免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法

2023-06-10 14:29:26

免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法，其基於液相色譜串聯質譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨特選擇識別性，能快速、簡便、高效測定海洋生物中的河豚毒素。
【專利說明】免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河 豚毒素的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種河豚毒素的檢測方法，特別涉及一種免疫親和柱淨化-液相色 譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法。

【背景技術】
[0002] 河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX)是一種天然海洋生物神經毒素，分布廣泛，主要存 在於河豚魚中，圓尾鱟、藍環章魚、螺類等其他動物體內也有存在。河豚毒素毒性極強，食用 〇. 5mg就可致人死亡，其帶正電荷的胍基能伸入鈉通道的離子選擇過濾器，和通道內壁上的 游離羧基結合，阻礙鈉離子進入，從而抑制神經衝動的傳導，使人感覺神經麻痺，四肢癱瘓， 呼吸困難，最後因呼吸抑制而死亡。我國每年都有因食帶有TTX的海洋生物而導致中毒的 事件發生。鑑於河豚毒素的嚴重危害，有必要建立一種簡便、能有效檢測河豚毒素的方法。
[0003] 目前，河豚毒素的檢測方法有生物測定法、高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜串聯 質譜法（LC-MS)及酶聯免疫法（ELISA)等。其中生物測定法一般需要專門動物，適用性差， 且操作繁瑣，費時費力重複性差；酶聯免疫法雖特異性強，但酶聯免疫反應耗時長，操作難 度較大；液相色譜串聯質譜法靈敏度高，但現有的文獻方法檢出限偏高，前處理複雜，且採 用的固相萃取技術淨化樣品不理想、易受基質幹擾，回收率低。免疫親和柱（IAC)是一種基 於抗原抗體反應的新型層析柱，利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結 合的特性製作而成，具有獨特的選擇專一性和良好的吸附淨化性能。目前，尚未有以免疫親 和柱作為前處理淨化手段檢測河豚毒素的相關報導。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在於提供一種免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物 中河豚毒素的方法，其基於液相色譜串聯質譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨 特選擇識別性，能快速、簡便、高效測定海洋生物中的河豚毒素。
[0005] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案是： 一種免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以 下步驟： (1) 樣品處理：準確稱取已充分均質樣品2. OOg於50mL具塞離心管中，加入IOmL含有 1 %乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，6(TC水浴超聲提取15min，冷卻至室溫後，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調節PH至7?8,得樣品液； (2) 免疫親和柱淨化：免疫親和柱上樣品液，上樣結束後，用水淋洗親和柱，擠幹柱內 殘留液，並棄去以上全部流出液，最後用含有1 %乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液於 60°C氮氣吹乾，用ImL流動相定容溶解得淨化液； (3) 液相色譜-質譜分析：淨化液經濾膜過濾後供液相色譜-串聯質譜儀測定獲得河 豚毒素的峰面積，將峰面積代入標準曲線分析計算，從而獲得樣品中河豚毒素的含量。
[0006] 本發明開發了獨特的樣品處理工藝及製備了對TTX獨特選擇識別性的免疫親和 柱，配合優化的液相色譜-質譜分析方法，能快速、簡便、高效測定海洋生物中的河豚毒素 作為優選，步驟（2)中流動相配比為：含0. 1%甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液：乙腈= 5% :95%。
[0007] 作為優選，步驟（3)中色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；樣品室 溫度KTC;柱溫40°C;進樣體積10 μ L ;流速0. 3mL/min ;流動相A為含0. 1 %甲酸的5mmol/ L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫：0?I. 5min，5 %?80% A ; L 5?3. Omin, 80% A ;3· 0? 3. 5min，80%?5% A ;3· 5 ?5min，5% Α。
[0008] 作為優選，步驟（3)中質譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測方式：多反應 監測；毛細管電壓：3. OkV ;離子源溫度：110°C ;脫溶劑氣溫度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ; 脫溶劑氣流量：600L/h。
