生長激素釋放因子類似物的製作方法

2023-05-28 06:53:01 3

專利名稱：生長激素釋放因子類似物的製作方法
生長激素釋放因子(GRF)最初是由人的胰腺腫瘤中分離得到的44個胺基酸肽(Guillemin et al.，Science 218585，1982)。由於GRF能刺激內源生長激素的釋放，所以它是一種有用的肽。因其分子量較小，所以很難通過重組方法大量生產。
以前試圖在大腸桿菌中表達GRF所作的種種嘗試在兩個方面都不能令人滿意。直接表達則產生的蛋白質的量很少(美國專利4728609);大量表達則只能與另一多肽融合才能獲得，但為了產生活性GRF，需要裂解融合多肽(Villa et al.，Eur.J.Biochem.171-137，1988;歐洲專利申請0199018)。本發明提供了能夠在大腸桿菌中大量表達的多肽，但又不需要裂解就能獲得具有活性的多肽。本發明提供了在氨基末端增加1個、2個或3個胺基酸，就能得到具有GRF活性的多肽化合物。本發明進一步提供了GRF的脫氨基酪氨酸衍生物。所述多肽化合物可以採用任何合成方法都能產生，包括固相肽合成、溶液肽合成、酶合成、半合成方法，以及重組DNA方法。
本發明提供的多肽化合物具有能在大腸桿菌中大量表達的生長激素釋放因子(GRF)的活性。該多肽化合物還將採用其他肽合成的方法產生，包括固相合成方法。本發明還提供編碼這些多肽的DNA化合物。本發明提供了由下式表示的能在大腸桿菌中大量表達的多肽化合物及其藥物上可接受的無毒酸加成鹽或羧酸加成鹽
A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-Arg-B-Val-Leu-C-5 10 15Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X;
20 25式中A是 Met, Met-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr,Met-Asp-Tyr, Met-Gly-Tyr, Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr,Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr, Met-Arg-Pro-Tyr,Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr, Met-Phe-Pro-Tyr,Met-Pro-Pro-Tyr或Met-Ser-Pro-Tyr; R是Asn或Ser; B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr; D是Arg或Lys; E是Met, Val, Leu,或Ser;
X是長度足以在大腸桿菌中大量表達的胺基酸殘基的鏈;具有游離氨基的1個或1個以上的胺基酸或缺失這些胺基酸都是經化學修飾得到的。
從本發明目的而言，「化學修飾」定義為具有烷基或羥烷基的胺基酸的游離氨基的衍生。1個或1個以上游離氨基或缺失這些游離氨基可以通過化學方法修飾。修飾的程度可通過反應時間或試劑用量控制。具有游離氨基的所有胺基酸都由化學修飾為佳，在能夠進行化學修飾的氨基末端僅含1個游離氨基的化合物則更佳。這樣的一種化合物除了在N端外沒有賴氨酸或蛋氨酸。含有賴氨酸和/或蛋氨酸的化合物，通過用精氨酸取代賴氨酸和用亮氨酸取代蛋氨酸，可轉化為僅在N端具有游離氨基的化合物。
A的較佳選擇是Met-Pro-Tyr和Met-Ala-Tyr;最佳選擇是Met-Ala-Tyr。C和E的較佳胺基酸分別是Thr和Leu。但X可以是長度足以使化合物在大腸桿菌中大量表達的任何胺基酸鏈，較佳的鏈長約為31-100個胺基酸，更佳的鏈長約為40-80個胺基酸，最佳的鏈長約為45-55個胺基酸。X的最佳胺基酸選擇為Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
該胺基酸順序表示具有全都由亮氨酸取代蛋白酸人GRF前體的C端48個胺基酸。以上順序中的賴氨酸被精氨酸取代時，得到了X的另一個較佳選擇Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Arg-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
該順序之所以較佳是由於如果B和D都為精氨酸，則生成的化合物僅具有1個游離氨基，因而能產生經化學修飾的均一的化合物。
X的另一個較佳胺基酸順序包括口蹄病毒表面蛋白的肽和組成GRF的胺基酸順序，從而形成了GRF二聚體。X的適宜順序包括Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu andGln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Glu-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Met-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
本發明的另一類多肽化合物是由下式表示的多肽化合物及其在藥物上可接受的無毒酸加成鹽或羧酸鹽A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-Arg-B-Val-5 10Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-E-15 20 25Asn-Arg-X;
式中A是 Met, desNH2-Tyr, Ala-Tyr, Gln-Tyr, Gly-Tyr,His-Tyr, Met-Tyr, Phe-Tyr, Pro-Tyr, Ser-Tyr, Ala-Ala-Tyr,Arg-Ala-Tyr, Asp-Ala-Tyr, Phe-Ala-Tyr, Pro-Ala-Tyr,Pro-Pro-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr, Met-Asp-Tyr,Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr, Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr,Met-Arg-Pro-Tyr, Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr,Met-Phe-Pro-Tyr,或Met-Ser-Pro-Tyr; R是Asn或Ser;
B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr; D是Arg或Lys; E是Met, Val, Leu或Ser;
X是具有30個胺基酸以上長度的胺基酸鏈;具有游離氨基的1個或1個以上胺基酸或缺失這些胺基酸是通過化學修飾得到的。
本發明還提供了下式的多肽化合物及其在藥物上可接受的無毒酸加成鹽和羧酸鹽Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-B-Val-5 10Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-E-Asn-15 20 25Arg-X;
式中A是Met, Ala-Tyr, Gln-Tyr, Gly-Tyr, His-Tyr,Met-Tyr, Phe-Tyr, Pro-Tyr, Ser-Tyr, Ala-Ala-Tyr,Arg-Ala-Tyr, Asp-Ala-Tyr, Phe-Ala-Tyr, Pro-Ala-Tyr,Pro-Pro-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr, Met-Asp-Tyr,Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr, Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr,Met-Arg-Pro-Tyr, Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr,Met-Phe-Pro-Tyr,和Met-Ser-Pro-Tyr; B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr; D是Arg或Lys; E是Met, Val, Leu,或Ser;
X是NH2或具有1-30個胺基酸長度的胺基酸鏈;具有游離氨基的1個或1個以上胺基酸或缺失這些胺基酸是通過化學修飾得到的。
本發明的多肽化合物與天然的bGRF有若干不同之處。天然的bGRF的胺基酸順序如下Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-5 10Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-15 20 25Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-30 35Ala-Lys-Val-Arg-Leu.
