光譜學分子染料的製作方法
2023-06-11 04:08:56
專利名稱：光譜學分子染料的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種光譜學中使用的分子染料。該發明特別涉及一種使用例 如拉曼散射等光散射的分光鏡技術中使用的染料。
背景技術：
已知有許多檢測分析物分子的作用或存在的技術。這些技術的其中之一
利用了拉曼散射(Raman scattering, RS)效應。當光線從分子散射時，大部 分的光子被彈性散射。絕大多數被散射的光子具有與入射光子相同的能量 (並且因此具有相同的頻率和波長)。然而，該光線的小部分(約107個光子 中的一個)的散射頻率與入射光子的頻率不同。當被散射的光子損失能量給 分子時，該光子具有比入射光子更長的波長(被稱為斯託克斯散射(Stokes scatter))。相反地，當被散射的光子獲得能量後，該光子具有較短的波長(被 稱為反斯託克斯光散射(anti-Stokes scatter))。通常地，斯託克斯光散射為 較強的效應。
產生這種非彈性散射的過程被稱為拉曼效應，是以在1928年第一位描 述這種非彈性散射的C.V.拉曼先生命名的。非彈性散射與分子的振動、旋轉 或電子能的變化有關，並伴隨通常作為熱被散逸的能量從光子傳遞到分子。 入射光子和拉曼散射光子間的能量差等於散射分子的振動態或電子躍遷的 能量，使被散射光子與入射雷射的量子化能量不同。被散射的光的強度與能 量或者波長差的曲線被稱為拉曼光譜，並且該技術被知悉為拉曼光譜學 (RS)。
表面增強拉曼光譜(SERS)是RS分析技術的一種變體。如果分子在位 置上接近於特定金屬表面，由於分子和金屬的表面電子(等離子激元
(plasmons))之間的附加能量傳遞，拉曼信號的強度能夠被極大地增加。為 了進行SERS,所述分析物分子被吸附在原子級的粗糙金屬表面並檢測到增 強的拉曼散射。還能夠使用溶液中的銀膠(silver colloids)進行SERS。
數埃金屬表面內的分子或離子中的拉曼散射能高於在溶液中的拉曼散 射的103-106倍。在可見波長附近，SERS在銀上最強，但在金、銅和鋁上易 於觀察。目前的研究已表示許多其它的金屬也可以引起有效的SERS增強。
所述SERS效應本質上是在分子和金屬表面附近的電磁場之傳遞間的共 振能。激發雷射的電矢量在金屬表面感應出偶極子，並且回復力造成該激發 態下的共振頻率的振蕩電磁場。所述共振的強度和頻率主要由金屬(等離子 激元(plasmons))表面的決定所謂等離子激元波長的自由電子，以及金屬的 介電常數和環境所決定。吸附或者緊鄰在表面上的分子處於特大的電磁場 內，該電磁場中曲面法線上的耦合的振動模式被最大地增強。這是表面等離 子體共振(SPR)效應，該效應使貫穿空間(through-space)的能量在所述 等離子激元和所述表面附近的分子之間傳遞。由於能量傳遞的效率依賴於激 光波長和金屬的等離子體波長之間良好的配合，所述表面等離子體共振效應 的強度由包括入射光光的波長和金屬表面的形態等諸多因素決定。
為了更進一步地增加這種增強，可以使用發色團部分提供提升能量傳遞 的附加的分子共振，該技術被稱為表面增強共振拉曼光譜(SERRS)。共振 拉曼峰的強度與分子的散射截面的平方成比例。相應地，所述散射截面與躍 遷偶極矩(transition dipole moment)的平方有關，並因而通常遵循吸收光譜。 若入射光子具有的能量接近於它們的吸收光譜中的吸收峰，當散射事件發生 時，該分子則更傾向於處於激發態，因此增加了所述反斯託克斯信號的相對 強度。表面和共振增強效應的結合意味著SERRS能提供巨大的信號增強， 典型地為傳統拉曼光譜的109-1014倍。
除了拉曼散射的共振增強外，目前還存在共振削弱描述，其中所述拉曼
信號的強度通過共振能量轉移(resonance energy transfer)機理而被降低。在 具體條件下，具有接近所需的能量的激發能態能夠引起拉曼散射的下降。在 這種情況下，拉曼強度與總的截面的平方成比例，並且如果這些截面異號則 能發生相消幹擾，使得能夠觀察到共振削弱。這提供了另一種拉曼基檢測器 系統中使用的度量(metric):通過使用提升這種削弱效應的雷射頻率可以將 來自特定拉曼活性的發色團的信號選擇性地從拉曼光譜中去除。
表面增強拉曼光譜及其範圍和表面增強共振拉曼光譜作為定量生物分 析工具得到普及。上述兩種技術在很大程度上都依賴於在金屬(等離子激元) 表面的移動的導電電子的等離子體和接近該表面的分子種類之間的相互作 用。這種相互作用導致特定的振動能量下的拉曼散射極大的增強，在拉曼散 射光下產生出強烈的光譜信號。
迄今為止，圍繞對這種增強的機理的理解還存在有爭議。兩種主要觀點 對大於106的增強因素在化學增強機理和電磁增強機理之間的劃分存在分 歧。現在被認為提升了 102的增強因素的化學增強機理，聲稱在金屬和被吸 附分子之間產生了電荷遷移態。這種機理依賴於位點特異性和分析物。所述 分子必須被直接吸附在表面上以進行化學增強。所述電磁增強機理提升了高 於正常拉曼散射104倍的增強。為了理解電磁增強，必須考慮到表面納米級 (nanoscale)粗糙特徵的大小、形狀及其材料。如果波長合適的光衝擊金屬 的粗糙特徵，導電電子的等離子體將共同振蕩。因為這種共同振蕩被局限在 電子等離子體的表面上，己作為局域表面等離子體共振(LSPR)而被知曉。 所述LSPR使得共振波長被吸收和分散，在粗糙特徵周圍產生大的電磁場。 若分子被置於該電磁場內，可以測量到增強的拉曼信號。
