於口服施用的液體製劑可以採 取例如溶液、糖漿劑或懸浮液的形式，或者它們可以呈現為用於在使用前用水或其他合適 的媒介物進行構建的乾燥產物。此類液體製劑可以通過常規方法用藥學上可接受的添加劑 來進行製備，所述添加劑例如為懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物或防腐劑。當適當時，所述制 劑還可以包含緩衝鹽類、矯味劑、著色劑或甜味劑。用於口服施用的製劑可以適當地進行配製，以產生活性化合物的受控釋放。
對於頰施用，所述組合物可以採取以常規方式配製的片劑或錠劑的形式。本發明的雙特異性抗體可以被配製成用於腸胃外施用，所述腸胃外施用通過注 射，例如通過推注或輸注來進行。用於注射的製劑可以呈現為單位劑型，例如在玻璃安瓿或 多劑量容器例如玻璃小瓶中。用於注射的組合物可以採取諸如在油性或水性媒介物中的懸 浮液、溶液或乳狀液的形式，並且可以包含配製試劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩 定劑、防腐劑和/或分散劑。備選地，活性成分可以為用於在使用前用合適的媒介物例如無 熱原的無菌水進行構建的粉末形式。除了上面所描述的製劑外，本發明的雙特異性抗體也可以配製為貯庫製劑。此類 長效製劑可以通過植入或者通過肌內注射來進行施用。對於鼻施用或通過吸入施用，根據本發明的化合物可以方便地以用於加壓包裝或 噴霧器的噴霧劑呈現形式進行遞送，其中使用合適的推進劑例如二氯二氟甲烷、一氟三氯 甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體或氣體混合物。如果需要，所述組合物可以呈現在包裝或分配裝置中，所述包裝或分配裝置可以 包含一個或多個含有活性成分的單位劑型。所述包裝或分配裝置可以附有關於施用的說明 書。對於局部施用，根據本發明的化合物可以方便地配製在包含活性組分的合適的軟 膏中，所述活性組分懸浮或溶解在一種或多種藥學上可接受的載體中。具體的載體包括例 如礦物油、液體石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蠟和水。備選地，根據本發明的化合 物可以配製在包含活性組分的合適的洗劑中，所述活性組分懸浮或溶解在一種或多種藥學 上可接受的載體中。具體的載體包括例如礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯 60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、苯甲醇、2_辛基十二烷醇和水。對於眼施用，根據本發明的化合物可以方便地配製為在等滲的、pH經調整的無菌 鹽水中的微離子化(microionized)的懸浮液，其中具有或不具有防腐劑例如殺細菌劑或 殺真菌劑，例如硝酸苯汞、苯扎氯銨或醋酸氯己定。備選地，對於眼施用，化合物可以配製在 軟膏例如凡士林中。
對於直腸施用，根據本發明的化合物可以方便地配製為栓劑。這些可以通過將活性組分與合適的非刺激性賦形劑相混合來製備，所述非刺激性賦形劑在室溫下是固體但在 直腸溫度下是液體，並因而將會在直腸中融化從而釋放出活性組分。此類材料包括例如可 可脂、蜂蠟和聚乙二醇。對於預防或治療特定病狀所需的本發明化合物的量將依賴於所選擇的化合物和 待治療的患者的病狀而改變。然而，一般而言，日劑量可以為大約lOng/kg至1000mg/kg，通 常100ng/kg至100mg/kg，例如對於口服或頰施用為大約0. 01mg/kg至40mg/kg體重，對於 腸胃外施用為大約lOng/kg至50mg/kg體重，和對於鼻施用或者通過吸入或吹入施用為大 約0. 05mg至大約lOOOmg，例如大約0. 5mg至大約lOOOrng。本發明的每個實施方案的優選特徵比照適用於其他實施方案中的每一個。在本說 明書中所引用的所有出版物(包括但不限於專利和專利申請)通過提及而合併入本文，就 如同每一單個出版物被明確和單獨地指明通過提及而合併(好像完全闡述似的)一樣。現在，將就下列實施例而言來描述本發明，所述實施例僅是舉例說明性的，而無論 如何不應當解釋為限制了本發明的範圍。附圖列表

