使用表達人的ENaC的卵母細胞的改進的電生理測定法和用於在使用膜電位報告染料的測...的製作方法

2023-06-04 18:49:56

專利名稱：使用表達人的ENaC的卵母細胞的改進的電生理測定法和用於在使用膜電位報告染料的測 ...的製作方法
技術領域：
本發明部分涉及新的基於細胞的測定法，所述測定法使用表達氨氯吡嗪脒敏感性鈉通道的重組宿主細胞表徵、篩選和鑑定味覺調節性化合物。更特別地，本發明涉及利用表達功能性人上皮鈉通道(hENaC)的受試細胞，優選地兩棲動物卵母細胞或哺乳動物細胞的測定，和在基於細胞的高通量或中通量測定中(優選地電生理測定)利用細胞中的這些受試細胞鑑定增強或阻斷hENaC功能的化合物。
背景技術：
氨氯吡嗪脒敏感性上皮鈉通道(ENaC)介導鈉流入舌上的味蕾細胞的頂部膜(Heck，等人，Science(1984)223403-405)。ENaC，參與鈉運輸的離子通道的ENaC/退化蛋白超家族的成員，由三個部分同源的α、β、γ亞基組成，所述亞基在味覺組織中的菌狀乳頭、follate乳頭、輪廓乳頭以及舌上皮細胞(Li，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911814-1818；Kretz，等人，J.Histochem.Cytochem.(1999)47(1)51-64；Lin，等人，J.Comp.Neurol.(1999)405406-420；Xiao-Jiang，等人，Mol.Pharmacol.(1995)471133-1140)中在RNA和蛋白水平上都有表達。
已從腎細胞中分離編碼氨氯吡嗪脒敏感性上皮鈉通道(ENaC)的通道亞基互補DNA(cDNA)並且將其在哺乳動物細胞系中表達。在該系統中表達的通道已顯示和遠端腎鈉通道具有相似的特徵，即高鈉選擇性、低傳導性和氨氯吡嗪脒敏感性。天然發生的ENaC通道的一種形式由三種相似結構的亞基組成α(OMIM Entry 600228)、β(OMIMEntry 600760)和γ(OMIM Entry 600761)。各亞基據預測包含2個跨膜跨越結構域、細胞內氨基和羧基端和富含半胱氨酸的細胞外結構域。三個亞基在胺基酸序列上具有32至37％的同一性。也鑑定了α-ENaC可變剪接形式，顯示了氨氯吡嗪脒敏感性鈉通道的α亞基的不均一性，所述不均一性可解釋在該通道純化過程中觀察到的蛋白多樣性(參見美國專利號5,693,756，此處引用作為參考)。
已知ENaC鈉通道功能的抑制劑氨氯吡嗪脒在許多非哺乳類動物和哺乳動物包括人中消弱對氯化鈉的味覺反應(Halpern，Neuroscience and Behavior Reviews(1998)235-47，所有資料在此引用作為參考；Liu，等人，Neuron(2003)39133-146；Zhao，等人Cell(2003)115255-266)。在人中，據報導，當以特異性地抑制ENaC功能的濃度使用氨氯吡嗪脒時，氨氯吡嗪脒減少15-20％氯化鈉的強度(Halpern，Neurosciences and Behavior Reviews(1998)235-47，所有資料在此引用作為參考；Feldman，等人，J.Neurophysiol.(2003)90(3)2060-2064)。因此，增加通過ENaC通道的鈉離子運輸的化合物可用作一般的鹽味覺增強劑並在我們前面的專利申請(PCT WO 02/087306 A2)中提出的用於增加人的鹽味感覺。此外，基於公開的電生理數據和人ENaC在味蕾細胞中表達的發現，建立了通過ENaC介導鹽味覺傳導的模型。還有，提出了ENaC在鑑定刺激或阻斷鹽味感覺的物質中的用途(參見美國專利號5,693,756，同上，和PCT WO 02/087306 A2)。
普遍用於ENaC生理學表徵的基於細胞的功能性表達系統是非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞和培養的哺乳動物細胞系。所述卵母系統具有優於哺乳動物細胞的有利方面，其在於其允許直接注射多mRNA，提供高水平的蛋白表達，和能容納ENaC過量表達所固有的有害效應。然而，該系統的缺點是非洲爪蟾卵母細胞中的電生理記錄不易用於篩選大量化合物並且非洲爪蟾卵母細胞是兩棲動物而不是哺乳動物系統。在文獻中已報導了穩定地表達嚙齒類動物ENaC通道的哺乳動物細胞(HEK293和MDCK)中的ENaC通道的電生理特徵。儘管這些研究使用了哺乳動物細胞系，但仍使用繁瑣的電生理技術測定通道功能。這些方法不能使其自身適合於高通量的化合物篩選。因此，本領域仍就存在對適合於高通量篩選的鹽味覺增強劑的鑑定的需要。
鹽味覺增強劑的發展已成為許多以前的科學出版物和專利的焦點。然而，參與鹽味覺感覺的ENaC鈉通道的直接調節是新的和獨特的增強人鹽味覺的方法。下面討論一些以前報導的鹽增強性化物和其特性的一些實例。
據報導一些經蛋白酶解的蛋白、肽、胺基酸和胺基酸酯用作鹽增強劑(Tamura，等人，Argic.Biol.Chem.(1989)53(6)1625-1633，1989；美國專利5,711,985)。然而，這些試劑要求高濃度(30-60mM之間)，並且必須補充以鹽酸以正向調節鹽味覺。此外，合成這些化合物的成本和困難阻礙了其大規模商業用作用於大眾的鹽增強劑。
已報導氯化膽鹼，聯邦政府將其分類為GRAS(通常被認為是安全的)化合物的銨鹽，在人和嚙齒類動物中用作鹽增強劑。在人中，氯化膽鹼通過兩個因素中的一個增加稀釋的鹽溶液(低於50mM NaCl)的鹽度，並且據報導增加了煮熟的豌豆和Campbell′s低鹽番茄湯(Locke，等人，Physiology Behavior(1994)55(6)1039-1046；US Patent 5,260,091；US Patent 5,260,049)的有利方面或享樂比例。然而，與上述的肽和胺基酸相似，氯化膽鹼要求較高濃度(mM範圍內)以增強鹽味。
據報導氨氯吡嗪脒的衍生物和氯通道阻斷劑例如IAA-94和鄰氨基苯甲酸在嚙齒類動物模型系統(美國專利5,260,091)中增加流體的吸收量(鹽消耗的間接測量)，所述氨氯吡嗪脒的衍生物不阻斷ENaC功能但阻斷鈉-質子交換。然而，還未報導過這些試劑用作人的鹽增強劑。
已報導當以低濃度(高μM範圍)使用Cetylpyridiuniumchloride(CPC)時，其在大鼠中增加了對鹽的氨氯吡嗪脒敏感性神經應答和在人中增加了50％的低鹽Campbell′s番茄湯的鹽度(DeSimone，等人，J.Neurphysiol.(2001)862638-2641；美國專利4,997,672)。然而，CPC是去垢劑並且基於其結構可能插入到細胞的脂質雙層，從而通過破壞脂質的動態平衡非特異性地激活鹽味覺細胞。的確，高於臨界微團濃度的高濃度CPC(低mM範圍)實際上抑制了大鼠神經對大量鹽化合物包括氯化鈉、氯化鉀和氯化銨的應答，進一步支持了報導的觀察到的CPC效應可能是非特異性的。
海藻糖，由兩個葡萄糖分子構成的二糖，據報導增加氯化鈉溶液的鹽度1.2至2倍(美國專利6,159,529)。類似於肽和氯化膽鹼，高水平(1.5-12％)的該糖是增強鹽度所必需的，暗示著觀察到的效應可能是非特異性和可歸因於由高滲性造成的味覺細胞體積變化(細胞皺縮)。此外，沒有提到海藻糖和其它前面提到的增強鹽味覺但不調節其它味覺(包括甜味、苦味、酸味和umami)的增強劑的特異性。
alapyridaine，一種在加熱的糖/胺基酸混合物中作為副產品形成的胺基酸丙氨酸的衍生物，據報導使檢測氯化鈉的閾值減少了5倍(Soldo等人，Chemical Senses(2003)28371-379，2003；Ottinger，等人，J.Agric Food Chem(2003)511035-1041，2003)。然而，據報導alapyridaine用作一般的味覺增強劑並降低鹽味以及甜味和umami味的檢測閾值。此外，alapyridaine在更高、更生理學相關的鹽濃度上對鹽味覺的效應還未弄清楚。因此，當品味閾值檢測水平附近的低鹽濃度時，alapyridaine的效應可能只是表面的。
據報導抗生素新生毒素在大鼠(Feigin等人，Am.J.Physiol.(1994)266Cl165-C1172)中也增強對氯化鈉的神經應答。然而，據報導新生黴素不利地在脂雙層中形成氨氯吡嗪脒非敏感性陽離子選擇性離子通道，暗示著該試劑在細胞膜上穿孔，從而可能類似於CPC，非特異性地增加了味覺細胞的活性。新生黴素對人鹽味感覺的效應從未報導過。
已報導Bretylium tosylate(調節腎上腺素和毒蠅鹼受體的抗原纖維藥物)在齧齒動物和人中特異性地加強鹽味而不影響甜味、酸味或苦味(Schiffman等人，Physiology和Behavior(1986)361129-1137)。然而，Bretylium tosylate的明顯的不利方面，除了正向調節鹽味所必需的相對高濃度(mM範圍)外，是所述化合物是用於治療心臟病患者的治療劑。因此該化合物不適合用於普通人群。
據報導，Glybenclamide，ATP結合盒(ABC)蛋白超家族成員的抑制劑，包括囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白和磺醯脲受體，通過個體ENaC通道開放概率的加倍(Chraibi等人，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics (1999)290341-347，1999；Schnizler等人，Biochemica et Biophysica Acta(2003)1609170-176)增加氨氯吡嗪脒敏感性ENaC鈉流。然而，因為Glybenclamide調節ABC蛋白的功能，所以Glybenclamide的效應可能歸因於通過ABC蛋白對ENaC活性的間接調節而不是歸因於ENaC通道功能的直接調節。此外，還未證明Glybenclamide增強人鹽味感覺，也未表明Glybenclamide是鹽味增強劑。
因此，基於前述，很明顯需要改進的用於鑑定特異性調節ENaC和鹽味的化合物的方法和改進的鹽味調節劑。優選地，這些方法包括高或中通量方法並且用於篩選對人ENaC功能具有直接作用的化合物。
發明簡述本發明克服了現有技術中涉及用於鑑定調節ENaC的化合物的測定法的問題。特別地，本發明提供了基於細胞的測定法，所述測定法利用表達功能性人ENaC的重組宿主細胞，優選的哺乳動物或卵母細胞以鑑定調節ENaC從而調節鹽味的化合物。更特別地，本發明提供了基於卵母細胞和哺乳動物細胞的測定法，用於表徵和篩選鈉通道尤其是氨氯吡嗪脒敏感性上皮鈉通道(ENaC)，優選地高或中通量的方法，所述測定方法任選地可包括加入部分或完全抑制ENaC功能的化合物，優選地氨氯吡嗪脒或氨氯吡嗪脒衍生物例如phenamil。已發現在測定過程中，優選地用於鑑定調節(增強或抑制)ENaC功能的高或中通量的測定過程中，使用phenamil特別能增強信號的強度。這些方法可用於功能性表徵ENaC活性或鑑定增強或阻斷鹽味感覺的化合物(此處稱為鹽味調節劑)。
因此，本發明的第一方面提供了表達功能性人hENaC重組宿主細胞，優選地的哺乳動物細胞或兩棲動物的卵母細胞。在優選的實施方案中這些細胞短暫地或穩定地表達hENaC的所有三個亞基(α或δ、β和γ)，或短暫地或穩定地表達一個或多個亞基或其功能性嵌合體、變體或片段。適合用於本發明的哺乳動物細胞包括任何能夠表達功能性hENaC的哺乳動物細胞，包括例如COS、CHO、MDCK、HEK293、HEK293T、NIH3T3、Swiss3T3和BHK細胞。然而，在優選的實施方案中，本發明提供了表達功能性hENaC的HEK293T細胞。用於本發明的卵母細胞優選地包括兩棲動物的卵母細胞，例如，非洲爪蟾的卵母細胞。
在第二方面，本發明提供了基於細胞的測定方法，所述測定方法利用表達功能性ENaC優選地hENaC的哺乳動物細胞或兩棲動物卵母細胞鑑定增強或阻斷ENaC功能的化合物，其包括例如有機小分子、抗體、肽、環肽、脂和核酸。優選地，這些測定法包括在加入一種或多種假定的ENaC調節化合物之前以部分抑制ENaC功能的濃度加入已知的ENaC抑制劑。