場的強度和局域密度由各種參數決定。散射光的波長決定了它的能量， 而金屬的構成和形態決定了強度和效率，在該強度和效率下表面等離子激元 耦合至光子能量。例如金屬的相對介電性質和分析物溶液等其它因素，也有
力地促進了該效應。另外，在場和任何接近金屬表面的分子之間的能量傳遞 的效率還由分子自身的共振能態決定，包括，例如在紅外光譜區的^^定振動
模式和在紫外線下的電子躍遷能。這是SERRS在傳統的SERS上得以實現 的機理。
我們已經意識到拉曼散射效應中的問題與瑞利散射(Rayldgh scattering)(其中散射的光子具有與入射光子相同的能量)相比，即使採用 表面增強拉曼散射(SERS)，拉曼散射也提供小量的拉曼散射輻射。我們更 進一步地意識到，由於拉曼信號因而弱於噪音，需要引入幫助區分拉曼信號 和噪音的方法。
發明內容
權利要求書中闡述了本發明，所述權利要求書在此引用作為參考。
本發明的一種實施方式使用了 SERRS活性的標記基團(labelling group),所述標記組基於過渡金屬離子和合適的配體基團之間形成配位配合 物以生產在拉曼光譜中使用的染料。
選擇所述金屬離子和合適的配體基團，以使所述配體能發生從形成配合 物時配體的激發態到增強的非輻射衰減/馳豫，該配體在其自由態下通常是熒 光的，因此形成強的發色團，同時降低背景螢光中的拉曼信號的幹^t閉，並 通過能量傳遞機理增強拉曼散射。通過所述配體和離子之間的靜電吸引或通 過疏水引力可以形成配合物。
發色團無疑為本領域技術人員所公知，並被使用於此以覆蓋具有特定光 學特性的基團。術語"染料"涉及一種發色團，該發色團使一個或多個連接 基團連接以提供某種官能度。可以由例如加入親金屬表面基團(metal surface seeking group),或能夠連接至分析物的基團而導致所述官能度。所述發色團 應該有力地吸附具有適於表面增強波長的激發雷射(最普遍的拉曼雷射為
514納米、532納米和785納米)。這在綠-紅可見範圍內，因此傳統的鮮豔 色彩的發色團作為特別良好的拉曼活性染料的要素而被發現。
分析物為任何需要檢測或量子化的化學物質。合適的分析物的例子包
括生物分子(例如蛋白質、抗體、核酸、碳水化合物、蛋白多糖、月旨質或
荷爾蒙)、藥物製劑或其它治療劑以及他們的代謝產物、濫用藥品(drugs of abuse)(例如苯丙胺、阿片、苯二氮類、巴比妥、大麻素、古柯鹼、麥角醯 二乙胺以及他們的代謝產物)、炸藥(例如硝化甘油和硝基甲苯包括三硝基 甲苯(TNT)、三次甲基三硝基胺(RDX)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和 環四甲撐四硝胺(HMX))、以及環境汙染物(例如除草劑、殺蟲劑)。
分析物樣品為任何需要測定存在或含量的分析物的樣品。有許多需要測 定分析物存在、不存在或含量的情況。例子包括臨床應用(例如在例如血樣 或者尿樣等生物樣品中檢測抗原或抗體的存在)、檢測濫用藥品的存在(例 如在違禁樣品中，或在例如體液樣品或呼吸樣品等生物樣品中)、檢測炸藥， 或檢測環境汙染物(例如在液體、空氣、土壤或植物樣品中)。
除了直接檢測分析物自身以外，還可以通過使用報告分子(report molecules)間接地檢測分析物，所述報告分子在目標分析物的存在下能夠產 生可測拉曼信號變化。該方法的一個例子將是可染料標記的肽從分析物-特 定抗體的抗原結合位點上的置換，因此釋放出能隨後與SERRS活性金屬表 面互相作用的自由報告分子。對於本發明的目的，這種報告分子也可以視為 "分析物"。
所述染料可以通過篩選劑(selective agent)而結合到分析物上，所述篩 選劑為在分析物樣品的其它組分存在下，並且在檢測方法進行的條件下，選 擇性地結合至分析物，從而能夠檢測到所述分析物在樣品中的存在(或含量) 的任何試劑。所述篩選劑的性質將當然地依賴於分析物的特性。在多數情況 下，所述篩選劑為抗體。然而，可以使用其它合適的分析物結合對。例如，
如果所述分析物為抗體，所述篩選劑可以為被抗體選擇性地結合的抗原或抗 原衍生物。若所述分析物為核酸，所述篩選劑可以為與該分析物核酸雜交的 核酸或核酸類似物。
術語"抗體"被應用於此以包括抗體、或片段(例如Fab片段、Fd片 段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、單鏈Fv分子或CDR區)、或能選擇 性結合分析物以檢測到該分析物的抗體或片段的衍生物。
所述分析物本身可以為本徵拉曼活性的(intrinsically Raman-active),這
是可能的。在該實施方式中，所述染料可以與所述分析物化學地相同。
通常地，希望染料的組分能通過單獨的連接子被連接在一起。對本領域 技術人員來說，有許多可以使用的合適的連接子是顯然的。所述連接子的特 性將依賴於所述染料組分的特性。若所述連接子與傳統的肽鏈化學相容，則 當所述篩選劑結合基團含有肽時是有利的。例如，所述連接子可以優選含有 單個羧酸基團以與肽的N末端反應。
在某些情況下，依賴於所使用的特定組分，例如通過染料不同組分的化 學基團之間的反應，可以不使用單獨的連接子就可能可以將兩種或更多的染 料組分連接在一起。