圖1 :Fab-dAbs的圖解表示，其中dAb在C-末端處。圖 2 :Fab-didAbs 的圖解表示。圖 3 :FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和 FabA_dAbL3 (CK-G [APAPA] 2) (2)的 SDS PAGE 分 析。圖 4 :FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和 FabA_dAbL3 (CK-G [APAPA] 2) (2)的 Western 印 跡分析。圖 4a :FabB-didAbs 的 SDS PAGE 泳道M = SeeBlue標準參照物泳道1和2 = IgG對照泳道3 = FabB泳道4 = FabB-didAb, -dAbLl (ck_G4Sx2) & dAbHl (CH1_G4Sx2)泳道5 = FabB-didAb, _dAbL2 (ck_G4Sx2) & dAbH2 (CH1_G4Sx2)。圖5 結構域抗體dAbHl、dAbH2、dAbLl和dAbL2以及源自這些抗體中每一個的 ⑶Rs的序列。圖6 :FabB-dAb構建體，其包含與結構域抗體相融合的FabB重鏈或輕鏈可變結構 域。圖Fab，A重鏈和輕鏈序列以及FabA重鏈序列。實驗實施例1 對於人血清白蛋白特異的dAb的產生使用重組DNA技術來產生由符合讀框的DNA編碼的轉錄單元，其編碼具有對於人 血清白蛋白的特異性的dAb。當需要時，使用重組DNA技術可以產生由符合讀框的DNA編碼的轉錄單元，其編碼 具有對於募集蛋白的特異性的dAb。實施例2 抗體片段的產生
為了 dAb與輕鏈C-末端的融合，合成了編碼人κ輕鏈恆定區(具有κ恆 定區的Km3同種異型)、肽接頭和dAb的DNA，並將其作為SacI-PvuII限制片段克隆 到UCB-Celltech內部的(in-house)表達載體pTTOD(Fab) (ρΤΤ0-1的衍生物，其描述在 Popplewell等人，Methods Mol. Biol. 2005 ；308 17-30中)中，所述表達載體包含編碼人 Y-ICHl恆定區的DNA。這產生了由下列組成的雙順反子基因排列經由接頭與dAb相融合 的人源化輕鏈的基因，隨後為人源化重鏈Fab片段的基因，兩者都在tac啟動子的控制下。 還編碼了在Gly4Ser接頭上遊的獨特的BspEl位點，或在富含Ala-Pro的接頭上遊的AscI 位點。
為了 dAb與重鏈C-末端的融合，合成了編碼人CHl片段(具有Yl同種型)以及 隨後的接頭編碼序列和dAb的DNA。將這作為Apal-EcoRI限制片段亞克隆到UCB-Celltech 內部的表達載體pTTOD (Fab) (pTTO-1的衍生物，其描述在Popplewell等人(上文)中)中， 所述表達載體包含編碼人Y-ICHl恆定區的DNA。這產生由下列組成的雙順反子基因排列 人源化輕鏈的基因，非編碼性基因間序列，隨後為經由接頭與dAb相融合的重鏈的基因，這 兩個基因都在tac啟動子的控制下。將該重組表達質粒轉化到大腸桿菌菌株W3110中，在 其中通過添加IPTG來誘導表達。最初通過在大約0. 5的0D(600nm)時添加200uMIPTG來 以小規模進行表達實驗(5ml培養體積)，在誘導後2小時收穫細胞，並且在Tris/EDTA中於 30°C提取過夜。將經澄清的提取物用於通過Biacore的親和力分析。選擇給出有前途的表 達產率和活性的構建體用於發酵。^^在下列實施例中，將dAb所與之融合的抗體鏈命名為CK或LC (對於c κ輕鏈)，和 命名為CHl或HC (對於重鏈恆定結構域CHl)。用於在大腸桿菌中表達的FabA-dAb融合物質粒的構建通過使dAbL3或dAbH4與FabA的輕鏈或重鏈恆定區的C-末端相融合來構建 Fab-dAb融合蛋白。