優選地所述測定法包括基於哺乳動物或卵母細胞的測定法，優選地高或中通量的，用於表徵和篩選假定的上皮鈉通道(ENaC)的調節劑，其包括(i)在含有鈉的緩衝液存在的情況下將表達ENaC載有膜電位螢光染料或鈉敏感性螢光染料的受試細胞與至少一種假定的調節劑化合物接觸；(ii)在加入所述的至少一種假定的調節劑化合物之前，將所述宿主細胞和以至少部分抑制ENaC功能的濃度的已知的抑制ENaC功能的化合物接觸，所述化合物優選地是氨氯吡嗪脒衍生物例如phenamil；和(iii)監控在加入已知的ENaC抑制劑化合物後，與假定的調節劑和鈉接觸的細胞中膜電位染料或鈉敏感性染料的螢光變化，將其與與只與鈉接觸的細胞中的膜電位染料或鈉敏感性染料的螢光變化比較以確定ENaC調節的程度。
在本發明的另一優選的方面，提供了用於監控上皮鈉通道(ENaC)活性的方法，其包括(i)提供受試細胞，例如，用功能性ENaC轉染或轉化的哺乳動物細胞；(ii)將所述受試細胞接種在多孔板的小孔中並溫育長達足以達到至少大約70％匯合的時間；(iii)在多孔板的小孔中用膜電位螢光染料或鈉敏感性螢光染料染料荷載(dye-loading)所述接種的受試細胞；(iv)在多孔板的小孔中將所述荷載染料的受試細胞與至少一種假定的調節性化合物接觸；(V)在加入所述至少一種假定的調節性化合物之前，進一步將所述宿主細胞與部分抑制ENaC功能的化合物例如氨氯吡嗪脒衍生物例如phenamil接觸；和(Vi)利用螢光板讀出計監控螢光的任何變化。
在本發明的另一個優選的實施方案中，(i)用編碼產生功能性人ENaC所必需的亞基的DNA序列轉化、轉染合適的細胞，例如HEK293T細胞或另一種哺乳動物細胞系；(ii)將所述細胞接種在多孔板中，例如，384孔板，優選地培養至大約80％匯合；(iii)將膜電位敏感染料例如CC2-DMPVE或DiSBAC2(3)荷載所述接種的受試細胞中；(iV)然後將荷載染料的細胞與至少一種假定的ENaC調節性化合物接觸；(V)在與所述至少一種ENaC調節性化合物接觸之前優選地進一步將荷載染料的細胞與以導致至少部分ENaC抑制的濃度量的至少一種已知的ENaC抑制劑接觸；和(iv)使用電壓強度板讀出器，例如，VIPRII(Aurora Biosciences)監控細胞螢光的變化。
在本發明的另一方面，提供了用於鑑定鹽味調節化合物的方法，其包括(i)提供用功能性人ENaC轉染、轉化的受試細胞；(ii)將所述受試細胞接種在多孔板的孔中並溫育足以達到至少約70％匯合、優選至大約80％匯合的時間；(iii)在多孔板的小孔中用膜電位染料染料荷載所述接種的受試細胞；(iv)在多孔板的小孔中使荷載染料的受試細胞與至少一種假定的調節化合物接觸；(v)優選在加入所述至少一種假定的調節化合物之前進一步將荷載染料的受試細胞與以至少部分抑制ENaC功能的濃度的已知的ENaC抑制劑化合物接觸，例如，氨氯吡嗪脒染生物，如phenamil；(vi)使用螢光板讀取儀監測調節劑/ENaC相互作用引起的膜電位染料螢光的任何變化和(vii)基於監測到的螢光變化將所述至少一種假定的調節劑鑑定為鹽味調節化合物。
在本發明的另一優選實驗方案中，(i)用編碼產生功能性人ENaC必須的亞基的DNA序列轉染或轉化合適的細胞，例如HEK293T細胞；(ii)將所述細胞接種在多孔板中，例如384孔板中，優選地培養至80％匯合；(iii)將所述接種的受試細胞用膜電位敏感染料例如CC2-DMPVE或DiSBAC2(3)荷載；(iv)然後將荷載染料的細胞與至少一種假定的ENaC調節性化合物接觸；(v)優選地在此之前將荷載染料的細胞與以至少部分抑制ENaC功能的濃度的已知的抑制ENaC功能的化合物例如氨氯吡嗪脒的衍生物例如phenamil接觸；(vi)使用電壓強度板讀出計例如VIPRII(Aurora Biosciences)監控細胞螢光的變化；和(vii)基於螢光強度的變化選擇調節鹽味的化合物。
在本發明另一個優選的實施方案中，提供了電生測定方法，優選地兩電極電壓鉗測定方法(two-electrode voltage clamp assay)，其中基於其對卵母細胞優選地兩棲動物卵母細胞(蛙)中的宏觀電流的影響(抑制或增強)來鑑定人ENaC調節性化合物，所述卵母細胞表達功能性人ENaC鈉通道。這些測定方法在鑑定ENaC調節劑方面比其它基於細胞的測定方法有改進，部分因為卵母細胞幾乎不表達內源離子通道；因此所述卵母表達系統有利地允許直接測量ENaC鈉通道流並且只有很小的或無背景。
在本發明的另一個優選的實施方案中，這些生理測定法進一步將所述卵母細胞與ENaC的至少部分抑制劑，例如氨氯吡嗪脒或氨氯吡嗪脒衍生物接觸，以作為對照或增加可測量的鈉通道細胞流的變化。
在本發明的另一個優選的實施方案中，提供了功能性表達人ENaC鈉通道的蛙卵母細胞，所述卵母細胞表達人ENaCα、β和γ或δ、β和γ亞基。
在本發明的另一個優選的實施方案中，用於根據本發明的基於細胞的測定法中的ENaC可由天然發生的人ENaC亞基、一個或多個可變剪接的人ENaC亞基或其功能性變體構成。可選擇地，所述ENaC可由至少天然發生的人ENaCα亞基或其可變剪接形式構成。在另一個實施方案中，δ亞基(例如Genebank目錄號U38254；參見JBiol Chem，270(46)27411-4(1995))或其變體可替代α亞基。
優選地，這些亞基由下文公開的SEQ IDNO.1、2、3和7編碼。通過下列詳細的描述、附圖和權利要求，本發明的這些和其它方面對本領域技術人員將變得顯而易見。
附圖詳述

圖1說明導致鈉依賴性的氨氯吡嗪脒敏感性螢光變化的hENaC的功能性表達。與模擬轉染的細胞相比，用變化的1∶1∶1比例的人腎ENaC的α、β和γ亞基質粒轉染HEK293T細胞導致Na+依賴性的氨氯吡嗪脒敏感性電壓變化。用111∶1的α、β和γ質粒比例分別以絕對水平4.4.1和0.25轉染A、B、C和D。用β-gal和pUC模擬感染E和F。轉染效率為大約40％，細胞密度為大約70％。所有圖形(trace)來自單個具有A(n＝4)、B、C、D、E(n＝12和F(n＝8)的板。
圖2說明表達hENaCα、β和γ的HEK293T細胞的NaCl劑量反應關係。
圖3說明用50mM NaCl處理的表達人hENaCα、β和γ的HEK293T細胞的氨氯吡嗪脒劑量反應關係。
圖4說明使用電壓成像板讀出計(VIPR)產生的表達ENaC的HEK293T細胞的NaCl劑量反應關係。用表達ENaC亞基的質粒(ENaC)或載體質粒(模擬物)轉染HEK293T細胞。24小時後，用膜電位染料荷載細胞並在VIPRII(Aurora Biosciences)上監控響應Na+刺激的細胞的螢光變化。只有表達ENaC的細胞表現響應Na+濃度增加的變化。
圖5也說明表達人ENaC的HEK2933T細胞的NaCl劑量反應關係。HEK293T細胞用ENaC亞基表達質粒(ENaC)轉染，24小時後細胞用膜電位染料荷載，並且在VIPRII(Aurora Biosciences)上監測響應Na+刺激的細胞螢光的變化。Phenamil，ENaC拮抗劑，抑制Na+誘導的螢光變化。相反地，化合物「X」，ENaC增強劑，增加Na+誘導的螢光變化並且該效應被phenamil抑制。
圖6顯示增加的phenamil濃度對ENaC活性的影響。藍色圖線Phenamil對ENaC活性的抑制。紅色圖線在100μM化合物478354(ENa(增強劑))存在的情況Phenamil對ENaC活性的抑制。黑框包含顯示在Phenamil不存在時的化合物478354的效應數據。黃框包含顯示在不斷增加濃度的Phenamil存在的情況下增強的478354的效應的數據。
圖7A.在Phenamil不存在時Z′的分布。「Z′」定義為1-((在化合物478354存在時3X ENaC反應標準差+3X ENaC反應標準差)/在478354存在時的ENaC平均活性-ENaC的平均活性)。大多數Z′值小於0，表明當用於高對照時，479354不能提供有意義的測定窗口。
圖7B.在0.5μM Phenamil存在的情況下Z′的分布。Z′定義為1-((3X ENaC反應標準差+3X在478354存在的情況下ENaC反應標準差)/(在478354存在的情況下平均ENaC活性-平均ENaC活性))。大多數Z′值＞0並且≤1，表明作為高對照，在Phenamil存在的情況下478354可提供有意義的測定窗口。
圖8說明就增加ENaC活性的化合物篩選注射了人ENaC cRNA的卵母細胞的實例。對於各被篩選的化合物，計算％增強因子。該值對應於由化合物造成的電流變化量值除由氨氯吡嗪脒造成的電流變化量值乘以-100％。在該示例中，在OpusXpress系統中，在可能最多8個電壓被鉗制在-60mV的卵母細胞的7個中連續篩選兩種化合物。所有7個卵母細胞表達ENaC，由氨氯吡嗪脒對測量的卵母細胞電流的抑制作用所證實。
圖9說明如何為各注射有人ENaC cRNA的卵母細胞計算％增強因子的示例。確定各被篩選的化合物的、平均的和確定標準差的％增強因子。在這種情況下，化合物1和化合物2對應於在圖8中在編號為2至8的細胞中篩選的化合物。
圖10說明篩選未注射人ENaC cRNA的卵母細胞的示例。化合物對在所述卵母細胞膜上內源性表達的離子通道的活性沒有影響，表明化合物的活性是ENaC依賴性的並且可歸因於增細的流經ENaC通道的宏觀鈉流。該圖也顯示由於缺少ENaC鈉通道表達，氨氯吡嗪脒對未注射的卵母細胞沒有作用。
圖11說明在化合物存在和不存在的情況下在注射有人ENaC cRNA的卵母細胞或未注射的卵母細胞中I/V曲線的示例。在經注射的卵中，化合物增加I/V曲線的斜率，而在未注射的卵母細胞中化合物對I/V曲線的斜率沒有作用(即，在化合物存在和不存在的情況下曲線相同)。
圖12說明氨氯吡嗪脒競爭實驗的示例。在注射有人ENaC cRNA的卵母細胞中，氨氯吡嗪脒和化合物的共同使用不增強流經ENaC通道的鈉流。這表明化合物直接對ENaC通道起作用；當ENaC通道由於氨氯吡嗪脒的原因被關閉時，化合物不能增加ENaC功能。
圖13說明2種化合物在注射有人ENaC cRNA的卵母細胞中的劑量反應曲線。化合物A的更大的EC50(化合物A的5.4μM與化合物B的0.47μM比較)和右移的劑量反應曲線表明其沒有化合物B有效。
圖14示意性地舉例說明用於通過使用兩電極電壓鉗(TEVC)技術檢查化合物在卵母細胞表達系統中對人ENaC活性的影響的一組實驗。
發明詳述本發明提供了包含受試細胞，優選地表達功能性hENaC的重組哺乳動物細胞或兩棲動物卵母細胞的測定系統以及基於哺乳動物細胞和基於兩棲動物卵母細胞的測定方法，用於表徵和篩選上皮鈉通道(ENaC)，優選地高或中通量測定方法。更特別地，本發明提供了表達能用於篩選ENaC調節劑的基於細胞的測定法中的hENaC的α、β和γ亞基的人細胞系例如HEK293T細胞和兩棲動物卵母細胞。本發明也提供了哺乳動物細胞和兩棲動物卵母細胞，所述細胞表達由δ、β和γ亞基構成的功能性ENaC，用於功能性表徵ENaC活性和鑑定增強或阻斷鹽味感覺的化合物(此處稱為鹽味調節劑)。這些化合物可作食物、藥物和飲料中的成分以增強、調節、抑制或阻斷鹽味。
然而，在更詳細地討論本發明之前，提供下列定義。應當理解技術術語或短語有其一般的意思，正如由本領域技術人員所解釋的意思。
定義如此處所用的，術語「鹽味」或「鹽味感覺」是指受試者對鹽味刺激的感覺和反應。如上面所討論的，據信hENaC參與鹽味感覺，特別是在人受試者中引起「鹽味」的鹽。這種刺激物包括在功能性ENaC、優選地hENaC中引起反應的化合物例如NaCl。
術語「ENaC」亞基蛋白或其片段，或編碼「ENaC」蛋白的三個亞基中的一個或其片段的核酸是指核酸和多肽、多態性變體、等位基因、突變體和種間同源物，其(1)具有胺基酸序列，所述胺基酸序列優選地在至少大約25、50、100、200或500、或更多胺基酸的區域上具有與胺基酸序列(由包含於SEQ ID NO1、2或3的核酸序列編碼的)超過大約80％的胺基酸序列同一性、85％、90％、優選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的胺基酸序列同一性；或(2)特異性地結合產生的抗包含由SEQ ID NO1、2或7編碼的胺基酸序列的免疫原或其免疫原性片段和其保守修飾的變體的抗體，例如多克隆抗體；或(3)在嚴緊雜交條件下特異性地與對應於編碼ENaC蛋白的核酸序列例如SEQ ID NO1、2、3或7的反義鏈或其互補序列和其保守修飾的變體雜交；或(4)具有核酸序列，所述序列優選地在至少大約25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的區域上具有與SEQID NO1、2、3或7或其互補序列超過大約80％的序列同一性、85％、90％、優選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性；或(5)當在HEK細胞中表達和通過使用兩電極完整細胞電生理學或通過響應鈉或鋰的膜電位染料的螢光變化測試時，在鈉傳導測定中與此處描述的hENaC功能性等同。
