全合成蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白基因的製作方法

2023-06-04 18:31:01 1

專利名稱：全合成蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程的螢光假單胞工程菌(pseudomonas fluorescens)，更具體地說全合成蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因。
蘇雲金桿菌(Bacitlus thuringiensis簡稱Bt)是國內外最重要的生物殺蟲劑，它產生的晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲具殺傷活性，而對人畜無害。Bt蛋白在田間易分解，對環境的汙染小，另外，害蟲對Bt產生抗性的過程明顯長於化學農藥。從人類可持續發展的角度考慮，Bt殺蟲劑將把化學殺蟲劑慢慢排擠出去。迄今全世界已有100多種Bt產品進入市場，年銷售額超過1億美元。這些產品被廣泛地應用於農業及林業害蟲的防治。
國內外大多數Bt產品來自於天然的蘇雲金桿菌，不同的菌株殺蟲譜存在較大差異，殺蟲毒力相差很大。分離菌株對害蟲的殺蟲譜含擴了鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、食毛目和蜱蟎目等，它們分別代表45種不同的血清型。到目前為止，從這些Bt中發現100多個cry基因，根據cry蛋白的胺基酸順序關聯性，這些基因分成了17個大組。蘇雲金桿菌可以從土壤、植物表面以及昆蟲體內分離得到，但是篩選高毒力、殺蟲譜廣的蘇雲金桿菌需要投入大量的人力和物力；此外由於蘇雲金桿菌發酵條件要求嚴格，發酵密度很難提高；再加上細菌發酵形成芽孢過程中，容易導致菌體自溶，產品不穩定。隨著Bt產品市場需求越來越大，傳統Bt產品已不能適應生產需要。
重組DNA技術為構建新的cry基因提供了更大的靈活性，利用基因工程技術能夠克隆單獨的cry基因，還可以通過改變cry基因的調控序列來提高殺蟲蛋白的表達量。
許多實驗室構建的載體質粒已廣泛應用到cry基因的克隆與表達中。這些種類和數目繁多的各類cry基因表達載體已經轉化到Bt(Takashi，1993；Bruce，1993殺蟲工程進展)、大腸桿菌(範雲六，1991，科學通報)、農桿菌(郭三堆，1991，生物工程學報)、枯草芽孢桿菌(餘學政，1990，生物工程學報)，巨大芽孢桿菌(Bora，1994，應用和環境微生物學)、蠟仗芽孢桿菌(Moar，1994，應用和環境微生物學)以及各種植物組織中(謝道晰，1991，中國科學)，美國的作物遺傳研究所甚至把克隆的Bt毒蛋白基因導入作物內生菌中，但是這些工程菌還很難推向市場，其中有以下原因(1)來自蘇雲金桿菌的Bt毒蛋白基因在不同的宿主菌中表達量很低，需要大劑量的細菌才能起到防蟲殺蟲效果；(2)包括大腸桿菌在內的很多細菌含有內毒素，對人體有害，如果Bt毒蛋白作為粗製產品使用，具有極大的危害，如果作為純化產品使用，將大大提高成本；(3)Bt毒蛋白基因如果在細菌或植物細胞中組成型表達，田間釋放後對環境將構成很大的壓力，抗蟲蛋白功能極容易丟失。
在國內，有多家研究機構進行了Bt基因的克隆和原核表達載體的構建工作。劉子鐸等利用廣宿主質粒pSUP106將Bt基因轉化到熒火假單胞菌中，通過SDS-PAGE分析，可以檢測Bt基因的表達，中國農科院張光炳等利用Tn5轉座子將Bt基因轉化到螢光假單胞菌染色體上，Westernblotting檢測出Bt基因表達。但這些研究思路都不成熟，(1)直接利用蘇雲金桿菌的野生型基因，影響了基因的轉錄和翻譯；(2)都採用組成型表達，發酵密度不高；(3)拷貝數低，難以實現高表達；(4)只能用死菌防止害蟲。研究不夠深入從而影響其應用價值。
本發明目的全合成適合螢光假單胞工程菌高表達殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因。
本發明另一目的利用全合成高表達殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因用於生物防治。
本發明採用螢光假單胞菌作為Bt基因表達的宿主菌，根據螢光假單胞菌的偏愛密碼全合成1.8kb CryIA(c)Bt基因。
CryIA(c)Bt基因合成採用重疊延伸PCR方法，結合高保真的PWO耐高溫DNA聚合酶進行PCR擴增。分兩段進行合成，第一段從ATG起始密碼到1424PstI位點(Bio/technology，1990，8939-943)，共有1429bp核苷酸；第二段從1424PstI位點到終止密碼TGA，共有424bp核苷酸。利用T4連接酶將合成片段在PstI位點連接成完整的基因。合成基因與野生型基因相比，核苷酸的同源性僅為66.8％；616個密碼子中有496個密碼子核苷酸改變；整個基因的核苷酸組成發生了變化，增加了結構穩定的鹼基含量，其中G+C的含量由37.2％提高到64％；mRNA不穩定的AT核苷酸積聚區域序列全部替換；並改動了4個易形成二級發卡結構區域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054CAACAACGTATTGTTG。
全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因核苷酸序列如下BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI- TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI- CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI- CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI- CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI- GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI- CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI- ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI- GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI- GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI- AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI- GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI- GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI- GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI- TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI- CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI- TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI- ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI- GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI- ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比較。兩基因的同源性為66.8％，616個密碼子中有496個密碼子核苷酸改變，以適應螢光假單胞菌中翻譯表達。改動了4個易形成二級發卡結構區域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。改動了23個富含AT的區域。36-43TTATAATT；110-115 ATATTT；185-193 ATATAATAT；198-204 AATTTTT；247-254 TTAATTAA；323-329 AAATTTA；470-475 TTTTAT；495-508AAATTTACATTTAT；566-579 TTATAATGATTTAA；683-696ATATAATCAATTTA；703-708 AATTAA；785-793 AATTAACA 798-809AAATTTATACAAA；815-825 TATTATGAAAT；938-946 AATATTATT；960-966 AAATAAT；1110-1132 TTTTAATATAGGGATAAATAAT；1382-1398 AATTTAATAATATAATT；1441-1452 TTTCTTTTTAATT；1496-1507 TTAGATTAAATA；1515-1524 AAATAACATT；1706-1719ATTTTGGTTATTTT；1752-1758 TAATATA；1770-1777 AAATTTTA；1811-1816 AATTTATT人工全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比較如下BT- ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGGATTCCTTATAATTGTTTAAGTAACC -55BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BT- CTGAAGTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGA -110BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BT- TATTTCCTTGTCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGA -165BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BT- TTTGTGTTAGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGG -220BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BT- ACGCATTTCTTGTACAAATTGAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGC -275BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BT- TAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTAGAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTAC -330BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BT- GCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGATCCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAG -385BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BT- AGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCCCTTACAACCGCTATTCCTCT -440BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BT- TTTTGCAGTTCAAAATTATCAATTTCCTCTTTTATCAGTATATGTTCAAGCTGCA -495BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BT- AATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAAAGGTGGGGAT -550BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BT- TTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATTTAACTAGGCTTATTGGCAA -605BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BT- CTATACAGATCATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAGCGTGTATGGGGA -560BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BT- CCGGATTCTAGAGATTGGATAAGATATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTAA -715BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BT- CTGTATTAGATATCGTTTCTCTATTTCCGAACTATGATAGTAGAACGTATCCAAT -770BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BT- TCGAACAGTTTCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAACCCAGTATTAGAAAAT -825BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BT- TTTGATGGTAGTTTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAGGAAGTATTAGGAGTC -880BTI - TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BT- CACATTTGATGGATATAGTGAATAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGAGG -935BTI - CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BT - AGAATATTATTGGTCAGGGCATCAAATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTTTCGGGG -990BTI - CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BT - CCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACTATGGGAAATGCAGCTCCACAACAAC -1045BTI - CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BT - GTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGAACATTATCGTCCACCTTATA -1100BTI - GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BT - TAGAAGACCTTTTAATATAGGGATAAATAATCAACAACTATCTGTTCTTGACGGG -1155BTI - CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BT - ACAGAATTTGCTTATGGAACCTCCTCAAATTTGCCATCCGCTGTATACAGAAAAA -1210BTI - ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BT - GCGGAACGCTAGATTCGCTGGATGAAATACCGCCACAGAATAACAATGTGCCACC -1265BTI - GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BT - TAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCTTT -1320BTI - GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BT - AGTAATACTAGTGTAAGTATAATAAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTA -1375BTI - AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BT - GTGCTGAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGT -1430BTI - GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BT - GAAGGGAAACTTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGACCAGGATTTACTGGT -1485BTI - GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BT - GGGGACTTAGTTAGATTAAATAGTAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATA -1540BTI - GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BT - TTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATCGACTTCGTGTACG -1595BTI - TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BT - GTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT -1650BTI - CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BT - TTTTCCAATACAGTACCAGCTACAGCTACGTCATTAGATAATCTACAATCAAGTG -1705BTI - TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BT - ATTTTGGTTATTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCATTAGGTAATATAGT -1760BTI - ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BT - AGGTGTTAGAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATAATAGACAGATTTGAATTT -1815BTI - GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BT - ATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAATGA -1848BTI - ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848利用螢光假單胞菌作為Bt基因表達的宿主菌有很多優點(1)發酵時間僅為蘇雲金桿菌的1/3，培養基成份簡單，因此發酵成本降低且可明顯減少雜菌及噬菌體汙染。(2)發酵菌體密度可望提高，而菌體的毒力單位相近。(3)由於蘇雲金桿菌在產生晶體蛋白的同時產生菌體的自溶，故傳統發酵產品穩定性差，不易儲存，且殺蟲有效期僅持續2-3天。而螢光假單胞菌發酵後不溶菌，菌體的胞壁成為毒蛋白的保護層，便於儲存，且殺蟲有效期可延長至12天。(4)螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是植物根際和葉圍微生物的主要類群，一方面能夠在植物表面定植，另一方面能夠對其它有害病原菌產生拮抗作用，起到防病抗蟲的雙重效果。