使用柔性接頭(SGGGGSE(SEQ ID NO :1))或剛性接頭(G (APAPA) 2 (SEQ ID NO 34))來將 dAb 與 c κ 區(SEQ IDNO 75)相連接，而使用接頭 DKTHTS (SEQ ID NO 2) 來將dAb與CHI區(SEQ ID NO 76)相連接。作為片段合成地製備編碼恆定區_dAb融合物 的DNA序列，以使得能夠亞克隆到內部的pTTOD載體的FabA序列中。通過下列方式來構建輕鏈-dAb融合物將合成的基因的SacI-ApaI片段亞克隆到 能夠表達FabA的質粒的相應位點中，所述合成的基因編碼經由柔性接頭(SGGGGSE(SEQ ID NO 1))或剛性接頭(G (APAPA) 2 (SEQ ID NO :34))與 dAbL3 或 dAbH4 相融合的 C-末端 c κ。通過下列方式來構建重鏈-dAb融合物將合成的基因的Apal-EcoRI片段亞克隆 到能夠表達FabA的質粒的相應位點中，所述合成的基因編碼經由DKTHTS接頭與dAbL3或 dAbH4相融合的C-末端CHI。Fab』A源自IL-I β結合抗體，其重鏈和輕鏈序列分別提供在圖7中所示的SEQ ID NO 74和75中。在其中輕鏈具有附著的dAb的Fab，A中，將重鏈的鉸鏈改變為DKTHTS，即 使當無dAb與重鏈(SEQ ID NO 76)相附著時。FabA包含相同的輕鏈序列(SEQ ID NO 75)和在鏈間半胱氨酸處終止的截短的重 鏈序列(SEQ ID NO 77)。dAbL3和dAbH4分別為結合人血清白蛋白的輕鏈和重鏈結構域抗體。
用幹在大腸桿菌中表汰的FabA-didAb融合物質粒的構律通過將編碼CHl-dAb融合物的Apal-EcoRI片段亞克隆到現有的Fab_dAb質粒(其 中dAb經由柔性接頭與輕鏈相融合)中來構建在輕鏈和重鏈上均具有dAbL3或dAbH4的 FabA-didAbο用幹在Π甫gL雲M勿細胞衝表汰的FabB-dAb融合物質粒的構律FabB-dAb s、FabB-dAbHl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbH2 (CHI-G4Sx2)、FabB-dAbLl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbL2 (CH1_G4Sx2)都通過 PCR 進行裝配，然後克隆到哺乳動 物表達載體中從而在HCMV-MIE啟動子和SV40E polyA序列的控制下。這些與包含FabB輕 鏈的相似載體相配對以用於在哺乳動物細胞中表達(參見下文)。FabB源自結合細胞表面共刺激分子的抗體。如實施例3中所描的，獲得dAbHl、dAbH2、dAbLl和dAbL2。用幹在π甫gL雲M勿細朐中表汰的FabB-dAb融合質粒的構律FabB-dAbs、FabB-dAbHl (CH1_G4Sx2)、FabB_dAbH2 (CH1_G4Sx2)、 FabB-dAbLl (CK_G4Sx2)、FabB_dAbL2 (CK_G4Sx2)都通過PCR進行裝配，然後克隆到哺乳動物 表達載體中從而在HCMV-MIE啟動子和SV40E polyA序列的控制下。FabB-dAbs和didAbs的哺乳動物表汰根據製造商的說明書，使用Invitrogen的293feCtin轉染試劑，用重鏈和 輕鏈質粒轉染HEK293細胞。簡而言之，使2yg重鏈質粒+2yg輕鏈質粒與ΙΟμΙ 293fectin+340 μ 1 Optimem介質一起在RT下溫育20分鐘。然後，將該混合物添加至處於 懸浮的5 X IO6個ΗΕΚ293細胞，並且於37°C在搖動下溫育4天。Biacore使用CM5 傳感器晶片和 HBS-EP(10mM HEPES (pH7. 4), 150mM NaCl,3mM EDTA, 0. 05 % ν/ν表面活性劑Ρ20)運行緩衝液，通過在BiacoreT 100上進行的表面等離子共 振(SPR)來測定關於Fab-dAb構建體的相互作用的結合親和力和動力學參數。使用人 F (ab，)2-特異性山羊 Fab (Jackson ImmunoResearch, 109-006-097)或內部產生的抗人 CHl 單克隆抗體來將Fab-dAb樣品捕獲至傳感器晶片表面。