所述染料組分可以以任何順序被連接在一起，如果所述染料通過金屬表 面結合基團被連接到表面上，該染料在靠近所述金屬表面的的區域內。
染料中的金屬表面結合基團應該為優先結合(典型地通過吸附)至金屬 表面上的基團。在某些情況下，希望金屬表面結合基團足夠有力地結合至金 屬表面以將所述染料固定在金屬表面。所述金屬表面結合基團的化學性質將 依賴於所使用的金屬表面。合適的銀結合官能團包括具有氮雜環的基團，例 如噁唑、噻唑、二唑、三唑、噁二唑、噻二唑、口惡三唑(oxathiazoles)、噻 三唑、苯並三唑、四唑、苯並咪唑、卩引唑、異吲唑、苯並二唑或苯並異二唑。 其它合適的官能團包括胺、醯胺、巰基、硫酸鹽、硫代硫酸鹽、磷酸鹽、硫
代磷酸酯、羥基、羰基、羧酸鹽、和硫代氨基甲酸酯。胺基酸例如半胱氨酸、 組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺或精氨酸也能進行 銀結合。
本發明的實施方式將僅通過實施例的方式，並結合附圖進行說明，其中:
圖1表示了可以在有機分子中發生的各種電子激發；
圖2表示了涉及螢光和磷光的電子躍遷能(electronic energy transition);
圖3表示了涉及拉曼散射的電子躍遷能；
圖4表示了各種d軌道；
圖5A表示了八面體分子排布；
圖5B表示了與八面體排布相關的d軌道能級的變化； 圖6A表示了四面體分子排布；
圖6B表示了與四面體排布相關的d軌道能級的變化； 圖7A表示了正方平面分子排布；
圖7B表示了與正方平面排布相關的d軌道能級的變化； 圖8表示了典型的有機分子(菲咯啉)的電子能級和金屬離子/有機配 體的配合物的電子能級；
圖9表示了水溶液中的菲咯啉的發射光譜；
圖10表示了在532納米波長的光照下，加入了銀膠的水溶液中的 [Fe(Phen)3產的發射光譜；
圖11表示了三-l,10-菲咯啉鐵(II) [Fe(Phen)3]2+的結構;
圖12表示了可能由中心離子和三個不對稱配體形成的對映異構體和幾 何異構體的可能排布；
圖13表示了與發色團和官能連接子基團結合的染料的可能的結構圖解；
圖14表示了用於根據本發明的配合物的可能配體的例子；
圖15表示了用於標記分析物的另一種排布；
圖16表示了根據本發明的組合配合物的預期排布；
圖17表示了[Fe(Phen)3產的基態軌道和激發軌道； 圖18表示了在本發明中使用的產生替代配體的反應； 圖19表示了由圖18的配體A和鐵(II)離子形成的配合物的結構； 圖20表示了闡述苯並三唑加入到菲咯啉中的反應； 圖21表示了結合圖18和20表示的反應形成的染料的結構，該染料含 有發色團、肽/核酸連接位點以及3-苯並三唑銀連接基團； 圖22表示了三腳形配體(tripedalligand)的例子。
具體實施例方式
下面的實施方式描述用於光譜法的改進的染料的特徵。本發明使用金屬 /配體配合物的躍遷來製備用於光譜法的具有光學特性的染料，特別是拉曼 光譜及其所衍生的SERS和SERRS。這樣的配合物具有的較低螢光性，降低 了螢光背景對拉曼信號的幹擾，能夠通過能使能量傳遞從產生螢光的機理至 產生拉曼散射的機理而進一步增強拉曼強度，並且提供共振拉曼光譜所必需 的光學吸收峰。對於拉曼染料來說，螢光性是不理想的特性，因為它實質上 產生使拉曼信號不分明的背景噪音。
光吸收
可見區域的光譜(400nm到800nm)包括能量為150-300 kJ.mor1的光子， 而近紫外區域(低於200nm)將這個能量範圍擴展到約《OOkJ.mor1 。所有的
這些能量都足夠將分子的電子提升或激發到更高的能量軌道。圖1表示了可 能發生在有機分子中的各種電子激發。
在圖1所示的六個躍遷中，只有1、 2兩個最低能量的躍遷(如實線箭
頭所示)可以由200nm-800nm的光譜得到的能量所獲得。所有這些躍遷都 涉及向反鍵7l軌道(3)的躍遷，因此，擁有大量的兀系統的有機分子是特 別好的發色團。
當發色團分子暴露於具有與分子中可能的電子躍遷相匹配的能量的光 子時， 一些光子可能隨著電子被提升到更高的能量軌道而被吸收。接受能量 的電子的提升一般是從最高佔據分子軌道(HOMO)到最低未佔據分子軌道 (LUMO)。分子軌道的概念是公知的，它們也可以被理解為分子中的電子 能級。
螢光和磷光
螢光和磷光是相關的現象，在該現象中光能量以特有的發射輪廓被吸收 和再發射。這個發射輪廓的形狀是和激發波長沒有關係的，但是它的強度隨 化合物的吸收輪廓而改變。圖2表示了所涉及的電子能量的躍遷。
圖2表示了一般的螢光/磷光分子的基態，單重激發態和三重激發態以及 這些態之間如何激發可以產生螢光或磷光。y軸表示各個態的能量值，x軸 表示"Q"值，該值可以被認為是分子鍵的長度。在螢光中，基態和發射性 激發態的自旋多重性是相同的。在大多數有機分子中，基態為單重態(也就 是，所有電子自旋是成對的)。當分子通過吸收躍遷201被提升到激發的單 重態，隨後又通過發射躍遷202-205衰變到基態單重態時，便出現螢光。
磷光是一個光發射過程，該過程中的激發態和基態有不同的自旋多重 性。在基態為單重態的有機分子中，存在一些能量接近的三重激發態(有兩 個不成對的自旋)。隨著通過吸收躍遷201激發到單重激發態的多重性後， 分子可能由非福射衰變(系間竄越207)到三重激發態。然後隨著該分子衰 變到基態，該三重激發態可能通過輻射躍遷208-211而發射光子。