功能性等同的ENaC蛋白包括ENaC亞基，所述ENaC亞基具有不同於下面鑑定的序列的一級序列，但具有如功能性測定法例如下文描述的鈉傳導測定法確定的等同功能。
「確定功能性效應」是指測定化合物增加或減小參數的效應，所述參數是間接或直接地在ENaC多肽的影響例如功能性、物理和化學效應之下。這些功能性效應包括但不限於離子流量、膜電位、流振幅和電壓門控上的變化和其它生物學效應例如任何標記基因的基因表達變化等。離子流可包括任何通過通道的離子，例如鈉或鋰和其類似物例如放射性同位素。這些功能性效應可通過任何本領域技術人員已知的方法進行測量，例如通過使用兩電極電生理學或電壓敏感染料或通過測量參數例如光譜特徵(例如，螢光、吸光率、折射率)、流體力學(例如，形狀)、層析或可溶性特徵的改變來進行測量。優選地ENaC功能可通過使用兩電極完整細胞電生理學或通過監控響應鈉或鋰的膜電位染料的螢光變化來估計。
ENaC多核苷酸和多肽序列的「抑制劑」、「激活劑」和「調節劑」是指使用基於細胞的測定法鑑定的激活、抑制或調節的ENaC多核苷酸和多肽序列的分子。抑制劑是例如結合ENaC蛋白、部分或完全阻斷、減少、阻止、延遲活性、失活、降低敏感或下調ENaC蛋白的活性或表達的化合物，例如，拮抗劑。
「激活劑」是增加、開放、激活、促進、增強活性、敏化、激動或上調ENaC蛋白活性的化合物。抑制劑、激活劑或調節劑也包括ENaC蛋白的遺傳上經修飾的形式，例如具有改變的活性的形式和天然發生和合成的配體、拮抗劑、激動劑、肽、環肽、核酸、抗體、反義分子、核酶、有機小分子等。這些用於抑制劑和激動劑的測定方法包括，例如，在細胞、細胞提取物或細胞膜中表達ENaC蛋白，使用假定的調節劑化合物，和任選地在此之前將所述ENaC蛋白與以導致部分ENaC抑制的濃度的已知的ENaC抑制劑接觸，然後如上所述確定旋光化合物(rotation compound)對活性的功能性效應。
將包含用潛在的激活劑、抑制劑或調節劑處理的ENaC蛋白的樣品或測定法與不具有抑制劑、激活劑或調節劑的對照樣品比較以考查激活、抑制或調節的程度。在一個測定的實施方案中，對化合物就其對細胞(被提供以亞適宜的鈉濃度)反應的影響進行檢測。用亞適宜的鈉濃度但缺少化合物處理的對照細胞通常表現最大反應的10-20％。增加對亞適宜鈉濃度的反應高於10-20％水平的化合物是假定的ENaC增強劑。相反，降低反應至低於10％的化合物是假定的ENaC增強劑。
如此處所用的，術語「受試化合物」或「受試候選者」或「調節劑」或其語法等同詞描述要對其調節ENaC活性的能力進行檢驗的任何分子，所述分子是天然發生的或合成的，例如蛋白、寡肽(例如，在長度上從大約5至大約25個胺基酸，優選地在長度上從大約10至20個或12至18個，優選地在長度上為12、15或18個胺基酸)、有機小分子、多糖、脂(例如，鞘脂)、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。受試化合物可以受試化合物文庫的形式存在，例如提供足夠多樣性範圍的組合或隨機化文庫。將受試化合物任選地與融合配偶體例如靶向化合物、拯救化合物、二聚化化合物、穩定化化合物、可尋址化合物和其它功能性部分連接。常規地，通過鑑定具有想要的性質或活性例如增強活性的受試化合物(稱為「前導化合物」)、產生前導化合物的變體和估計這些變體化合物的性質和活性來產生具有有用性質的新化學實體。優選地，高通量篩選(HTS)方法用於這樣的分析。
「有機小分子」是指天然發生的或合成的有機分子，所述分子具有大於大約50Da和小於大約2500Da、優選地小於大約2000Da、優選地在大約100至大約1000Da，更優選地在大約200至大約500Da之間的分子量。
「生物學樣品」包括組織切片(section)例如活檢組織和屍體剖檢的樣品和用於組織學目的的冷凍切片。這些樣品包括血液、唾液、組織、培養細胞例如原代培養物、外植體和轉化的細胞、糞便、尿等。生物學樣品通常獲自真核生物體，最優選地哺乳動物例如靈長類動物例如黑猩猩或人、牛、狗、貓；齧齒動物例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔或鳥類、爬行類動物或魚。
「抑制ENaC活性的化合物」是指抑制鈉通道活性的化合物，優選地當將該化合物與功能性ENaC接觸時，所述抑制作用是可逆的。這類化合物的優選實例是氨氯吡嗪脒和氨氯吡嗪脒衍生物例如Phenamil、benzamil、3′，4′-dichlorobenzamil、乙基異丙基氨氯吡嗪脒(ethylisopropylamiloride)；5-(N-4-氯苯甲基)-2′，4′二甲基-benzamil、5-(N-甲基-N-胍基羰基)甲基)氨氯吡嗪脒；5-(N，N-hexa-myethylene)氨氯吡嗪脒；5-(N-乙基-N-異丙基)氨氯吡嗪脒(EIPA)；5-(N-4-氯-苄基)2′，4′dimethylbenzamil；2′，4′-dimethylbenzamil；2′，3′-benzo-benzamil等。
「氨氯吡嗪脒衍生物」是指具有類似於抑制ENaC功能的氨氯吡嗪脒的結構的化合物。通常這類衍生物在胍取代基(例如，Phenamil)或在5-N位置(例如，ethylisopropylamiloride)上被取代。
術語「同一的」或百分比「同一性」在兩個或多個核酸或多肽序列的上下文中是指，兩個或多個相同的或具有指定百分比(即，當在比較窗口或指定的區域上就最大一致性進行比較和比對時，在指定的區域(例如，SEQ ID NO1、2、3或7核苷酸序列)上具有大約80％同一性，優選地85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的相同胺基酸殘基或核苷酸的序列或亞序列，如通過使用具有下列描述的預設參數的BLAST或BLAST2.0序列比較算法或通過人工比對或目測(參見，例如，NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)或等)所測量的。然後這些序列稱為「基本同一」。該定義也指或可用於受試序列的互補序列。所述定義也包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下面所描述的，優選的算法可考慮缺口等。優選地，同一性存在於在長度上至少大約25個胺基酸或核苷酸的區域，或更優選地存在於長度上至少50-100個胺基酸或核苷酸的區域。
對於序列比較，通常一個序列用作與受試序列進行比較的參照序列。當使用序列比較算法時，將受試和參照序列輸入計算機，然後指定亞序列坐標(coordinates)，如果必要，指定序列算法程序參數。優選地，可使用預設程序參數，或可指定可選擇的參數。然後基於程序參數，序列比較算法計算受試序列相對於參照序列的百分比序列同一性。
如此處所用的，「比較窗口」是指任何一個選自20至600，通常大約50至大約200，更通常地大約100至大約150的連續位置數目的片段，其中在將兩個序列進行最優化排列後可將序列與相同連續位置數目的參照序列進行對比。用於比較的序列比對方法在本領域是熟知的。通過例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜尋方法，通過這些算法的計算機化執行(Wisconsin遺傳學軟體包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過人工比對和目測(參見，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人，eds.1995增刊))進行用於比較的序列的最優比對。
適合用於確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的優選實例是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。使用具有此處描述的參數的BLAST和BLAST2.0來確定本發明的核酸和蛋白的百分比序列同一性。用於進行BLAST分析的軟體可通過國立生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information)公開獲得。該算法包括首先通過鑑定查尋序列中長度為W的短字符來鑑定高分值序列對(HSPs)，當所述短字符與資料庫序列中的相同長度的字符比對時，其匹配或滿足一些正值閾值分值T。T被稱為相鄰字符得分閾值(Altschul等人，同上)。這些初始相鄰字符標用作起始搜尋的種子以找到更長的包含其的HSPs。字符標沿著各序列向兩個方向延伸，只要累積比對分值可增加。對於核苷酸序列，使用參數M(配對殘基對的獎賞分值；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算累積分值。對於胺基酸序列，使用打分矩陣計算累積分值。當累積比對分值從其達到的最大值下降數量X；由於一個或多個打負分的殘基比對導致累積分值下降至0或更低；或到達序列兩端時，字符標在各方向上的延伸停止。BLAST算法參數W、T和X確定了比對的靈敏性和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用預設值字符長度為(W)11，期望值(E)為10，M＝5，N＝4和兩條鏈的比較。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用預設值字符長度為3、期望值(E)為10，而BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))的比對值(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，和比較兩條單鏈。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白」在此處可交換使用，是指胺基酸殘基的多聚體。所述術語用於指其中一個或多個胺基酸殘基是對應的天然發生的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸多聚體，和天然發生的胺基酸多聚體和非天然發生的胺基酸多聚體。
術語「胺基酸」是指天然發生和合成的胺基酸以及與類似於天然發生的胺基酸的方式發揮功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然發生的胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸和後來經過修飾的胺基酸，例如，羥脯氨酸、γ羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是指具有與天然發生的胺基酸相同基本結構即結合氫的碳原子、羧基基團、氨基基團和R基團的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、亞碸甲硫氨酸、甲基鋶(sulfonium)甲硫氨酸。這些類似物具有經修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈，但保持與天然發生的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有不同於胺基酸一般化學結構的結構但以類似於天然發生的胺基酸的方式發揮其功能的化學化合物。