通過標準的胺偶聯化學來達到捕獲 抗體的共價固定。每個試驗循環由下述組成首先採用1分鐘注射來捕獲Fab-dAb，隨後為由3分鐘 的抗原注射組成的締合階段，在這之後監控解離5分鐘。在每個循環後，採用下列方式來使 捕獲表面再生2X 1分鐘的40mMHCl注射，隨後為30秒的5mM NaOH0所使用的流速對於捕 獲來說為10 μ 1/分鐘，對於締合和解離階段來說為30 μ 1/分鐘，和對於再生來說為10 μ 1/ 分鐘。關於動力學試驗，執行抗原滴定法(對於人血清白蛋白通常為62. 5ηΜ_2μΜ，對於 IL-I β為1.25-40ηΜ)，將空白流動池(flow-cell)用於參照扣除，並且包括了緩衝液空白 注射以扣除儀器噪聲和偏移。使用Biacore T100評價軟體，通過所得到的傳感圖(sensorgram)與標準1 1 結合模型的同時總體配合(simultaneousglobal-fitting)來測定動力學參數。為了測試同時的結合，在被捕獲的Fab-dAb上注射分開的5 μ MHSA或IOOnM IL-I β，或者5 μ M HSA和IOOnM IL-1 β的混合溶液的3分鐘注射。
從大腸桿菌中純化Fab-dAb周質提取將在周質內包含Fab-dAbs的大腸桿菌粒狀沉澱重懸浮在具有IOOmM Tris/HCl,IOmM EDTA pH 7. 4的原始培養體積中。然後，使這些懸浮液於4°C在250rpm下溫育16小 時。使重懸浮的粒狀沉澱於4°C以IOOOOxg離心1小時。去除上清液，並且進行0.45 μ m過
濾οG蛋白捕獲通過G蛋白色譜法從經過濾的上清液中捕獲Fab-dAbs。簡而言之，以20分鐘 的停留時間將上清液施加至在20mM磷酸鹽，150mM NaClpH7. 1中平衡的Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare)柱。用 20mM 磷酸鹽，150mM NaCl pH7. 1 洗滌該柱，並且用 0. IM 甘氨酸/HClpH2. 8洗脫下結合的材料。收集洗脫峰，並且用IM乙酸鈉將pH調整至 pH5。 將pH經調整的洗出液濃縮，並且使用IOk麗CO膜而滲濾到50mM乙酸鈉pH4. 5中。離子交換用NaCl洗脫梯度，在pH4. 5下，通過陽離子交換色譜法來進一步純化Fab-dAbs。 簡而言之，將經滲濾的G蛋白洗出液施加至在50mM乙酸鈉pH4. 5中平衡的Sourcel5S(GE Healthcare)柱。用50mM乙酸鈉pH4. 5洗滌該柱，並且用20柱體積的在50mM乙酸鈉pH4. 5 中0至IM NaCl的線性梯度來洗脫下結合的材料。在該梯度自始至終收集第三柱體積級分。 通過A280和SDS-PAGE來分析所述級分，並且匯集相關級分。凝膠過濾如果需要，通過凝膠過濾來進一步純化Fab-dAbs。簡而言之，將 FabA-dAbL3 (CK-SG4SE)匯集的離子交換洗脫級分施加至在50mM乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0 中平衡的 Superdex200(GE Healthcare)柱，並且用 50mM 乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0 的 等度梯度(isocraticgradient)來進行洗脫。在該梯度自始至終收集1/120柱體積級分。 通過A280和SDS-PAGE來分析所述級分，並且匯集相關級分。對於未經歷凝膠過濾的Fab-dAbs，將匯集的離子交換洗脫級分濃縮，並且使用IOk MWCO膜而滲濾到50mM乙酸鈉，125mM NaCl pH 5. 0中。SDS-PAGE當需要時用水稀釋樣品，然後向10μ 1中添加IOyL 2Χ樣品走樣緩衝液。對於非 還原的樣品，在這一點上添加2 μ L IOOmM NEM,而對於還原的樣品，添加2 μ L IOX還原劑。 