圖2的能量曲線表示了各種與分子振動和轉動態有關的微觀狀態。在室 溫下，電子具有約0.04eV的能量，而這些微觀狀態之間的間隔平均起來也
近似為該值。因此電子一般可以進入相鄰的態並且能夠在它們之間躍遷。微 觀狀態之間的躍遷是非輻射的，並且隨著電子通過這些態向下躍遷，能量會 轉化為分子自身的轉動和振動模式。螢光和磷光一般只由第一激發單重/三重 態(也就是最低能量的激發單重態/三重態)產生，而與通過吸收最初產生的 是哪個激發單重態無關。
因為它們涉及從激發態的最低能帶到基態能帶的躍遷，所以螢光和磷光 的發射輪廓的形狀不因照射波長的不同而改變。但是，它們的強度依賴於光 子被吸收形成激發態的效率，因此螢光和磷光的發射強度依賴於分子的吸收 輪廓。
一般地，三重激發態的能量比單重態激發的能量稍低些。當能量上允許 時，電子從單重分子激發態到三重分子激發態間的系間竄越(如圖2所示) 是可能發生的。這就是，當一個微觀狀態與比它能量低的單重態中的下一個 連續的微觀狀態的能量差比所述微觀狀態與三重態中的微觀狀態的能量差 更大的時候。對於能夠在微觀狀態之間運動或者經由系間竄越而不發射光子
的電子，連續態間的能量差必須約為kbT或者更小(其中kb是玻爾茲曼常數， T是電子的溫度)。
形成有機分子的螢光的單重激發態的壽命是有限的，通常以納秒來計。 磷光在一個比螢光較長的時間量程內發生，因為從三重激發態衰變為單重態 基態需要電子反轉它的自旋(也已知為自旋躍遷)。電子反轉它的自旋的概 率是依賴熱的，其結果是三重激發態有長得多的壽命，通常是毫秒或更長。
晶體場分裂
在自由原子或離子中，所有的d軌道具有相同的能量，因為它們之間的 唯一差別在於它們的方向。但是，在分子或配合物中，如果方向正確，最外 層的電子可以和相鄰原子的電子之間相互作用。圖4表示了五個d軌道的方 向和形狀。
在八面體場，如圖5A所示，六個原子與中心原子之間相互作用，在全 部三個軸的各個邊上存在一個。這些其它原子的電子將排斥位於軸(dp和 dx2-y2)的d軌道。能量守恆的要求意味著如果這兩個軌道是不穩定的(即， 能量較高)，那麼其它三個軌道(dxy、 4z和dy》必須是穩定的(能量較低)， 因此最終效果是能量不變。低能量軌道(dxy、 dxz和dyz)和高能量軌道(dz2
和42-y2)之間的能量差為晶體場分裂能A。(其中"o"下標表示八面體結構)。 圖5B用圖解法表示了這種能量分裂。
在四面體場中，如圖6A所示，有四個相互作用的原子位於軸之間。這
就意味著dz2和42-y2軸是穩定的，而Cixy、 4z和dyz軸是不穩定的。因此，四
面體晶體場分裂能At採取了與八面體排布相反的排布(見圖6B)。
另一種由四個原子結成的幾何結構為正方平面，如圖7A所示。正方平 面場就像八面體場一樣，但是缺少沿著一個軸的原子。因此，八面體排布的 每個能級重新分裂。d軌道從而採取了如圖7B所示的能量結構。正方平面 晶體分裂能被稱作Asp。
分裂的大小取決於分裂的類型(通常，△。>△》、分裂的原子的種類和 導致分裂的原子的種類。由於At比較小， 一般和與自旋夥伴成對相比，從 能量角度更有利於四面體結構中的電子進入更高能量的d軌道。對於八面體 結構，電子是更容易成對(當A。更大時)還是更容易進入更高的軌道(當 A。更小時)取決於A。的大小。電子容易成對的化合物稱為低自旋。電子容 易進入較高能量軌道的化合物稱為高自旋。
d軌道的分裂導致了電子躍遷的出現，電子躍遷在自由金屬原子中是不 存在的。例如，引起3.734xlO"J的d軌道分裂的配合物的形成將會導致波 長為532nm的光吸收的電子躍遷，該波長位於可見光區的中間。很多過渡金 屬配合物都經歷約為該大小的d軌道分裂，使得它們具有特有的鮮豔色彩。
形成具有理想特性的發色團的一種方式是選擇能夠形成金屬-配體電荷
轉移配合物(MLCT配合物)的金屬和配體的組合。MLCT配合物被定義為
含有金屬離子和配體的對，其中，該對中的一個為電子給體，另一個為電子 受體，其中，存在從給體到處於激發電子態的受體的電子電荷的部分轉移。
MLCT配合物一般具有激發分子態和基態之間的電子能量躍遷，該躍遷不但 提供了適於在紫外/可見區域激發的能量間隔，而且提供了提升激發態的非輻 射熱弛豫的電子躍遷路徑。
由MLCT配合物提供的非輻射電子躍遷路徑是由離子和配體之間的化 學鍵產生的。該鍵提供了配合物的基態電子能級和離子的激發態電子能級之 間的可熱獲取的電子能級，並且使得電子熱馳豫到基態，而不發射光子。當 配體的最低空電子能級和可熱獲取的電子能級，與可熱獲取的電子能級和基 態電子能級之間的能量差各自為kbT以內時，可以發生這種非輻射衰變。術 語"可熱獲取"為本領域技術人員所公知，包括被電子佔據的能級的kbT以 內的能級，如上述實施例中所述。
通過選擇適當的過渡金屬和配體，可以生成MLCT配合物，這樣，HOMO 和基態與金屬離子的dz2軌道有關，而LUMO和激發態與配體的/軌道有關， 配體的兀、九道也是三重態。由於金屬離子的dz2軌道是HOMO，而配體的Z 軌道是LUMO，因此基態電子密度實質上集中在F^+離子上。金屬離子吸收 光子能量，電子在轉移到配體的LUMO之前被提升到離子的激發能態。如 果離子激發能級的能量在LUMO能級的kbT以內，則可以轉移到配體的 LUMO能級。這就是說，電子實際上是在MLCT和能態以內物理地變換位 置的。
電子實際上物理地變換位置的結果是增進配合物的熱運動，從而進一步 增強拉曼信號。