40與此相反，本發明提供的GRF類似物，在氨基端和/或羧基端不同於天然的bGRF。此外，本發明的類似物在15位上的甘氨酸被蘇氨酸取代。
在1位上天然GRF的氨基末端是酪氨酸，而本發明多肽化合物除了A為Met外，還在N端被延長。這種延長稱之為可變A。當在大腸桿菌中產生時，A以蛋白氨酸開始、繼之丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸或絲氨酸的本發明化合物經過天然處理後，釋出起始子蛋氨酸。這種方法產生了A以丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸或絲氨酸開始的本發明化合物。A為Met的化合物在除去蛋氨酸後，產生的化合物的活性很低，但生成的化合物可用作1位上取代的化合物的底物，例如1位上為酪氨酸的化合物可被「脫NH2-酪氨酸」取代。非蛋氨酸開始的本發明化合物可採用包括固相肽合成方法的各種合成方法產生。另外，A為Gln-Tyr，His-Tyr，Phe-Tyr，Arg-Ala-Tyr，Asp-Ala-Tyr，Phe-Ala-Tyr和E為纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸的本發明化合物可先用重組技術繼之用溴化氰裂解起始子蛋氨酸的方法產生。溴化氰裂解只能用於X所表示的胺基酸不包括蛋氨酸。本領域專業人員所掌握的凡能產生本發明化合物的其他方法均可使用。
本發明的有些多肽在羧基端上具有由X限定的胺基酸。已知天然GRF的活性部位是在N-端的29個胺基酸(Rivier et al.，Nature 300276，1982)。X為30個胺基酸以上的胺基酸鏈的本發明多肽化合物是由胺基酸能延長到足以在大腸桿菌中大量表達但仍保持GRF活性的化合物中產生的。
本發明認為需要總長度最小約為60個胺基酸才能在大腸桿菌中獲得高產率的GRF。由X(當X為30個以上胺基酸的胺基酸鏈時)限定的C端的延長是以任何胺基酸鏈都能延長鏈的長度並保持其GRF活性為基礎。但是具有人GRF前體的C端33個胺基酸的牛GRF化合物(本發明的較佳多肽化合物)在牛和羊中活性最高，該化合物在豬、貓和雞中也有一定活性。
本發明包括化學修飾形式的本發明多肽化合物。烷基化肽的方法已為本領域專業人員所公知(Acharya and Manjula，Biochem.263524，1987;Brown and Greenberg，Anal.Letters 171429，1984)。烷基化的衍生物是在其游離氨基上被由0、1個或1個以上羥基取代的C1-C6直鏈或支鏈烷基所取代。較佳的基團是C1-C3直鏈羥烷基基，更佳的取代基團是甲基、2-羥乙基和2，3-二羥丙基，最佳的基團是2，3-二羥丙基。
較佳的多肽化合物是Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-0 5 10Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-15 20 25Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-30 35
Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-40 45 50Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-55 60Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
65 70 75更佳的上述化合物的衍生物，其中0位上的丙氨酸和12、21、41、56和70位上的賴氨酸的游離氨基被2，3-二羥丙基取代。與天然分子相比，該化合物在體內具有更高的生長激素釋放因子的活性。另一個較佳化合物是由上述化合物經精氨酸取代所有5個賴氨酸衍生物得到的下述化合物Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-0 5 10Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-15 20 25Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-30 35Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-40 45 50Trp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-55 60Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Arg-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
65 70 75生成的化合物只在其能進行化學修飾的氨基末端具有游離氨基。
本發明更佳的多肽化合物是脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Asn-Tyr-Arg-Arg-Val-5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25
Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-45 50 55Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-60 65Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
70 75本發明另一個多肽化合物是由下式表示的化合物Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-5 10C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X;
15 20 25式中B是Arg或Lys;C是Thr;D是Arg或Lys;E是Met，Val，Leu或Ser;X是NH2或任何長度的胺基酸殘基鏈。較佳的選擇是X為NH2;更佳的選擇是下式化合物Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,and Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
本申請還提供了編碼本發明多肽的經過分離的DNA化合物。本領域專業人員知道什麼樣的密碼子可用於產生各胺基酸。本發明較佳的DNA化合物編碼更佳的多肽化合物，該多肽化合物中的A是Ala-Thr，B是Lys，C是Thr，D是Lys，E是Leu，X是 Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,和
式中A是脫氧腺苷殘基，G是脫氧鳥苷殘基，C是脫氧胞苷殘基，T是胸苷殘基。
本發明的其他DNA化合物包括但不限於下式化合物
以下部分將詳細說明本發明。如本文所公開的和要求保護的內容，為了清楚闡明和幫助理解本發明，下列術語和縮寫詞的定義如下。
bGRF-具有牛生長激素釋放因子活性的多肽。
bGRF(1-78)OH-含有人GRF前體的羧基末端33個胺基酸的多肽。
bGRF二聚體-具有首尾連接的2個bGRF化合物的多肽化合物。
bp-雙股DNA的鹼基對。
c1857-編碼對溫度敏感的λpL啟動子的阻遏物的基因。
克隆-將DNA片段摻入到重組DNA克隆載體的方法。
編碼順序-基因中的DNA順序，該順序編碼由該基因表達的蛋白質的胺基酸殘基的順序，或在rRNA或tRNA基因條件下編碼由基因表達的rRNA或tRNA的RNA順序。
裝配質粒-重組DNA克隆載體，能按如質粒的相同方法在宿主細胞中複製而又能利用噬菌體包裝機制。