使樣品渦旋振蕩，於85°C溫育5分鐘，冷卻，並且在12500rpm下離心30秒。將準備好的樣 品加載到4-20%丙烯醯胺Tris/甘氨酸SDS凝膠上，並且在125V下走樣100分鐘。將凝膠 轉移到PVDF膜上以用於Western印跡法，或者用考馬斯藍蛋白質染料進行染色。Western 印跡法在150mA下，在12mM Tris，96mM甘氨酸pH8. 3中，將凝膠轉移至PVDF膜，共16小 時。用在PBS+0. 1% Tween20中的2% Marvel (封閉緩衝液)使PVDF膜封閉1小時。抗-輕鏈HRP-兔抗人κ輕鏈，在封閉緩衝液中的1/5000稀釋度，共1小時。抗-重鏈小鼠抗人重鏈，在封閉緩衝液中的1/7000稀釋度，共1小時。隨後為HRP-山羊抗小鼠，在封閉緩衝液中的1/2000稀釋度，共1小時。抗-His標籤 兔抗His6，在封閉緩衝液中的1/1000稀釋度，共1小時。隨後為HRP-山羊抗兔 IgG，在封閉緩衝液中的1/1000稀釋度，共1小時。所有印跡用100ml PBS+0. 1 % Tween20洗滌6次，每次洗滌10分鐘。印跡用下列 方式進行顯現用ECL試劑1分鐘，隨後暴露於Amersham Hyperfilm ；或者用金屬增強的 DAB試劑20-30分鐘，隨後為水。高溫反相HPLC樣品(2μ g)於80°C在2. Imm C8 Poroshell柱上進行分析，其中使用2ml/分鐘的 流速和18-38% B的梯度，經過4分鐘。A = 0. 1% TFA,在 H2O 中B = O. 065% TFA，在 80 20 IPA MeOH 中通過在214nm處的吸收來進行檢測。ELISA使用夾心ELISA來測量Fab-dAb的產率。簡而言之，用抗-CHl抗體來捕獲 Fab-dAb,隨後用抗-κ -HRP來揭示。實施例3 產牛抗白蛋白抗體用重組的chromapure人血清白蛋白(購自Jackson)對1/2垂耳兔進行免疫接 種。兔以皮下方式接受IOOug HSA蛋白的3次免疫接種，第一次免疫接種在完全弗氏佐劑 中，而後續的免疫接種在不完全弗氏佐劑中。使用W004/051268中描述的方法來分離出結 合人、小鼠和大鼠血清白蛋白的抗體1和2。分離出抗體1和2的重鏈可變結構域(VH)和 輕鏈可變結構域(VL)的基因，並進行測序，在經由反轉錄PCR進行克隆後。將所嫁接的輕鏈序列亞克隆到兔輕鍊表達載體PVRbcK中，所述表達載體包含編 碼兔C- κ恆定區的DNA。將所嫁接的重鏈序列亞克隆到兔重鍊表達載體pVRbHFab中，所 述表達載體包含編碼兔Fab』重鏈恆定區的DNA。將質粒共轉染到CHO細胞中，並且就白蛋 白結合和親和力來篩選所產生的抗體(表1)。根據製造商的說明書(InVitrogen，目錄號 11668)，使用LipofectamineTM2000操作程序來進行CHO細胞的轉染。產生人源化的結構域抗體dAbLl、dAbHl、dAbL2和dAbH2通過使用人V-區接納體構架和供體殘基(在構架區中)來設計人源化的VL和VH 區。對於抗體1和2中的每一種，設計一個所嫁接的VL區(Li (SEQ ID NO 53)和L2 (SEQ ID NO 55))和一個 VH 區(HI (SEQ ID NO 52)和 H2 (SEQ ID NO :54))，並且通過寡核苷酸 裝配和PCR誘變來構建基因。所嫁接的結構域抗體及其CDRs顯示在圖5中。表1 抗白蛋白抗體的親和力 實施例4 在哺乳動物細胞中表汰的FabB-dAbs的分析如在「方法」中所描述的，產生FabB-dAb構建體，並且在BIAcore中直接測試包含 FabB-dAbs的來自經轉染的HEK293細胞的上清液。進行動力學分析以評估HSA與FabB-dAb構建體的相互作用。這些構建體由與 FabB的CHl的C-末端相融合的dAbLl、dAbH2或dAbL3組成(參見圖6)。FabB_dAbLl對 於 HSA(Kd = 170nM)具有比 FabB_dAbL3 (KD = 392nM)更高的親和力。FabB_dAbH2 顯示出 具有最差的針對HSA的親和力(KD = 1074nM)，參見表2。