檢測和預測對β激動劑的支氣管擴張反應的方法

2023-05-28 12:19:16

專利名稱：：檢測和預測對β激動劑的支氣管擴張反應的方法
技術領域：
：本發明涉及，用於預測個體對β激動劑的支氣管擴張反應的方法。具體的，本發明涉及，β2AR基因的特定等位基因變異體的檢測和它們作為β激動劑的藥物遺傳學標記物的用途。
背景技術：
：哮喘是氣道的慢性炎症疾病，其症狀是喘鳴、胸悶和咳嗽的反覆發作，其嚴重程度和發生頻率因人而異(Suki等人，2003)。該病症是肺部氣道變狹窄或完全堵塞，阻止正常呼吸。但是，自發地或者藉助藥物，哮喘中的這種肺部阻塞是可逆的。目前，主要有三種治療方法(Jeffrey等人，2000)(a)吸入糖固醇(Martin，2003；Settipane等人，2003)(b)β2激動劑(Eh等人，2003)和(c)白三烯抑制劑(Biermer等人，2002)。在患有表觀相同表型哮喘的病人中，對藥物治療的反應可能有顯著差異(Drysdale等人，2000)。β2AR受體激動劑作為支氣管擴張藥被推薦為治療哮喘的一線藥物(NationalAsthmaEducationandPreventionProgram(1997)ExpertPanelReportII)。短效和長效的β2激動劑顯示出對抗多種直接和間接的支氣管收縮刺激物的保護作用(Cockcroft等人，1996)。β腎上腺素能受體傳統地分為至少三個不同的亞型β1，β2，β3，被確定分別在心臟、氣道平滑肌和脂肪組織中(JohnsonM，1998)。在β1，β2和β3受體之間有65-70％的同源性。β腎上腺素能受體以激活和失活兩種形式存在，在平常狀態下這兩種形式平衡存在，失活狀態佔絕大多數(JohnsonM，1998)。當β2AR和一分子鳥苷三磷酸(GTP)與G蛋白α亞單元連結時，它以激活的形式存在，並且通過該α亞單元，該受體與腺苷酸環化酶偶合。GTP被GDP的替換催化了ATP藉助酶向cAMP的轉化，並大大降低α亞單元和該受體的親和力，導致分裂和該受體返回低能量的失活形式(JohnsonM，1998)。對於用於哮喘的支氣管擴張的β2受體激動藥，該β2腎上腺素能受體是關鍵的靶體。β2AR是與G蛋白偶合的，並且具有細胞外的氨基末端，七個跨膜結構域，三個細胞內和三個細胞外環，和一個細胞內羧基末端，廣泛分布於全身特別是支氣管的平滑肌細胞，在多種組織和器官中調節兒茶酚胺的作用。β2AR包括約46500Dalton(Da)的413個胺基酸殘基(Drysdale等人，2000)。β2AR被染色體上的5q31-32非內含子基因編碼(Kobilka等人，1987)。JohnsonM.，(1998)報導了β2AR基因編碼區的幾種單核苷酸多態性(SNP)，其導致人類種群中的β2AR蛋白結構的顯著遺傳多態性(GenBank登記號AF022953.1GI2570526；AF022954.1GI2570528和AF022956.1GI2570532)。這些SNP位於β2AR編碼序列的46(A或G)，79(C或G)，491(C或T)的核苷酸，結果導致受體在胺基酸16(Arg或Gly)和27(Gln或Glu)的氨基末端和第四個跨膜結構域的胺基酸164(thr或Ile)分別發生變異。這些胺基酸變異體具有清楚的表型差異，正如重組細胞實驗所證實(Green等人，1994)，細胞(CHW-12)的原代培養內源性地表達了這些變異體(Green等人，1995)，並且轉基因小鼠在心臟中過表達了Thr164或Ile164(Turki等人)。除此之外，已經報導，編碼區的523核苷酸的C和A的同義多態性與日本人種族對於沙丁胺醇(salbutamol)的反應性變化有關(Ohe等人，1995)。除上述編碼區的多態性外，5′啟動子區的幾種SNP最近已經被確定並被定位於核苷酸-1023(A或G)，-654(G或A)，-468(C或G)，-367(T或C)，-47(C或T)和-20(T或C)(Scott等人，1999)。最近，Drysdale(2000)等人報導了-709(C或A)和-406(C或T)的另外兩種SNP。因此，已經確定13個多態性位點位於GenBank登記號M15169.1的565和2110核苷酸之間的β2AR基因區域中。不同的小組已經表明某些上述β2AR胺基酸變異體和對多種病症的易感性增加的關係，包括高血壓(Gly16變異體，Hoit等人，2000)；過敏症(Gly16變異體，Dewar等人，1998)；夜間哮喘(Gly16變異體，Turki等人，1995)；對肥胖治療的反應(Gly16變異體，Sakane等人，1999)；重症肌無力(Arg16變異體，Xu等人，2000)；兒童期哮喘(Gln27變異體，Dewar等人，1997)；肥胖症(Glu27變異體，Large等人，1997)和充血性心力衰竭的死亡率(Ile164變異體，Liggett等人，1998)。還表明，上述討論的某些β2AR基因多態性可能作為哮喘中的疾病修飾劑發揮作用或者可能是已知的對於β激動劑的支氣管擴張反應的個體差異的基礎(Drysdale等人，2000)。事實上，Martinez等人(1997)已經報導，個體的Arg16變異體的純合子和雜合子與個體的Gly16變異體的純合子相比，更可能對沙丁胺醇(albuterol)產生反應。有趣的是，另一個小組報導了，在Gly16變異體的哮喘症純合子中，在連續使用β激動劑福莫特羅(formoterol)治療後的支氣管擴張藥的脫敏作用(Tan等人，1997)。但同時，其他的研究沒有證明不良藥物反應和使用β激動劑的常規治療之間的關聯(Lipworth等人，1999)。哮喘是世界上最普遍的疾病之一。印度有1.5-2千萬的哮喘病人，並且在印度有6％的孩子患有哮喘(ChabraS.K.，1998)。哮喘是一種複雜的、多因素疾病，涉及很多基因和一些環境因素(Suki等人，2003)。印度人種的遺傳因子已經被充分闡明。許多導致錯誤治療的不合理藥物處方的產生是由於，缺乏個體和種族在對目前用於哮喘的多數藥品的藥物反應差異的知識。在一些急性病例中這可能是致命的。通過使用以前對於根據藥物遺傳學基本理論開出的藥物的個體反應知識，可以避免這些情況。存在多種由於不合理藥物處方而產生的副作用，如發抖、心悸、疼痛和耐藥性(O′Connor等人，1992，Dennis等人，2000)。已經發現，特別是在印度人種中，本發明中公開的β2AR基因核苷酸46(A/G)位的等位基因變異體是用於β激動藥的支氣管擴張反應的指示標記物(dicatator)。已經觀察到，患有哮喘的病人有時對沙丁胺醇沒有反應，並且需要很長時間(幾天至幾個月)來確定特殊患者對該藥物沒有反應。在此期間，很難為患者提供病症的緩解。如果該醫生在治療一開始就能確定反應者和非反應者，那麼將節省劑量效價時間(dosetitrationtime)，而且病人將能得到使用其他治療方法的及時治療。在急診病例中能夠給非反應者提供及時準確的治療，而這將挽救生命。Drysdale等人(2000)在美國專利申請811286號中公開了一種方法，其中，在β2AR基因-654(G/A)，46(A/G)和252(G/A)位的三種SNP決定了高加索人種的β激動藥反應。Drysdale等人(2000)要求保護的該方法和診斷試劑盒耗費更多時間，而且昂貴(由於使用三套探針和引物以及相關的生物化學試劑)。進一步，他們的方法嚴格限用於高加索人。因此，由於印度有1.5-2千萬哮喘病人並且印度有6％的孩子患有哮喘，所以需要開發一種不昂貴，快速且特定用於篩選印度人種對β激動劑的藥物反應的診斷方法和試劑盒。本發明中公開的SNP具有作為個體患者的藥物反應的指示劑的很強的預測能力。哮喘是一種複雜的疾病，具有臨床很難定義的表型。用於治療哮喘的最普遍的藥物是吸入式β腎上腺素能激動劑。β2AR多態性可能會影響受體的調節。本發明的新穎性在於，提供了單核苷酸多態性作為藥物反應的藥物遺傳學基因座決定印度哮喘患者對β激動劑的有力關聯。本發明的新穎性還在於，提供了一種通過檢測β2AR基因46位(A/G)的等位基因變異體，預測支氣管擴張反應的方法。該單核苷酸多態性已經被發現其獨自與印度哮喘患者的藥物反應有關。而且，已經發現該SNP是印度人種藥物反應的dictator標記物。Drysdale等人發現，三種SNP一起為高加索人中的藥物反應做出貢獻，但是在印度人種中發現，這三種SNP是沒有關聯的，並且因此我們觀察到在印度人種中採用這三種SNP效果不如只使用一種SNP(A→G)。本發明還提供了新穎的用於篩選印度人種中對於β2激動劑的反應者的特定探針和引物以及診斷試劑盒。本發明進一步提供了一種用於預測印度哮喘患者對於β2激動劑的藥物反應的廉價快速的方法。該β2AR基因多態性作為一種廉價的診斷試劑和在開發該疾病的新治療方法方面，都具有很大的商業價值。發明的目的本發明的主要目的是，提供一種用於檢測和預測對β2激動劑的支氣管擴張反應的方法。本發明的另一個目的是，提供一種檢測和預測β2AR基因的特定等位基因變異體或單核苷酸多態性的方法。本發明的另一個目的是，提供一種製備用於檢測和預測對β2激動劑的支氣管擴張反應的藥物遺傳學標記物的方法。本發明的另一個目的是，提供一種用於檢測和預測對β2激動劑的支氣管擴張反應的診斷試劑盒。本發明的另一個目的是，提供用於檢測和預測對β2激動劑的支氣管擴張反應的新穎的藥物遺傳學標記物。本發明的另一個目的是，提供一種快速和特定的方法，用於篩選哮喘病人中對於β2激動劑的反應者和非反應者。本發明的另一個目的是，提供用於預測該藥物反應的β2AR基因中藥物遺傳學基因座位的基因型。本發明的另一個目的是，提供用於檢測β2AR基因編碼區核苷酸46位的非同義等位基因變異體(A/G)的探針和引物，其用於篩選印度人種哮喘病人的該藥物反應。本發明的另一個目的是研究β2AR基因多態性和哮喘之間的關係。圖1a表示β2AR基因中包括非同義多態性的全部SNP的示意圖。圖1b用於整個β2AR基因區域的PCR擴增的引物。圖1cSNP的定位和印度人種中β2AR基因區域的連鎖不平衡的鑑定。圖1d表示46位核苷酸的A/G的多態性(基因型)的分布。圖2a與具有SEQIDNo.6的等位基因特定引物雜交表示存在A。圖2b與具有SEQIDNo.7的等位基因特定引物雜交表示存在A。圖2c與具有SEQIDNo.8的等位基因特定引物雜交表示存在G。圖2d與具有SEQIDNo.9的等位基因特定引物雜交表示存在G。發明概要本發明公開了印度人種中腎上腺素能受體基因(β2AR基因)，亞型β2中的十個多態基因座的基因型和單元型。本發明涉及用於預測對於β激動劑(β激動劑)的支氣管擴張反應的方法。本發明對於印度人種是特別有益的。本發明提供了一種用於檢測β2AR基因中的等位基因變異體(基因型)的方法，其對於用於支氣管擴張的β2激動劑的關鍵靶體是可靠的。本發明對於開發一種用於預測個體藥物反應的診斷試劑盒是有用的。已經確定了人類染色體5q31上β2AR基因編碼區中的幾種錯義多態性。本發明還公開了對藥物反應有效的、用於檢測β2AR基因中特定等位基因變異體的特定引物和探針。發明的詳細說明β2AR是哮喘病中用於支氣管擴張的β2激動劑的關鍵靶體。反應者和非反應者病人樣本的該基因編碼區(只有一個外顯子)的直接測序導致發現了與藥物反應有關的非同義多態性。在個體中，編碼精氨酸的密碼子AGA變成編碼甘氨酸的GGA。如果非同義多態性存在於反應者/非反應者個體純合子狀態中，則可能導致支氣管擴張的變化。因為β2AR基因的外顯子區的非同義多態性與哮喘病中的支氣管擴張有關，所以這導致發現了與易感性變化有關的哮喘病人中的非同義多態性。