一種丹參酮IIAPEG‑PLGA‑PEG納米粒及其製備方法與流程
2023-06-04 00:43:26 2
本發明涉及醫藥技術領域，涉及一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備方法及用途。
背景技術：
丹參酮iia（tanshinoneiia）為二萜醌類化合物，是臨床常用活血化瘀中藥丹參的主要有效成分之一，屬於脂溶性的藥物，易溶於有機溶劑，是一種天然的抗氧化藥物。丹參酮iia具有廣泛的藥理作用，丹參酮iia可以通過保護血管內皮細胞、降低體內過氧化脂質、免疫調節等多種方式，起到改善動脈粥樣硬化的作用。臨床研究發現，丹參酮iia還具有抑制心肌細胞凋亡作用，在治療心血管疾病的發展中起關鍵的作用；丹參酮iia不僅在治療心血管疾病方面有廣泛的應用，對於缺血缺氧引起的大腦中樞神經系統損傷也有顯著的治療效果。藥理學實驗已經證明，丹參酮iia的抗炎、抑制細胞凋亡、抗氧化及清除氧自由基的作用，可以用來治療腦缺血等疾病並且效果非常明顯。
雖然丹參酮iia在治療很多腦部疾病方面有廣泛的藥理活性，但是在藥物研發上還有許多問題沒有得到解決，比如丹參酮iia難溶於水，製成水溶性製劑存在困難，且血液循環半衰期短、生物利用度低、跨越血腦屏障的滲透性差等，因此限制了丹參酮iia在臨床的應用。目前，主要是通過磺酸化反應對丹參酮iia進行結構修飾，轉化為水溶性的丹參酮iia磺酸鈉注射液，但是由於丹參酮iia磺酸鈉在血液中半衰期短，快相和慢相分別為26min及108min，因此必須用較大劑量（160mg/250ml/日）進行靜脈滴注【邵鶴生，景錫南，殷蘭琴，顧建峰，趙敏敏。丹參酮iia磺酸鈉在大鼠體內的分布排洩和代謝的研究，《中成藥研究》1979，2：8-12】。此外，磺酸鈉鹽為離子型化合物，較難通過以脂質及蛋白質成分為基礎的生物膜結構系統，使得丹參酮iia的利用率不高，大幅度降低了丹參酮iia的治療效果，而且反覆給藥對正常器官組織的副作用較大。
隨著納米技術的快速發展，直徑小於100nm納米材料的在生物醫學領域得到了廣泛的應用，尤其是在醫學成像、疾病診斷、藥物靶向遞送、癌症精準治療、基因轉染等領域。腦血管疾病的治療，由於血腦屏障的阻礙，大約有98%的親水性小分子和絕大多數大分子都不能通過，使藥物分子難以達到病灶處，限制了對腦血管疾病的臨床療效。而納米藥物載體由於優良的生物相容性、可修飾性等特性，成為腦靶向遞藥系統研究的熱點之一。研究發現，採用納米載藥系統負載化學治療藥物、多肽、蛋白質藥物，能實現緩釋、控釋和靶向給藥的目的，使得這類藥物不會在很短的時間內被降解和清除，從而減少注射給藥頻率，提高患者的順應性同時，經過特異性靶向配體修飾後，可攜載藥物分子透過血腦屏障，顯著提高藥物在腦組織病變部位的有效濃度，達到精準治療腦部疾病的目的。降低其它非病變部位的藥物濃度，減少對機體的毒副作用。
聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),plga)是由乳酸(lacticacid,la)和羥基乙酸(glycolicacid,ga)按照不同比例聚合而成的一種功能性高分子有機材料，已經通過美國的食品藥品監督管理局(fda)認證。目前，已被廣泛用於製備人工導管，藥物緩釋載體(微球、納米粒、微丸)，埋植劑以及膜劑等制【acharyas,sahoosk.plgananoparticlescontainingvariousanticanceragentsandtumourdeliverybyepreffect.advdrugdelivrev.2011,63(3):170-183.；chenyc,liudz,liujj,etal.developmentofterbinafinesolidlipidnanoparticlesasatopicaldeliverysystem.intjnanomedicine.2012,7:4409-4418.】。作為納米藥物載體plga具有以下優點：①由乳酸(la)和羥基乙酸(或稱乙醇酸，ga)聚合而成，合成工藝成熟；②具有可控的粒徑，納米粒分散度小；③具有良好的生物降解性和生物相容性的、無免疫原性；plga共聚物在人體內最終的降解產物是二氧化碳(co2)和水(h2o)，並且可以通過正常的生陳代謝排出體外，因此對人的身體沒有刺激性和毒性。④能夠實現藥物的長時間緩釋（數周或數月），降低了用藥頻率，提高患者順應性；⑤經修飾後的plga納米粒，適於包埋生物活性分子如蛋白、基因dna，疫苗等；⑥在plga表面修飾配基後，可實現藥物的靶向遞送【chohj,yoonis,yoonhy,etal.polyethyleneglycol-conjugatedhyaluronicacid-ceramideself-assemblednanoparticlesfortargeteddeliveryofdoxorubicin.biomaterials.2012,33(4):1190-1200.；collinsmnbirkinshawc.hyaluronicacidbasedscaffoldsfortissueengineering-areview.carbohydrpolym.2013,92(2):1262-1279.】。利用納米載體peg-plga-peg包載丹參酮iia，可以改善丹參酮iia的親水性、生物相容性、生物利用度低等問題。納米粒表面的親水性與親脂性將影響吞噬細胞對其吞噬的快慢，因而要延長丹參酮iia在體內的血液循環半衰期需增加plga表面的親水性。因plga嵌段結晶性較強，且有疏水性，所以極易被res清除，很難將藥物到達靶向部位。而peg-plga-peg三嵌段共聚物具有親水性，且生物相容性好，無毒性、抗原性和免疫原性，易溶於水和許多有機溶劑。通過與plga共聚合成peg-plga-peg，可以將peg和plga的優點結合起來，有效延緩res的清除，延長體循環時間。