表2 關於HSA與融合至dAbLl、dAbH2或dAbL3的FabBs的結合而測定的親和力和動力 學參數。所顯示的數據為平均值士SEM。(對於FabB-dAbLl和FabB_dAbH2，η = 4。對於 FabB-dAbL3, η = 2)。FabB-dAb蛋白質的SDS-PAGE和Western印跡法證實了，所產生的FabB-dAbs具有 預期的大小。實施例5 在哺乳動物細胞中表汰的FabB-didAbs的分析如在「方法」中所描述的，產生FabB-didAb構建體，並且在BIAcore中直接測試包 含didAbs的來自經轉染的HEK293細胞的上清液。使用其中將單dAbs與Fab的重鏈和輕鏈C-末端兩者相融合的didAb構建體來進 行進一步的分析。與單獨的單dAb相比較而言，其中didAb源自天然重鏈和輕鏈可變結構域 配對的構建體顯示出親和力的顯著改善(表2和3)。由兩個等同的dAbLls組成的didAb 融合物未顯示出超過對於單個dAbLl所看到的那種的在親和力方面的改善(數據未顯示)。表3

關於HSA與融合至dAbLl & dAbHl或dAbL2 & dAbH2的FabBs的結合而測定的親 和力和動力學參數。FabB-didAb蛋白質的SDS-PAGE證實了，所述FabB-didAbs良好地表達並且具有預 期的大小(參見圖4a)。注意該SDS PAGE凝膠為由細胞所表達的總蛋白質。實施例6 經純化的FabA-dAbs的分析如在「方法」中所描述的，構建出用於在大腸桿菌中表達Fab-dAbs， Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab，A_dAbL3 (CK-G[APAPA]2)的質粒。如在「方法」中所描述的， 將Fab-dAbs表達到大腸桿菌的周質中，並且純化至均質。通過高溫反相HPLC、SDS-PAGE和 Western印跡法來評估Fab-dAbs的純度。還通過Biacore就抗原結合來對Fab-dAbs進行 評估。高溫反相HPLC如在「方法」中所描述的來施行的高溫反相HPLC給出了在FabA_dAbL3 (CK-SG4SE) 和FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)中所包含的所有種類的定量分析。所存在的每種種類的百 分比顯示在表4中。表4 在Fab-dAb批次中存在的種類的定量 如在「方法」中所描述的，在非還原和還原條件下準備Fab-dAb樣品，並且在凝膠 上走樣。對凝膠進行考馬斯染色。Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE)和 Fab，A_dAbL3 (CK_G[APAPA]2) 這兩種Fab-dAb樣品的條帶圖譜與通過高溫反相HPLC所觀察到的圖譜良好地相符合(圖3)。Western 印跡如在「方法」中所描述的，對Fab-dAb樣品實施非還原SDS-PAGE，隨後為用抗-輕 鏈和抗_重鏈抗體進行的Western印跡分析。這證實了，dAb在Fab的輕鏈上，並且重鏈在 兩種樣品中均是未修飾的(圖4)。還證明了，通過經考馬斯染色的非還原SDS PAGE而檢測 出的所有條帶都是Fab-dAb相關產物。Biacore將如在「方法」中所描述的通過SPR的動力學分析用於評估人血清白蛋白與 Fab，A-dAbL3 (CK-SG4SE)和 Fab，A_dAbL3 (CK-G[APAPA]2)的結合。表 5 中的結果證明，這 兩種構建體均能夠以大約ΙμΜ的相似的親和力(Kd)結合人血清白蛋白。表 5 進一步的動力學分析證明，所有融合構建體保留了原始FabA針對IL_1 β的相互 作用特徵(表6)，其中在動力學和親和力參數方面僅可見很小的差異。表6 通過將每種構建體捕獲至傳感器晶片表面來評估每種構建體同時與人血清白蛋 白和IL-I β抗原兩者相結合的潛力，然後施行分開的3分鐘的5 μ M人血清白蛋白或IOOnM IL-I β注射，或者5μ M人血清白蛋白和IOOnM IL-I β兩者的混合溶液注射。