已經發現，這一多態性預測體內易感性的變化。進一步，幾個哮喘病人(反應者和非反應者)的基因分型表現了與對β2激動劑反應變化的顯著相關。這些結果構成了單核苷酸多態性與對β2激動劑反應變化的相關性的例證。本發明還提供了適用於檢測與藥物反應有關的β2AR基因多態性的寡核苷酸序列(如SEQIDNO2，3，4，5，6，7，8和9)。本發明還包括預測對於β激動劑的個體反應的診斷試劑盒，該試劑盒包括一套特定引物或探針，以及需要的緩衝液和適於鑑定β2AR基因多態性的附屬品，用以估測對於β2激動劑的個體反應。另外，本發明的主要實施方式涉及，一種用於預測和檢測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知和速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因或基因座編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(e)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(f)對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列的計算比較，對經測序的、步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(g)設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(h)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中所述寡核苷酸引物特異性地與靶SNP或特定β2AR等位基因變異體雜交，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。本發明的另一個實施方式涉及，一種檢測和預測哮喘患者的β2AR基因的特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)的方法，所述方法包括以下步驟a.通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知的而非速效的β2激動劑，b.對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，c.從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，d.設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，e.使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，f.對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或SNP進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，g.設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，h.使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。本發明的另一個實施方式涉及，一種製備用於檢測和預測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的藥物遺傳學標記物的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知和速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因或基因座編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(e)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(f)對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(g)設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(h)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換和作為藥物遺傳學標記物的作用。本發明的另一個實施方式涉及，用於檢測和預測哮喘患者對β激動劑的支氣管擴張反應的新穎的藥物遺傳學標記物，所述標記物由以下組成a)具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物b)具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物c)具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物本發明的另一個實施方式涉及，一種用於預測和檢測哮喘病人對β激動劑的支氣管擴張反應的診斷試劑盒，所述試劑盒包括(a)用於β2AR基因標記物區擴增的、具有SEQIDNo.2和3的第一套寡核苷酸引物，(b)用於非同義多態性或單核苷酸多態性(AGA至GGA)基因分型的、具有SEQIDNo.4和5的第二套引物，所述過程包括下述PCR條件a)(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，b)(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，c)(iii)60℃，步驟(ii)中的退火DNA延伸30秒，(c)用於驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)存在SNP或特定β2AR等位基因變異體的、具有SEQIDNo.6，7，8和9的第三套引物，其中該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有哮喘病人β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換和作為藥物遺傳學標記物的作用。本發明的另一個實施方式涉及患者，其中該患者是人類。本發明的另一個實施方式涉及β2激動劑，其中該β2激動劑是沙丁胺醇。本發明的另一個實施方式涉及藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇，其中該藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。本發明的另一個實施方式涉及藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇，其中該藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。本發明的另一個實施方式涉及藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇，其中該藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為通過吸入劑釋藥。本發明的另一個實施方式涉及寡核苷酸引物，其中適於擴增β2AR編碼區的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。本發明的另一個實施方式涉及寡核苷酸引物，其中適於擴增被檢測的非同義多態性或SNP的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。本發明的另一個實施方式涉及PCR循環的次數，其中進行PCR的次數為37。本發明的另一個實施方式涉及寡核苷酸引物，其中適於驗證β2AR基因或基因座的SNP或等位基因變異體的寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物。本發明的另一個實施方式涉及合成的寡核苷酸引物的長度，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。本發明的另一個實施方式涉及合成的寡核苷酸引物的長度，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。本發明的另一個實施方式涉及基因型，其中基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。本發明的另一個實施方式對於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑是有用的。本發明的另一個實施方式涉及先進方法，其中該先進方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因或基因座的單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。本發明的另一個實施方式涉及藥物遺傳學標記物，其中該藥物遺傳學標記物與β2AR基因或基因座的單個特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)有關。本發明的另一個實施方式涉及非同義多態性或SNP，其中被鑑定的非同義多態性或SNP或特定的單個β2AR等位基因變異體作為藥物遺傳學標記物發揮作用。本發明的另一個實施方式涉及標記物，其中標記物/具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物能夠擴增β2AR基因的編碼區。本發明的另一個實施方式涉及標記物，其中標記物/具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物能夠篩選和鑑定反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，從而檢測β2AR基因的特定SNP。本發明的另一個實施方式涉及標記物，其中標記物/具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物能夠驗證正常對照個體和哮喘病人(包括反應者和非反應者)存在SNP或特定等位基因β2AR或基因座變異體。本發明的另一個實施方式涉及試劑盒，其中所述試劑盒用於鑑定適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。本發明的另一個實施方式涉及試劑盒，其中該試劑盒方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因座單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。本發明的另一個實施方式涉及試劑盒，其中被鑑定的非同義多態性或SNP或特定單個β2AR等位基因變異體作為藥物遺傳學標記物發揮作用。本發明的另一個實施方式涉及試劑盒，其中，該試劑盒為特定的單個β2AR等位基因變異體或SNP或非同義多態性，其作為對於β2激動劑的藥物遺傳學標記物發揮作用。本發明的另一個實施方式涉及試劑盒，該試劑盒進一步包括使用該寡核苷酸和基於β2AR基因變異體AA或GG基因型的反應類型歸屬的用法說明書。