技術實現要素：
針對上述丹參酮iia傳統製劑的技術問題，本發明的目的在於提供一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備方法，該方法過程簡單，重現性好。利用這種方法製備的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒，大小均一、具有明顯的球狀結構、穩定性好，載藥量和包封率均較高，分散性好，丹參酮iia載藥納米粒在體內的循環半衰期明顯延長，不易被res清除。
本發明提供一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒：是用三嵌段共聚物peg-plga-peg包載親脂性藥物丹參酮iia，經過冷凍乾燥後，得到性質穩定、大小均一，加水復溶後溶解性好的載藥納米粒。
所述的三嵌段共聚物peg-plga-peg納米載體材料，其分子量為10000～60000；其中，plga的含量為40%～96%，分子量為2000～30000，合成plga過程中乙交酯與丙交酯的比例為1/100～99/100；其中peg的含量為4%～60%，分子量為1000～5000。
所述的丹參酮iia的質量分數為80%～98%；乳化劑的類型為：吐溫80、聚乙烯醇（pva）、泊洛沙姆188、大豆磷脂或卵磷脂其中的一種或幾種的混合物，在內水相和外水相中的質量分數為0.1%～10%；所述的納米粒徑的範圍為100～400nm，納米粒中丹參酮iia的載藥量10%～35%，包封率50%～90%。
一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備方法，工藝如下:
（1）將丹參酮iia和peg-plga-peg溶解在混合有機溶劑中作為油相，將乳化劑溶於去離子水作為內水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相緩慢滴加到有機相中，超聲形成初乳；
（3）將乳化劑溶於去離子水中作為外水相（外水相和內水相中所用的乳化劑為同一種乳化劑），在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，深入外水相的液面下，緩慢滴加超聲震蕩形成復乳；
（4）採用攪拌的方式除去復乳中的有機溶劑，將納米混懸溶液高速離心，用去離子水反覆清洗超聲分散，用微孔濾膜過濾後冷凍乾燥，即可獲得負載丹參iia的peg-plga-peg納米粒。
步驟（1）中加入處方劑量的丹參酮iia的量為1mg/ml～20mg/ml，所用的混合有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯，無水乙醇中任意兩種混合，混合的比例為1:1～1:20，加入的peg-plga-peg的量為0.5mg/ml～50mg/ml。
步驟（3）中初乳與外水相的比例為1：1～1:30，滴加的速度為10～30滴/每分鐘，攪拌的速度為100r/min～700r/min。
所述的一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備方法中，超聲的功率為100w～500w，超聲的方式為超聲2s～60s間歇10s～30s，連續超聲5～40min。
所述的一種包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備方法中，攪拌揮發有機溶劑的時間為4～6h，所用高速離心的轉速為10000r/min～16000r/min,離心時間為20min～60min。
本發明的優點是：
1．本發明製備的包載丹參酮iia，採用的載體材料二嵌段共聚物peg-plga-peg，是一種毒性低、成本低、生物降解性較好的高分子材料，共聚物中的plga在人體內降解時,降解產物可參與新陳代謝,並最終形成二氧化碳(co2)和水(h2o),不會在體內聚集。因此，生物相容性好，無免疫原性，安全性高；
2．載體材料中plga中羥基乙酸（ga）和乳酸(la)的比例為1/100～99/100，降解能力達到最佳能夠緩慢降解，控制藥物緩慢釋放，能充分發揮丹參酮iia的藥理作用；peg親水基團能夠減少血液對納米粒的調理作用，從而延長藥物的血液半衰期；且不使用輔助溶劑，可以避免對其他正常組織器官產生副作用，給藥方便，增加患者適應性；
3．peg-plga-peg為兩親性聚合物，其組成的納米粒經過冷凍乾燥後可以有效的溶於水溶液，其內部疏水性區域可以為丹參酮iia提供空間，提高丹參酮iia的溶解性，改變其在體內的分布，提高生物利用度。
附圖說明
圖1為實施例1製備得到的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒掃描電鏡圖。
圖2為實施例1製備得到的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒粒度分布圖。
圖3為丹參酮iia的高效液相色譜圖。