[0009] 作為優選，步驟（3)中標準曲線的製作方法為：配製濃度為0. 3μ g/L、l. 0μ g/L、 2. 0 μ g/L、5. 0 μ g/L、10. 0 μ g/L和20. 0 μ g/L的標準工作溶液，以TTX濃度為橫坐標，峰面 積為縱坐標，製作標準曲線。
[0010] 作為優選，所述免疫親和柱的製備方法為： A、抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入IOmg的BSA，2mL 0· 05M ρΗ7· 4乙酸鈉緩衝液，Img的TTX，60 μ L 的37% (質量濃度）的甲醛，混勻，37°C攪拌48h。然後用0. IM ρΗ7. 3的PBS緩衝液，於 4°C透析3天，每天換液2次，免疫原TTX-BSA ;此抗原用作免疫。
[0011] 檢測原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測原TTX-0VA，用於ELISA實驗的包被。
[0012] B、單克隆抗體製備及純化 取5隻，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點注射TTX-BSA，20 μ g/只，免疫4 周后開始加強免疫，每隔2周加強免疫1次；初次免疫時，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強免疫時用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變； 第2次加強免疫10天後，取小鼠尾靜脈血檢測，包被TTX-0VA，用間接競爭ELISA法檢 測血清的效價，選擇效價最高的BALB/c小鼠用於製備雜交瘤細胞，融合前3天小鼠腹腔加 強免疫一次，取效價最高的BALB/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合，篩選獲得雜交瘤 細胞； BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天後向小鼠腹腔內注射I X IO7個雜交瘤 細胞，10天後開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之後每隔1天抽取腹水1次，離心，收集上 清液，採用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進一步純化獲得TTX單克 隆抗體； C、親和柱製備 稱取0· 5g CNBr活化的S印harose 4B乾粉用IOOmL IM HCl溶脹，並洗滌；再用IOOmL 偶聯緩衝液（〇· Imol · L-1NaHCO3A. 5mol · L-1NaCl, ρΗ8· 3)洗滌得凝膠； 取I. 5mL溶脹後的凝膠，加入I. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振蕩 偶聯反應2h，抽濾，並用30mL偶聯緩衝液洗滌凝膠，抽濾，加入IOmL封閉緩衝液 (0· Imol .L-ITris-HCLpH 8.0)，室溫振蕩反應 2h，抽濾，再用 100mLPBS(0.01M ρΗ7·3) 緩衝液洗滌凝膠，並轉移到5mL柱管中，加入含有0. 05 %硫柳汞及0. 05% BSA的0. OlM pH7. 3PBS溶液，於2?8°C儲存。
[0013] 作為優選，偶聯緩衝液組成為：0· lmol/L NaHC03,0. 5mol/L NaCl，ρΗ8· 3。
[0014] 作為優選，封閉緩衝液為0· lmol/L的Tris-HCl，pH 8· 0。
[0015] 本發明的有益效果是：本發明基於液相色譜串聯質譜的高靈敏性和精確性，利用 免疫親和柱的獨特選擇識別性，能快速、簡便、高效測定海洋生物中的河豚毒素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是TTX -級質譜全掃描圖。
[0017] 圖2是提取試劑酸度對TTX提取效果的影響。
[0018] 圖3是樣品液PH對樣品中TTX的回收率的影響。
[0019] 圖4是10 μ g/kg加標陰性樣品經免疫親和柱淨化後的MRM圖譜。
[0020] 圖5是0· 3 μ g/mL的TTX標準溶液的MRM圖。

【具體實施方式】
[0021] 下面通過具體實施例，並結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0022] 本發明中，若非特指，所採用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0023] 儀器和試劑 ACQUITY超高效液相色譜-串聯質譜儀Quattro Premier XE (美國Waters公司）；MS2 漩潤混合器（德國IKA公司）；氮氣吹乾儀（美國Organomatio公司）；Centrifuge5810高 速離心機（德國Eppendorf公司）；12通道固相萃取裝置（美國supelco公司）。 TTX標準品（純度彡98. 0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國 Merck公司）；乙酸銨、甲酸（美國Sigma公司）；乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二 氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（上海國藥集團）；實驗用水均為超純水。
[0024] 溶液的配製 (I)TTX標準溶液：準確稱取5, OOmgTTX標準品，用含有0. 1 %甲酸乙腈-水溶液（1 : I(VV))溶解定容至50mL，4°C避光保存，保存期限為6個月；使用時逐級用含有0. 1%甲酸 乙腈-水溶液（I :1(V/V))稀釋至100ng/mL。
[0025] (2)磷酸鹽緩衝液（PBS):分別稱取十二水合磷酸氫二鈉6. 45g，二水合磷酸二氫 鈉I. 〇9g，氯化鈉4. 25g，用水溶解並定容至500mL。