以說明本發明的方式給出以下實施例，其不限制本發明的範圍。實施例實施例1種群研究吸入的β2激動劑引起的氣道反應的測量作為本發明的第一步，申請人通過為病人施加短效β激動劑如沙丁胺醇進行研究，其表現多種程度的反應，為了進行更多的分類研究，我們根據病人對沙丁胺醇的反應程度把病人分為良好反應者和不良反應者。沙丁胺醇可以口服，或者更普遍地使用吸入裝置。吸入劑保證很小劑量的藥物被直接傳遞到肺部。哮喘的診斷是根據與該疾病相符的跡象和症狀的陽性歷史和通過可逆的氣道阻塞物的存在而做出的。所有病人都接受了常規的實驗室診斷試驗和肺功能試驗(PFT)，以排除其他可能的胸部疾病。在肺活量試驗中，進行最少三種可接受的方案並選擇「最佳-試驗(best-test)」曲線(「最佳-試驗」曲線定義為符合美國胸科協會(AmericanThoracicSociety)規定的可接受標準並給出FVC和FEV1的最大和的試驗)。表現氣道阻塞跡象的病人被給予200mg沙丁胺醇(β2腎上腺素能激動劑)，並且在20分鐘後重複該試驗。該做法用來評定氣道阻塞可逆性的程度。同樣的程序在兩周多的期間內重複2-3次，並且選擇FEV1中年齡變化百分比的最佳值，用於將哮喘病人分為對沙丁胺醇的良好、不良或非反應者。實施例2II.β2AR基因多態性的鑑定本發明人等在印度人種中鑑定了β2AR基因的5′上遊和編碼序列的鄰近區域的10個多態性位點(表2)。該發現與Drysdale等人(2000)報導發現的13個多態性位點是不同的。表3表示的7個單元型對是由使用了Clark運算法則(Clark，1990)範圍的非定相基因型(unphasedgenotype)評估的，其中單元型是直接指所有位點均為純合子或最多一個可用位點為雜合子的個體。實施例3III.作為藥物反應指示(dicatator)的本發明的單個多態性本申請人等使用寡核苷酸引物進行了人類β2AR基因外顯子區的PCR擴增。這些引物是根據美國能源部聯合基因組研究所(DOEJointGenomeInstitute)和斯坦福人類基因組中心(StanfordHumanGenomeCenter)(1999-10-6)(GenBankaccessionnumber-AC011354)提出的人類β2AR基因序列設計的。純化的PCR產物的測序表明，人類β2AR基因外顯子區域的純合子非同義多態性與支氣管擴張有關。本發明提供了人類β2AR基因的等位基因變異體的序列，其包括資料庫中(GenBankAccessionNo.-AC011354)與藥物反應有關的人類β2AR基因的外顯子區域的純合子非同義多態性。表1位點的變化與使用人類β2AR基因鄰接外顯子區域(GenBankaccessionnumber-AC011354)的引物(SEQIDNo.2和3)獲得的PCR產物序列是一致的。A→G的替換使精氨酸變為甘氨酸，結果導致了人類β2AR基因外顯子區域的等位基因變異體的核苷酸序列。使用鄰接SEQIDNo.1的人類β2AR基因外顯子區的非同義多態性的SEQIDNo.2和3引物，獲得了包括該非同義多態性的PCR產物序列。上述序列中核苷酸857位的多態性位點(A*)與資料庫GenBankaccessionnumber-AC011354)中核苷酸46位相當。根據使用鄰接人類β2AR基因外顯子區的引物(SEQIDNo.2和3)得到的PCR產物，使用引物檢測857位多態性(表1)。實施例4IV.藥物反應的相關性分析本發明人等發現，通過對β2AR基因核苷酸46位的唯一多態性位點的基因分型，可以高可信度地預測印度人種中病人對沙丁胺醇的支氣管擴張反應。幾個哮喘病人(反應者和非反應者)的進一步基因分型顯示，其具有與對β激動劑的反應變化的顯著相關性。這些結果組成了單個多態性與對β激動劑的易感性變化有關的第一個示例。純合子Arg16和純合子Gly16表現出與印度人種中不良和良好反應的關係(圖1d)。此外，由於其他(Martinez等人，1997)研究中，使用了很少數的有陽性支氣管擴張反應的Arg16純合子哮喘病人和有負性支氣管擴張反應的哮喘病人，潛在的人種混淆，輕度的兒科哮喘病人，而使其與這裡描述的本發明人的研究之間是沒有可比性的，本發明利用的是具體的印度哮喘病人，更大數量的哮喘病人和具有一定哮喘嚴重程度的成年印度患者。這些申請人沒有發現與印度人種哮喘有關的β2AR基因SNP。實施例5V.診斷試劑盒本發明進一步提供了用於預測對β激動劑的個體反應的診斷試劑盒，其包括SEQIDNo.2和3的PCR擴增引物，SEQIDNo.4和5的快照(snapshot)引物，選自SEQIDNo.6，7，8和9寡核苷酸的至少一種等位基因特定寡核苷酸。適合PCR或雜交反應的緩衝液。等位基因特定寡核苷酸可被選擇性地提供作為固定的底物，其能夠用於檢測β2AR基因多態性。試劑盒的隨意附加組成包括，例如，限制性酶，聚合酶，底物核苷三磷酸，用於標記的工具(例如，如果標記為生物素時的抗生物素蛋白酶結合和酶底物和色原體)。實施例6吸入的β2激動劑引起的氣道反應的測量哮喘的診斷是根據與該疾病相符的跡象和症狀的陽性歷史和通過可逆的氣道阻塞物的存在而做出的。所有病人都接受了常規的實驗室診斷試驗和肺功能試驗(PFT)，以排除其他可能的胸部疾病。在肺活量試驗中，進行最少三種可接受的方案，選擇「最佳-試驗」曲線(「最佳-試驗」曲線定義為符合美國胸腔協會(AmericanThoracicSociety)規定的可接受標準並給出最大總和的FVC和FEV1的試驗)。表現氣道阻塞跡象的病人被給予200mg沙丁胺醇(β2腎上腺素能激動劑)，並且在20分鐘後重複該試驗。該做法用於評定氣道阻塞可逆性的程度。同樣的程序在兩周多的期間內重複2-3次，並且FEV1中％年齡最佳值的變化被選擇用於，將哮喘病人分為對沙丁胺醇的良好、不良或非反應者。實施例7β2AR基因多態性的鑑定本發明人等在印度人種中鑑定了β2AR基因的5′上遊和編碼序列的鄰近區域的10個多態性位點(表2)。舉例說明了從ATG起始位點上遊的1581鹼基對至ATG起始位點下遊的750鹼基對的10個多態性位點。Drysdale等人(2000)發現的13個多態性位點與我們發現的在印度人種中僅10個位點是不同的。表3中表示的7個單元型對是由使用了Clark運算法則(Clark，1990)範圍的非定相基因型評估的，其中單元型是直接指所有位點均為純合子或最多一個可用位點為雜合子的個體。β2AR基因的重疊部分是使用以下引物從哮喘病人和正常印度個體的基因組DNA中擴增的，具有與GeneBankAccessionNo.AC011354相應的指示位置。部分1引物位置是以起始密碼子為+1的第一核苷酸為基礎的。正向引物nt-1472至-1448反向引物nt-530至-548的補體942nt產物(-1472至-530)部分2正向引物(SEQIDNo.2)nt-811至-787反向引物(SEQIDNo.3)nt+143至+122的補體954nt產物(-811至+143)部分3正向引物(5)nt+126至+148反向引物(6)nt+721至+699的補體595nt產物(+721至+126)表2印度人種β2AR基因中鑑定的多態性表3此表中表示的7個單元型對是由使用了Clark運算法則(Clark，1990)範圍的非定相基因型評估的，其中單元型是直接指所有位點均為純合子或最多一個可用位點為雜合子的個體。-1023-6.54-468-367-47-2046792525231.AGGCCCGGGC2.GACTTTACGC3.GACTTTGCGC4.GGCTTTGCAA5.GACTTTACAA6.GGCTTTGCAC7.GGCTTTGCGC實施例8β2AR基因非同義多態性的鑑定本實施例描述，通過根據本發明的PCR及測序，使用一定寡核苷酸引物對β2AR基因外顯子區域的非同義多態性進行鑑定。使用鹽析方法(Miller等人，1988)從外周血液中分離基因組DNA。通過測量樣品在160nm波長下的吸光度來確定該DNA的濃度。然後使用寡核苷酸引物2和3(SEQIDNo.2和3)通過聚合酶鏈反應對來自哮喘病人的DNA進行擴增。每50μlPCR反應包括10xPCR緩衝液(含有100mMTris(pH9.0)，500mMKCl，和0.1％明膠)中的DNA200ng，寡核苷酸引物2和3(SEQIDNo.2和3)各20pmol，1.8單位的Taq聚合酶(BangaloreGenei)，和200mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。樣品在94℃變性5分鐘，37個變性(94℃，45秒)，退火(56℃，1分鐘)，延伸(72℃，1.2分鐘)循環，並最後在PerkinElmerGeneAmpPCRSystem9600中於72℃延伸10分鐘。該反應產生954個鹼基的DNA片段。利用聚乙二醇/醋酸鈉溶液(含有PEG8000，1M氯化鎂和3M無水醋酸鈉，pH-4.8)純化該PCR產物，並且在使用末端標記化學(dyeterminatorchemistry)的ABIPrism3100DNA自動測序儀上可以直接對該PCR產物進行測序。發現該PCR產物與資料庫(AccessionNumber-AL022326)中的β2AR基因外顯子的序列是相同的。使用FacturaandSequenceNavigator軟體程序將序列歸為相應的野生型序列。實施例9篩選種群中的多態性本實施例描述用於篩選單核苷酸變異體的引物的延伸反應。如實施例2所述，通過PCR對來自幾個哮喘病人(反應者/非反應者)和幾個正常受試者的DNA樣品進行擴增，並將PCR產物純化。該引物延伸反應是使用寡核苷酸引物和快照(snapshot)ddNTP引物延伸試劑盒(PE生物系統)對純化後的PCR產物進行的。該快照(snapshot)設備廣泛用於分子研究，而且在多態基因座的確切的鹼基特性確定中是很有用的。雖然，所有研究中的全部快照(snapshot)方案的基礎方法學都是相同的。但是，每個快照(snapshot)草案本身是唯一的。這是因為每個草案是基因座特定的。因此，必須開發和發明用於鑑定特定基因座的特定工作草案。換言之，本發明中開發的使用快照(snapshot)設備的該反應和PCR條件與其他任何用於其他任何疾病基因座的快照(snapshot)設備是不同的。這意味著，已經建立了本發明中給出的快照(snapshot)設備的新穎的特定草案，其用於特定基因座即β2AR基因座。只有使用特殊設計和開發的具有SEQIDNo.4和5的引物時，該草案才發揮作用。該寡核苷酸引物被設計直至突變的倒數第二位，並且通過一個ssNTP延伸該引物，其與現存的等位基因變異體是一致的。該反應為在PerkinElmerGeneAmpPCRSystem9600中，使用SEQIDNo.4和5的引物進行的30個(96℃，10秒)，退火(55℃，5秒)，延伸(60℃，30秒)的變性循環。用牛腸鹼性磷酸酶(新英格蘭生物實驗室(NewInglandBiolabs))處理該引物延伸產物，除去未結合的二脫氧核苷酸。在ABIPrism3100DNA自動測序儀上對該產物測序。憑藉螢光標記的已結合的二脫氧核苷酸的顏色，檢測β2AR基因的野生型和多態性等位基因。實施例10β2AR基因等位基因變異體的核苷酸序列該β2AR基因等位基因變異體的核苷酸序列是使用實施例2所述的方法得到的。