圖4為實施例1製備得到的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒體外釋放曲線。
圖5為實施例1製備得到的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒組和臨床丹參酮iia注射劑組的血藥濃度-時間曲線。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不局限於這些實施例。
實施例1包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將2mg丹參酮iia和30mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:9）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為0.5%的泊洛沙姆f188溶液作為水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相30μl以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到20ml0.5%泊洛沙姆f188溶液中（初乳復乳比為1:10），超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒，測得納米粒的平均粒徑為158nm，包封率為90%，載藥量為35%。
實施例2包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將4mg丹參酮iia和30mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:8）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為0.5%的吐溫-80溶液作為水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相30μl以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到20ml0.5%吐溫-80溶液中，超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒。測得平均粒徑為180nm，載藥量為27%，包封率為81%。
實施例3包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將8mg丹參酮iia和30mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:8）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為0.5%的pva溶液作為內水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中30μl的內水相以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到20ml0.5%pva溶液中（初乳復乳比為1:10），超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒，測得納米粒的平均粒徑為210nm，載藥量為17%，包封率為74%。
實施例4包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將8mg丹參酮iia和40mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml乙酸乙酯和二氯甲烷（乙酸乙酯：二氯甲烷=1:8）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為1%的pva溶液作為水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相30μl以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到30ml%的pva溶液中（初乳復乳比為1:20），超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.45um微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒，測得納米粒的平均粒徑為240nm，載藥量為12%，包封率為61%。
實施例5包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將2mg丹參酮iia和20mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml無水乙醇和二氯甲烷（無水乙醇：二氯甲烷=1:10）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為1.0%的吐溫-80溶液作為水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相30μl以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到1.0%的吐溫-80溶液中（初乳復乳比為1:5），超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒將，測得納米粒的平均粒徑為196nm，載藥量為20%，包封率為71%。