對於每種 Fab-dAb構建體，對於組合的HSA/IL-1 β溶液所看到的應答與獨立注射的應答之和幾乎等 同，參見表7。這顯示，所述？油-(^1^能夠同時與11^-10和人血清白蛋白兩者相結合，並且 IL-I β或人血清白蛋白的結合不抑制另一個的相互作用。原始FabA僅與IL-Ιβ結合，並 且有著可忽略的與人血清白蛋白的結合。表 7 上表顯示了在分開注射HSA或IL-1 ^，或者注射預混合的HSA和IL_1 0後，對於 每種構建體所看到的結合應答(RU)。在每種情況下，終濃度對於HSA來說為5 u M,和對於 IL-10來說為100nM。獨個的HSA和IL-1 0應答之和顯示在括號中。實施例7 :FabA didAbsFabA-didAbs在大腸桿菌中的表達在大腸桿菌中表達C-末端HIS6標籤終止的FabA-dAbs和FabA_didAb融合物。在 周質提取後，經由C-末端His6標籤來純化dAb融合蛋白。通過用抗-CH1和抗-c k抗體 來進行的非還原凝膠的Western印跡法來分析Fab表達。將FabA_dAb和FabA_didAb表達 為全長蛋白質，並且顯示出與所述兩種抗體檢測試劑反應。在大腸桿菌中表達的FabA-didAbs的分析進行進一步的分析以表徵HSA與已向其融合了一個或多個dAbs的FabA構建體的 結合。對於其中dAbL3或dAbH4與FabA的輕鏈或重鏈相融合的各種構建體進行結合試驗 (關於構建體的細節和結合數據的概括參見表8)。儘管看到僅在輕鏈或重鏈上攜帶dAbH4 的構建體以相當差的親和力(分別 9iiM和3iiM)結合HSA，但對於攜帶dAbL3(作為單一 融合物(在輕鏈或重鏈上)或者與在相對鏈上的第二個dAb(dAbL3或dAbH4)搭檔)的構 建體觀察到較高親和力結合。表8
權利要求
雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於第二目的抗原的特異性的單結構域抗體相融合。
2.根據權利要求1的融合蛋白，其在所述Fab或Fab』片段的重鏈或輕鏈的N-或C-末 端處包含單結構域抗體。
3.根據權利要求2的融合蛋白，其中所述單結構域抗體是VH或VHH。
4.根據權利要求2的融合蛋白，其中所述單結構域抗體是VL。
5.根據權利要求1的融合蛋白，其包含兩個單結構域抗體，其中一個單結構域抗體與 所述Fab或Fab，片段的輕鏈的C-末端相融合，而另一個單結構域抗體與所述Fab或Fab』 片段的重鏈的C-末端相融合。
6.根據權利要求5的融合蛋白，其中每個單結構域抗體是具有相同的結合特異性的VH 結構域。
7.根據權利要求5的融合蛋白，其中每個單結構域抗體是具有相同的結合特異性的VL 結構域。
8.根據權利要求5的融合蛋白，其中一個單結構域抗體是VH結構域，而另一個單結構 域抗體是VL結構域，並且所述VH和VL結構域是協作地結合所選擇的抗原的互補VH/VL對。
9.根據權利要求8的融合蛋白，其中所述VH結構域與所述Fab或Fab』片段的重鏈的 C-末端相融合，並且所述VL結構域與所述Fab或Fab』片段的輕鏈的C-末端相融合。
10.根據權利要求1-9中任一項的融合蛋白，其中每個單結構域抗體是完全人的或人 源化的。
11.根據權利要求1-10中任一項的融合蛋白，其中所述Fab或Fab』是完全人的或人源 化的。
12.根據權利要求1至11中任一項的融合蛋白，其中與所述抗體Fab或Fab』片段相 融合的每個單結構域抗體是經由獨立地選自下列的接頭進行融合的胺基酸序列GS、PPP、 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO 15,SEQ IDNO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO 25,SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ IDNO : 129、SEQ ID NO :30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 37,SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ IDNO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 50 和 SEQID NO :51。