(SEQIDNo.1)5』GTTCGGAGTACCCAGATGGAGACATCCGTGTCTGTGTCGCTCTGGATGCCTCCAAGCCAGCGTGTGTTTACTTTCTGTGTGTGTCACCATGTCTTTGTGCTTCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTCTGGCCGCGTTTCTGTGTTGGACAGGGGTGACTTTGTGCCGGATGGCTTCTGTGTGAGAGCGCGCGCGAGTGTGCATGTCGGTGAGCTGGGAGGGTGTGTCTCAGTGTCTATGGCTGTGGTTCGGTATAAGTCTGAGCATGTCTGCCAGGGTGTATTTGTGCCTGTATGTGCGTGCCTCGGTGGGCACTCTCGTTTCCTTCCGAATGTGGGGCAGTGCCGGTGTGCTGCCCTCTGCCTTGAGACCTCAAGCCGCGCAGGCGCCCAGGGCAGGCAGGTAGCGGCCACAGAAGAGCCAAAAGCTCCCGGGTTGGCTGGTAAGGACACCACCTCCAGCTTTAGCCCTCTGGGGCCAGCCAGGGTAGCCGGGAAGCAGTGGTGGCCCGCCCTCCAGGGAGCAGTTGGGCCCCGCCCGGGCCAGCCCCAGGAGAAGGAGGGCGAGGGGAGGGGAGGGAAAGGGGAGGAGTGCCTCGCCCCTTCGCGGCTGCCGGCGTGCCATTGGCCGAAAGTTCCCGTACGTCACGGCGAGGGCAGTTCCCCTAAAGTCCTGTGCACATAACGGGCAGAACGCACTGCGAAGCGGCTTCTTCAGAGCACGGGCTGGAACTGGCAGGCACCGCGAGCCCCTAGCACCCGACAAGCTGAGTGTGCAGGACGAGTCCCCACCACACCCACACCACAGCCGCTGAATGAGGCTTCCAGGCGTCCGCTCGCGGCCCGCAGAGCCCCGCCGTGGGTCCGCCCGCTGAGGCGCCCCCAGCCAGTGCGCTTACCTGCCAGACTGCGCGCCATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGCGCCTTCTTGCTGGCACCCAATA*GAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTCACGCAGCAAAGGGACGAGGTGTGGGTGGTGGGCATGGGCATCGTCATGTCTCTCATCGTCCTGGCCATCGTGTTTGGCAATGTGCTGGTCATCACAGCCATTGCCAAGTTCGAGCGTCTGCAGACGGTCACCAACTACTTCATCACTTCACTGGCCTGTGCTGATCTGGTC3』實施例11非同義多態性與藥物反應的相關性非同義SNP或多態性定義為「改變的編碼並不相當於野生型序列的胺基酸，即導致了不同胺基酸的編碼區的替換」。這裡本發明人等發現，通過對β2AR基因核苷酸46位的唯一多態性位點的基因分型，可以高可信度地預測印度人種中病人對沙丁胺醇的支氣管擴張反應。幾個哮喘病人(反應者和非反應者)的進一步基因分型顯示出具有與對β2激動劑的變化的反應的顯著關聯性。這些結果組成了單個多態性單獨與對β2激動劑的變化的易感性有關的第一個示例。純合子Arg16和純合子Gly16表現出與印度人種中不良和良好反應的關係(圖1d)。此外，由於其他(Martinez等人，1997)研究使用了很少數的有陽性支氣管擴張反應的ARG16純合子哮喘病人和有負性支氣管擴張反應的哮喘病人，潛在的人種混淆，輕度的兒科哮喘病人，而使其與這裡描述的本發明人的研究之間是沒有可比性的，本發明利用的是具體的印度哮喘病人，更大數量的哮喘病人和具有一定哮喘嚴重程度的成年印度患者。這些申請人沒有發現與印度人種哮喘有關的β2AR基因的SNP。具有AA基因型的病人有0.76的可能性是不良反應者，具有GG基因型的病人有0.72的可能性是良好反應者。印度人種中，反應者對沙丁胺醇的狀況和哮喘病人的β2AR基因基因型密切相關(x2＝11.28，df＝2，p＝0.004)。實施例12為了驗證核苷酸46位的多態性，建立了特定序列寡核苷酸(SSO)的雜交實驗。該實驗基於，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增關注的區域，將該PCR產物印跡在尼龍薄膜上，隨後與放射標記的SEQIDNo.6，7，8和9的引物雜交。使用寡核苷酸引物2和3(SEQIDNo.2和3)通過聚合酶鏈反應擴增來自哮喘病人的DNA。每50μlPCR反應包括在10xPCR緩衝液(含有100mMTris(pH9.0)，500mMKCl，和0.1％明膠)中的DNA200ng，寡核苷酸引物2和3(SEQIDNo.2和3)各20pmol，1.8單位的Taq聚合酶(BangaloreGenei)，和200mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。如上產生的PCR產物各1微升在1％瓊脂糖凝膠上電泳，並轉移到尼龍薄膜上，並且在6XSSPE(NaCl0.9M；NaH2PO470mM；EDTA6mM)，0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)，5XDenhardt’s，和100μg/ml鮭魚精DNA中與核苷酸46位特異性寡核苷酸引物(SEQIDNo.6，7，8和9的放射標記引物)雜交。雜交是在每個寡核苷酸的嚴格的熔解溫度條件下進行的，其由每個標準草案確定。過濾器在室溫下2XSSPE，0.1％SDS中清洗兩次，每次10分鐘，在高於溶解溫度2℃，6XSSPE，1％SDS中清洗一次，並暴露於射線自顯影裝置下。分析曝光的射線照片的雜交點，其由包括46位SNP的序列的PCR產物與放射標記的SEQIDNo.6，7，8和9等位基因特定引物的雜交產生。放射標記的SEQIDNo.6，7，8和9等位基因特定引物的這些結果分別顯示在圖2a，2b，2c，2d中。圖2a和2b中，兩個產物帶(lane)，每幅圖中一個產物帶，表示與SEQIDNo.6和7的等位基因特定引物的雜交點，其證實了核苷酸46位等位基因A的存在，而圖2a和2b中，與SEQIDNo.8和9的等位基因特定引物的雜交點證實了核苷酸46位等位基因G的存在。參考文獻1.Bjermer，L.，Diamant，Z.(2002).Theuseofleukotrienereceptorantagonists(LTRAs)ascomplementarytherapyinasthma.MonaldiArchChestDis.57(1)76-83.2.ChabraS.K.(1998).Epidemiologyofchildhoodasthma.Ind.J.ofChestDiseaseAlliedSci.40179-93.3.Clark，A.G.，MolBioEvol7，111-122，1990.4.Cockcroft，D.W.andSwystun，V.A.(1996).Functionalantagonismtoleranceproducedbyinhaledbeta2agonist.Thorax51，1051-1056.5.DennisS.M.，SharpS.J.，VickersM.R.，etal.(2000).RegularinhaledsalbutamolandasthmacontroltheTRUSTrandomizedtrial.TherapyWorkingGroupoftheNationalAsthmaTaskForceandtheMRCGeneralPracticeResearchFramework.Lancet3551675-96.Dewar，Wheatley，Venn，Morrison，BrittonHall(1998).Beta2-adrenoceptorpolymorphismsareinlinkagedisequilibrium，butarenotassociatedwithasthmainanadultpopulation.ClinicalExperimentalAllergy，28(4)442-448.7.Dewar，J.C.，Wilkinson，J.，Wheatley，A.，N.Thomas，S.(1997).Theglutamine27beta2-adrenoceptorpolymorphismisassociatedwithelevatedIgElevelsinasthmaticfamilies.JournalofAllergyandClinicalImmunology.100(2)261-265.8.Drysdale，ConnieM.，Judson，RichardS.，Liggett，StephenB.，Nandabalan，K.，Stack，CatherineB.，Stephens，J.Claiborne(2002).Associationofbeta2-adrenergicreceptorhaplotypeswithdrugresponse.9.Eh，W.，Walters，J.，Gibson，Mdp(2003).Inhaledlongactingbetaagonistsforstablechronicasthma.CochraneDatabaseSystRev.；4CD001385.10.Green，S.A.(1994).Amino-TerminalPolymorphismsoftheHumanB2-AdrenergicReceptorImpartDistinctAgonist-PromotedRegulatoryProperties.Biochemistry，Vol.33.P.9414-9419.11.Green，S.A.，Turki，J.，Bejarano，P.，Hall，I.P.，andLiggett，S.B.(1995).Influenceofbeta2-adrenergicreceptorgenotypesonsignaltransductioninhumanairwaysmoothmusclecells.Am.J.Respir.CellMol.Biol.1325-33.12.Hoit，B.D.，Suresh，D.P.，Craft，L.，Walsh，R.A.，LiggettS.B.(2000).Beta2-adrenergicreceptorpolymorphismsataminoacid16differentiallyinfluenceagonist-stimulatedbloodpressureandperipheralbloodflowinnormalindividuals.AmHeartJ.139(3)537-42.13.Jeffrey，M.Drazen，EdwinK.SilvermanandTakH.Lee(2000).Heterogeneityoftherapeuticresponsesinasthma.BritishMedicalBulletin561054-1070.14.Johnson，M.(1998)Thebeta-adrenoceptor.AmJRespirCritCareMed.158(5Pt3)S146.15.Kobilka，B.K.，Dixon，R.A.，Frielle，H.G.，Dohlman，M.A.，Bolanowski，I.andSigalI.S.