胺基酸在此處可以由其普遍已知的三個字母的符號表示或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣核苷酸可以由其普遍接受的單字母編碼表示。
「保守修飾的變體」是指胺基酸和核酸序列。對於特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼一致或基本一致的胺基酸序列的核酸，是指基本一致的序列，或其中所述核酸不編碼胺基酸序列。因為遺傳密碼的簡併性，大量功能性一致的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部編碼胺基酸丙氨酸。因此，在每一個被密碼子確定為丙氨酸的位點上，可將密碼子改變成任何一個描述的相應的密碼子而不改變被編碼的多肽。這類核酸變異是「沉默變異」，其是一種保守修飾的變異。此處編碼多肽的每一個核酸序列也描述了每種可能的核酸沉默變異。本領域技術人員認識到核酸中的各密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)可經修飾產生功能相同的分子。因此，各編碼多肽的核酸的沉默變異包含於各描述的序列中，所述序列與表達產物有關但與實際的探針序列無關。
對於胺基酸序列，本領域技術人員認識到對於核酸、肽、多肽或蛋白序列的單個替代、缺失或添加(在被編碼的序列中改變、添加或刪除單個胺基酸或小百分比的胺基酸)是「保守修飾的變體」，其中所述改變導致用化學上相似的胺基酸對胺基酸的替代。提供功能上相似的胺基酸的保守替代表在本領域是熟知的。除了但不排除多態性變體外，這些保守修飾變體是種間同源物和本發明的等位基因。
下列八組各包含相互之間保守替代的胺基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)；3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見，例如，Creighton，Proteins(1984))。如前面所指出的，本發明包括表達ENaC亞基多肽的細胞，所述多肽具有不同於本申請中公開的序列的一級序列，在合適的測定例如下文詳細描述的使用完整細胞的鈉傳導測定中功能等同。
大分子結構例如多肽結構可根據各種組織水平進行描述。關於這種組織的一般討論，參見，例如Alberts等人，Molecular Biology ofthe Cell(3rd ed.，1994)以及Cantor和Schimmel，BiophysicalChemistry Part IThe Conformation of BiologicalMacromolecules(1980)。「一級結構」是指特定肽的胺基酸序列。「二級結構」是指在多肽內局部有序的三維結構。這些結構通常稱為結構域，例如，跨膜結構域小孔結構域和胞質尾區結構域。結構域是形成多肽的緊湊單位並且通常為15至350個胺基酸長的多肽部分。示例性結構域包括細胞外結構域、跨膜結構域和胞質結構域。典型的結構域由組織較鬆散的部分例如α摺疊和β螺旋構成。「三級結構」是指多肽單體的完整三維結構。「四級結構」是指由獨立的三級單位非共價締合形成的三維結構。各向異性術語也稱作能量術語。
特定核酸序列無疑也包括「拼接變體」。類似地，由核酸編碼的特定蛋白無疑包括任何由所述核酸的拼接變體編碼的蛋白。「拼接變體」如名稱所表明的，是基因的可變拼接的產物。在轉錄後，最初的核酸轉錄物可進行拼接以使不同(可變的)核酸拼接產物編碼不同的多肽。產生拼接變體的機制是可變的，但包括外顯示子的改變拼接。該定義也包括通過通讀轉錄產生的來源於相同核酸的可變多肽。任何拼接反應的產物，包括所述拼接產物的重組形式，包括在本定義中。
ENaC核酸序列也包括單一核苷酸多態性，所述多態性核酸編碼ENaC亞基，當使用合適的測定法進行測定時，所述ENaC亞基在此處描述的鈉傳導測定中與此處公開的ENaC多肽功能上等同。
膜電位染料或電壓敏感性染料是指在膜去極化時改變螢光特性的分子或分子組合物。這些染料可用於檢測離子通道例如在細胞中表達的ENaC的活性的變化。
「標記」或「可檢測的部分」是指通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理方法可檢測的組合物。例如，有用的標記包括32P、螢光染料、電子緻密劑、酶(例如，如在ELISA中普遍使用的酶)、生物素、地高辛、或可通過例如將放射性標記摻入肽使其可被檢測或用於檢測特異性地與所述肽反應的抗體的半抗原和蛋白。
當術語「重組體」用於指例如細胞或核酸、蛋白或載體時，是指通過導入異原核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白進行修飾的細胞、核酸、蛋白或載體，或指所來源於經過如此修飾的細胞的細胞。因此，重組細胞表達例如未在細胞的天然(非重組)形式中發現的基因或表達異常、降低表達或根本不表達的天然基因。在本發明中這通常是指已用編碼一個或多個ENaC亞基的核酸序列轉染的細胞。
當術語「異源的」用於指核酸的部分時，是指包含兩個或多個在自然界中在相互之間相同的關聯中未發現的亞序列的核酸。例如，所述核酸通常是通過重組產生的，具有兩個或多個來自非關聯的排列以產生新的功能性核酸的基因，例如，來自一個來源的啟動子和來自另一個來源的編碼區。類似地，異源蛋白表示包含兩個或多個在自然界中在相互之間相同的關聯中未發現的亞序列的蛋白(例如，融合蛋白)。術語「異源的」當用於指基因、cDNA、mRNA或蛋白的細胞表達時，是指通常不在所述細胞中表達或來自另一個種類而不是細胞原始來源的基因、cDNA、mRNA或蛋白。
短語「嚴緊雜交條件」是指探針與其通常存在於複合核酸混合物中的靶亞序列雜交而不與其它序列雜交時所處的條件。嚴緊條件是序列依賴性的並且在不同的情況下不同。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidassays″(1993)中可看到更詳細的核酸雜交指南。通常，在確定的離子強度pH下，選擇的嚴緊條件比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-10℃。所述Tm是在平衡(因為靶序列過量存在，在Tm下，50％的探針在平衡時被佔據)時50％的與靶互補的探針與靶序列雜交的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度)。嚴緊條件也可通過加入去穩定劑例如甲醯胺實現。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的兩倍，優選地10倍於背景雜交。示例性嚴緊雜交條件可以是如下50％甲醯胺，5x SSC，和1％ SDS，在42℃溫育，或，5x SSC，1％ SDS，在65℃溫育，在0.2x SSC和0.1％SDS中在65℃下進行清洗。清洗和雜交步驟通常進行1/2、1、2、5、13、15、30、60或更多分鐘，更通常大約30秒至2分鐘。
在嚴緊條件下相互之間不雜交的核酸，如果其編碼的多肽基本上是同一的，那麼其也基本上是同一的。這發生在例如當使用由遺傳密碼所允許的最大密碼子簡併性產生核酸拷貝的情況下。在這些情況下，所述核酸通常在中等嚴緊雜交條件下雜交。示例性「中等嚴緊雜交條件」包括在40％甲醯胺，1M NaCl，1％ SDS的緩衝液中，在37℃下雜交，和在1X SSC中，45℃下清洗。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域技術人員很容易地識別可用於提供相似嚴緊度條件的可選擇的雜交和清洗條件。在大量參考資料例如Current Protocols in MolecularBiology，ed.Ausubel等人中提供了用於確定雜交參數的另外的指導。
對於PCR，大約36℃的溫度通常用於低嚴緊性擴增，儘管依賴於引物長度的退火溫度可在大約32℃至48℃之間變化。對於高嚴緊性PCR擴增，通常是大約62℃的溫度，儘管高嚴緊性退火溫度，依賴於引物長度和特異性，可在大約50℃至大約65℃之間變化。通常用於高和低嚴緊性擴增的循環條件包括在90℃-95℃下進行30秒至2分鐘的變性相，持續30秒至2分鐘的退火相和在大約72℃下進行1-2分鐘的延伸相。例如在Innis等人(1990)PCR Protocols，A Guide toMethods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.中提供了用於低和高嚴緊性擴增反應的實驗方案和指南。
「抗體」是指包含構架區的多肽，所述框架區來自免疫球蛋白基因或其特異性結合和識別抗原的片段。被識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恆定區基因，以及許多免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分成κ或λ兩類。重鏈分成γ、μ、α、δ或ε類，其反過來定義免疫球蛋白的種類，分別表示IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗原結合區在結合的特異性和親和性上是最重要的。
特別地，這樣的抗體包括特異性結合此處公開的ENaC的抗體或特異性結合這類ENaC多肽的抗體混合物。
短語「特異性地(或選擇性地)結合」抗體或「特異性地(或選擇性地)與......免疫反應「，當指蛋白或肽時，是指通常在蛋白或其它生物製劑的異源群體中確定所述蛋白存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，指定的抗體與特定蛋白的結合至少是背景的兩倍和更普遍地超過背景10至100倍。在這些條件下與抗體的特異性結合要求就其針對特定蛋白的特異性選擇獲得的抗體。例如，可對針對ENaC亞基蛋白(例如，由SEQ ID NO1、2、3或7編碼的ENaCα、β、γ或δ亞基、多態性變體、等位基因、直向同源物、和保守修飾的變體、或拼接變體、或其部分)產生的多克隆抗體進行選擇以只獲得特異性地與ENaC亞基蛋白(即，ENaCα、β、γ或δ亞基，例如具有包含於SEQ ID NO.4、5、6或8中的胺基酸序列的亞基)而不與其它蛋白免疫反應的多克隆抗體。可通過除去與其它分子交叉反應的抗體實現該選擇。可使用各種免疫測定方式選擇特異性地與特定蛋白免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定法常規地用來選擇特異性地與蛋白免疫反應的抗體(參見例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，用於確定特異性免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述)。
調節ENaC活性的蛋白的測定高或中通量的功能性基因組測定法可用於鑑定阻斷、抑制、調節或增強鹽味的ENaC調節劑。這些測定法可通過使用細胞系或初級細胞或卵母細胞監控例如細胞表面標記表達的變化、細胞內離子的變化或細胞膜電流的變化。通常，將細胞與cDNA或隨機肽文庫(由核酸編碼的)接觸。所述cDNA文庫可包含有義、反義、全長和截短的cDNAs。所述肽文庫由核酸編碼。然後使用上述的測定法監控cDNA或肽文庫對細胞表型的影響。可使用例如可調節的核酸表達例如從四環素啟動子的表達來驗證cDNA或肽的影響以及區別其和體細胞突變的影響。可使用本領域技術人員已知的技術例如使用序列標記來拯救編碼肽的cDNAs和核酸。
可使用酵母雙雜交系統、哺乳動物雙雜交系統或噬菌體展示篩選等來分離與肽或由cDNA(例如，SEQ ID NO1、2或7)編碼的蛋白相互作用的蛋白。通過這些方法鑑定的靶在這些測定中可進一步用作誘餌，用以鑑定可能與ENaC通道相互作用的其它成分，所述ENaC通道的成員也是藥物開發的靶(參見，例如，Fields等人，Nature 340245(1989)；Vasavada等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA 8810686(1991)；Fearon等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 897958(1992)；Dang等人，Mol.Cell.Biol.11954(1991)；Chien等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 9578(1991)；美國專利號5,283,173、5,667,973、5,468,614、5,525,490和5,637,463)。