分子的溫度/熱運動的增進提高了電子的能量微觀狀態的可用性(微觀狀 態例如圖2所示的那些狀態)。在共振拉曼光譜中，入射光子的能量儘可能
地與分子的電子躍遷相匹配。像共振拉曼光譜所必需的那樣，如果存在更多 的可近似得到與配合物的電子躍遷大致相同能量的微觀狀態，吸收"調整" 到特定的電子躍遷能量的光子後的電子將更可能被提升到"真正的"微觀狀 態(與實際上的狀態相反)。因此，提高了根據共振拉曼效應發生的躍遷的 概率。值得注意的是，當實際上進行共振拉曼光譜時，入射或照射、輻射僅 需要足以將實際比例的電子從分子的基態激發至激發態電子能級的能量。一 般認為所需要的能量為待測分子的激發態能級和基態之間的能量差的kbT以內。
通過使配體與金屬離子配位，和使配體的兀*軌道的能級與金屬離子的不 穩定的d軌道的能級匹配，三重激發態的穩定性優於單重激發態。這促使了 電子系間竄越到三重態，導致螢光機理變為量子力學禁止的躍遷，則稱為被
猝滅(quenched)。通過將合適的配體與合適的離子配合，可以形成提供位 於LUMO和配合物的基態間的額外的能級的化學鍵。該額外的能級允許電 子從LUMO到基態的熱馳豫，而不輻射光子。
螢光的減少對拉曼光譜有兩個好處。不僅是以螢光形式散射的光子的數 量被減少，而且由非輻射衰變"消耗"的能量一部分可以轉化為散射分子中 的熱運動或者電子躍遷，使得與來自常規的拉曼光譜的相比，拉曼信號得到 進一步的增強。配體離子配合物具有能夠接受由電子的熱馳豫產生的能量的 熱振動方式。這就是說，如本發明提供的配體離子配合物具有振動方式，該 振動方式可熱獲取在配體的最低未佔電子能級和可熱獲取的電子能級之間， 與可熱獲取的電子能級和基態電子能級之間躍遷的電子的能量(在kbT以 內)。根據本發明，當另外的將參與螢光機理的電子具有可選擇的、非輻射 的、馳豫路徑時，能量將由電子傳遞給這些熱振動方式，使配合物的熱量增 加，從而增強拉曼信號。
圖8表示的是Phen和MLCT配合物[Fe(Phen)3產的分子能級的典型例
子。過渡金屬Fe"和Phen配體之間的鍵引起了 HOMO和LUMO之間的另 外的電子能級。當電子移動到三重激發態時，它將向下移動到振動微觀狀態 的最低能級，但不能不通過反轉自旋而回到基態。這就是磷光機理。HOMO 和LUMO之間的另外的能級在熱力學上有利於使從三重激發態到基態之間 的躍遷為非輻射的，因為可熱獲取的電子能級的存在為處於激發態的電子提 供了可選擇的馳豫路徑，並且降低了光子被發射的概率。
對於本發明的配合物，轉移到配體的最低未佔據電子能級的激發態電子 能夠經可熱獲取的電子能級馳豫到配合物的基態，而不需要旋轉躍遷。如果 配合物的基態電子能級和離子的激發態電子能級之間的可熱獲取的電子能 級沒有被電子佔據，經非輻射路徑熱馳豫的電子不需要反轉它的自旋。如果 配合物的基態能級和離子的激發態電子能級之間的可熱獲取的電子能級被 電子佔據，假設這個電子的自旋是與位於配體的最低未佔據電子能級的馳豫 電子反方向的自旋，那麼經非輻射路徑熱馳豫的電子不需要反轉它的自旋。
當如上所述從激發離子能級移動到配體的能級時，優選電子移動到配體 的LUMO。電子在沿著可選擇的熱馳豫路徑熱馳豫之前必須在LUMO。如 果電子將要移動到位於LUMO之上的微觀狀態時，在它利用可選擇的熱馳 豫路徑之前，需要熱馳豫到LUMO。這樣的時間延遲是不理想的，因為它將 允許配合物從它的激發態馳豫，這將導致配合物輻射的概率增加。
光範圍內的躍遷發生在過渡金屬的d軌道之間，和有機分子的7i和兀* 軌道之間。如果有機分子的兀和兀*軌道之間的能量差與d軌道能量分裂相匹 配，過渡金屬和有機分子之間形成的配合物有兩種機理可以利用。如果能級 距離能夠與所用的RS雷射相匹配，則利用不同於過渡金屬的d軌道或者是 有機分子的兀軌道是可能的。上述的能級距離便於使用波長為532nm的典型 雷射。
Phen/鐵實施方式
下面將描述本發明的一個特定的實施方式，該實施方式涉及鐵與1,10-
菲咯啉(Phen)形成的配合物。Phen形成淺黃色水溶液，該水溶液在532nm的 光照下有螢光。Phen還被公認為Fe"或Fe"的氧化還原指示劑，分別形成 [Fe(Phen)3]2+ (深紅色)或[Fe(Phen)3;T (淺藍色)。
Phen的HOMO的大部分離開分子原位，主要地形成共軛^體系。最低 的單重態和三重態激發態(LUMOs)也是具有不同的電子密度分布的"體 系。因此，Phen的光吸收可能涉及兀一"*躍遷。
Phen很容易與鐵(II)按照下述反應形成配合物
formula see original document page 202+ (特別是三-l，lO-菲咯啉合鐵(II) (tris-l，10-phenanthroline iron(II)))具有如圖ll所示的結構。中心Fe"離子被三個Phen基團包圍，
以八面體方式排布。
圖9中的實線所示的是Phen在水溶液中在波長為532nm的光照下的發 射光譜。寬的基線"拱起"特徵是由於螢光，在它上面覆蓋的更尖的峰是拉 曼散射光子(Raman-scattered photons )。除了氯化鐵(II)，還形成了 [Fe(Phen)3;T配合物，使淺黃色溶液變成深紅色，並極大地降低了發射信號 (靠近x軸的細線)。這說明，通過與F^+形成配合物，大量地降低了Phen 的螢光。