(1987).cDNAforthehumanbeta2-adrenergicreceptoraproteinwithmultiplespanningdomainsandencodedbyagenewhosechromosomallocationissharedwiththatofareceptorforplateletgrowthfactor.Proc.Natl.Acad.Sci8446-50.16.Large，V.，Hellstrm，L.，Reynisdottir，S.，Lnnqvist，F.，Eriksson，P.，Lannfelt，LandArner，P(1997).HumanBeta-2AdrenoceptorGenePolymorphismsAreHighlyFrequentinObesityandAssociatewithAlteredAdipocyteBeta-2AdrenoceptorFurction.J.Clin.Invest.1003005-3013.17.Liggett，S.B.，Wagoner，LE.，Craft，L.L.，Hornung，R.W.，Hoit，B.D.，McIntosh，T.C.andWalsh，R.A(1998).TheIle1642-AdrenergicReceptorPolymorphismAdverselyAffectstheOutcomeofCongestiveHeartFailure.J.Clin.Invest.1021534-1539.18.Martin，R.J.(2003).Consideringtherapeuticoptionsintherealworld.JAllergyClinImmunol.112(5Suppl)S112-115.19.Martinez，F.D.，Graves，P.E.，Baldini，M.，Solomon，S.andErickson，R.(1997).AssociationbetweenGeneticPolymorphismsofthebeta2-AdrenoceptorandResponsetoAlbuterolinChildrenwithandwithoutaHistoryofWheezing.J.Clin.Invest.1003184-3188.20.NationalAsthmaEducationandPreventionProgram(1997)ExpertPanelReportII，GuidelinesfortheDiagnosisandManagementofAsthma，NationalInstitutesofHealthPublication9724051，Bethesda，MD.21.Ohe，M.，Munakata，M.，Hizawa，N.，Itoh，A.，Doi，I.，Yamaguchi，E.，Homma，YandKawakami，Y(1995).Beta2adrenergicreceptorgernerestrictionfragmentlengthpolymorphismandbronchialasthma.Thorax50353-359.22.O′ConnorB.J.，AikmanS.L.，andBarnesP.J.(1992).Tolerancetothenonbronchodilatoreffectsofinhaledbeta2-agonistsinasthma.NEnglJMed3271204-823.Reihsaus，E.，Innis，M.，MacIntyre，NandLiggett，S.B.(1993)Mutationsinthegeneencodingforthebeta2-adrenergicreceptorinnormalandasthmaticsubjects.AmJRespirCellMolBiol.8(3)334-339.24.ScottM.G.H.，SwanC.，WheatleyA.P.，andHallI.P.(1999).Identificationofnovelpolymorphismswithinthepromoterregionofthehumanβ2adrenergicreceptorgene.BrJPharmacol126841-844.25.SukiB.，Frey(2003).Temporaldynamicsofrecurrentairwaysymptomsandcellularrandomwalk.U.JApplPhysiol.95(5)2122-21227.26.Settipane，R.A.(2003).Definingtheeffectsofaninhaledcorticosteroidandlong-actingbeta-agonistontherapeutictargets.AllergyAsthmaProc.Mar-Apr；24(2)85-89.27.28.Sakane，N.，Yoshida，T.，Umekawa，T.，Kogure，A.，Kondo，M.(1999).β2-adrenoceptorgenepolymorphismandobesity.Lancet353(9168)1976.28.Turki，J.，JohnN.Lorenz，StuartA.Green，ElizabethT.Donnelly，MarieJacinto，andStephenB.Liggett.(1996).Myocardialsignalingdefectsandimpairedcardiacfunctionofahumanbeta2-adrenergicreceptorpolymorphismexpressedintransgenicmice.PNAS9310483-10488.29.TurkiJ，PakJ，GreenSA，MartinRJ，LiggettSB(1995).Geneticpolymorphismsofthebeta2-adrenergicreceptorinnocturnalandnonnocturnalasthma.EvidencethatGly16correlateswiththenocturnalphenotype.JClinInvest.95(4)1635-1641.30.Tan，S.，Hall，I.P.，Dewar，J.，Dow，E.，Lipworth，B.(1997).Associationbetweenβ2-adrenoceptorpolymorphismandsusceptibilitytobronchodilatordesensitisationinmoderatelyseverestableasthmatics.Lancet350(9083)995.31.Xu，B.Y.，Huang，D.，Pirskanen，RLefvert，A.K.(2000).Beta2-adrenergicreceptorgenepolymorphismsinmyastheniagravis(MG).ClinicalExperimentalImmunology119(1)Page156.序列表一般信息申請人印度科學工業研究所發明名稱用於檢測和預測對β激動藥的支氣管擴張反應的方法序列的個數9通信地址SEQIDNO1的信息1.序列特徵(A)序列的長度1156bp(B)序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？15』GTTCGGAGTACCCAGATGGAGACATCCGTGTCTGTGTCGCTCTGGATGCCTCCAAGCCAGCGTGTGTTTACTTTCTGTGTGTGTCACCATGTCTTTGTGCTTCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTCTGGCCGCGTTTCTGTGTTGGACAGGGGTGACTTTGTGCCGGATGGCTTCTGTGTGAGAGCGCGCGCGAGTGTGCATGTCGGTGAGGTGGGAGGGTGTGTCTCAGTGTCTATGGCTGTGGTTCGGTATAAGTCTGAGCATGTCTGCCAGGGTGTATTTGTGCCTGTATGTGCGTGCCTCGGTGGGCACTCTCGTTTCCTTCCGAATGTGGGGCAGTGCCGGTGTGCTGCCCTCTGCCTTGAGACCTCAAGCCGCGCAGGCGCCCAGGGCAGGCAGGTAGCGGCCACAGAAGAGCCAAAAGCTCCCGGGTTGGCTGGTAAGGACACCACCTCCAGCTTTAGCCCTCTGGGGCCAGCCAGGGTAGCCGGGAAGCAGTGGTGGCCCGCCCTCCAGGGAGCAGTTGGGCCCCGCCCGGGCCAGCCCCAGGAGAAGGAGGGCGAGGGGAGGGGAGGGAAAGGGGAGGAGTGCCTCGCCCCTTCGCGGCTGCCGGCGTGCCATTGGCCGAAAGTTCCCGTACGTCACGGCGAGGGCAGTTCCCCTAAAGTCCTGTGCACATAACGGGCAGAACGCACTGCGAAGCGGCTTCTTCAGAGCACGGGCTGGAACTGGCAGGCACCGCGAGCCCCTAGCACCCGACAAGCTGAGTGTGCAGGACGAGTCCCCACCACACCCACACCACAGCCGCTGAATGAGGCTTCCAGGCGTCCGCTCGCGGCCCGCAGAGCCCCGCCGTGGGTCCGCCCGCTGAGGCGCCCCCAGCCAGTGCGCTTACCTGCCAGACTGCGCGCCATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGCGCCTTCTTGCTGGCACCCAATA*GAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTCACGCAGCAAAGGGACGAGGTGTGGGTGGTGGGCATGGGCATCGTCATGTCTCTCATCGTCCTGGCCATCGTGTTTGGCAATGTGCTGGTCATCACAGCCATTGCCAAGTTCGAGCGTCTGCAGACGGTCACCAACTACTTCATCACTTCACTGGCCTGTGCTGATCTGGTC3』SEQIDNO2的信息1.序列特徵(A)序列的長度24bp(B)序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？25』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』SEQIDNO3的信息1.序列特徵(A)序列的長度21bp(B)序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？35』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3』SEQIDNO4的信息1.序列特徵(A)序列的長度21bp(B)序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？45』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』SEQIDNO5的信息1.序列特徵序列的長度21bp序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？