表達ENaC蛋白的合適細胞和細胞系包括例如腎上皮細胞、肺上皮細胞、味覺上皮細胞和其它哺乳動物優選地人的上皮細胞，和卵母細胞，優選地兩棲動物的卵母細胞，最優選地非洲爪蟾卵母細胞。
編碼ENaC蛋白的核酸的分離本發明部分地基於重組遺傳學領域內的常規技術。公開用於本發明的一般方法的教科書包括Sambrook和Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler，GeneTransfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人，eds.，1994))。
可通過在嚴緊雜交條件下使用ECN核酸探針和寡核苷酸篩選文庫來分離編碼ENaC亞基、多態性變體、直向同源物和基本上與由SEQ IDNO1、2、3或7編碼的胺基酸序列同一的等位基因和其它家族成員的核酸。可選擇地，可通過用抗血清或純化的抗人ENaC或其部分的抗體對表達的同源物進行免疫檢測，從而利用表達文庫克隆ENaC亞基蛋白、多態性變體、直向同源物和等位基因。
為建立cDNA文庫，應當選擇富含ENaC RNA的來源。然後使用逆轉錄酶將mRNA轉變成cDNA，連接入重組載體，並轉染入用於增殖的重組宿主中，進行篩選和克隆。用於製備和篩選cDNA文庫的方法是熟知的(參見，例如Gubler和Hoffman，Gene 25263-269(1983)；Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)。
對於基因組文庫，從組織中提取DNA並通過機械剪切或酶消化產生大約12-20kb的片段。然後通過梯度離心將片段與不想要的大小中分離出來並構建入λ噬菌體載體中。在體外包裝這些載體和噬菌體。通過Benton和Davis，Science 196180-182(1977)中描述的噬菌斑雜交來分析重組噬菌斑。如通常在Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，723961-3965(1975)中所描述的一樣進行集落雜交。
可選擇地，可使用T7RNA聚合酶在體外從DNA(用合適的限制性酶線性化的)轉錄cRNA，從而從α、β、γ或δ人ENaC DNA質粒中產生編碼人ENaC亞基的ENaC cRNA，然後將所得的cRNA顯微注射入合適的細胞例如卵母細胞，優選地蛙的卵母細胞中。
可選擇的分離ENaC亞基核酸和其直向同源物、等位基因、突變體、多態性變體和保守修飾的變體的方法組合了合成寡核苷酸引物的應用和RNA或DNA模板的擴增(參見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis等人，eds，1990))。方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)和連接鏈式反應(LCR)可用於從mRNA、從cDNA、從基因組文庫或cDNA文庫直接擴增人ENaC的核酸序列。通過使用此處提供的序列，可以設計簡併寡核苷酸以擴增ENaC同源物。可將限制性內切核酸酶位點整合入引物。也可將聚合酶鏈式反應或其它體外擴增方法用於例如克隆核酸序列和製備用作探針的核酸，所述核酸序列編碼要表達的蛋白，所述探針用於在生理學樣品中檢測編碼ENaC的mRNA的存在，用於核酸測序或用於其它目的。通過PCR反應擴增的基因可從瓊脂糖凝膠中純化並被克隆入合適的載體中。
也可通過本領域已知的技術分析ENaC亞基的基因表達，所述技術是例如mRNA的反轉錄和擴增，總RNA或polyA+RNA的分離、Northern印跡法、點印跡法、原位雜交、RNA酶保護法、高密度多核苷酸陣列技術等。
編碼ENaC亞基蛋白的核酸可與高密度寡核苷酸陣列技術(例如，GeneChipTM)一起使用以鑑定本發明中的ENaC蛋白、直向同源物、等位基因、保守修飾的變體和多態性變體。在把要被鑑定的同源物與T細胞活性和遷移的調節關聯的情況下，可將其與GeneChipTM一起使用作為在生物學樣品中檢測疾病的診斷工具，參見，例如Gunthand等人，AIDS Res.Hum.Retroviruses 14869-876(1998)；Kozal等人，Nat.Med.2753-759(1996)；Matson等人，Anal.Biochem.224110-106(1995)；Lockhart等人，Nat.Biotechnol.141675-1680(1996)；Gingeras等人，Genome Res.8435-448(1998)；和Hacia等人，Nucleic Acids Res.263865-3866(1998)。
在轉化入原核或真核細胞以進行複製和/或表達之前，通常將編碼ENaC亞基優選地人ENaC亞基的基因克隆入中間載體。這些中間載體通常是原核載體，例如質粒或穿梭載體。
1.在原核和真核生物中的表達為獲得經克隆的基因例如編碼hENaC亞基的cDNA的高水平表達，通常將hENaC亞基核酸序列亞克隆入表達載體，所述表達載體包含指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子，如果對於編碼蛋白的核酸，還有用於轉錄起始的核糖體結合位點。合適的細菌啟動子在本領域是熟知的並且描述於例如Sambrook等人，和Ausubel等人，同上。在例如大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)和沙門氏菌屬(Salmonella)(Palva等人，Gene 22229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302543-545(1983))中可獲得用於表達ENaC亞基蛋白的細菌表達系統。這些表達系統的試劑盒可商業購得。用於哺乳動物、酵母、非洲爪蟾卵母細胞和昆蟲細胞的真核生物表達系統在本領域是熟知的並且也可商業購得。
在本發明的優選實施方案中，卵母細胞表達系統用於表達功能性人ENaC和檢查特定化合物對通過ENaC通道的鈉運輸的影響。非洲爪蟾卵母細胞表達系統以前曾用於表達離子通道包括ENaC和用於功能性研究(Dascal，CRC Crit.Rev.Biotech.(1987)22(4)317-387；Wagner等人，Cellular Physiology and Biochemistry(2000)101-12；和Canessa等人，Nature(1994)367463-467)。在另一個實施方案中，逆轉錄病毒表達系統可用於本發明。在另一個實施方案中瞬時表達系統可與基於質粒的載體一起使用，所述載體例如pcDNA3和其衍生物可商業購得。
選擇用於指指導表達異源核酸的啟動子依賴於特定的應用。優選地，啟動子與異源轉錄起始位點的距離與其與其在天然位置上的轉錄起始位點的距離大致相同。然而，正如本領域已知的，可允許這些距離產生一些變化而不失去啟動子的功能。
除了啟動子外，表達載體通常包含轉錄單位或表述盒，所述轉錄單位和表達盒包含所有在宿主細胞中表達ENaC亞基編碼核酸所必需的元件。因此典型的表達盒包含至少一個有效地連接編碼ENaC亞基的核酸序列的啟動子和轉錄物的有效聚腺苷醯化所需的信號、核糖體結合位點和翻譯終止區。表達盒的其它元件可包括增強子和在基因組DNA用作結構基因的情況下，具有功能性拼接供體和受體位點的內含子。
除了啟動子序列外，所述表達盒還應當包含結構基因的轉錄終止區下遊以提供有效的終止作用。終止區和啟動子序列可獲自相同的基因或可獲自不同的基因。
用於傳遞遺傳信息至細胞的特定表達載體不是特別重要。可使用任何用於在真核或原核細胞中表達的常規載體。標準的細菌表達載體包括質粒例如基於pBR322的質粒、pSKF、pET23D和融合表達系統例如MBP、GST和LacZ。也可給重組蛋白加上表位標記例如c-myc以提供便利的分離方法。序列標記可包含在用於核酸拯救的表達盒中。標記物例如螢光蛋白、綠色和紅色螢光蛋白、β-gal、CAT等可包含在載體中作為載體轉導的標記物。
包含來自真核病毒的調控元件的表達載體通常用於真核表達載體中，例如，SV40載體、乳頭病毒載體、逆轉錄病毒載體和來源於Epstein-Barr病毒的載體。其它示例性真核載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆狀病毒pDSVE和任何其它允許在啟動子指導之下表達蛋白的載體，所述啟動子是CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠科動物乳腺腫瘤病毒啟動子，勞斯肉瘤病毒啟動子，多角體蛋白(polyhedrin)啟動子，或其它顯示在真核細胞中有效表達的啟動子。
也可使用可誘導的啟動子調控來自真核載體的蛋白表達。在可誘導的啟動子的情況下，通過將針對誘導劑例如四環素或脫皮激素的應答元件整合入啟動子中，將表達水平與這些試劑的濃度關聯。通常，只在誘導劑存在的情況下通過可誘導啟動子獲得高水平表達，基礎表達水平很低。
在一個實施方案中，本發明的載體可具有可調節的啟動子，例如，tet-調節系統和RU-486系統(參見，例如，Gossen和Bujard，PNAS 895547(1992)；Oligino等人，Gene Ther.5491-496(1998)；Wang等人，Gene Ther.4432-441(1997)；Neering等人，Blood 881147-1155(1996)；和Rendahl等人，Nat.Biotechnol.16757-761(1998))。這些提供了對候選靶核酸的表達的小分子控制。該有利的性質可用於確定想要的表型是由轉染的cDNA而非體細胞突變造成的。
一些表達系統具有提供基因擴增的標記例如胸苷激酶和二氫葉酸還原酶。可選擇地，不涉及基因擴增的高產量表達系統也是合適的，例如使用昆蟲細胞中的杆狀病毒載體，所述載體具有在多角體蛋白啟動子或其它強杆狀病毒啟動子的指導下的ENaC編碼序列。
通常包含於表達載體中的元件也包含在大腸桿菌中發揮作用的複製子、編碼允許篩選含有重組質粒的細菌抗生素抗性基因和允許真核序列插入的存在於質粒的非必需區域的單一限制性位點。所選擇的特定抗生素抗性基因不是關鍵的，許多本領域已知的抗性基因中的任一種是合適的。如果必要，優選地選擇原核序列以使其不幹擾DNA在真核細胞中的複製。
標準的轉染方法可用於產生表達大量ENaC蛋白的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，然後使用標準技術(參見，例如，Colley等人，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide to ProteinPurification，in Methods in Enzymology，第182卷(Deutscher，ed.，1990))將所述蛋白純化。按照標準技術(參見，例如，Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，Methodsin Enzymology 101347-362(Wu等人，eds，1983)進行真核和原核細胞的轉化。可選擇地，在本發明的優選的實施方案中，通過顯微注射編碼此處所述亞基的cRNA以產生表達人ENaC亞基的卵母細胞。
可使用任何用於將外源核苷酸序列導入宿主細胞的熟知方法。這些包括使用磷酸鈣轉染、polybrene、原生質體融合、電穿孔、biolistics、脂質體、經最優化用於DNA轉染的脂、顯微注射、原生質載體(plasma vectors)、病毒載體和任何其它熟知的用於將克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遺傳物質導入宿主細胞的方法(參見，例如，Sambrook等人，同上)。所使用的特定的基因工程方法能夠成功地將至少一種ENaC亞基基因導入宿主細胞(優選地能夠表達功能性ENaC的哺乳動物細胞)才是必需的。