DHP-2，3-二羥丙基。
基因-DNA片段，包括定位的啟動子、轉譯活性順序、編碼順序和3′調節順序，以控制蛋白質(和因此所需的mRNA)、tRNA或rRNA基因產物的表達。
GRF-具有生長激素釋放因子活性的多肽。
GRG(1-29)NH-全潛能所需的GRF最小部分。
大腸桿菌中的大量表達-能由考馬斯蘭染色檢測到基因產物量的克隆基因編碼的GRF類似物的產物。
分離的DNA化合物-能夠構建或合成的任何DNA順序，其在位置上區別於產生該順序的有機體的基因組DNA。
pL-λ噬菌體的左側啟動子。
啟動子-指導或啟動DNA轉錄的DNA順序。
重組DNA克隆載體-任何自主複製或整合物，包括但不限於含有能夠或已經附加1個或多個DNA分子的DNA分子的質粒。
重組DNA表達載體-任何自主複製或整合物，包括但不限於含有定位啟動子和其他調節順序以控制編碼多肽或RNA的DNA片段表達的質粒。
重組DNA順序-除了可衍生DNA順序的宿主染色體外的任何DNA順序，包括經過分離、合成或部分合成得到的DNA順序。
重組DNA載體-任何重組DNA克隆或表達載體。
限制片段-由1個或多個酶的作用產生的任何線性DNA分子。
TcR-給予四環素抗性的基因，也可用於表示四環素抗性的表現型。
轉錄終止區-通過RNA聚合酶提供DNA終止信號的DNA順序。
轉化株-經過轉化的受體宿主細胞。
轉化-將DNA引入能改變基因型的受體宿主細胞，從而改變受體細胞。
轉譯活性順序-當轉錄到mRNA時啟動mRNA轉譯為蛋白質的調節DNA順序。
本文全文均採用標準三字母表示的胺基酸簡寫符號。
附圖所示的限制性位點和功能圖大致表示本文所討論的重組DNA載體。限制性位點的信息並非包攔無遺，因此一定類型的載體的限制位點實際上可多於圖中所示。


圖1質粒pHS190的限制性位點和功能圖。
圖2質粒pHS451的限制性位點和功能圖。
本發明包括具有生長激素釋放因子活性的能在大腸桿菌中大量表達但又不需離體裂解為活性的多肽。該化合物還可由任何合成方法產生，包括酶、溶液、半合成和固相肽合成等方法。本發明的有些多肽化合物(其中包括以精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、組氨酸或苯丙氨酸開始的多肽化合物)如果是由重組方法產生的，則需要離體除去開始的蛋氨酸。
GRF用於刺激生長激素的釋放。本發明化合物適宜用於動物，尤其是牛、豬、羊、家禽和魚。本發明還提供編碼GRF多肽的DNA化合物。這些化合物也包括在本發明範圍之內。
根據對A不同選擇生成的胺基酸，多肽可分成若干類。A為蛋氨酸和X為31或31個左右長度的胺基酸鏈的化合物，在大腸桿菌中能大量產生。如果第2個胺基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸，則開始的蛋氨酸可通過細菌裂解，生成仍保持GRF活性的分子。A以Met-Pro開始的化合物仍保留其這個特徵。美國專利4782139(1988年11月1日公開)介紹了具有式H-X-Pro-肽的化合物，其中X表示天然胺基酸殘基，可用作具有生物活性的肽的中間體。
如果起始子蛋氨酸被去除，則A非蛋氨酸開始的化合物可通過合成方法產生，包括固相肽合成方法或重組技術。如果第2個胺基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸，則蛋氨酸可用大腸桿菌在體內予以去除。當27位上的蛋氨酸由亮氨酸，絲氨酸或纈氨酸取代時，起始子蛋氨酸可用溴化氰在體外予以去除。
雖然A為Met的化合物的活性極低，但是N端延長的化合物仍具有GRF活性。從已有技術角度來看，在0位上延長胺基酸會破壞GRF活性，但N端延長的化合物的活性卻令人驚奇(Ling et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.122304，1984)。該類化合物經烷基或羥烷基化處理，可進一步提高GRF活性。
另一類多肽化合物並不具有GRF活性，但可用於製備其類似物。當A為Met時，生成的化合物能在大腸桿菌中大量表達。除去蛋氨酸後產生的脫酪氨酸化合物(2位的丙氨酸是氨基端的化合物)能用於製備1位上含有除酪氨酸外的其他胺基酸化合物的底物。1位上能夠取代酪氨酸的部分的例子是脫NH2-酪氨酸。
所有肽化合物都能採用固相肽合成方法或重組方法產生。兩種方法在美國專利4617149(本文參考文獻)中已作了介紹。如果需要高產量，以採用重組方法為佳。Brown等介紹了構建任何所需DNA順序的一般方法(Brown et al.，Methods in Enzymology，68109;1979，本文參考文獻)。本發明的有些多肽化合物能在大腸桿菌中大量產生。當X為長於30個左右的胺基酸鏈時，本發明化合物可以獲得大量表達。由X限制的鏈的關鍵特徵是其長度。鏈的長度必須使化合物避免由於大腸桿菌蛋白酶的影響而造成顯著降解。這種降解是本領域公認的一個問題。鏈的足夠長度估計為60個胺基酸左右(表達化合物的總長度)。
以往對大腸桿菌中GRF表達所作的種種嘗試都不能令人滿意。第一個問題就是直接表達產生的GRF量很低(美國專利4728609，Bhett等)。Bhatt等得到的GRF量約為25nm/l。X為30個左右以上長度的胺基酸鏈的本發明化合物在體內除去起始的蛋氨酸以後，得到的量可高達103μm/l，比Bhatt等得到的量高約4000倍左右。由其他研究工作者將GRF與其他多肽融合後，其表達產生了大量的化合物。由於與獲得大量表達所需的另一個多肽順序融合，所以需要進行離體裂解才能產生活性分子(Villa et al.，Eur.J.Biochem.171137，1988;Geli et al.，Gene，80129，1989;歐洲專利申請0199018)。
本發明提供了能夠直接在大腸桿菌中大量表達的多肽化合物，但是不需要離體裂解步驟就能產生活性分子。如同在大腸桿菌中製備所有蛋白質一樣，A以丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸開始的本發明化合物的表達是與起始的蛋氨酸連接在一起的。蛋氨酸可通過細菌的內源蛋氨酸氨基肽酶除去，從而產生活性化合物。
本發明較佳的多肽在X位上具有由人GRF前體分子衍生的胺基酸鏈(Gubler et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA804311，1983)。由於前體一般被理解為沒有活性，所以該分子具有活性出乎意料，從而能通過裂解步驟使細胞能調節活性化合物的水平(參閱Giraud et al.，1241711，1989;Fisher and Scheller，J.Biol.Chem.26316515，1988;Smith and Funder，Endocr.Rev.9159，1988)。有關GRF前體的參考文獻都認為該前體是沒有活性的(Hammer et al.，Nature 315413，1985;Mayo et al.，Nature 30686，1983;Mayo et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 804311，1983)。
本發明更佳的多肽化合物包括由亮氨酸取代蛋氨酸的人GRF前體的羧基末端。該化合物如下
Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
70 75該分子的烷基化，使0位上的丙氨酸和12、21、41、56及70位上的賴氨酸的游離氨基由2，3-二羥丙基取代，從而產生活性更高的優選化合物。
本發明的其他優選化合物如下Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55Arg-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65Arg-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly;