實施例6包載丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的製備
（1）將10mg丹參酮iia和60mgpeg-plga-peg超聲溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:5）的混合溶劑中作為油相，配製質量分數為1.5%的吐溫-80溶液作為水相；
（2）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（1）中的內水相30μl以10~30滴/每分鐘速度滴加到有機相中，超聲5s間歇5s，連續超聲10min形成初乳；
（3）在冰水浴攪拌的條件下，用注射器吸取步驟（2）中的初乳，採用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分鐘速度滴加到40ml1.5%的吐溫-80溶液中（初乳復乳比為1:20），超聲5s間歇5s，連續超聲20min形成復乳；
（4）室溫下攪拌5h，除去復乳中的有機溶劑，15000r/min高速離心30min，倒掉上清液，用去離子水反覆清洗超聲分散即可獲得載丹參酮的納米混懸溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除去未包裹的藥物，冷凍乾燥，即可獲得負載丹參酮iia的peg-plga-peg納米粒將，測得平均粒徑為260nm，載藥量為10%，包封率為53%。
實施例7丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒的載藥量及包封率的測定
採用高效液相色譜測定丹參酮iia的含量:色譜柱：watersc18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇：水=75:25（v/v）柱溫：25℃流速：1.0ml/min紫外檢測波長：268～270nm，進樣量：20μl；
分別取濃度為1、5、10.0、25.0、50、80、100μg/ml的丹參酮iia標準品溶液，按照色譜條件進行測試，以峰面積對丹參酮iia濃度進行擬合，建立回歸方程。精密稱取凍幹好的2mg丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒，置於10ml容量瓶中，用甲醇稀釋後搖勻定容。0.22μm微孔濾膜過濾後，進樣3次每次20μl。用hplc檢測，測定峰面積，根據標準曲線回歸方程，計算丹參酮iia的含量。根據以下公式，可以求得載藥量和包封率(丹參酮iia高效液相色譜圖如圖3所示)，包封率%=（納米載體中所含的藥量/投入的總藥量）×100%，載藥量%=（納米載體中所含的藥量/投入的總藥量）×100%。
實施例8:丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒外觀形態、zate電位、粒徑大小和分布的測定。
實施例9:使用掃描電子顯微鏡觀察納米粒(實施例2製備)的外觀形態，如圖1所示，採用雷射粒度分析儀可測定納米粒的粒徑分布及zeta電位，如圖2所示。
實施例10丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒體外釋藥的測定。
精密稱量丹參酮iia原料藥和冷凍乾燥後的丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒各8mg，分別置於5ml0.01mol/l的ph=7.4pbs緩衝液中，再放入50ml的離心管，立即置於37±1℃恆溫水浴搖床中，100r/min勻速攪拌，並保持漏槽條件。分別於0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h規定的時間點取樣1ml，同時補充等量等溫的新鮮介質。樣品經15000r/min離心25min後，取出上清液用0.22μm微孔濾膜過濾後，加一倍量的甲醇稀釋後進樣20μl，記錄峰面積，代入標準曲線，計算溶液中丹參酮iia的濃度液，計算規定時間內的藥物累計釋放率。每個樣品平行操作3份，以累積釋放率的平均值對時間繪製體外累計釋放曲線（如圖4所示）。
實施例11:丹參酮iiapeg-plga-peg納米粒大鼠體內藥動學性質考察。
使用健康雄性sd大鼠，隨機分為兩組（n=10），每組5隻，空白丹參酮iia（10mg/kg）混懸在羧甲基纖維素鈉溶液中，peg-plga-peg納米粒(含有tiia10mg/kg，實施例1製備)分散於生理鹽水中，分別通過尾靜脈注射，分別於給藥後（0,5,15,30和45分鐘;1,2,4,6,8,12、24和36小時），通過尾靜脈收集血樣（0.5ml），4000r/min離心l0min，取上清(血清)200μl,加入500μl甲醇，渦旋3min,7000r/min離心l0min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，使用高效液相法測定濾液中丹參酮iia的濃度，計算血液中丹參酮iia的濃度，繪製peg-plga-peg納米粒組和臨床丹參酮iia注射劑組血藥濃度一時間曲線(如圖5所示)。