在將表達載體導入細胞後，在有利於ENaC亞基表達的條件下培養經轉染的細胞。在一個實施方案中，使用基於脂的轉染將所有三個hENaC基因短暫地轉染細胞，並在進行ENaC調節劑篩選之前培養24-48小時。
如前面所指出的，本發明的優選實施方案包含卵母細胞表達系統。這些方法通常包括蛙手術、卵母細胞的分離、cRNA的製備和卵母細胞顯微注射。用於蛙手術和卵母細胞分離的一般方法在本領域是熟知的(參見，Marcus-Sekur，等人，Methods in Enzymol.152284-288(1987)；Goldin，Methods in Enzymol.207266-279.)。同樣，用於製備cRNA的方法也是熟知的並報導於例如Swansen，等人，Meth.Enzymol.207310-319(1912)，Golden，等人，Meth.Enzymol.217279-297(1992)中。然後通過標準方法將所得的cRNA顯微注射入青蛙卵母細胞。(參見，Molten，等人，Meth.Enzymol.254458-466(1975)；Hitchcock等人，Meth.Enzymol.152276-284(1987)。
ENaC蛋白的調節劑的測定法A.測定法可使用各種測定法優選地上述基於細胞的模型評估對ENaC蛋白的調節。這些測定法可用於檢驗調節、阻斷、增強或抑制鹽味感覺的ENaC抑制劑和激活劑。
優選地，ENaC由三個亞基α(或Δ)、β和γ和優選地人ENaC亞基構成，所述亞基由SEQ ID NO1、2、3或7或人直向同源物(其保守修飾的變體)編碼。可選擇地，被測定的ENaC來源於非人上皮細胞。通常，各亞基的胺基酸序列分別具有與由SEQ ID NO1、2、3或7編碼的多肽至少是80％、優選至少85％或90％，最優選地至少95％，例如96％、97％、98％或99％的同一性。
可使用各種此處描述的測定法對包含的候選物或ENaC蛋白或表達ENaC蛋白的細胞(重組或天然發生的)的效應進行測量。優選地為鑑定能夠調節ENaC的分子，在表達功能性ENaC的兩棲動物的卵母細胞或哺乳動物細胞中進行測定以檢測各種候選調節劑對ENaC活性的影響。優選地，這些測定在加入至少一種假定的ENaC調節劑例如ENaC增強劑之前，首先將ENaC與已知的ENaC抑制劑接觸。優選地，所述抑制劑是氨氯吡嗪脒或氨氯吡嗪脒衍生物例如Phenamil。
使用各種測量離子流量變化的測定法可測定ENaC蛋白的通道活性，所述測定法包括膜片鉗技術、完整細胞電流的測量、放射性標記的離子流量測定法和使用電壓敏感性染料(參見，例如，Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.8867-75(1988)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.25185-193(1991)；Hoevinsky等人，J.Membrane Biol.13759-70(1994))和離子敏感染料的螢光測定法。例如，可將編碼一個或多個ENaC蛋白的亞基的核酸或其同源物注射入非洲爪蟾的卵母細胞中。然後可通過測量膜電流的變化來測定通道活性。獲得電生理測量值的一個方法是使用膜片鉗技術例如「細胞附著」模式、「膜內側翻外」模式和「完整細胞」模式(參見，例如，Ackerman等人，New Engl.J.Med.3361575-1595，1997)測量電流。使用標準的方法學例如由Hamil等人，Pflugers.Archiv.391185(1981)描述的方法可確定完整細胞電流。
也可通過使用例如離子敏感性染料測量細胞內離子水平的變化來方便地測定通道活性。
也可使用各種其它測定法評估ENaC多肽的活性，所述測定法用於確定功能、化學和物理效應例如測量ENaC多肽與其它分子包括肽、有機小分子和脂的結合；測量ENaC蛋白和/或RNA水平，或測量ENaC多肽的其它方面，例如，轉錄水平或影響ENaC活性的生理學變化。當使用完整的細胞或動物來確定功能性序列時，也可測量多種效應例如細胞生長上的變化或pH變化或細胞內第二信使例如IP3、cGMP或cAMP、或磷脂酶C信號傳導途徑的組分或調節劑的變化。這些測定法可用於檢驗激活劑和抑制劑。因此經鑑定的調節劑用於例如在食物、飲料和藥物中作為食用香料。
基於細胞的測定法在另一個實施方案中，在細胞中表達至少一個ENaC亞基蛋白，並且測定功能例如物理和化學或表型變化以鑑定ENaC調節劑。表達ENaC蛋白的細胞也可用於結合測定法中。如此處所描述的，可測量任何合適的功能性效應。例如，膜電位的變化、細胞內離子水平的變化和配體結合都是適合通過使用基於細胞的系統鑑定潛在調節劑的測定。用於這些基於細胞的測定法的合適細胞包括原代細胞例如表達ENaC蛋白的味覺上皮細胞和培養的細胞系例如表達ENaC的HEK293T細胞。另一個優選的表達系統包含兩棲動物卵母細胞。如所指出的，這些測定法在將細胞系與至少一種假定的ENaC調節劑接觸之前，優選地首先將ENaC表達細胞系例如兩棲動物卵母細胞或HEK293與以部分抑制ENaC功能的濃度的已知的ENaC抑制劑例如氨氯吡嗪脒或氨氯吡嗪脒衍生物例如Phenamil接觸。所述ENaC蛋白可以是天然發生的或重組體。同樣，如上所述，ENaC蛋白的片段或具有離子通道活性的嵌合體可用於基於細胞的測定中。
在另一個實施方案中，通過測量蛋白或mRNA的水平確定細胞ENaC多肽水平。通過使用免疫測定法例如Western印跡法、ELISA等用選擇性結合ENaC多肽或其片段的抗體測量ENaC蛋白或與ENaC離子通道活性相關的蛋白的水平。為測量mRNA，使用例如PCR、LCR的擴增，或雜交測定法，例如Northern雜交、RNA酶保護法、點印跡法是優選的。如此處所描述的，使用直接或間接標記的檢測試例如，螢光或放射性活性標記的核酸，放射性活性或酶標記的抗體等來檢測蛋白或mRNA的水平。
可選擇地，可使用報告基因系統測量ENaC表達。通過使用有效地連接至報告基因的ENaC蛋白啟動子可設計這樣的系統，所述報告基因是例如氯黴素乙醯轉移酶、熒火蟲螢光素酶、細菌螢光素酶、β-半乳糖苷酶和鹼性磷酸酶。此外，通過附著至第二報告子例如紅色或綠色螢光蛋白(參見，例如，Mistili和Spector，NatureBiotechnology 15961-964(1997))，目的蛋白可用作間接報告子。通常將報告構建體轉染入細胞。在用潛在的調節劑處理後，並且優選地處理用已知的ENaC抑制劑例如Phenamil，按照本領域技術人員已知的標準技術測量報告基因轉錄、翻譯量或活性。
在另一個實施方案中，可測量與信號傳導相關的功能效應。經激活或抑制的ENaC將改變靶酶、第二信使、通道和其它效應器蛋白的性質。用於ENaC活性的測定法包括裝載有用以報告(例如，通過觀察膜去極化或鈉流入)通道活性的離子或電壓敏感性染料的細胞。用於確定這些受體活性的測定法也可使用已知的ENaC拮抗劑例如氨氯吡嗪脒或phenamil作為對照以估計受試化合物的活性。在用於鑑定調節性化合物(例如，激動劑、拮抗劑)的測定法中，分別使用離子敏感或膜電位螢光指示劑監控細胞質中離子水平或膜電位的變化。在離子敏感指示劑和電壓探針中可使用的是分子探針2002產品目錄(www.probes.com)中描述的和下文公開的特定化合物。
優選的測定系統使用注射有ENaC cRNAs的蛙卵母細胞，其中將所述卵母細胞與受試化合物接觸，然後通過兩電極電壓鉗電生理記錄技術進行分析。(參見Stuhmer，Meth.Enzymol.207319-339(1992)；Wagner等人，Cellular Physiology and Biochemistry 101-12(2000))。
電生理測定法如所指出的，優選的用於調節即增強、抑制或阻斷ENaC的化合物的鑑定的測定法包括電生理測定法，所述電生理測定法監控細胞中的電流，所述細胞是與至少一種假定的ENaC調節劑(增強劑或抑制劑)接觸、表達人ENaC亞基的細胞。這些測定法可使用任何表達功能性ENaC的細胞。在優選的實施方案中，所述細胞包括卵母細胞(優選地蛙卵母細胞)、哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞或其它適合用於表達功能性ENaC離子通道的表達系統。優選地，所述表達系統表現強勢和快速的人ENaC鈉通道的表達並且如願地不表達任何或非常少的內源離子通道，從而有助於鑑定特異性調節ENaC鈉通道功能的化合物。因此，不想要的背景反應被減小到最小或消除。此外，耐用的細胞例如卵母細胞是想要的，因為其能使細胞在根據本發明測定中被重新利用。以前已報導卵母細胞快速和強勢地表達其它功能性離子通道，包括ENaCs(Pascal，CRC Crit.Rev.Biotech.22(4)317-87(1987)；Wagner等人，Cell Physiol.Biochem.101-12(2000)；Canessa等人，Nature 367463-467(1994))。
特別優選的電生理測定法是通過兩電極電壓鉗技術在蛙卵母細胞中測量ENaC鈉通道功能的中通量測定法。這種強勢、快速的表達系統僅在大約18-24小時後在卵母細胞膜上提供了大約一百萬個ENaC通道的表達。此外，因為卵母細胞相對較大(直徑1mm，與大多數哺乳動物細胞相比相對較大)，所以其容易操作和使用。
基於這些有利方面，單個卵母細胞可用於獲得多個和反覆的電生理記錄。同樣，卵母細胞通常表達少量內源通道，並且表達處於低於造成高背景(相對於在一些其它表達系統例如HEK293T細胞中看到的背景)的表達水平。因此，卵母細胞允許反覆的直接測量靶化合物對ENaC鈉通道功能的影響。
在優選的根據本發明的兩電極電壓鉗測定法(在下面的實施例4中詳細舉例說明的)中，將已顯微注射有ENaC α、β和γ人ENaCcRNA(或δ、β和γ人ENaC cRNA)的蛙卵母細胞轉移至玻璃閃爍瓶中並在合適的有利於ENaC蛋白表達的條件下溫育。
在獲得ENaC鈉離子通道表達後，通常在cRNA顯微注射後大約24小時，使用合適的二電極電壓測量設備例如OpusXpress 6000A平行卵母細胞電壓鉗系統(Axon Instruments)按照兩電極電壓鉗技術測量ENaC功能。兩電極電壓鉗技術測量通過ENaC鈉離子通道流經完整卵母細胞膜的宏觀電流。用電壓傳感電極和電流傳感電極刺破卵母細胞；使用電壓傳感電極將電壓或穿過卵母細胞膜的勢差鉗制在特定的值，使用電流傳感電極測量維持所述電壓所需的、穿過卵母細胞膜的電流或離子流。所述OpusXpress系統是一個商業可購的兩電極電壓測量設備的示例，所述系統是半自動的並且包括允許同時產自8個卵母細胞的電生理記錄的工作站。該系統也提供了自動的卵母細胞刺穿和通過計算機控制的流體輸送裝置進行的靶化合物遞送，所述輸送裝置將化物遞送至96孔化合物板。最好可將該系統描述為中等或中通量系統，因為其允許每周評估大約60個化合物。當然如上所述，通過加入其它電壓測量設備可篩選更多的化合物。
在該測定系統中，ENaC增強劑將導致通過卵母細胞膜上的ENaC通道的電流增加。通過下文(實施例4中)提供的標準式計算該值。該測定也可包括合適的負對照，例如氨氯吡嗪脒，其是已知的阻斷通過ENaC通道的鈉運輸的ENaC抑制劑。因此，該化合物用作內部對照以鑑定卵母細胞表達功能性ENaC，和，在表現氨氯吡嗪脒抑制的卵母細胞中，在施用氨氯吡嗪脒化合物後允許篩選假定的ENaC增強劑(如果所述靶化合物是ENaC增強劑那麼其將導致通過卵母細胞上的ENaC通道的電流增加)。
理想地，計算各增強劑的％增強因子。例如，100％增強劑相對於基礎對照值(無化合物)增加了100％的ENaC活性。
也想進行負對照以確定未注射ENaC cRNAs的卵母細胞不表現相同的效應。
如在下面的實施例4中更詳細地討論的，也想對表現最大的％增強值(閥)化合物進行更複雜的分析，例如，電流/電壓(I/V)曲線、氨氯吡嗪脒競爭實驗和劑量反應曲線，以確定所述化合物表現最大活性的一半(EC50值)時的濃度。這些實驗進一步確定所述化合物的效應是ENaC特異性的。