13.根據權利要求12的融合蛋白，其中所述接頭序列選自SEQIDN0:USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :45。
14.根據權利要求2的融合蛋白，其中所述單結構域抗體經由具有SEQID NO :2或SEQ ID NO 45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的重鏈的C-末端相連接。
15.根據權利要求2的融合蛋白，其中所述單結構域抗體經由具有SEQID NO :1或SEQ ID NO :45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的輕鏈的C-末端相連接。
16.根據權利要求9的融合蛋白，其中所述VH結構域經由具有SEQID NO :2或SEQ IDN0:45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片段的重鏈的C-末端相連接，並且所述VL 結構域經由具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab，片 段的輕鏈的C-末端相連接。
17.根據權利要求1-16中任一項的融合蛋白，其中每個單結構域抗體具有對於血清載 體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性，所述單結構域抗體通過與所述血清載 體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1結合而為具有對於所述目的抗原的特異性的所 述抗體Fab或Fab，片段提供了延長的半衰期。
18.根據權利要求17的融合蛋白，其中每個單結構域抗體的特異性是對於血清載體蛋 白的。
19.根據權利要求17或權利要求18的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是選自下列的 人血清載體蛋白甲狀腺素結合蛋白、運甲狀腺素蛋白、α -酸性糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維 蛋白原和血清白蛋白。
20.根據權利要求19的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是人血清白蛋白。
21.表達載體，其包含關於權利要求1至20中任一項之中所定義的雙特異性抗體融合 蛋白的密碼。
22.宿主細胞，其包含權利要求21中所定義的載體。
23.權利要求1至20中任一項之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白在製備用於治療疾 病或病症的藥物中的用途。
24.用於治療疾病或病症的方法，其包括施用治療有效量的權利要求1至20中任一項 之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白。
全文摘要
本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對於目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab』片段，所述片段與至少一個具有對於第二目的抗原的特異性的單結構域抗體相融合。
文檔編號C07K16/46GK101842387SQ200880113719
公開日2010年9月22日 申請日期2008年9月26日 優先權日2007年9月26日
發明者D·P·胡姆皮雷斯, E·達弗 申請人:Ucb醫藥有限公司