檢測hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變方法及試劑盒的製作方法

2023-06-04 08:56:21 1

專利名稱：檢測hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測Hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
背景技術：
一、核苷和核苷類似物類藥物作用機制:人類免疫缺陷病毒(HIV)屬於逆轉錄病毒，又分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區的愛滋病患者是被HIV-1病毒所感染，現有藥物主要是抑制HIV-1型病毒的複製。自從1995年開始應用新的抗病毒治療方案，即聯合使用逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的HAART以來，HIV感染的臨床進程被大大改變。這些藥物通過阻斷病毒複製使得免疫系統重建其CD4+T細胞庫並恢復對病原體的免疫力，明顯降低了 HIV/AIDS相關疾病的發病率和病死率。截至目前，美國FDA已經批准了 4大類共26種抗病毒藥物用於愛滋病的臨床治療，其中包括核苷類逆轉錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,nRTI)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)、蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)和融合抑制劑(fusion inhibitors)。我國已有5種國產抗病毒藥物進入臨床。在HIV-1的複製循環中，逆轉錄酶在完成RNA指導的DNA合成、RNA水解反應和DNA指導的DNA合成過程中起著十分重要的作用。因此，HIV-1逆轉錄酶是抗HIV/AIDS藥物設計的一個重要生物靶點。目前市場上出現的以HIV-1逆轉錄酶為靶點的藥物按作用機制和化學結構可分為核苷類逆轉錄酶抑制劑和非核苷類逆轉錄酶抑制劑。核苷類逆轉錄酶抑制劑是最先問世、開發品種較多的一類藥物，臨床證實對HIV複製具有很強的抑制作用，核 苷類逆轉錄酶抑制劑(nRTIs)，是HIV病毒逆轉錄酶作用底物脫氧核苷酸的類似物，在體內轉化成活性的三磷酸核苷衍生物，與天然的三磷酸脫氧核苷競爭性與HIV逆轉錄酶(reverse transcriptase, RT)結合,抑制RT的作用，阻礙前病毒的合成。已上市的nRTIs藥物有:齊多夫定、去輕肌苷、扎西他濱(DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韋等。nRTIs的結構與核苷類似，為雙脫氧核苷衍生物，可與細胞內核苷競爭性地結合逆轉錄酶，從而終止逆轉錄反應。通過阻斷病毒RNA基因的逆轉錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去複製的模板。此類藥物首先進入被感染的細胞，然後磷酸化形成具有活性的雙脫氧核苷三磷酸化合物，競爭性抑制愛滋病病毒逆轉錄酶，可導致未成熟的DNA鏈合成終結，從而病毒複製受到抑制。早期用於治療AIDS及其相關症候群，對治療HIV陽性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及機會性感染率，但不能治癒AIDS。研究表明，核苷類逆轉錄酶抑制劑聯用，副作用大，易出現交叉耐藥。二、HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑的耐藥類型及機制:隨著我國免費愛滋病抗病毒治療的開展，HIV-1病毒耐藥性的監測越來越受到重視。HIV-1病毒耐藥性的產生取決於兩方面:病毒複製過程中的高頻突變和抗病毒藥物產生的選擇壓力。HIV-1是RNA病毒，其基因組由單鏈RNA轉變為RNA-DNA複合物，進而反向轉錄為前病毒DNA,再由前病毒轉錄為病毒基因組RNA,整個過程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，對轉錄錯誤無校正功能，所以轉錄的忠實性差，轉錄中的鹼基錯配常導致基因突變，因此HIV-1病毒複製過程中表現出很高的突變頻率，每個鹼基對在每輪複製中發生突變的頻率約為3.4X 10_5。另一方面，HIV-1病毒複製迅速，感染初期每天可新形成IO9 101°病毒顆粒。HIV-1病毒的高速複製及複製過程中的高頻突變，導致原發感染的幾個月內就可形成非常大量的基因突變病毒。一旦突變發生在逆轉錄酶和蛋白酶的編碼基因序列，就有可能引起逆轉錄酶和蛋白酶分子發生改變，導致HIV-1病毒對作用於這兩種酶的抑制劑不再敏感，產生耐藥性。開始抗病毒治療後，野生型病毒被顯著抑制，臨床上可見到病毒載量明顯下降，如果藥物對病毒抑制不完全，與耐藥有關的突變型仍可以持續複製。在藥物產生的選擇壓力下，耐藥突變型最終取代野生病毒株成為優勢群體，臨床上可表現為病毒載量的反彈。核苷和核苷類似物通過抑制RT終止病毒DNA的合成。HIV對這些藥物的耐藥涉及
2種不同機制，即破壞這些類似物與DNA結合以及將其從過早終止的DNA鏈末端移除。RT的多種變異或組合變異可通過選擇性破壞RT而具有將類似物結合到DNA的能力，導致耐藥產生。主要包括M184V變異、Q151M變異複合體以及K65R變異。M184V、非胸苷類似物突變如K65R和L74V、多核苷耐藥突變Q151M複合體是通過減少nRTI整合至DNA的機制產生耐藥；脫氧胸腺嘧啶核苷類似物突變(TAMs)、與多核苷耐藥相關的T69插入以及許多輔助突變是通過促使nRTIs從DNA水解而產生耐藥。M184V變異即在RT第184位的甲硫氨酸被纈氨酸取代，該變異也是導致病毒對拉米夫定耐藥的主要變異。Q151M複合體在HIV-1中相對較少(在所有對核苷類似物耐藥的HIV-1中所佔比例小於5%)，但可導致對大部分而非全部(如拉米夫定和替諾福韋)類似物的耐藥。RT的一組變異可導致核苷類似物從DNA鏈末端被移除，促使對所有核苷和核苷酸類似物的耐藥，其中包括替諾福韋。此類變異是逐漸出現的，且出現的順序也是多變的。TAMs突變可分為兩條通路: 一條與T215Y突變有關(包括M41L、L210W、T215Y和EA4D)，稱為 TAMs-1 ;另一類與 T215F 突變有關(包括 D67N、K70R、T215F 和 K219Q)，稱為 TAMs-1I。研究認為，在TAMs-1通路中，最初出現的突變是T215Y，隨後是M41L和L210W，之後再在此基礎上逐級積累1-3個其他突變密碼子。至於TAMs-1I通路，很多研究認為K70R突變通常是逆轉錄酶在AZT治療過程中最先出現的基因突變。三、Hiv-1病毒的耐藥檢測方法:在高效抗逆轉錄病毒聯合療法(highlyactive antiretroviral therapy,HAART)治療中，病毒變異使得治療的敏感性下降，常常導致治療失敗。一些研究顯示，耐藥與抗逆轉錄病毒治療無效密切相關，對HIV-1耐藥株進行監測以指導臨床用藥及預防耐藥株的迅速上升和擴散日顯其重要性。目前已有數項研究表明，對病人進行耐藥性檢測具有重要臨床應用價值，因而國際愛滋病學會(International AIDS Society-USA)、歐洲AIDS臨床學會(European AIDSClinical Society, EAcs)等幾個專家組,在其AIDS治療指南當中推薦使用HIV耐藥檢測。耐藥成為AIDS治療面臨的嚴峻挑戰，同時耐藥性檢測逐漸成為幫助臨床醫生選擇聯合用藥方案的重要工具。目前HIV-1病毒耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病