55』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』SEQIDNO6的信息1.序列特徵序列的長度19bp序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸SEQUENCEID？65』GCACCCAATAGAAGCCATG3』SEQIDNO7的信息1.序列特徵序列的長度19bp序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？75』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』SEQIDNO8的信息1.序列特徵序列的長度19bp序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？85』GCACCCAATGGAAGCCATG3』SEQIDNO9的信息1.序列特徵序列的長度19bp序列的類型DNA2.生物體人工序列3.直接來源合成4.名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸5.SEQUENCEID？95』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』權利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種用於檢測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知和速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(e)對步驟(d)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的、步驟(d)中獲得的PCR產物的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(f)使用具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(e)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(g)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(f)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定的β2AR等位基因變異體的存在，其中所述寡核苷酸引物特異性地與靶SNP或特定的β2AR等位基因變異體雜交，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述患者是人類。3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述β2激動劑是沙丁胺醇。4.根據權利要求1和3所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。6.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的β2激動劑為通過吸入劑釋藥。7.根據權利要求1所述的方法，其中，具有SEQIDNo.2至9合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。8.根據權利要求1所述的方法，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。9.一種檢測哮喘患者的β2AR基因的特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知的而非速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(e)對步驟(d)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或SNP進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(f)使用具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(e)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，其中，步驟(i)至(iii)進行37個循環，(g)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(f)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定的β2AR等位基因變異體的存在，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述患者是人類。11.根據權利要求9所述的方法，其中，所述β2激動劑是沙丁胺醇。12.根據權利要求9和11所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。13.根據權利要求9所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。14.根據權利要求9所述的方法，其中，步驟(a)中的β2激動劑為通過吸入劑釋藥。15.根據權利要求9所述的方法，其中，具有SEQIDNo.2至9的合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。16.根據權利要求9所述的方法，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。17.一種製備用於檢測和預測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的藥物遺傳學標記物的方法，所述方法包括以下步驟(a)設計併合成具有SEQIDNo.2至9的合成的寡核苷酸引物。18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述患者是人類。19.根據權利要求17所述的方法，其中，具有SEQIDNo.2至9的合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。20.用於檢測和預測哮喘患者對β激動劑的支氣管擴張反應的新穎的藥物遺傳學標記物，所述標記物由以下組成(a)具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(b)具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，(c)具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物。21.根據權利要求20所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物檢測β2AR基因的編碼區。22.根據權利要求20所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物檢測反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，從而檢測β2AR基因的特定SNP。23.根據權利要求20所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物檢測正常對照個體和哮喘病人(包括反應者和非反應者)存在SNP或特定等位基因β2AR或基因座變異體。24.根據權利要求20所述的引物，其中，藥物遺傳學標記物的長度在8～24鹼基的範圍。25.根據權利要求20所述的引物，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。26.根據權利要求20所述的引物，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。27.一種用於預測和檢測哮喘病人對β激動劑的支氣管擴張反應的診斷試劑盒，所述試劑盒包括(a)具有SEQIDNo.2和3的第一套寡核苷酸引物，(b)具有SEQIDNo.4和5的第二套引物，和(c)具有SEQIDNo.6，7，8和9的第三套引物。28.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，具有SEQIDNo.2和3的引物適於擴增和檢測β2AR基因編碼區。29.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，具有SEQIDNo.4和5的引物適於擴增和檢測非同義多態性。30.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，第三套寡核苷酸引物適於驗證非同義多態性。31.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，具有SEQIDNo.2至9的合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。32.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。33.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，所述試劑盒用於鑑定適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。34.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，所述試劑盒方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因座單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。35.根據權利要求27所述的試劑盒，其中，被鑑定的非同義多態性或SNP或特定單個β2AR等位基因變異體作為藥物遺傳學標記物發揮作用。36.權利要求1所述的方法的用途，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。37.權利要求1所述的方法的用途，其中，所開發的方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因或基因座的單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。38.權利要求9所述的方法的用途，其中，所述方法用於檢測哮喘患者的β2AR基因的特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)。39.權利要求20所述藥物遺傳學標記物的用途，其為，用於檢測和預測哮喘患者對β激動劑的支氣管擴張反應。40.權利要求27所述的診斷試劑盒的用途，其為，用於預測和檢測哮喘病人對β激動劑的支氣管擴張反應。