[0026] 實施例： 一種免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以 下步驟： (1)樣品處理：準確稱取已充分均質樣品2. OOg於50mL具塞離心管中，加入IOmL含有 1 %乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，6(TC水浴超聲提取15min，冷卻至室溫後，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調節PH至7?8,得樣品液。
[0027] (2)免疫親和柱淨化：免疫親和柱上樣品液，上樣結束後，用水淋洗親和柱，擠幹 柱內殘留液，並棄去以上全部流出液，最後用含有1%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液 於601：氮氣吹乾，用11^流動相（含0.1(%甲酸的5111111〇1/1乙酸銨溶液 ：乙腈=5(%:95(%) 定容溶解得淨化液。
[0028] 免疫親和柱的製備方法為： A、抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入IOmg的BSA，2mL 0· 05M ρΗ7· 4乙酸鈉緩衝液，Img的TTX，60 μ L 的37% (質量濃度）的甲醛，混勻，37°C攪拌48h。然後用0. IM ρΗ7. 3的PBS緩衝液，於 4°C透析3天，每天換液2次，免疫原TTX-BSA ;此抗原用作免疫。
[0029] 檢測原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測原TTX-0VA，用於ELISA實驗的包被。
[0030] B、單克隆抗體製備及純化 取5隻，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點注射TTX-BSA，20 μ g/只，免疫4 周后開始加強免疫，每隔2周加強免疫1次；初次免疫時，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強免疫時用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變。
[0031] 第2次加強免疫10天後，取小鼠尾靜脈血檢測，包被TTX-0VA，用間接競爭ELISA 法檢測血清的效價，選擇效價最高的BALB/c小鼠用於製備雜交瘤細胞，融合前3天小鼠腹 腔加強免疫一次，取效價最高的BALB/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合，篩選獲得雜 交瘤細胞（現有常規方法）。
[0032] BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天後向小鼠腹腔內注射I X IO7個雜 交瘤細胞，10天後開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之後每隔1天抽取腹水1次，離心，收 集上清液，採用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進一步純化獲得TTX 單克隆抗體。
[0033] C、親和柱製備 稱取0· 5g CNBr活化的S印harose 4B乾粉（市售）用IOOmL IM HCl溶脹，並洗滌；再 用 IOOmL 偶聯緩衝液（0· Imol .L-1NaHOVO. 5mol .L-1NaCl, ρΗ8· 3)洗滌得凝膠（已溶脹）。
[0034] 取I. 5mL溶脹後的凝膠，加入I. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振 蕩偶聯反應2h，抽濾，並用30mL偶聯緩衝液洗滌凝膠，抽濾，加入IOmL封閉緩衝液 (0· Imol .L-ITris-HCl，pH 8.0)，室溫振蕩反應 2h，抽濾，再用 IOOmLPBS ((XOlM ρΗ7· 3) 緩衝液洗滌凝膠，並轉移到5mL柱管中，加入含有0.05%硫柳汞及0.05% BSA的0. OlM pH7. 3PBS溶液，於2?8°C儲存。
[0035] (3)液相色譜-質譜分析： 色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；樣品室溫度KTC ;柱溫40°C ;進樣 體積10 μ L ;流速0. 3mL/min ;流動相A為含0. 1 %甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈， 梯度洗脫：〇 ?I. 5min，5%?80% A ;1· 5 ?3. 0min，80% A ;3· 0 ?3. 5min，80%?5% A ; 3. 5 ?5min，5% A0
[0036] 質譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測方式：多反應監測；毛細管電壓： 3. OkV ;離子源溫度：110°C ;脫溶劑氣溫度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ;脫溶劑氣流量： 600L/h。
[0037] 錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質譜多反應監測實驗條件如表1 所示。
[0038] 表1河豚毒素的質譜多反應監測實驗條件

【權利要求】