毒基因突變。
基因型檢測的方法有直接測序法、異源雙鏈軌跡試驗(ΗΤΑ)、PCR連續酶測定試驗、線性探針試驗、限制性內切酶酶切試驗、引物特異的PCR測定、RNA酶A (RNaseA)錯配剪切試驗等，其中部分技術已有商用系統。在進行基因測序後，將測序結果與標準病毒株比較後可坦福大學耐藥資料庫(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐藥資料庫。通過輸入所測得的序列，資料庫可自動提供病毒基因變異及耐藥結果。目前已有基於測序技術的商品化的試劑盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto,Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems,Inc.Foster City, CA,USA)。兩者都已獲得美國FDA批准成為應用於臨床常規檢測的試劑盒。此外，基於線性探針技術(Line probe assay)的商品化的試劑盒 LiPA (Innogenetics, Ghent, Belgium)也已用於實驗室研究。基因型檢測的優點是可提供交叉耐藥資料，可在樣品收集後I 2周得到結果，技術步驟較少，一般情況下費用較便宜。但也存在明顯缺點，即不直接提供藥物的耐受程度，無法定量，部分變異位點與臨床耐受的相關性無法完全確認，分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結果進行正確的分析。表型檢測通過病毒培養，再通過與無耐藥性個體減少HIV複製50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC9tl)所需的藥物水平比較來分級耐藥程度。表型分析的標準方法是首先從病人體內分離病毒，與待檢藥物共同培養，然後測定不同藥物濃度下外周血單核細胞(PBMC)所產生的p24抗原量，據此得到IC5(I。該法步驟複雜，對操作技術要求高，整個過程至少需6周時間，病毒分離培養過程還有可能發生變異。重組表型方法將病人體內HIV-1的蛋白酶和逆轉錄酶基因序列進行RT-PCR擴增，擴增產物繼而插入pol基因缺失型HIV-1載體以形成重組病毒，因此重組病毒保持了病人體內病毒對藥物的敏感性，然後在不同藥物，同一藥物不同濃度下對重組病毒進行培養，即可測定出對藥物的敏感性。表型耐藥檢測的結果與基因型檢測結果通常相同，但有時亦有差異。當耐藥HIV株水平較低時，表型檢測可發現基因型檢測所沒有提示的耐藥性變異。表型耐藥是耐藥檢測的金標準，直接提供藥物的耐受情況，可定量，但缺點也很明顯，即技術要求高、費時、費用高昂，因此目前國際上廣泛應用於臨床的是基因型耐藥檢測。基因型和表型檢測的進一步應用限制，包括缺乏對現有檢測方法的質量保證；檢測費用較高；對微小病毒標本不敏感；如果存在耐藥病毒，而病毒量又低於20%，現有檢測方法很可能檢測不到。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種特異性好、靈敏度高、快速、成本低的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。為了解決上述技術問題，本發明提供一種檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括以下16類特異性探針中的至少一類:檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ ID NO:1 9中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 10 17中的任意一種或任意一種的互補 序列；
檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 18 23中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 24 29中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ ID N0:30 39中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 40 45中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:46 51中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 52 57中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因F77L突變 的特異性探針，為SEQ ID NO: 58 63中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ ID NO:64 69中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ ID NO:70 75中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 76 81中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 90中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ ID NO:91 96中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 97 105中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 106 116中的任意一種或任意一種的互補序列。作為本發明的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針的改進:檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針中，SEQ ID NO:1 3中的任意一種為針對第41位胺基酸殘基為M (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID N0:4 9中的任意一種為針對第41位胺基酸殘基為L (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 10 12中的任意一種為針對第62位胺基酸殘基為A (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 13 17中的任意一種為針對第62位胺基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種為針對第65位胺基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID N0:21 23中的任意一種為針對第65位胺基酸殘基為R (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；
檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一種為針對第67位胺基酸殘基為D (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一種為針對第67位胺基酸殘基為N (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針中，SEQ ID NO:30 32中的任意一種為針對第69位胺基酸殘基為T (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:33 39中的任意一種為針對在第69位胺基酸殘基T後插入SSS、SSA或SSG (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 40 42中的任意一種為針對第70位胺基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:43 45中的任意一種為針對第70位胺基酸殘基為R (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:46 48中的任意一種為針對第74位胺基酸殘基為L (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:49 51中的任意一種為針對第74位胺基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一種為針對第75位胺基酸殘基為V (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一種為針對第75位胺基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因F77L突變的 特異性探針中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一種為針對第77位胺基酸殘基為F (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID N0:61 63中的任意一種為針對第77位胺基酸殘基為L (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針中，SEQ ID NO:64 66中的任意一種為針對第115位胺基酸殘基為Y (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種為針對第115位胺基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的特異性探針中，SEQ ID NO:70 72中的任意一種為針對第116位胺基酸殘基為F (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:73 75中的任意一種為針對第116位胺基酸殘基為Y (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 76 78中的任意一種為序列76到序列78是針對第151位胺基酸殘基為Q (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO: 79 81中的任意一種為針對第151位胺基酸殘基為M (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 82 84中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為M(野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID N0:85 87中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為V(耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQIDNO: 88 90中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針中，SEQ ID NO:91 93中的任意一種為針對第210位胺基酸殘基為L (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:94 96中的任意一種為針對第210位胺基酸殘基為W (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針中，SEQ ID N0:97 99中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為T (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO: 100 102中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO: 103 105中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為Y (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因；檢測逆轉錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 106 108中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO: 109 111中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為Q (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO: 112 116中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為E (耐藥突變型)的HIV-1逆轉錄酶基因。利用上述檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針製備而得的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒:除了包括檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因F77L突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Fl 16Y突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針外，還包括HIV-1逆轉錄酶基因內標探針、表面化學質控探針和雜交陽性質控探針。作為本發明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的改進=HIV-1逆轉錄酶基因內標探針、表面化學質控探針和雜交陽性質控探針的長度均為15 35個核苷酸；所述探針的5』端均連接 上10 40個寡聚dT。