70 75Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly;
70 75Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40Val-Arg-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-45 50 55Lys-Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-60 65Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-70 75 80Ala-Lys-Val-Arg-Leu;
85Met-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-0 5 10Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-15 20 25Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-30 35 40Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-45 50Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-55 60 65Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly;
70 75
Met-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-0 5 10Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-15 20 25Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-30 35 40Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Met-Trp-Ala-Glu-45 50Gln-Lys-Gln-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-55 60 65Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly;
70 75Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-0 5 10Val-Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-15 20 25Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-30 35Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Met-40 45 50Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-55 60Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly; and65 70 75desNH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Asn-Tyr-Arg-Arg-Val-5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-45 50 55Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-60 65Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
70 75
烷基化和羥烷基化的這些化合物也是較佳化合物，尤其是由2，3-二羥丙基基取代游離氨基基團的化合物。
本發明化合物中還包括其在藥物上可接受的無毒酸加成鹽及其在藥物上可接受的無毒羧酸鹽。
「藥物上可接受的無毒酸加成鹽」包括有機和無機酸加成鹽，例如由氫氯酸、氫氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富馬酸、氫溴酸、乙醇酸、檸檬酸、馬萊酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸等一類酸製備的鹽。較佳的酸加成鹽是由鹽酸、乙酸或琥珀酸製取的鹽。以上所述的任何鹽均可採用常規方法製取。
「羧酸鹽」包括胺、銨、季銨、鹼金屬和鹼土金屬一類的鹽，例如鈣、鎂、鈉、鉀和鋰等。
本發明還提供藥物組合物，含有作為活性組份的多肽化合物或其藥物上可接受的酸或羧酸加成鹽和藥物上可接受的固體或液體載體，其中所述多肽化合物是具有下式的化合物A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-5 10Arg-B-Val-Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-15 20Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X;
25式中A是 Ala-Tyr,脫NH2-Tyr, Gln-Tyr, Gly-Tyr,His-Tyr, Met-Tyr, Phe-Tyr, Pro-Tyr, Ser-Tyr, Ala-Ala-Tyr,Arg-Ala-Tyr, Asp-Ala-Tyr, Phe-Ala-Tyr, Pro-Ala-Tyr,Pro-Pro-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr, Met-Asp-Tyr,Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr, Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr,Met-Arg-Pro-Tyr, Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr,Met-Phe-Pro-Tyr,和Met-Ser-Pro-Tyr; R是Asn或Ser;
B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr;
D是Arg或Lys, E是Met, Val, Leu,或Ser; X是NH2或1個或多個胺基酸;具有游離氨基的0、1或1個以上的胺基酸可以進行化學修飾。
本發明還提供誘發生長激素釋放的方法，包括施用有效量的由下式表示的多肽化合物A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-5 10Arg-B-Val-Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-15 20Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X;