實施例1CryIA(c)Bt基因的全合成1、全合成60-90 bq長的寡核苷酸2、利用PWO taq DNA聚合酶將寡核苷酸片段連接


圖1連續延伸PCR合成CryIA(c)Bt基因。引物長度為60-90bp.每個引物間有20-30 bp左右重疊。將所有引物加入後進行PCR擴增，中間引物用量為10-20ng，兩邊引物用量為100-200ng。PCR擴增條件為94℃，30 s；65℃，30 s；72℃，2min。共進行35個循環。分兩段進行PCR擴增第一段從ATG起始密碼到1424 PstI位點，共有1429 bp核苷酸第一段的引物為BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA CTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段從1424 PstI位點到終止密碼TGA，共有424 bp核苷酸BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC將兩個片段用T4DNA連接酶相連實施例2CryIA(c)Bt在大腸桿菌中表達圖2大腸桿菌產生蘇雲金桿菌δ-內毒素的SDS-PAGE圖譜實施例3大腸桿菌表達CryIA(c)蛋白的生物活性測定收集帶CryIA(c)表達載體的大腸桿菌菌體和空載菌各50ml，用20ml的重蒸水懸浮，超聲波處理後，按10倍梯度稀釋，分別塗抹於16cm2的甘藍葉片上，烘乾後飼餵三齡菜青蟲，對照組以空載菌蛋白粗提液替代。餵食4天後觀察，100倍稀釋液對菜青蟲的致死率為93.3％(表1)。
表1大腸桿菌表達的CryIA(c)對菜青蟲的毒殺效果處理 活蟲數 死蟲數(％)1 2 3對照(PUT56)20 20 20 0大腸肝菌稀釋液1∶1 0 0 0 1001∶10 0 1 0 98.31∶100 2 1 1 93.3實施例4全合成CryIA(c)基因螢光假單胞菌中表達圖3螢光假單胞菌中CryIA(c)基因表達產物的SDS-PAGE分析實施例5螢光假單胞工程菌殺蟲活性測定二齡菜青蟲的毒殺實驗表明，工程菌蛋白抽提液800倍稀釋後對幼蟲的致死率為40％，測定LD50為0.028μg/cm2(表2)。
表2.螢光假單胞菌表達產物的生物測定
權利要求
1.一種蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，它的核苷酸序列如下BTI -ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI -CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI -CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI -TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI -ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI -CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI -GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI -AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI -GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI -AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI -TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI -CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI -CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI -CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI -CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI -TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI -CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI -CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI -CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI -GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI -CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI -ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI -GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI -GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI -AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI -GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI -GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI -GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI -TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI -CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI -TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI -ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI -GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI -ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848
2.根據權利要求1所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特徵在於Bt基因表達的宿主菌是螢光假單胞菌。
3.根據權利要求1所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特徵在於四個易形成二級發卡結構區域被消除，這四個區域的核苷酸序列如下291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465 TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。
4.一種蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的製備方法，其特徵在於分兩段進行合成，第一段從ATG起始密碼到1424 PstI位點，共有1429bp核苷酸，第二段從1424 PstI位點到終止密碼TGA，共有424 bp核苷酸，再用T4連接酶將第一段和第二段在PstI位點連接而得。
5.根據權利要求4所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的製備方法，其特徵在於引物長度為60-90 bp左右每個引物間有20-30bp左右重疊，將所有引物加入後進行PCR擴增，中間引物用量為10-20ng，兩邊引物用量為100-200ng。
6.根據權利要求5所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的製備方法，其特徵在於第一段合成引物為BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段合成引物為BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC
7.根據權利要求4所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的製備方法，其特徵在於PCR擴增條件為94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，2分鐘共進行35個循環。
8.一種蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，具有生物活性可用作殺蟲劑。
9.根據權利要求8所述的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特徵在於對鱗翅目昆蟲有效。
全文摘要
本發明提供全合成適合螢光假單胞工程菌高表達殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因,採用重疊延伸PCR方法,結合高保真的PWO耐高溫DNA聚合酶進行PCR擴增,分兩段進行全合成及其在生物防治中作為殺蟲劑特別對鱗翅目昆蟲有效。
文檔編號A01N63/00GK1340614SQ0011975
公開日2002年3月20日 申請日期2000年8月25日 優先權日2000年8月25日
發明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生 申請人:上海市農業科學院生物技術研究中心