作為本發明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:HIV-1逆轉錄酶基因內標探針的序列為SEQ ID NO: 117所示或其互補序列；表面化學質控探針PBQC-003 為 HEX-poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg_NH2 ；雜交陽性質控探針PBQC-002 為 NH2_poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。作為本發明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:探針固定於載體上，所述載體為矽片、用各種功能基團衍生的膜、或用各種功能基團修飾的玻片。作為本發明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:載體為表面帶有醛基基團修飾的玻片。本發明還同時公開了一種檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法，包括以下步驟:I)利用所述試劑盒擴增待測的人類免疫缺陷病毒基因組中的逆轉錄酶基因區段；2)將步驟I)得到的擴增產物與所述試劑盒中的HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變特異性探針進行雜交，確定待測人類免疫缺陷病毒所含的對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變類型。
作為本發明的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法的改進:PCR擴增為套式不對稱RT-PCR，其中用外套引物進行的PCR為RT-PCR，取其部分擴增產物作為內套引物擴增的模板，用內套引物進行的PCR擴增為不對稱PCR。作為本發明的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法的進一步改進:所述擴增HIV-1病毒逆轉錄酶基因區段的內套引物對，其下遊引物的5』端標記有螢光分子，且其5』端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無關的序列，使上下遊引物的Tm值相差至少8-15° C。本發明公開的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒，包括擴增HIV-1病毒逆轉錄酶基因的方法，以及與上述擴增的PCR產物進行雜交，檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針。在本發明中:待測人類免疫缺陷病毒耐藥突變為nRTIs耐藥突變(即核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變)。耐藥突變位於人類免疫缺陷病毒逆轉錄酶基因區段內。檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針、HIV-1逆轉錄酶基因內標探針的序列可以是如序列SEQ ID NO: 1-117所示，也可以是如序列SEQ IDNO: 1-117所示序列的互補序列。當採用的HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針和內標探針序列為SEQ IDN0:1-117時，內套擴增引物的反向引物被螢光標記；當採用的HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針和內標探針序列為SEQ ID NO: 1-117所示序列的互補序列時，內套擴增引物的正向引物被螢光標記。試劑盒還包括雜交陽性探針的靶標；試劑盒還包括進行PCR擴增和分子雜交反應的反應液，和50%的二甲 亞碸(DMSO)作為點樣和雜交反應的空白對照。所述雜交反應液中含有所述的雜交陽性對照探針的靶標。在本發明的檢測方法中:所述用內套引物進行的不對稱PCR擴增包含兩個階段，每個階段的每個溫度循環由變性、退火和延伸三個步驟組成，包括10-30個溫度循環，優選為20個溫度循環。其中第一階段的退火溫度為45-50° C，優選為48° C ;第二階段的退火溫度為55-65° C，優選為58。Co所述的內套引物中的上遊引物與下遊引物的濃度比例可以是1:2至1: 100之間的任意比例，優選為1:5。雜交包括以下步驟:I)將內套引物PCR擴增產物與雜交液，及雜交陽性對照探針的靶標混合，高溫變性並速冷以使雙鏈PCR產物解鏈為單鏈；2)上述變性後的雜交混合物與固定於載體上的探針在合適的溫度下雜交一定時間；3)在洗液中清洗，去除未與載體上的探針雜交的PCR產物、鹽離子等雜交液成分。所述的雜交液包含雜交所需的鹽溶液、表面活性劑，以及用於控制雜交嚴謹度的甲醯胺。所述的鹽溶液可以是1-10XSSC，或1-10XSSPE，優選為3XSSC或3XSSPE。所述的用於控制雜交嚴謹度的甲醯胺濃度範圍可以是5%-30%，優選為20%。
所述的合適的雜交溫度範圍可以介於30° C_42° C，優選為32° C。所述的雜交時間可以介於15分鐘至24小時之間，優選為2小時。本發明的用外套引物進行的RT-PCR包含兩個階段:第一階段為逆轉錄階段，與常規逆轉錄方法相同。第二階段為PCR擴增階段，在滅活逆轉錄酶後，在外套引物存在的條件下進行PCR擴增。擴增溫度循環由變性、退火和延伸三個步驟組成，包括10-40個溫度循環，優選為30個循環。所述的第二階段退火溫度為45-55° C，優選為48° C。所述的不對稱PCR擴增是指通過調整內套引物中上遊引物與下遊引物的濃度比例，使上遊引物的量低於下遊引物，以及在擴增的第二階段提高退火溫度(如上文所述)，使得上遊引物在該退火溫度下無法與模板復性，而下遊引物由於Tm值高於上遊引物，在該退火溫度下仍可正常與模板復性並進一步延伸，最終實現PCR擴增產物中兩條鏈的產量不同的不對稱擴增效果，其中能夠與HIV-1耐藥突變特異性探針雜交的單鏈數量高於該鏈的互補鏈。

所述的上遊引物的Tm值高於下遊引物，其差值可以是8-15° C之間的任意值，優選為10° C。在本發明中:檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒包括對HIV-1病毒基因組中與耐藥相關的逆轉錄酶基因區段進行套式不對稱PCR擴增及螢光標記的擴增方法，以及與上述擴增的PCR產物進行雜交，檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針。所述HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變是指HIV-1病毒逆轉錄酶基因內某個(或多個)核苷酸的突變，進一步改變了該位點所對應的胺基酸殘基類型，導致含有該突變的HIV-1病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑產生耐藥的突變。所述的HIV-1病毒基因組中與核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥相關的逆轉錄酶基因區段是指包含待檢耐藥突變的區段，具體的是指編碼第I到第257個胺基酸的基因片段。