25式中A是 Ala-Tyr,脫NH2-Tyr, Gln-Tyr, Gly-Tyr,His-Tyr, Met-Tyr, Phe-Tyr, Pro-Tyr, Ser-Tyr, Ala-Ala-Tyr,Arg-Ala-Tyr, Asp-Ala-Tyr, Phe-Ala-Tyr, Pro-Ala-Tyr,Pro-Pro-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr, Met-Asp-Tyr,Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr, Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr,Met-Arg-Pro-Tyr, Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr,Met-Phe-Pro-Tyr,和Met-Ser-Pro-Tyr; R是Asn或Ser;
B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr;
D是Arg或Lys,E是Met, Val, Leu,或Ser;X是NH2或1個或多個胺基酸;具有游離氨基的0、1或1個以上的胺基酸可以進行化學修飾。
本發明的多肽化合物可在各種系統中進行測定。體內測定可在戊巴比妥鈉麻醉的大鼠體內進行(Wehrenberg et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.109382，1982)。生長激素釋放的測定可在體外用大鼠腦垂體細胞進行(Heiman et al.，Endocrinol.116410，1985)。如以下實施例所述，測定也可在閹小羊體內進行。
本發明的DNA化合物編碼本發明的多肽化合物。如何構建編碼一定胺基酸順序的DNA順序，系本領域的專業人員所熟知的。為了產生所需的多肽，只需要將DNA順序插入到許多重組DNA表達載體中的任何一個載體。編碼順序可通過操作與啟動子和宿主細胞中起作用的核糖核蛋白體結合位點連接。較佳的載體由大腸桿菌質粒pHS190產生，含有TcR基因、λCI857遏阻物和λpL啟動子。質粒pHS190於1988年9月9日保藏在美國北部實驗室，保藏號為NRRL B-18410。
構建所需的DNA順序應使其在編碼鏈的5′端具有XbaⅠ位點和在編碼鏈的3′端具有BamHⅠ位點。用EcoRⅠ消化pHS 190，得到載體DNA。插入突出端，並連接質粒。繼之用BamHⅠ和XbaⅠ消化，得到載體質粒。將所構建的GRF編碼順序插入到載體中，被插入的DNA順序是本發明的較佳DNA順序，生成的質粒名為pHS451。所述較佳DNA順序為
其他編碼本發明多肽化合物的DNA順序為
將連接的質粒轉移到大腸桿菌株中，產生能夠表達本發明多肽化合物的重組細胞。該細胞在32℃下培養到產生需要表達的多肽化合物。CI857遏阻物通過轉移到42℃的培養溫度使其失活，並且pL啟動子失去遏阻。產生具有GRF活性的大量多肽高達總細胞蛋白的15%左右。採用本領域專業人員已知技術和以下實施例所述方法可以純化所得活性多肽。
在非經腸道施用本發明多肽化合物時，適用於注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液或能夠配製成無菌注射溶液或分散液的無菌粉劑。載體可用溶劑或分散介質，例如包括水、乙醇、多羥基化合物(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)以及它們適合的混合物和植物油。採用包衣(如卵磷酯)、保持分散劑中符合要求的顆粒大小和使用表面活性劑等方法，能夠保持合格的流動性。使用各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸、氯丁醇、苯酚和山梨酸等，能夠確保不受微生物作用的影響。在許多情況下，還需要等滲劑，例如蔗糖、氯化鈉等。注射藥劑的延長吸收可以使用延遲吸收劑，例如一硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射液的製備將本發明化合物加入到需要量的適當溶劑中，如果需要還可含有其他各種組份。如果需要，條分散得更均勻，可將化合物加入到緩釋系統或靶緩釋系統，例如聚合物基質、脂質體和微粒體。化合物可以採用機械傳送裝置、滲透泵或能提供連續或脈動釋放的任何其他釋放裝置或系統。
給受體施用本發明化合物的時限是刺激生長激素釋放所需要的時間。受體的體重和用藥方式都會影響誘發具體應答所需劑量的大小。在羊中的較佳劑量約為0.1-3.0mg/天，最佳劑量約為1.0mg/天。牛用較佳劑量約為0.5-12mg/天，更佳劑量為3mg/天。
將本發明化合物配製成便於施用和劑量均勻的單位劑量形式則特別有利。本文所用的單位劑量係指適用於被治療對象單一劑量的獨立物理單位。每個單位含有預定量的化合物，該預定量是根據與藥物上可接受的載體結合後產生所需療效計算得到的。根據(a)具體組合物的特徵和(b)所要達到的具體療效，直接規定具體單位劑量。
以下實施例是為了說明本發明，但並不是限制本發明的範圍。
實施例1質粒pHS 451的構建當宿主細胞在一定條件下進行培養時，質粒pHS 451是產生大量本發明較佳多肽化合物的重組DNA表達載體。
大腸桿菌K12 RV308/pHS190的凍乾物可從美國NRRL(Peoria，IL61604)得到，其保藏號為NRRL B-18410，保藏日期1988年9月9日，並直接用作下述方法中的「培養物」。質粒pHS 190的限制位點和功能圖示於附圖1。將大腸桿菌K12 RV308/pHS 190的培養物接種到10ml含5μg/ml四環系的TY培養液(每升10g胰蛋白酶腖，5g NaCl和5g酵母膏)中，在30℃下通氣培養過夜(15-18小時)。生成的培養物用作質粒pHS 190源。
將大腸桿菌K12 RV308/pHS 190接種到1升含5μg/ml四環素的TY培養液中，在32℃下通氣培養過夜(15-18小時)。培養物於4℃下在Sorvall(DuPont Co.，Instrument Products，Biomedical Divsion，Newtown，CT 06470)GSA離心機中(5200rpm)離心10分鐘，將細胞破碎。潷去形成的上清液，再將細胞碎片懸浮在28ml蔗糖(25%)和EDTA(50mM)的溶液中。加入約1ml的溶菌酶(20mg/ml)的Tris-HCl(0.25M)溶液(pH8.0)和約1.5ml的EDTA(0.5M，pH8.0)，並與細胞懸浮液混合。生成的混合物在冰上培育15分鐘。將3ml溶菌溶液(由3ml 10%Triton X-100(Rohm ＆ Haas混合製備)、75ml EDTA(0.25M，pH8.0)和7ml水加到溶菌酶處理過的細胞中，緩慢混合。生成的溶液在冰上再培育15分鐘。
在4℃下，用Sorvall SS34離心機(17000rpm)離心約45分鐘，從溶液中除去細胞碎片。將大約28.6g CsCl和大約1ml的溴乙錠(5mg/ml)溶液加到約30ml上清液中。然後用水將體積調至40ml，再將溶液潷到超速離心管中，密封離心管，在Ti70離心機(Beckman，7360 N.Lincoln Avenue，Lincolnwood，IL 60646)中(49500rpm)將溶液離心約18小時。分離到用紫外光可目視到生成的質粒帶，用CsCl飽和異丙醇提取，除去溴乙錠，透析約20份體積的TE緩衝液(10mM Tris-HCl，pH7.5和1mM EDTA)3次變化。收集透析物，然後加入2體積的乙醇和0.05體積乙酸鈉溶液(3M)。將乙醇混合物冷卻到-20℃。於-10℃下，用SS34離心機(10000rpm)離心30分鐘，將質粒DNA破碎。再將形成的碎片懸浮在大約1ml TE緩衝液中，並用等體積苯酚∶氯仿混合物(1∶1，V/V)提取。加0.1體積的3M乙酸鈉和2體積乙醇，回收水相中的DNA，繼之在-20℃下培育約30分鐘，然後用SS34離心機(15000rpm)離心20分鐘。生成的DNA碎片先後用70%乙醇和100%乙醇衝洗，乾燥。