1. 一種免疫親和柱淨化-液相色譜-串聯質譜測定海洋生物中河豚毒素的方法，其特 徵在於，包括以下步驟： (1) 樣品處理：準確稱取已充分均質樣品2. OOg於50mL具塞離心管中，加入10mL含有 1%乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，60°C水浴超聲提取15min，冷卻至室溫後，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調節PH至7?8,得樣品液； (2) 免疫親和柱淨化：免疫親和柱上樣品液，上樣結束後，用水淋洗親和柱，擠幹柱內 殘留液，並棄去以上全部流出液，最後用含有1 %乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液於 60°C氮氣吹乾，用lmL流動相定容溶解得淨化液； (3) 液相色譜-質譜分析：淨化液經濾膜過濾後供液相色譜-串聯質譜儀測定獲得河 豚毒素的峰面積，將峰面積代入標準曲線分析計算，從而獲得樣品中河豚毒素的含量。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2)中流動相配比為：含0.1 %甲酸 的5mmol/L乙酸銨溶液：乙腈=5% :95%。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（3)中色譜條件為：色譜柱： ACQUITYUPLC BEH Amide 柱；樣品室溫度 KTC;柱溫40°C;進樣體積 10 y L ;流速0. 3mL/min ; 流動相A為含0. 1%甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫：0?1.5min，5%? 80% A ;1. 5 ?3. 0min，80% A ;3. 0 ?3. 5min，80%?5% A ;3. 5 ?5min，5% A。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（3)中質譜條件為：電噴霧離子源， 正離子掃描；檢測方式：多反應監測；毛細管電壓：3. OkV ;離子源溫度：11(TC ;脫溶劑氣溫 度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ;脫溶劑氣流量：600L/h。
5. 根據權利要求1-4任意一項所述的方法，其特徵在於：步驟（3)中標準曲線的製作 方法為：配製濃度為 〇? g/L、l. Oil g/L、2. Oil g/L、5. Oil g/L、10. Oil g/L 和 20. Oil g/L 的 標準工作溶液，以TTX濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，製作標準曲線。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述免疫親和柱的製備方法為： A、 抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入l〇mg的BSA，2mL 0? 05M pH7. 4乙酸鈉緩衝液，lmg的TTX，60 ii L 的37%的甲醛，混勻，371：攪拌4811，然後用0.說？117.3的？85緩衝液，於41：透析3天，每 天換液2次，免疫原TTX-BSA ; 檢測原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測原TTX-0VA ; B、 單克隆抗體製備及純化 取5隻，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點注射TTX-BSA，20 y g/只，免疫4 周后開始加強免疫，每隔2周加強免疫1次；初次免疫時，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強免疫時用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變； 第2次加強免疫10天後，取小鼠尾靜脈血檢測，包被TTX-0VA，用間接競爭ELISA法檢 測血清的效價，選擇效價最高的BALB/c小鼠用於製備雜交瘤細胞，融合前3天小鼠腹腔加 強免疫一次，取效價最高的BALB/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合，篩選獲得雜交瘤 細胞； BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天後向小鼠腹腔內注射1 X 107個雜交瘤 細胞，10天後開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之後每隔1天抽取腹水1次，離心，收集上 清液，採用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進一步純化獲得TTX單克 隆抗體； C、親和柱製備 稱取0? 5g CNBr活化的S印harose 4B乾粉用100mL 1M HC1溶脹，並洗滌；再用100mL 偶聯緩衝液洗滌得凝膠； 取1. 5mL溶脹後的凝膠，加入1. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振蕩偶聯反應 2h，抽濾，並用30mL偶聯緩衝液洗滌凝膠，抽濾，加入10mL封閉緩衝液，室溫振蕩反應》1， 抽濾，再用1〇〇1111^85緩衝液洗滌凝膠，並轉移到51^柱管中，加入含有0.05%硫柳汞及 0? 05% BSA 的 0? 01M pH7. 3PBS 溶液，於 2 ?8°C儲存。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於：偶聯緩衝液組成為：0. lmol/L NaHC03， 0?5mol/L NaCl，pH8. 3。
8. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於：封閉緩衝液為0. lmol/L的Tris-HCl， pH8. 0〇
【文檔編號】G01N30/06GK104391061SQ201410603308
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】張小軍, 王瑩, 倫麗麗 申請人:浙江省海洋水產研究所, 江蘇美正生物科技有限公司