這些測定法提供了ENaC調節劑，優選地ENaC增強劑的鑑定，所述ENaC調節劑可用作食物、飲料、藥物等的添加劑以調節與之相關的鹽味。理想地，ENaC增強劑表現至少20％的增強因子，更優選地至少50％和甚至更優選地至少100％的增強因子。在本申請的實施例4中進一步詳細地討論這些基於卵母細胞的測定法和與之相關的內在有利方面。
動物模型表達hENaC的動物模型也用於篩選鹽味調節劑。類似地，轉基因動物技術包括基因敲除技術(例如作為與合適的基因靶向載體的同源重組結果)或基因過量表達，其將導致ENaC蛋白表達的缺少或增加。相同的技術也可用於產生基因敲除細胞。當想要時，ENaC蛋白的組織特異性表達或敲除可能是必需的。通過這些方法產生的轉基因動物用作對鹽味刺激劑作出反應的動物模型。
可通過同源重組將標記基因或其它異源基因插入到小鼠基因組中內源ENaC基因位點上產生基因敲除細胞和轉基因小鼠。也可用ENaC基因的突變形式替代內源ENaC或通過突變內源基因來製造這些小鼠。
將DNA構建體導入胚胎幹細胞的細胞核內。將含有經新基因改造的遺傳損傷的細胞注射入宿主小鼠胚胎中，將所述胚胎再移入雌性受體中。這些胚胎中的一些發育成擁有部分來源於突變細胞系的生殖細胞的嵌合小鼠。因此，通過繁殖所述嵌合小鼠可能獲得包含導入的遺傳損傷(參見，例如，Capecchi等人，Science 2441288(1989))的小鼠新系。根據Hogan等人，Manipulating the Mouse EmbryoALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)andTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach，Robertson，ed.，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)可獲得嵌合的被靶向的小鼠。
B.調節劑作為ENaC蛋白調節劑的受試化合物可以是任何小有機分子或生物學實體例如蛋白，例如，抗體或肽、糖、核酸例如反義寡核酸或核酶、或脂。可選擇地，調節劑可以是經遺傳改變形式的ENaC蛋白。通常受試化合物是有機小分子、肽、脂和脂類似物。優選地，所述受試化合物對人的消費是安全的。
基本上任何化學化合物都可以在本發明的測定中用作潛在的調節劑或配體，儘管最常使用可溶解在水或有機溶液(特別是基於DMSO的)中的化合物。設計測定法以篩選大的化學文庫，通過自動化測定步驟和為測定提供來自任何方便來源的化合物，所述測定通常平行進行(例如，在自動化儀器測定中的微量滴定板上的微量滴定形式中)。已知有許多化學化合物的提供商，包括ChemDiv(San Diego，CA)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica-Analytika(Buchs Switzerland)等。
在優選的實施方案中，中或高通量篩選方法包括提供有機小分子或包含大量潛在ENaC調節劑(潛在的激活劑或抑制劑化合物)的肽文庫。然後以一種或多種此處描述的測定法篩選這類「化學文庫」以鑑定展示想要的特徵活性的文庫成員(特別是化學種類或亞類)。因此經鑑定的化合物可用作常規的「前導化合物」或其自身可用作潛在或現實的產物。如所指出的，優選的卵母細胞兩電壓鉗電極系統(單一設備)允許每周檢驗大約60個化合物。
重組化學文庫是通過化學合成或生物學合成產生的各種化學化合物的集合，通過將許多化學「結構單元」例如反應物組合。例如，通過以每一種可能的方式將成套的化學結構單元(胺基酸)組合成給定的化合物長度(即，在多肽化合物中胺基酸的數目)，從而形成線性組合化學文庫例如多肽文庫。通過這種化學結構單元的組合混合可合成數以百萬計的化學化合物。
組合化學文庫的製備和篩選對本領域技術人員來說是熟知的。這些組合化學文庫包括，但不限於，肽文庫(參見，例如，美國專利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等人，Nature 35484-88(1991))。也可使用其它用於產生化學多樣性文庫的化學物質。這些化學方物質包括，但不限於類肽(例如，PCT公開號WO 91/19735)、經編碼的肽(例如，PCT公開號WO 93/20242)、隨機生物寡聚體(例如，PCT公開號WO 92/00091)、苯並二氮雜類(例如，美國專利號5,288,514)、diversomers例如乙內醯脲類、苯並二氮雜類和二肽(Hobbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))、vinylogous多肽(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽類肽模擬物(peptidomimetics)(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))、小化合物文庫的類似有機物合成(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))、寡氨基甲酸酯(Cho等人，Science 2611303(1993))、和/或肽磷酸(Campbell等人，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(參見Ausubel，Berger和Sambrook，所有同上)、肽核酸文庫(參見，例如，美國專利5,539,083)、抗體文庫(參見，例如，Vaughn等人，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖類文庫(參見，例如，Liang等人，Science，2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)、有機小分子文庫(參見，例如，苯二氮雜類，Baum C EN，Jan 18，page33(1993)；類異戊二烯美國專利5,569,588；thiazolidinones和metathiazanones，美國專利5,549,974；吡咯烷，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉化合物，美國專利5,506,337；苯二氮雜類，5,288,514等)。
用於製備組合文庫的設備可商業購得(參見，例如，357 MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster city，C A，9 050 Plus，Millipore，Bedford，M A)此外，大量組合文庫本身可商業購得(參見，例如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
含有使用公開的測定法鑑定的ENaC調節性化合物的食品和飲料組合物使用公開的測定法例如實施例中描述的電生理(兩電極電壓鉗技術)測定法和基於細胞的螢光測定法鑑定的化合物在可攝入的組合物(即，食物和飲料以及經口施用的藥物)中潛在地用作成分或食用香料。可單獨地或作為食物或飲料中的食用香料組合地使用調節或增強鹽味感覺的化合物。在優選的應用中，將調節劑整合入具有鈉水平降低的食物或飲料中，所得的產物的鹽味與高鈉產物的鹽味相似。除了其它以外，這些食物和飲料的示例包括快餐食品例如椒鹽卷餅(pretzels)、炸土豆片、餅乾(crackers)、湯、蘸浸液(dips)、軟飲料、包裝的肉產品。
可選擇地，阻斷或抑制鹽味感覺的化合物在食物中可用作成分或食用香料從而阻斷或掩蓋其鹽味，所述食物天然地含有高鹽濃度。
這些化合物的量是產生想要的鹽味感覺程度的量。當然要確定用於這些應用的化合物對人的消費是安全的，並且在人味覺檢驗中是可接受的。
使用Phenamil或等同物的優選的實施方案如上所公開的，本發明的一個優選的實施方案包括在膜電位染料存在的情況下將表達功能性ENaC的受試細胞與至少一種假定的調節劑化合物接觸，和優選地在此之前將所述受試細胞與至少一種已知的調節(抑制)ENaC功能的化合物接觸並監控由所述受試細胞表達的ENaC的活性以確定對ENaC調節的程度，所述已知的化合物優選地是氨氯吡嗪脒衍生物例如Phenamil。如所指出的，在受試化合物加入之前加入ENaC抑制劑以提高測定結果。以至少部分抑制ENaC功能的濃度使用該抑制劑，例如，Phenamil。所述方法可進一步包括測定所述假定的調節劑化合物在體內對鹽味感覺的影響(例如，進行品味實驗以確定對鹽味感覺的體內效應)。例如，從人腎細胞cDNA、人肺細胞cDNA或人味覺細胞cDNA中克隆編碼ENaC亞基的cDNAs。如上面提到的，天然的ENaC是由三個亞基(α或δ、β和γ)構成的多聚體蛋白。在味蕾和其它組織中發現ENaC發揮組成型地活性Na+選擇性陽離子通道的功能，並且其是鹽味生理學感覺下的人候選鹽受體。
在另一個本發明的優選實施方案中，使用多孔板和螢光強度板讀出計(例如，Aurora Biosciences VIPR儀或Molecular Device′sFLIPR儀)在高通量的測定形式中進行該方法。可接種、染料荷載(dye-loaded)受試細胞，任選地，優選地首先將所述受試細胞與以至少部分抑制和優選地可逆地抑制ENaC功能的濃度的已知的ENaC抑制劑接觸，然後將所述細胞與至少一種受試化合物接觸，並在相同的多孔板中監控螢光強度。該測定方式可以可靠地檢測ENaC功能的激活或抑制，為能夠增強或抑制通道活性的化合物提供了強有力的篩選。優化上述測定法以鑑定ENaC增強劑。因此上面描述的測定法具有優於現存測定法例如上面描述的測定法的有利方面，其在於使用了人ENaC，使用了哺乳動物細胞和所述測定法可在高通量模式的標準多孔(例如，96、384或1536孔)板中進行。(然而，如上面所討論的，哺乳動物細胞具有一些不利的性質，例如，其以導致不想要的背景水平表達內源離子通道。)在本發明的優選的實施方案中，產生功能性表達至少ENaCα(或δ)亞基的細胞，優選地哺乳動物細胞。在優選的實施方案中，所有三種hENaC的亞基(α或δ、β和γ)被瞬時或穩定表達。所使用的ENaC亞基可以是天然發生的形式、包含SNPs的變體、可變拼接的形式、組合形式或任何本領域已知的功能性變體(參見，例如，檢索號P37088、P51168、P51170和P51172)。優選地，ENaC由SEQ ID NO.1、2、3的核酸序列編碼的人α、β和γENaC亞基或由SEQ ID NO.2、3和7編碼的人β、γ和δ亞基構成。哺乳動物細胞可以是任何本領域已知的類型例如COS、CHO、BHK、MDCK、HEK293或HEK293T(表達大T細胞抗原的人胚胎腎細胞)。優選地，所述細胞是HEK293T。可使用本領域已知的標準方法例如但不限於磷酸Ca2+或基於脂的系統或前面描述的方法轉染細胞。
然後優選地將這些經轉染的細胞接種入多孔培養板中。接著允許在足以達到至少大約70％的匯合，更優選地達到大約80％匯合或形成細胞層(厚度足以抵抗由於化合物加入引起的可能的流體擾動)的時間內進行功能性表達。通常，至少24小時的溫育時間就足夠了，但也可以更長。然後清洗細胞以除去培養基並用膜電位染料溫育一段時間，所述時間足以允許染料穿過接種的細胞的質膜達到平衡)。本領域技術人員知道染料荷載條件依賴於例如細胞類型、染料類型、溫育參數等因素。在一個實施方案中，可以大約2μM至大約5μM的終濃度使用染料。此外，在37℃下對於大多數細胞，最佳的染料荷載時間可在大約30至大約60分鐘範圍內變化。在優選的實施方案中，膜電位染料來自Molecular Devices(cat#R8034)。在其它實施方案中，合適的染料包括，例如基於單波長的染料例如DiBAC、DiSBAC(Molecular Devices)和Di-4-ANEPPS(Biotium)、或基於FRET的雙波長染料例如DiSBAC2、DiSBAC3和CC-2-DMPE(Aurora Biosciences)。[化學名稱-Di-4-ANEPPS(吡啶4-(2-(6-二丁基氨基)-2-萘基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-，氫氧化物，內鹽)，DiSBAC4(2)(二-(1，2-二巴比土酸)-三次甲基oxanol)，DiSBAC4(3)(二-(1，3-二巴比土酸)-三次甲基oxanol)，CC-2-DMPE(Pacific BlueTM 1，2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-磷酸乙醇胺，triethylammonium salt)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸4，4′-[1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane-7，13-diylbis(5-methoxy-6，12-benzofurandiyl)]二-，tetra-kis[(乙醯基氧)甲基]酯。