將通過上述方法得到的約1.0g質粒pHS 190 DNA懸浮在1.5ml的0.1X TE緩衝液中，並貯藏於-20℃。約10μg的質粒pHS 190 DNA在含DNA的EcoRⅠ緩衝液(100mM Tris-HCl，pH7.5，5mM MgCl2，50mM NaCl)的反應液中，用限制性酶EcoRⅠ(約10單位)進行消化。反應物在37℃下培育2小時。
為了將5′突出端轉化為鈍端，將dNTP(dATP，dCTP，dGTP和TTP)各0.5mM僅與1-5單位的克列諾夫片段(Boehringer Mannheim Biochemicals，7941)Castleway Dr.，P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250)一起加入。反應物在30℃下培育15分鐘，然後在75℃下處理10分鐘使酶失活。反應混合物先用苯酚，苯酚/氯仿，氯仿提取，然後用乙醇析出。
將質粒懸浮在含40mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP和1單位T4 DNA連接酶(Boehringer-MannheimBiochemicals，7941 Castleway Drive，Indianapolis，IN 46250)的50μl溶液中。反應物在14℃培育過夜。
按下述Maniatis等人的方法(Maniatis et al.，Molecular Cloning 250-251，1982)，將連接的混合物轉移到大腸桿菌K12 RV308中(由NRRL得到，保藏號NRRL B-15624，保藏日期1983年9月28日)。將100ml TY培養液置於500ml燒並中，用1ml的RV308過夜培養物接種。於37℃下，細胞隨著強裂搖動培養密度約為5×107細胞/ml。將培養物置於冰上10分鐘，然後於4℃下離心(4000Xg)5分鐘。將細胞懸浮在50ml冰冷卻的50mM CaCl2於10mM Tris-HCl(pH8.0)中。再將細胞在冰上培育15分鐘後繼續離心。然後再將細胞懸浮在3.3ml的氯化鈣溶液中。將連接混合物加到200μl細胞中，在冰上培育30分鐘。然後將細胞轉移到42℃水浴中，2分鐘。將1ml TY培養液加到試管中，在30℃下將細胞培育1小時。將200μl等份溶液置於含有5μg/ml四環素的TY瓊脂(TY培養液+1.5%瓊脂)板上，在30℃下培養過夜。
將質粒懸浮在10μl水中，用XbaⅠ和BamH Ⅰ消化質粒後得到載體。將大約1μl XbaⅠ(約10單位)加到10μl質粒DNA(約10μg)和5μl的10X XbaⅠ緩衝液(500mM Tris-HCl，pH8.0，100mM MgCl2和500mM NaCl)中。在37℃下培育90分鐘後，加入0.5μl的5M NaCl和1μl BamHⅠ(約10單位)，在37℃再繼續培育90分鐘。該反應混合物經瓊脂糖凝膠電泳，先後通過電洗脫和乙醇析出，分離得到約5.75kb XbaⅠ-BamHⅠ載體片段。
在應用生物系統380B型合成儀上，採用本領域專業人員已知技術，合成下列DNA順序。按Brown等人所述方法(Brown et al.，Methods in Enzymology 68109，1979)將該順序分成為各個45寡核苷酸。該DNA順序編碼本發明較佳多肽，其中A是Met-Ala-Tyr，B是Lys，C是Thr，D是Lys，E是Leu，X是
Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
含有編碼順序的DNA與以上構建的XbaⅠ-BamHⅠ載體片段混合和連接，然後將連接的混合物轉移到如上所述的大腸桿菌K12 RV308中。抗四環素轉化株的質粒DNA經限制性酶消化分析，證明該質粒為pHS451。
實施例2大腸桿菌產生的GRF類似物的純化A.GRF類似物在大腸桿菌中的表達在32℃下，大腸桿菌K12 RV308/pHS451在含有5μg/ml四環素的TY培養液中培養到細胞達到中等對數階段。該混合物升溫至42℃後，繼續培育約3個多小時。將在質粒pHS451上定位控制GRF類似物表達的λpL啟動子的CI857溫敏遏阻物在42℃下失活，從而能夠表達GRF類似物。
B.含GRF類似物顆粒的分離分離含GRF類似物的顆粒。首先將全部細胞離心後，懸浮在10℃的水中，細胞漿在Gaulin均化器(8000 psig)中均勻化。將均勻化的細胞漿在水中稀釋，攪拌10分鐘，然後用10% NaOH將pH調至8.4-8.6。離心該混合物，固體為含GRF類似物的顆粒，在-70℃下冰凍至今後使用。
C.GRF類似物的最終純化實施例2B製備的顆粒在2-5℃熔化。加入10體積的0.05N 乙酸-7M尿素，均化5-8分鐘，使該顆粒溶解。加入10%鹽酸，將pH調至2.5-2.6。在2-5℃下，攪拌該混合物12-15小時。用塗有Dicalite Speedex助濾劑的Sparkler濾器(Grefco，Torrance，CA)過濾，使溶液澄清。用乙酸-尿素溶液稀釋後，使該溶液的導電率降至低於4000微歐姆。
用S.Sepharose (Pharmacia，800 Centenial Ave.，Piscataway，NJ 08854)樹脂製備陽離子交換柱。交換柱含有每50g材料1升樹脂。以流速為0.11/cm2/hr，將材料加到柱上，用2柱體積的0.1M氯化鈉的乙酸-尿素溶液洗滌。按0.25M至1.6M氯化鈉的乙酸-尿素溶液的線性梯度洗脫GRF類似物，以0.1柱體積餾收集3柱體積餾份。使用導電率O.D.276、HPLC和聚丙烯醯胺凝膠電泳方法鑑定含GRF類似物餾份，並收集該餾份。
將等體積的乙酸-尿素溶液加到所收集的餾份中，然後將材料塗在含有S.Sepharose 樹脂的乙酸-尿素溶液的交換柱上，所塗的量應為每升樹脂能容納50g蛋白質。流速為0.021/cm2/hr。以0.25M至1.2M氯化鈉的乙酸-尿素溶液的線性梯度洗脫GRF類似物餾份，按0.1柱體積收集餾份。如上述方法分析餾份並收集含GRF類似物餾份。
用0.02M甘氨酸(pH2.5)製備Sephadex G-15(Pharmacia)柱，其柱體積是以上所收集餾份的體積的5倍。分離得到含O.D.276峰的餾份。
製備含SP20SS樹脂(Sephabeads，Mitsubishi Chemical，Tokyo)的10%乙腈-0.02M甘氨酸(pH2.5)溶液的柱。將含有所收集的GRF類似物的溶液製備成10%的乙腈溶液，並以每小時1.5-2柱體積的流速加到柱上，用2柱體積的乙腈-甘氨酸緩衝液洗滌該柱。以3柱體積的10%乙腈-0.02M甘氨酸與3柱體積的50%乙腈-0.02M甘氨酸相混合形成的梯度溶液洗脫GRF類似物。以0.1柱體積收集餾份並測定GRF類似物餾份。
用經0.25M乙酸平衡的Sephadex
G15柱對含GRF類似物的材料進行色譜分析，然後分離出O.D.276峰，凍幹至以後使用。
實施例3GRF類似物的二羥丙基化基本上按Acharya和Manjula所述方法(Biochemistry 263524，1987)，在氰基硼氫鈉存在下，用甘油醛處理，使實施例2製備的一部份GRF類似物二羥丙基化。
將5g實施2製備的類似物在室溫下攪拌溶解於60ml 25%1-丙醇的0.1%三氟乙酸(Pierce，Rockford，IL)中，用約1.7ml 5N NaOH將pH調至8，加入0.92g DL-甘油醛(Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)和0.85g氰基硼氫鈉(Aldrich，Milwaukee，WI)。該混合物在室溫下攪拌1小時。用水裝填9×65cm的Sephadex
G-10(Pharmacia，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ 08854)柱。用10ml的25%丙醇洗滌柱中含GRF化合物的材料，再用約1500ml H2O洗脫柱。按24ml的份量收集各餾份，同時在280nm處監測紫外螢光現象。在收集50份餾份後，洗脫緩衝液由水改為10%乙酸。收集並凍幹峰值餾份。