[Fe(Phen)3f+配合物的分子軌道的量子力學分析說明了這一現象涉及了 哪些軌道。如上所述，初始吸收是由於單重態基態，最高佔據軌道(HOMO)， 以及任何螢光發射光子都來自於最低未佔據軌道(LUMO)和這個基態之間 的躍遷。圖16中顯示了[Fe(Phen)3產中的上述軌道。
HOMO基本上是F^+離子的dz2軌道(以及很小部分的Phen基團的貢 獻)，並且LUMO為限定在六個"吡啶"體系的環原子上的離域的"體系，
該六個"吡啶"體系與F^+發生配位。需要注意的是，配合物中的每一個Phen 分子的LUMO的電子密度基本與自由Phen的三重態激發態的LUMO相同。
由於HOMO被限制在Fe^離子上，LUMO被限制在Phen配體上，這些 軌道之間的電子躍遷會在F,離子和配體的^體系之間轉移電荷，支持被 提出的MLCT機理。引發該躍遷需要的光的波長約為510nm。
儘管所述實施方式中使用的是1,10-菲咯啉，但同時還需要注意的是， Phen配體的5 —和6 —位碳原子上不存在任何LUMO電子密度，這說明2,2'-雙吡啶('Bipy'， 一種相關的缺少這些原子的分子)將會顯示出與Phen非 常相似的性質。類似的，5,6-二氫-1，10-菲咯啉和它的衍生物也是合適的。
上文所述的實驗表明了在不存在表面增強效應的本體溶液中的體系的 特性，因此是共振拉曼光譜(resonance Raman spectroscopy, RRS)的例子，因 為[Fe(Phen)3產配合物在靠近照射波長(532nm)處有吸收峰(510nm處)。 通過將配合物吸收在銀表面(例如，通過加入銀膠或將溶液暴露在沉積有銀 的表面)，從而可以採用更敏感的表面增強共振拉曼光譜(SERRS)檢測方 法。
圖10顯示了添加了銀膠的水溶液中[Fe(Phen)3f+在波長為532nm的照射 下的發射光譜。與沒有銀膠的溶液的拉曼信號相比，產生了更強的SERRS 信號，這說明達到了表面增強效應。需要注意的是，存在很弱的螢光背景。 這說明，根據本發明所述的觀點選擇的[Fe(Phen)3;T準確顯示出了所需要的 特性。使用這一技術，拉曼信號很強，以至能被肉眼觀察到。
SERRS標記
我們認識到，[Fe(Phen)3產顯示出了用於SERRS發色團的很有前景的性 質。為了使這種配合物成為切實可行的SERRS標記基團，需要官能團，這 是本領域公知的，通過該官能團可以實現與待測物的共軛。另外，我們已經 證明，它確實顯示出了 SERRS活性，但加入特定的表面連接基團(binding
group)可以帶來更好的表面增強效應。
衍生的菲咯啉和二吡啶基團可以作為構建適合的功能性SRRES標記的 出發點。例如，化合物(xyzxyz)含有羧酸基團，可以帶來適於通過傳統耦 聯化學與肽共軛的位點，以及可以賦予與銀表面的強連接的苯並三唑基團。 該化合物可以按照與Phen相同的方式，由F^+離子通過與菲咯啉基團上的 氮原子配合，從而與F^+形成配合物。
F^+和三個這些不對稱配體形成的配合物可以導致形成大量的對映異構 體和幾何異構體(圖11)。它們中的一半具有按照次優化構型排布的表面連 接基團(圖11中，只有最左邊和最右邊的結構中，所有三個金屬-連接基團 都指向表面)。
這種情況可以通過限制金屬離子(圖11中的'M')周圍的配體的方向 而避免。如果每一個配體基團的一端都連接在共同的連接子('L')上，另 一端連接在表面連接基團('S')上，它們將會與金屬離子自組裝形成如圖 12所示的三腳形結構。需要注意的是，由於發色團與一個或多個官能團一起 存在，圖12中所示的分子都構成了染料。除去表面連接基團(S)或連接子 (L)，分子仍然是"染料"，然而，如果同時除去這兩個官能團，將會僅僅 留下發色團，因此不會再構成染料。
配合物可以形成兩種對映異構體(如圖12所示的鏡像)，但它們都會具 有方向正確的表面連接基團。連接子基團必須基本不妨礙金屬離子配合物的 形成。在下文描述的一個實施例中，並且如圖13所示，配體具有菲咯啉配 位基團、用於表面連接的苯並三唑基團和用於與連接子共軛的羧酸。為了使 SERRS化學增強最大化，發色團應當通過離域鍵體系連接在表面。所述三 價(trivalent)連接子具有三個胺基基團，每一個用於與各個配體基團相連， 並且進一步具有羧酸基團，該羧酸基團可以提供與分析物分子相連所需要的 共軛官能度。
根據預測，組裝的配合物採用了如圖15 (僅顯示了一種對映異構體)所 示的構造。
配體基團可以帶有額外的發色團。例如，苯並三唑基團通過乙烯間隔基
(spacer)在上述分子中與菲咯啉相連。它們可以很容易地被偶氮基團所取 代。得到的配合物則將具有四個發色團一一[Fe(Phen)3;T基團和三個偶氮基 團。取決於發色團的具體選擇，通過發色團間的轉移機理，也可以得到進一 步的信號增強。
對分析物進行標記的替代性策略是，將其共價連接在一個配體基團(可 以通過間隔基/連接子)，並通過加入金屬離子和過量的自由配體基團組裝配 合物(圖14)。如果配體基團帶有一個或多個可以在得到的拉曼發射光譜中 提供特徵峰的官能團，這將提供一種產生多種用於複合式應用的相關SERRS 的手段。適合的拉曼活性基團可以包括滷素原子，如我們以前的滷素金屬茂 (halometallocene)專利，儘管據預測，將它們直接添加至菲咯啉體系中會
妨礙離域體系的能量，導致它們具有相對差的發色團。
根據本發明的替代性的系列染料基於下述的合成。從3當量的2-溴-1，10-