關於條約第19條對權利要求修改的聲明意見陳述關於2004年6月的書面意見，本申請人等提交以下答覆對比文獻D1鑑定具有對β2AR編碼區多態性調節不良反應的風險的哮喘病人，該多態性影響對受體的特定生物化學和藥理學表型的。該研究稱，與非夜間哮喘相比，Gly16可能在夜間哮喘中過表達。該研究與發明人的β2激動劑給藥是無可比性的，另一方面本發明進行的研究為，給病人服用短效β2激動劑，例如沙丁胺醇，其呈現不同程度的反應，即良好反應者和不良反應者。對比文獻D2揭示了個體核苷酸46位多態性的藥物敏感性，其與本發明公開的關於核苷酸46位的內容相反，本發明中，核苷酸46位的鳥嘌呤而非腺嘌呤與對於沙丁胺醇的更顯著的支氣管擴張反應有關。而且，Martinez等人的研究中，很少數的有陽性支氣管擴張反應的Arg16純合子哮喘病人的使用，0.05的p值，潛在的人種混淆，輕度的兒科哮喘病人，都使其與這裡描述的本發明人的研究之間是沒有可比性的，本發明利用的是更多數的哮喘病人。對比文獻D3是一項此處所述的研究，其利用了更多數的哮喘病人，並且與夜間和非夜間的表型無關。因此，本領域技術人員不能由該研究預測出此處討論的結果。對比文獻D4是，根據長期使用長效β2激動劑後對支氣管擴張脫敏作用的易感性，分析具有變異β2AR表達的β2AR多態性。該研究與本發明人等在此描述的研究是沒有可比性的，本發明使用了更多數的哮喘病人和吸入式短效β2激動劑。短效β2激動劑具有與長效β2激動劑不同的作用模式。因此，本領域的技術人員不能由該研究預測出此處討論的結果。對比文獻D5是中度哮喘患者的沙丁胺醇的藥代動力學-藥效學研究。服用含有8mg沙丁胺醇的口服液後，確定不同時刻的FEV1和沙丁胺醇的血漿濃度。在該研究中，沙丁胺醇誘發的FEV1更高，並且Arg16純合子中的反應比Gly16組的反應更快。這一關於個體的核苷酸46位多態性(AA46)的藥物反應的發現，與本發明人等在此關於核苷酸46位的發現是相反的。即，核苷酸46位的鳥嘌呤而非腺嘌呤與對於沙丁胺醇的更顯著的支氣管擴張反應有關。而且，其給藥方式為口服，與本發明研究的吸入劑是不同的。這使該研究與本發明的研究是沒有可比性的，本發明利用的是更多數的哮喘病人。因此，本領域技術人員不能由該研究預測出此處討論的結果。權利要求1.一種用於預測和檢測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知和速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因或基因座編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(e)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(f)對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的、步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(g)設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(h)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中所述寡核苷酸引物特異性地與靶SNP或特定β2AR等位基因變異體雜交，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述患者是人類。3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述β2激動劑是沙丁胺醇。4.根據權利要求1和3所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。6.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的β2激動劑為通過吸入劑釋藥。7.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(d)中適於擴增β2AR編碼區的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。8.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(g)中適於擴增被檢測的非同義多態性或SNP的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。9.根據權利要求1所述的方法，其中，PCR循環的次數為37。10.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(h)中適於驗證β2AR基因或基因座的SNP或等位基因變異體的寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物。11.根據權利要求1所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。12.根據權利要求1所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。13.根據權利要求1所述的方法，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。14.根據權利要求1所述的方法，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。15.根據權利要求1所述的方法，其中，該先進方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因或基因座的單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。16.一種檢測和預測哮喘患者的β2AR基因的特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知的而非速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(e)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(f)對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或SNP進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(g)設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(h)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換。17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述患者是人類。18.根據權利要求16所述的方法，其中，所述β2激動劑是沙丁胺醇。19.根據權利要求16和18所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。21.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的β2激動劑為通過吸入劑釋藥。22.根據權利要求16所述的方法，其中，步驟(d)中適於擴增β2AR編碼區的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。23.根據權利要求16所述的方法，其中，步驟(g)中適於擴增被檢測的非同義多態性或SNP的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。24.根據權利要求16所述的方法，其中，PCR循環的次數為37。25.根據權利要求16所述的方法，其中，步驟(h)中適於驗證β2AR基因或基因座的SNP或等位基因變異體的寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物。26.根據權利要求16所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。27.根據權利要求26所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。28.根據權利要求16所述的方法，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。29.根據權利要求16所述的方法，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。30.根據權利要求16所述的方法，其中，該先進方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因座的單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。31.一種製備用於檢測和預測哮喘病患者對於β2激動劑的支氣管擴張反應的藥物遺傳學標記物的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過適當途徑給予患者藥學活性劑量的已知和速效的β2激動劑，(b)對哮喘患者對於β2激動劑的表型良好反應者和不良反應者進行鑑定和歸類，(c)從患有哮喘的反應者、非反應者和正常個體的血液樣品中分離基因組DNA，(d)設計併合成能夠擴增與哮喘有關的β2AR基因或基因座編碼區的、具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物，(e)使用SEQIDNo.2和3，擴增表型上屬於反應者和非反應者哮喘病人的基因組DNA，(f)對步驟(e)中獲得的擴增的PCR產物進行測序，並通過與β2AR基因或基因座的已知序列計算比較，對經測序的步驟(e)中獲得的PCR產物的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)進行鑑定，來檢測特定β2AR等位基因變異體，(g)設計具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物，直至步驟(f)中鑑定的非同義多態性或單核苷酸多態性(SNP)的倒數第二位，篩選反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，來檢測β2AR基因座或基因的特定SNP，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中退火後的DNA延伸30秒，(h)使用具有SEQIDNo.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物，驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)中SNP或特定β2AR等位基因變異體的存在，其中哮喘病人中，該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換，和(i)通過步驟(d)，(g)和(h)建立具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物作為藥物遺傳學標記物，用來檢測和預測對於β激動劑的支氣管擴張反應。