實施例4閹小羊體內GRF類似物及其烷基化的測定12頭閹小羊，體重約65kg，每頭羊都在右肩後插入皮下插管，並在左側插入頸靜脈插管用於放血。用Infu-CheckTM(IVAC Corporation，.P.O.Box 85335，San Diego，CA 92121-1579)泵，以每小時2.0ml流速通過皮下插管，施用注入液，注入時間120小時。將肽溶解於5ml的0.01M H3PO4，並用含0.1%羊血清清蛋白和50μg/ml多粘菌素B硫酸鹽的NaH2PO4緩衝液稀釋到1805ml。注入液含有20.8μg/ml肽。劑量為1.0mg類似物/羊/天。共有2個處理組，其中一組用本發明最佳化合物處理，該化合物中的A是Ala，B是Lys，C是Thr，D是Lys，E是Leu，X是Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
該化合物在表1中稱為Ala°;另一處理組用同樣化合物處理，但游離氨基已被單烷基化為2，3-二羥丙基。該化合物在表1中表示為DHP Ala°。
所有羊在開始處理前24小時，通過頸靜脈插管每天放4次血，在整個處理期都按此繼續進行，直至處理結束後24小時終止。每次用藥前後各半小時採集血樣，測定各血漿樣品的生長激素釋放。
每頭羊在每天0700和1500小時餵給400g高能量食物，結果示於以下各表，由此說明本發明化合物具有生長激素釋放活性。實施例3製備的本發明較佳化合物的結果示於表1，本發明其他化合物的結果示於其餘各表中。
表2-8給出了本發明各種GRF類似物在闡小羊體內生長激素釋放的測定結果。類似物按美國專利4617149(本文參考文獻)所述固相合成方法製備。類似物是所示各不同胺基酸組份和延長的牛GRF。
實施例5按美國專利4617149所述固相合成方法合成各種bGRF肽類似物。根據Heiman等人(Endocrinol.116410，1985)所述方法，測定大鼠腦垂體細胞中的合化合物。如表中所示組份，類似物以人生長激素釋放因子的前29個胺基酸順序為基礎。
實施例6在1位上具有脫NH2-Tyr的GRF類似物的製備GRF類似物脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Asn-Tyr-Arg-Arg-Val-5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-45 50 55Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-60 65Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
70該類似物按如下所述方法製備。在氨基末端的2位上為丙氨酸的中間體按實施例1和2所述的重組方法製備，但編碼該中間體的下列DNA順序已被取代
在室溫下，將18mg(2μmol)的中間體攪拌懸浮在2ml的0.2M Tris(pH7.8)/20%CH3CN中，再另加400μl CH3CN，保持一定程度的混濁。加入約10mg(27.3μmol)的3-(4-羥苯基)-丙酸琥珀醯亞胺酯(Pierce Chem.Co.，P.O.Box 117，Rockford，IL 61105)，反應在室溫下攪拌進行。30分鐘後，除去20μl，並用0.1%三氟乙酸(TFA)稀釋到400μl，用Pharmacia Pep RPCHR5/5(0.5mm×5cm)注射29μl(0.37mg/ml)後進行分析並與底物作對比。
1小時後，用3-4滴冰醋酸酸化反應混合物後，將其塗在2.5×28cm Sephadex G-10柱上，用10%乙酸洗脫。收集8ml餾份，同時在280nm波長處進行監測。合併7-9餾份，冷凍並凍幹，得到12mg。將產物溶解於1ml的10%TFA中，取0.1ml樣品凍幹在10個小並中。再將樣品溶解在1μg/μl的0.1N乙酸中，按實施例5方法進行測定。化合物顯示效能為0.49nM。
表1連續皮下注入闡小羊體內的生長激素應答相對時間 平均血漿 GH ng/ml±SEGRF(1-78)OH(小時) N. DHP Ala0Ala0-23 12 8±2.0 2±0.6-15 12 8 2.6 4 1.00 開始皮下注入 -1.0mg/半/天1 12 7 2.3 3 0.89 12 31 8.0 7 2.825 12 37 6.8 8 1.633 12 38 7.4 14 4.049 12 34 5.4 16 5.957 12 55 11.6 16 3.173 12 56 10.0 13 3.681 12 71 12.4 20 3.997 12 78 11.7 26 4.3105 12 73 10.5 22 3.4121 12 85 17.2 29 4.5121.5 終止注入+0.5 6 94 11.0 25 3.5+1.0 6 94 19.0 19 4.3+1.5 6 96 26.4 20 3.7+2.5 6 115 30.8 35 7.8+7.5 12 68 13.1 10 2.2+12.0 12 51 10.1 6 1.3+24.0 12 32 8.1 5 1.0
表2GRF類似物的Ⅳ型快速濃注劑量對闡小羊中血漿生長激素構型的作用血漿 GH,ng/ml,±SE1相對時間(分鐘) A B C-45 3.1±0.7 3.4±0.7 3.9±1.215 134.0 26.2 108.9 23.0 109.6 28.030 73.4 10.4 44.6 9.4 41.2 10.660 20.9 1.8 12.2 1.8 10.6 3.390 6.8 1.2 4.9 0.8 5.7 1.1120 4.0 1.1 4.1 1.0 3.8 1.1180 3.0 1.0 2.3 0.6 2.5 1.1血漿 GH,ng/ml,±SE1相對時間(分鐘) D E-45 1.4±0.3 3.0±0.815 162.3 34.6 122.5 16.030 69.4 18.2 42.6 4.960 14.3 3.7 9.5 1.290 7.7 2.0 4.0 1.2120 3.7 0.6 3.0 1.0180 1.8 0.3 2.0 0.816羊/處理-拉丁方A＝R12，21T15L27GRF(1-29)NH2B＝A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2C＝P0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2D＝N-甲基 A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2E＝DHP A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2
表3GRF類似物的Ⅳ型快速濃注劑量對闡小羊中血漿生長激素構型的作用血漿 GH ng/ml ± SE1相對時間(分鐘)A B C-45 2.2±0.5 2.9±0.6 2.5±0.715 115.5 51.5 107.7 20.6 81.1 13.630 35.8 14.4 40.1 6.2 35.4 3.860 8.0 3.2 14.8 1.8 11.2 1.290 3.4 0.7 6.1 1.1 4.3 0.8120 3.2 1.6 2.7 0.7 3.9 2.118024016羊/處理-拉丁方A＝F-1A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2B＝P-1A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2C＝D-1A0R12，21T15L27GRF(1-29)NH2
表8重組bGRF二聚體和bGRF前體的Ⅳ型快速濃注劑量對闡小羊體內血漿GH濃度的作用血漿GH濃度,ng/ml±S.E.