菲咯啉和1當量的2-氮-2-(羥甲基)-丙垸-l,3-二醇出發，例如，通過在0。C下、
在乾燥的N,N-二甲基甲醯胺中、在9當量的NaH存在下，攪拌24小時，可
以製得三腳形的配體A(如圖18所示)。可以使用6-溴-2,2，-聯吡啶或2-溴-5,6-
二氫-l，10-菲咯啉進行類似的反應，得到結構相關的發色團中心。還可以用
具有不同滷素的起始原來來進行類似的反應。
配體A會與鐵(II)離子形成穩定的配合物，得到的配合物的中心離子處 於八面體構型中(如圖19所示)。在與氯化鐵(II)溶液混合後，配合物將會 自發地形成，並且如果需要，可以通過加熱提高速率。
例如，配合物含有適合於進一步衍生的發色團和反應性胺，以與肽或核 酸形成共軛。發色團部分具有2+電荷，具有與SERRS活性金屬表面連接的
內在親和性(intrinsic affinity)。如圖20的反應式所示，可以通過加入金屬連 接基團，如苯並三唑，提高這種親和性。
這些反應的結合可以產生含有發色團、肽/核酸連接位點和三個苯並三 唑銀連接基團的SERRS染料。
通過使用在苯並三唑苯環和羧酸基團之間具有不同數量和類型的原子 的起始原料，可以控制苯並三唑基團與發色團中心的間隔和這些基團連接在 金屬表面時的方向。苯並三唑基團的方向也可以通過使用4-或5-取代的苯並 三唑衍射物控制。
可以通過在各種位點用拉曼活性基團進行取代，在這些分子中引入特徵 拉曼峰。任何如圖21所示的結構中的C-H基團都將適合於作為衍生點。因 此可以預見顏料的評審(panel),每一個都能夠從顏料混合物中在光譜上產 生一個或多個特徵拉曼峰，從而可以進行同時多路測量。
圖22中顯示了三腳形配體的另一個例子，該配體中"R"是鏈長為l一 4個原子的間隔基團。三個氨基可以被類似的間隔基團(鏈長為l一4個原子) 替代。該配體也可以使用重氮基團，該基團可以提供三個額外的發色團中心。
儘管已經給出了具體的例子，但適於用作SERRS標記的是一整族相關 金屬離子配合物。並沒有限定為Fe2+——這僅僅是在532nrn雷射處具有好的 功效的一種金屬離子。使用的離子可以是任何可以形成2+離子和具有八面體 排布的金屬。通常，過渡金屬有助於達到這一目的。所述離子可以為釩離子、 鉻離子、銅離子、鎂離子或鐵離子。其它過渡金屬，如鈷或鎳，也可以形成 類似的配合物，用於不同的激發雷射。事實上，並不要求離子是金屬，例如， 離子可以是滿足上述要求的有機分子。
同樣地，並不要求具有三個雙齒配體的八面體配合物。根據本發明的思 想，具有單齒的四面體和正方平面配合物和其它配體也可以使用。關鍵的思 想在於，配體應當選自或者被設計成具有能夠從激發態到非輻射性衰減過程
傳遞能量的電子結構，導致螢光的降低和拉曼散射的增強。MLCT機理是實 現這一目的的一種方式，但是，需要認識到，可以通過其它替代性機理實現 相同的目的。
本發明的一種實施方式可以包括位於分析物區的用於支持上述染料的 以及待分析的分子的分析物載體和檢測器，該檢測器提供雷射輻射至載體上 的分析物區，所述檢測器還具有用於檢測從分析物區接收的輻射的傳感器。 染料的響應是來自於入射雷射輻射的散射輻射，並通過這些傳感器檢測。分 析物載體和檢測器一起構成檢測器組件。
分析物載體可以包括用於進行上述SERS和SERRS的金屬表面。檢測 器本身可以包括各種形式的雷射原和傳感器。分析物載體的實施方式可以根 據檢測器採用各種形式。優選的實施方式為微流控晶片(microfkiidicchip)， 而其它實施方式包括如後面所述的經過適當改進的微板(microliter plate)。 分析物載體因此被稱作"晶片實驗室Oabonchip)"。
權利要求
1、一種檢測反應區樣品中染料的存在、不存在或含量的方法，該方法包括提供含有配體離子配合物的染料，所述配體具有最低未佔電子能級，所述離子具有激發電子能級，所述配體的最低未佔電子能級的能級使得所述離子的激發電子能級中的電子能夠非輻射傳遞至所述配體的最低未佔電子能級，所述配合物具有基態電子能級；使用特定波長的輻射照射所述染料，從而檢測染料的存在、不存在或含量；檢測來自被照射染料的輻射；其中，設置所述配合物的電子能級和輻射的波長，使得處於基態的電子通過光子吸收提升至激發態，並且在能量上有利於電子從所述離子的激發態電子能級傳遞至所述配體的最低未佔電子能級，並有利於電子通過所述配位化合物的基態電子能級和所述離子的激發態電子能級之間的可熱獲取的電子能級進行非輻射弛豫至基態電子能級。
2、 根據權利要求1所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其 中，所述配體的最低未佔電子能級的能量和所述離子的激發態電子能級的能 量在彼此的kbT範圍內。
3、 根據權利要求2所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其 中，所述配體的最低未佔電子能級和可熱獲取的電子能級之間的能量差，以 及可熱獲取的電子能級和基態電子能級之間的能量差均為kbT或更低。
4、 根據權利要求l、 2或3所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方 法，其中，所述照射輻射的能量足以使電子由所述離子的基態被激發至所述 離子的激發態電子能級。