32.根據權利要求31所述的方法，其中，所述藥物遺傳學標記物與β2AR基因或基因座的單個特定等位基因變異體或單核苷酸多態性(SNP)有關。33.根據權利要求31所述的方法，其中，被鑑定的非同義多態性或SNP或特定的單個β2AR等位基因變異體作為藥物遺傳學標記物發揮作用。34.根據權利要求31所述的方法，其中，所述患者是人類。35.根據權利要求31所述的方法，其中，所述β2激動劑是沙丁胺醇。36.根據權利要求31和35所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇在約100到約250μg的範圍內。37.根據權利要求36所述的方法，其中，所述藥學活性劑量的β2激動劑，沙丁胺醇為約200μg。38.根據權利要求31所述的方法，其中，步驟(a)中的β2激動劑為通過吸入劑釋藥。39.根據權利要求31所述的方法，其中，步驟(d)中適於擴增β2AR編碼區的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。40.根據權利要求31所述的方法，其中，步驟(g)中適於擴增被檢測的非同義多態性或SNP的該寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。41.根據權利要求31所述的方法，其中，PCR循環的次數為37。42.根據權利要求31所述的方法，其中，步驟(h)中適於驗證β2AR基因或基因座的SNP或等位基因變異體的寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物。43.根據權利要求31所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。44.根據權利要求31所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。45.根據權利要求31所述的方法，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。46.根據權利要求31所述的方法，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。47.根據權利要求31所述的方法，其中，該先進方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因或基因座的單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。48.一種用於檢測和預測哮喘患者對β激動劑的支氣管擴張反應的新穎的藥物遺傳學標記物，所述標記物由以下組成(a)具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物(b)具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物(c)具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物。49.根據權利要求48所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物能夠擴增β2AR基因的編碼區。50.根據權利要求48所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物能夠篩選和鑑定反應者和非反應者哮喘個體的46位多態性(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)，從而檢測β2AR基因的特定SNP。51.根據權利要求48所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物能夠驗證正常對照個體和哮喘病人(包括反應者和非反應者)存在SNP或特定等位基因β2AR或基因座變異體。52.根據權利要求48所述的標記物，其中，具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物能夠驗證，哮喘病人中，靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換和作為藥物遺傳學標記物靶體發揮作用。53.根據權利要求48所述的引物，其中，所述患者是人類。54.根據權利要求48所述的引物，其中，具有SEQIDNo.2和3的寡核苷酸引物具有以下特徵(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。55.根據權利要求48和50所述的引物，其中，進行使用PCR藉助具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物篩選的過程，所述過程包括(a)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(b)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(c)60℃，將步驟(ii)中的退火DNA延伸30秒，56.根據權利要求48所述的引物，其中，PCR循環的次數為37。57.根據權利要求48所述的引物，其中，具有SEQIDNo.4和5的寡核苷酸引物具有以下特徵(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。58.根據權利要求48所述的引物，其中，具有SEQIDNo.6，7，8和9的寡核苷酸引物具有以下特徵(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物59.根據權利要求48所述的引物，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。60.根據權利要求48所述的引物，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。61.根據權利要求48所述的引物，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。62.根據權利要求48所述的引物，其中，所述方法用於開發適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。63.一種用於預測和檢測哮喘病人對β激動劑的支氣管擴張反應的診斷試劑盒，所述試劑盒包括(a)用於β2AR基因標記物區擴增的、具有SEQIDNo.2和3的第一套寡核苷酸引物，(b)用於非同義多態性或單核苷酸多態性(AGA至GGA)基因分型的、具有SEQIDNo.4和5的第二套引物，所述過程包括下述PCR條件(i)96℃，將分離得到的DNA變性10秒，(ii)55℃，使用SEQIDNo.4和5的引物對步驟(i)中變性的DNA退火5秒，(iii)60℃，將步驟(ii)中的退火DNA延伸30秒，(c)用於驗證正常對照個體和步驟(g)中獲得的哮喘病人(包括反應者和非反應者)存在SNP或特定β2AR等位基因變異體的、具有SEQIDNo.6，7，8和9的第三套引物，其中該靶SNP或特定β2AR等位基因變異體具有哮喘病人β2AR基因或基因座的46位(其與本發明公開的每個SEQIDNo.1的鹼基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替換並作為藥物遺傳學標記物發揮作用。64.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，該試劑盒進一步包括使用該寡核苷酸和以β2AR基因變異體AA或GG基因型為基礎的反應類型歸屬的用法說明書。65.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，適於擴增β2AR編碼區的第一套寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3』(SEQIDNo2正向引物)(b)5』ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQIDNO3反向引物)。66.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，適於擴增被檢測的非同義多態性或SNP的第二套寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3』(SEQIDNO4)正向引物(b)5』CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3』(SEQIDNO5)反向引物。67.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，PCR循環的次數為37。68.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，適於驗證β2AR基因或基因座的SNP或等位基因變異體的第三套寡核苷酸引物選自組成如下的組(a)5』GCACCCAATAGAAGCCATG3』(SEQIDNO6)正向引物(b)5』CATGGCTTCTATTGGGTGC3』(SEQIDNO7)反向引物(c)5』GCACCCAATGGAAGCCATG3』(SEQIDNO8)正向引物(d)5』CATGGCTTCCATTGGGTGC3』(SEQIDNO9)反向引物。69.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在5～100鹼基的範圍。70.根據權利要求70所述的方法，其中，合成的寡核苷酸引物和探針的長度在8～24鹼基的範圍。71.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，基因型GG與對沙丁胺醇的良好反應者有關，基因型AA與對沙丁胺醇的不良反應者有關。72.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，所述試劑盒用於鑑定適合非反應者哮喘病人的、用於引發支氣管擴張的治療劑。73.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，該試劑盒方法提供了用於預測和檢測人類β2AR基因座單個等位基因變異體的標記物、引物和探針。74.根據權利要求63所述的試劑盒，其中，被鑑定的非同義多態性或SNP或特定單個β2AR等位基因變異體作為藥物遺傳學標記物發揮作用。全文摘要本發明涉及用於預測個體對β激動劑的支氣管擴張反應的方法。本發明特別涉及β2AR基因的特定等位基因變異體的檢測和它們作為對β激動劑反應的藥物遺傳學標記物的用途。文檔編號C12Q1/68GK1985005SQ200480043197公開日2007年6月20日申請日期2004年4月29日優先權日2004年4月29日發明者裡圖什裡·庫克雷提,帕拉·巴特那加,錢德裡卡·勞,巴爾拉姆·高希,薩米爾·庫馬·布拉馬查裡,蘭迪普·古勒裡亞,奇莫伊·達斯申請人:印度科學工業研究所,印度尼古拉斯皮拉瑪有限公司