所述的待檢的核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變是指針對HIV-1逆轉錄酶16個胺基酸位點的19種突變類型，具體是指以下突變類型:1)M41L (即逆轉錄酶基因的第41位胺基酸殘基由M突變為L)；2)A62V (即逆轉錄酶基因的第62位胺基酸殘基由A突變為V)；3) K65R (即逆轉錄酶基因的第65位胺基酸殘基由K突變為R)；4) D67N (即逆轉錄酶基因的第67位胺基酸殘基由D突變為N)；5) 69INS (即逆轉錄酶基因的第69位胺基酸殘基後有其他胺基酸殘基插入)；6) K70R (即逆轉錄酶基因的第70位胺基酸殘基由K突變為R)；7) L74V (即逆轉錄酶基因的第74位胺基酸殘基由L突變為V)；8) V75I (即逆轉錄酶基因的第75位胺基酸殘基由V突變為I)；9) F77L (即逆轉錄酶基因的第77位胺基酸殘基由F突變為L)；10) Y115F (即逆轉錄酶基因的第115位胺基酸殘基由Y突變F)；1DF116Y (即逆轉錄酶基因的第116位胺基酸殘基由F突變為Y);12) Q151M (即逆轉錄酶基因的第151位胺基酸殘基由Q突變為M)；13)M184V (即逆轉錄酶基因的第184位胺基酸殘基由M突變為V)、M184I (即逆轉錄酶基因的第184位胺基酸殘基由M突變為I)；14) L210W (即逆轉錄酶基因的第210位胺基酸殘基由L突變為O ；15) T215Y (即逆轉錄酶基因的第215位胺基酸殘基由T突變為Y)、T215F (即逆轉錄酶基因的第215位胺基酸殘基由T突變為F)；16)K219Q (即逆轉錄酶基因的第219位胺基酸殘基由K突變為Q)、K219E (即逆轉錄酶基因的第219位胺基酸殘基由K突變為E)。所述擴增HIV-1病毒基因組中與耐藥相關的編碼逆轉錄酶基因區段的引物分為外套正向引物和外套反向引物，以及內套正向引物和內套反向引物，大小均為15-50個核苷酸，優選為15-45個核苷酸；所述的內套反向引物5』-末端連接上加尾序列後,再被突光標記。所述的外套引物可擴增HIV- 1病毒基因組中長度為1300bps的片段，包含HIV-1蛋白酶基因上遊的132bps片段、所述的蛋白酶基因編碼第I到第99個胺基酸的基因片段和逆轉錄酶基因編碼第I到第290個胺基酸的基因片段。所述的內套引物可擴增858bp的片段，包含逆轉錄酶基因編碼第I到第257個胺基酸的基因片段。所述試劑盒還包括檢測Hiv-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針、內標探針、表面化學質控探針、雜交陽性探針以及所述雜交陽性探針的祀標。所述探針的大小均為12-24個核苷酸，優選為15-20個核苷酸；所述探針的5』-末端連接上10-40個寡聚dT，優選連接上20-30個寡聚dT。所述的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針為單鏈DNA，包括序列表中序列I到序列117所示序列，以及序列表中序列I到序列117所示序列的互補序列，優選為序列表中序列I到序列117所示序列。當採用的HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針為序列表中序列I到序列117所示序列時，內套擴增引物的反向引物5』 -末端連接上加尾序列後，再被螢光標記；當採用的HIV-1耐藥突變檢測探針為序列表中序列I到序列117所示序列的互補序列時，內套擴增引物的正向引物5』 -末端連接上加尾序列後，再被螢光標記。本發明的內標探針具有序列表中序列117的核苷酸序列，是針對逆轉錄酶基因擴增片段內的保守序列，無論是野生型HIV-1病毒，還是包含上述任何核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的HIV-1病毒均可與該探針雜交。所述的表面化學質控探針(PBQC-003)主要用於晶片製備過程中監控晶片表面化學性質，檢測探針固定效率，其序列可以是與待檢測序列無同源性的任何序列，長度介於20-70個寡核苷酸，其5』端被突光分子標記；所述的雜交陽性質控探針(PBQC-002)主要用於監控晶片雜交過程，其序列可以是與待檢測序列無同源性的任何序列，長度介於20-70個寡核苷酸；所述的雜交陽性對照探針的靶標(PBQC-001)是與所述的雜交陽性質控探針(PBQC-002)序列完全互補的寡核苷酸，其5』端被突光分子標記。本發明所述的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒具有集成化程度高、靈敏度高、特異性好，檢測結果穩定可靠，成本低的特點，可廣泛用於HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的發生、發展的流行病學監測，為合理用藥，有效降低和延緩耐藥得發生提供有效工具。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的探針點陣排布圖；圖2為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑單位點耐藥突變的雜交反應結果圖；圖3為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑多位點耐藥突變的雜交反應結果圖；圖4為檢測全血、血漿以及核酸樣品中HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的雜交反應結果圖。
具體實施例方式實施例1、利用本發明檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑單位點耐藥突變本實施例檢測了本發明所涉及的所有HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變類型，以及不包含任何突變的野生型HIV-1病毒逆轉錄酶基因類型。1.寡核苷酸引物和探針的製備表I和表2顯示了本發明檢測HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變所用的引物和探針的序列，均委託上海英駿生物技術有限公司合成。表1HIV-1病毒逆轉錄酶基因區段擴增引物
權利要求
1.檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特徵是:包括以下16類特異性探針中的至少一類: 檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1、中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1(Γ 7中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 18 23中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 24 29中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 30 39中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ ID NO:40 45中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 