5、 根據權利要求4所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其 中，所述照射輻射的波長使得所提供的能量在所述離子的激發能級和所述離 子的基態之間的能量差的kbT之內。
6、 根據前述任意一項權利要求所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其中，所述傳遞至所述配體的最低未佔電子能級的激發態電子能夠 通過可熱獲取的電子能級弛豫至所述配合物的基態，而不需要自旋躍遷。
7、 根據前述任意一項權利要求所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其中，所述可熱獲取的電子能級的存在提供了替代性的處於激發態 的電子的弛豫路徑，並降低了所述處於激發態的電子弛豫時發出光子的概率。
8、 根據前述任意一項權利要求所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其中，所述配體離子配合物具有能夠獲取電子熱弛豫產生的能量的 熱振動模式。
9、 根據權利要求8所述的檢測染料的存在、不存在或含量的方法，其中，所述配體離子配合物具有振動模式，該振動模式可熱獲取所述配體最低 未佔電子能級和所述可熱獲取電子能級之間、以及所述可熱獲取的電子能級 和基態電子能級之間的電子躍遷的能量。
10、 根據前述任意一項權利要求所述的檢測染料的存在、不存在或含量 的方法，其中，所述離子為任何能夠形成2+離子，並且具有八面體排布的金 屬離子。
11、 根據前述任意一項權利要求所述的檢測染料的存在、不存在或含量 的方法，其中，所述離子為釩離子、鉻離子、銅離子、鎂離子或鐵離子。
12、 一種染料，該染料含有連接基團配體離子配合物，所述配體具有最低未佔電子能級，所述離子具有激發 態電子能級，所述配體的最低未佔電子能級的能量級使得所述離子的激發態 電子能級中的電子能夠非輻射傳遞至所述配體的最低未佔電子能級，所述配 合物具有基態電子能級；其中，所述配合物的電子能級設置為使得處於基態的電子能夠通過光子 吸收被提升至激發態，並且在能量上有利於電子從所述離子的激發態電子能 級躍遷至所述配體的最低未佔電子能級，並有利於電子通過所述配位化合物 的基態電子能級和所述離子的激發態電子能級之間的可熱獲取的電子能級 進行非輻射弛豫至基態電子能級。
13、 根據權利要求12所述的染料，其中，所述配體的最低未佔電子能 級的能量和所述離子的激發態電子能級的能量在彼此的kbT範圍內。
14、 根據權利要求13所述的染料，其中，所述配體的最低未佔電子能 級和可熱獲取的電子能級之間的能量差，以及可熱獲取的電子能級和基態電 子能級之間的能量差均為kbT或更低。
15、 根據權利要求12-14中的任意一項所述的染料，其中，傳遞至所述 配體的最低未佔電子能級的激發態電子能夠通過可熱獲取的電子能級弛豫 至所述配合物的基態，而不需要自旋躍遷。
16、 根據權利要求12-15中的任意一項所述的染料，其中，所述可熱獲取的電子能級的存在提供了替代性的處於激發態的電子的弛豫路徑，並降低 了所述處於激發態的電子在弛豫時發出光子的概率。
17、 根據權利要求12-16中的任意一項所述的染料，其中，所述配體離子配合物具有可熱獲取電子熱弛豫產生的能量的熱振動模式。
18、 根據權利要求17所述的染料，其中，所述配體離子配合物具有振 動模式，該振動模式可熱獲取所述配體的最低未佔電子能級和所述可熱獲取 電子能級之間、以及可熱獲取的電子能級和基態電子能級之間的電子躍遷的能量。
19、 根據權利要求12-18中的任意一項所述的染料，其中，所述離子為 任何能夠形成2+離子，並且具有八面體排布的金屬離子。
20、 根據權利要求12-19中的任意一項所述的染料，其中，所述離子為 釩離子、鉻離子、銅離子、鎂離子或鐵離子。
21、 一種用於檢測器組件排布中的分析物載體，該載體包括 反應區，該反應區包括金屬表面和一定量的權利要求12-20中的任意一項所述的染料；其中，能夠通過使用特定波長的輻射照射反應區並檢測染料的響應，來 確定染料的存在、不存在或含量。
22、 一種檢測器組件，該檢測器組件包括權利要求21所述的分析物載 體，並進一步包括為照射靠近金屬表面的區域而設置的雷射光源，和為通過 檢測染料的響應來檢測染料的存在、不存在或含量而設置的檢測器。
全文摘要
提供了一種檢測反應區的樣品中的染料存在、不存在或含量的方法，該方法包括以下步驟提供含有配體離子配合物的染料，所述配體具有最低未佔電子能級，所述離子具有激發態電子能級，所述配體的最低未佔電子能級的能級使得離子的激發態電子能級中的電子能夠非輻射傳遞至配體的最低未佔電子能級，所述配合物具有基態電子能級；使用特定波長的輻射照射染料，從而檢測染料的存在、不存在或含量；檢測來自照射染料的輻射；其中，設置所述配合物的電子能級和輻射的波長，使得處於基態的電子通過光子吸收提升至激發態，並且在能量上有利於電子從離子的激發態電子能級傳遞至配體的最低未佔電子能級，並且有利於通過配體的基態電子能級和離子的激發態電子能級之間的可熱獲取的電子能級進行非輻射弛豫。
文檔編號G01N21/63GK101389638SQ200780006114
公開日2009年3月18日 申請日期2007年2月20日 優先權日2006年2月20日
發明者R·吉爾伯特 申請人:E2V生物傳感器有限公司