相對時間(分鐘) Pro0bGRF二聚體 Pro0bGRF(1-78)OH-0.75 4.9± 0.7 4.6± 0.80 Ⅳ型快速濃注*0.08 24.8 6.0 85.1 15.80.25 59.7 15.4 104.8 19.90.50 39.7 10.0 56.8 11.61.00 34.1 12.0 32.4 11.71.50 21.2 7.4 16.6 5.02.00 14.4 4.0 7.5 1.93.00 4.0 1.4 4.5 1.44.00 5.0 1.4 9.9 2.1＊劑量＝P0bGRF Dimer＝58.0μg/羊P0bGRF(1-78)OH＝58.0μg/羊表9大鼠腦垂體細胞中GRF類似物中介的GH分泌的效能效能b相對應能c類似物 nM(平均;n)(% stdd)hGRF(1-44)OH .136;3 1.0[R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.136;10 1.0DHP[R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.17;1 .8[P0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.665;2 .20DHP[P0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH21.01;1 .13[A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.534;9 .255DHP[A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.406;2 .335[N-Me-A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.78;3 .17[N-Ac-A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH21.40;2 .10[Q0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.712;2 .191[G0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.337;2 .36[H0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.528;1 .26[D0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.56;2 .24[S0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.51;2 .27[P-1,P0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH21.45;1 .09DHP[P-1,P0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.959;1 .14[P-1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH21.01;2 .13[R-1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.885;1 .15[A-1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.526;2 .26[F-1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH2.643;1 .21[D-1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRF(1-29)NH21.55;1 .09aGH對1pM-1μM類似物濃度的應答由ALLFIT計算。
(De Lean，A.，et al.，Am.J.Physiol.235E97(1978).
b效能是對各類似物的EC50。EC50是獲得50%最大應答的濃度。
cEC50[R12，T15，R21，L27]hGRF(1-29)NH2/EC50類似物dStd＝[R12，T15，R21，L27]hGRF(1-29)NH權利要求
1.製備藥物組合物的方法，該方法包括將多肽化合物與1個或多個藥物賦形劑相混合，其中所述多肽化合物為下式化合物A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-5 10Arg-B-Val-Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-15 20Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X；25式中A是脫NH2-Tyr，Ala-Tyr，Gln-Tyr，Gly-Tyr，His-Tyr，Met-Tyr，Phe-Tyr，Pro-Tyr，Ser-Tyr，Ala-Ala-Tyr，Arg-Ala-Tyr，Asp-Ala-Tyr，Phe-Ala-Tyr，Pro-Ala-Tyr，Pro-Pro-Tyr，Met-Ala-Tyr，Met-Arg-Tyr，Met-Asp-Tyr，Met-Leu-Tyr，Met-Pro-Tyr，Met-Ser-Tyr，Met-Ala-Ala-Tyr，Met-Arg-Pro-Tyr，Met-Asp-Pro-Tyr，Met-Gly-Pro-Tyr，Met-Phe-Pro-Tyr，和Met-Ser-Pro-Tyr；B是Arg或Lys；C是Gly，Ala，Leu，Val，Ile，或Thr；D是Arg或Lys，E是Met，Val，Leu，或Ser；X是NH2或1個或多個胺基酸，具有游離氨基的0、1或1個以上的胺基酸可進行化學修飾。
2.按權利要求1的方法，其中A是Ala-Tyr。
3.按權利要求1的方法，其中A是Pro-Tyr。
4.按權利要求1的方法，其中A是脫-NH2-Tyr。
5.按權利要求1的方法，其中C是Thr。
6.按權利要求1的方法，其中X是Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
7.按權利要求1的方法，其中多肽化合物是Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.70 75
8.按權利要求1的方法，其中多肽化合物是下式化合物和藥物上可接受的固體或液體載體脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Asn-Tyr-Arg-Arg-Val-5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-45 50 55Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-60 65Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,70
9.按權利要求1的方法，其中具有游離氨基的至少1個胺基酸在該氨基上被由0、1或1個以上羥基取代的C1-C6直鏈或支鏈烷基鏈取代。
10.按權利要求9的藥物組合物，其中至少1個羥烷基是2，3-二羥丙基。
11.誘發生長激素釋放的方法，該方法包括施用有效量的由下式表示的多肽化合物和藥物上可接受的固體或液體載體A-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-R-Tyr-5 10Arg-B-Val-Leu-C-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Leu-Leu-15 20Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X;25式中A是 脫NH2-Tyr, Ala-Tyr, Gln-Tyr, Gly-Tyr,His-Tyr, Met-Tyr, Phe-Tyr, Pro-Tyr, Ser-Tyr, Ala-Ala-Tyr,Arg-Ala-Tyr, Asp-Ala-Tyr, Phe-Ala-Tyr, Pro-Ala-Tyr,Pro-Pro-Tyr, Met-Ala-Tyr, Met-Arg-Tyr, Met-Asp-Tyr,Met-Leu-Tyr, Met-Pro-Tyr, Met-Ser-Tyr, Met-Ala-Ala-Tyr,Met-Arg-Pro-Tyr, Met-Asp-Pro-Tyr, Met-Gly-Pro-Tyr,Met-Phe-Pro-Tyr,和Met-Ser-Pro-Tyr; B是Arg或Lys; C是Gly, Ala, Leu, Val, Ile,或Thr; D是Arg或Lys, E是Met, Val, Leu,或Ser;X是NH2或1個或多個胺基酸，具有游離氨基的0、1或1個以上的胺基酸可以進行化學修飾。
12.按權利要求11的方法，其中A是Ala-Tyr。
13.按權利要求11的方法，其中A是Pro-Tyr。
14.按權利要求11的方法，其中A是脫-NH2-Tyr。
15.按權利要求11的方法，其中C是Thr。
16.按權利要求11的方法，其中X是Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
17.按權利要求12的方法，其中多肽化合物是Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.70 75
18.按權利要求11的方法，其中具有游離氨基的至少1個胺基酸在該氨基上被由0、1或1個以上羥基取代的C1-C6直鏈或支鏈烷基鏈取代。
19.按權利要求18的方法，其中至少1個羥烷基是2，3-二羥丙基。
全文摘要
本發明提供了新的生長激素釋放因子(GRF)類似物，還提供了這些分子經過化學修飾的編碼GRF類似物的DNA化合物。有些多肽化合物能夠通過大腸桿菌產生化合物，從而獲得高產化合物。本發明還提供了藥物組合物和誘發生長激素釋放的方法。
文檔編號C12R1/19GK1057784SQ91102730
公開日1992年1月15日 申請日期1991年4月23日 優先權日1990年4月24日
發明者傑拉爾德·S·布魯克, 理察·D·迪馬爾基, 馬克·L·海曼, 熊漢生, 戴維·L·基邁利, 丹尼斯·P·史密夫 申請人:伊萊利利公司