46 51中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 52 57中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因F77L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 58 63中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ ID Ν0:64 69中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 70 75中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 76 81中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 90中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ ID NO:91 96中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因Τ215Υ和T215F突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 97 105中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 106 116中的任意一種或任意一種的互補序列。
2.根據權利要求1所述的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特徵是: 所述檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1 3中的任意一種為針對第41位胺基酸殘基為M的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 4、中的任意一種為針對第41位胺基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因；所述檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一種為針對第62位胺基酸殘基為A的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 13^17中的任意一種為針對第62位胺基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種為針對第65位胺基酸殘基為K的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ23中的任意一種為針對第65位胺基酸殘基為R的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一種為針對第67位胺基酸殘基為D的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一種為針對第67位胺基酸殘基為N的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:3(Γ32中的任意一種為針對第69位胺基酸殘基為T的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 33 39中的任意一種為針對在第69位胺基酸殘基T後插入SSS、SSA或SSG的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:4(Γ42中的任意一種為針對第70位胺基酸殘基為K的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:43^45中的任意一種為針對第70位胺基酸殘基為R的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針中，SEQ ID N0:46 48中的任意一種為針對第74位胺基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:49^51中的任意一種為針對第74位胺基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一種為針對第75位胺基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一種為針對第75位胺基酸殘基為I的HIV-1逆轉錄 酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因F77L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一種為針對第77位胺基酸殘基為F的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:6Γ63中的任意一種為針對第77位胺基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針中，SEQ ID Ν0:64 66中的任意一種為針對第115位胺基酸殘基為Y的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種為針對第115位胺基酸殘基為F的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的特異性探針中，SEQ ID NO:70 72中的任意一種為針對第116位胺基酸殘基為F的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:73 75中的任意一種為針對第116位胺基酸殘基為Y的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 76 78中的任意一種為序列76到序列78是針對第151位胺基酸殘基為Q的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 701中的任意一種為針對第151位胺基酸殘基為M的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針中，SEQ ID NO:82 84中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為M的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:85 87中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:88 90中的任意一種為針對第184位胺基酸殘基為I的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針中，SEQ ID NO:91 93中的任意一種為針對第210位胺基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID Ν0:94 96中的任意一種為針對第210位胺基酸殘基為W的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針中，SEQ ID NO:97 99中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為T的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID N0:10(Tl02中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為F的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 103 105中的任意一種為針對第215位胺基酸殘基為Y的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 106 108中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為K的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 109 111中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為Q的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 112 116中的任意一種為針對第219位胺基酸殘基為E的HIV-1逆轉錄酶基因。
3.利用如權利要求1或2所述的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針製備而得的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特徵是: 除了包括檢測逆轉錄酶基因M41L突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因A62V突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K65R突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因D67N突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K70R突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因L74V突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因V75I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因F77L突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Q151M突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因L210W突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基 因Τ215Υ和T215F突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針外， 還包括HIV-1逆轉錄酶基因內標探針、表面化學質控探針和雜交陽性質控探針。
4.根據權利要求3所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特徵是: HIV-1逆轉錄酶基因內標探針、表面化學質控探針和雜交陽性質控探針的長度均為15 35個核苷酸；所述探針的5』端均連接上1(Γ40個寡聚dT。
5.根據權利要求4所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特徵是: 所述HIV-1逆轉錄酶基因內標探針的序列為SEQ ID NO: 117或其互補序列； 所述表面化學質控探針 PBQC-003 為 HEX- poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 ； 所述雜交陽性質控探針 PBQC-002 為 NH2-Poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。
6.根據權利要求3、4或5所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特徵是:用於固定探針的載體為矽片、用各種功能基團衍生的膜、或用各種功能基團修飾的玻片。
7.根據權利要求6所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特徵是:所述載體為表面帶有醛基基團修飾的玻片。
8.檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特徵是:包括以下步驟: 1)利用所述試劑盒擴增待測的人類免疫缺陷病毒基因組中的逆轉錄酶基因區段； 2)將步驟I)得到的擴增產物與所述試劑盒中的HIV-1病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變特異性探針進行雜交，確定待測人類免疫缺陷病毒所含的對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變類型。
9.根據權利要求8所述的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特徵是=PCR擴增為套式不對稱RT-PCR，其中用外套引物進行的PCR為RT-PCR，取其部分擴增產物作為內套引物擴增的模板，用內套引物進行的PCR擴增為不對稱PCR。
10.根據權利要求9所述的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特徵是: 所述擴增HIV-1病毒逆轉錄酶基因區段的內套引物對，其下遊引物的5』端標記有螢光分子，且其5』端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無關的序列，使上下遊引物的Tm值相差至少8-15° C。
全文摘要
本發明涉及檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。具體而言，本發明公開了檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括檢測逆轉錄酶基因M41L突變的探針、檢測逆轉錄酶基因A62V突變的探針、檢測逆轉錄酶基因K65R突變的探針、檢測逆轉錄酶基因D67N突變的探針、檢測逆轉錄酶基因69INS插入突變的探針、檢測逆轉錄酶基因K70R突變的探針、檢測逆轉錄酶基因L74V突變的探針、檢測逆轉錄酶基因V75I突變的探針、檢測逆轉錄酶基因F77L突變的探針、檢測逆轉錄酶基因Y115F突變的探針、檢測逆轉錄酶基因F116Y突變的探針等等。
文檔編號C12R1/93GK103215378SQ20131008882
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者張瓊, 李蘭娟, 項春生, 吳南屏 申請人:浙江大學