在一個實施方案中，優選地將荷載染料的細胞與已知的ENaC抑制劑例如Phenamil接觸，然後再與受試化合物(或對照)接觸，並使用標準的螢光分析儀器例如VIPR或FLIPR監控細胞培養物。對ENaC產生藥物學作用的NaCl或其它受試化合物的加入引起膜電位的變化，然後通過在標準的螢光強度板讀出計(例如，FLIPR)或電壓強度板讀出計(例如，VIPR)中檢測靜息螢光的變化來檢測所述膜電位。同樣，通過螢光監控受試細胞中ENaC的活性，本發明的方法可用於鑑定鹽味調節性化合物。例如，螢光的減少可表示味道(鹽味)阻斷劑，而螢光的增加可表示味道(鹽味)增強劑。
已概括地描述了本發明後，通過下列實施例將更容易理解本發明，通過例子提供所述實施例並且其不是限定性的。應當理解可對此處公開的示例性實施方案進行各種修飾和變化而不背離本發明的精神和範圍。
實施例1通過RT-PCR從人腎細胞中克隆編碼人ENaC的α、β和γ亞基的DNA序列，所述ENaC在人味覺細胞中表達。
用於複製人上皮細胞鈉離子通道亞基DNA序列(ENaCs)的方法分別使用下列引物通過PCR從人腎cDNA(Origene TechnologiesInc.)中擴增α、β和γENaC的人ENaC cDNAs5′CGCGGA TCCGCCCAT ACC AGG TCT CAT G 3′和5′CCGGAA TTCCTG CAC ATC CTT CAA TCTTGC 3′；5′CGCGGA TCCAGC AGG TGC CAC TAT GCA C 3′和CCGCTC GAGGTC TTG GCT GCT CAG TGA G 3′；5′CGCGGA TCCCCT CAA AGT CCC ATCCTC G 3′和5′CCGGAA TTCGAC TAG ATC TGT CTT CTC AAC 3′。設計引物與5′和3′非翻譯區序列互補以保留內源翻譯起始信號，並在其中引入末端限制性內切酶位點，所述位點用於將擴增的ENaC cDNAs克隆入用於功能性表達實驗的哺乳動物表達載體pcDNA3(Invitrogen)。對克隆的ENaC cDNAs測序並與公共DNA資料庫中的ENaC序列進行比較。各克隆的亞基是存在於不同資料庫等位基因中的多態性的集合；即，在各克隆的亞基中的每一個多態性可在另一個資料庫等位基因中發現，所述亞基是通過所述克隆的亞基與資料庫等位基因成對比較鑑定的。此外，通過對在獨立的PCR實驗中擴增的經克隆的cDNAs測序來確定克隆的ENaC亞基中的多態性。
編碼克隆的α、β和γhENaC亞基的序列的核酸序列分別包含於SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3而相應的胺基酸序列包含於SEQ ID NO4、5和6中。將這些DNA序列中的各序列插入表達載體pcDNA3以產生α、β和γ亞基質粒，所述質粒表達人ENaC亞基多肽。此外，人氨氯吡嗪脒敏感性鈉通道δ亞基(δNaCh)的核酸序列包含於SEQ ID NO7，其功能等同於ENaCα亞基。δ亞基的胺基酸序列包含於SEQ ID NO8。通過磷酸Ca2+方法用重量比為1∶1∶1的表達人ENaC的α、β和γ亞基的質粒瞬時轉染HEK293T。與模擬轉染的細胞相比，該轉染導致Na+依賴性的氨氯吡嗪脒敏感性螢光變化。關於圖1，用1∶1∶1比例的α、β和γ亞基質粒分別以4、4、1和0.25微克的絕對水平轉染樣品A、B、C和D。樣品E和F用β-gal和pUC DNAs模擬轉染。轉染效率大約為40％，細胞密度大約為70％。使用FLIPRI(Molecular Devices)儀使用膜電位螢光染料分析細胞。所有的結果(圖線)來自單一板，A(n＝4)，B，C，D，E(n＝12)和F(n＝8)。
如圖1、2和3所述，靜息電位的鈉依賴性氨氯吡嗪脒敏感性變化(hENaC反應)在未轉染的HEK293T細胞中未受明顯影響。而該靜息電位變化在用所有三個hENaC亞基轉染的細胞中被大大地加強(與只用hENaCα亞基轉染的細胞比較)(數據未顯示)。而且，NaCl誘導膜電位變化的能力以及氨氯吡嗪脒阻斷hENaC通道活性的效應遵循類似於使用低通量電生理記錄的文獻中報導的劑量反應關係。
實施例2將分別編碼人ENaC的α、β和γ亞基的DNA序列SEQ ID 1、2和3各克隆入表達載體pcDNA3中以產生表達人ENaC亞基多肽的α、β和γ亞基質粒。以1∶1∶1重量比的表達人ENaC的α、β和γ亞基質粒通過脂質轉染法瞬時轉染HEK293T細胞(2μg每種亞基/20百萬細胞)。將轉染的細胞置於384孔平板，並使用電壓敏感性螢光染料在VIPRII儀(Aurora Biosciences)上分析。與模擬轉染的細胞相比，表達ENaC的細胞表現Na+依賴性螢光變化(圖1)。在圖2中，Phenamil(一種ENaC拮抗劑)完全消除了該Na+依賴性螢光變化。相反地，發現另一種化合物增加Na+依賴性螢光變化，但該效應被Phenamil消除。該化合物據信是ENaC增強子，因為其在該測定中對ENaC的功能起著與Phenamil相反的作用。
實施例2的方法和材料1.在下面「材料部分」對使用的所有材料進行了鑑定。
2.將HEK293T細胞培養至80％匯合併在37℃下用酶溶液(胰蛋白酶/EDTA)進行3分鐘將其從培養皿中分離。使用臺式流式細胞儀(Guava；Guava Technologies)分析脫離的細胞的密度和存活力。將低於85％存活率的細胞從實驗中除去。3.清洗分離的細胞並以大約1,000,000細胞/ml的密度將其從其培養基(完全)中回收。將編碼人ENaC亞基的哺乳動物表達質粒DNA以等比例(10μgα∶10μgβ和10μg γ/20,000,000細胞)在eppendorf中混合。然後向DNA混合物中加入170μg載體質粒DNA(pUC-18)(總共200μg DNA/200,000,000個細胞)。向20ml無血清和抗生素的培養基中加入557μl的轉染試劑Transit(PanveraCorporation)。然後將DNA溶液加入Transit溶液中並將DNA-脂溶液在室溫下溫育。60分鐘後，將DNA-脂複合物轉移至細胞溶液中並用完全細胞培養基將體積調整至320ml，具有635,000存活細胞/ml的終密度。(如前面所討論的，α亞基DNA可與δ亞基DNA交換並用於產生表達功能性ENaC的重組細胞，所述ENaC由β、γ和δ亞基構成)。
4.用40μl/孔的Matrigel溶液(20μg/ml；CollaborativeBiomedical Products)在室溫下包被黑色384-孔聚D-賴氨酸底部透明的篩選板(Becton Dickinson)1小時。除去包被溶液並將板保持在室溫下直至細胞鋪板。
5.用Multidrop將細胞/DNA溶液以50,000細胞/孔(80μl/孔)的密度鋪入384孔板中。
6.鋪板27小時後，如下面描述的，清洗細胞並荷載膜電位敏感染料(CC2-DMPE和DiSBAC2(3))。
7.用200μM化合物([2x])刺激細胞並使用電壓強度板讀出計(VIPRII；Aurora Biosciences Corporation)在線讀數。其它濃度的化合物可用於所述測定。在下面對VIPR中的緩衝液製備和平板設計進行了描述。所述測定在「室溫」下進行，通常大約22℃，但也可在其它溫度下進行，通過在加入化合物前預熱或冷卻細胞和試劑。
材料1.培養在150cm2培養瓶(Becton Dickinson 0.2μm ventedBlueplug seal cap)(37℃，6％CO2)中的HEK293T細胞
2.Dulbecco′s Modified Eagle培養基(DMEM)(cat#11965-092Gibco BRL)(保持在4℃)3.含有HEPES的DMEM(DMEMH)(cat#12430-054，Gibco BRL)(保持在4℃)4.胎牛血清(FBS)(cat#10082-147，Gibco BRL)(保持在20℃)5.胰蛋白酶EDTA(1x)(cat#25200-072 Gibco-BRL)(保持在-20℃)6.Trans IT-293(cat# MIR2705，Panvera)(保持在4℃)7.α、β和γENaC DNA製劑(各1μg/μl)(保持在4℃)8.pUC18載體DNA((1μg/μl)(保持在4℃)9.Matrigel(cat #40230，Collaborative BiomedicalProducts)2.細胞荷載(loading)HBSS-Hank′s緩衝鹽溶液DiSBAC2(3)在100％DMSO中5mM 2.5μMESS-CY4或VABSC-1在dH2O中200mM 350μMVIPR NMDG緩衝液—參見以下″VIPR平板設計″部分中的式
製備CC2-DMPE荷載緩衝液
1.將等體積的CC2-DMPE母液與Pluronic F127混合。
2.向HBSS中加入CC2-DMPE/Pluronic混合物，同時渦旋。
用CC2-DMPE荷載細胞1.從CO2培養箱中取出細胞2.檢查密度/孔的變化3.用HBSS灌注(prime)EMBLA4.用HBSS(3×80μl)清洗細胞以除去殘留培養基和血清5.向各孔中加入40μl 10μM CC2-DMPE荷載緩衝液6.檢查密度/孔的變化7.在室溫下在暗處溫育30分鐘。
製備DiSBAC2(3)荷載緩衝液(可在CC2溫育期間進行)1.將DiSBAC2(3)和ESS-CY4或VABSC-1混合，加入DiSBAC2(3)的兩倍體積的PluronicF1272.向VIPR NMDG緩衝液中加入上面的混合物，渦旋用DiSBAC2(3)荷載緩衝液荷載細胞1.用NMDG緩衝液灌注(prime)EMBLA2.用VIPR NMDG緩衝液作為清洗緩衝液清洗裝有CC2-DMPE的細胞，3×80μ/孔3.向各孔加入40μ 2.5μM DiSBAC2(3)、350μM ESS-CY4或VABSC-1荷載緩衝液4.檢查密度/孔的變化5.在進行VIPRII之前在室溫下在暗處溫育20分鐘
VIPR平板布局圖
實施例3使用ENaC抑制劑(Phenamil)的改進的ENaC測定法在表達三個不同ENaC亞基的人胚胎腎(HEK)293細胞中監控對ENaC功能的調節。使用基於脂的系統用ENaC亞基質粒瞬時轉染HEK293細胞。將轉染的HEK293細胞接種入384孔篩選板中並允許ENaC功能性表達總共24小時。然後用特殊染料(例如DisBac2(3)和CC2-DMPE，Panvera)標記細胞，所述染料允許檢測膜電位的微小變化。使用電壓強度板讀出計((VIPR，Panvera)監控與ENaC功能的調節相關的染料螢光特徵的變化。通過使用該技術，我們能夠檢測不斷增加濃度的已知的ENaC抑制劑Phenamil(圖6，藍色描記線(trace))對ENaC功能(Na+誘導的膜電位染料螢光的變化)的抑制作用。另一方面，ENaC增強劑(ID #478354)增加ENaC的活性大約18％(圖6，黑色矩形內紅色和藍色數據點之間的差)。引人注意的是，通過增加Phenamil的濃度，化合物478354的效應得到很大的提高(圖6，黃色矩形內紅色和藍色數據點之間的差)。在這些條件下，478354在0.2至0.5μM Phenamil存在的情況下增加ENaC的活性高達50-60％。我們在0.5μM Phenamil不存在和存在(圖7A和圖7B)的情況下分別進行超過241和835個獨立的實驗。在這些實驗過程中，通過使用Z′因子，我們確定478354對測定窗口的影響。Z′是用於判斷信號窗口質量的統計參數，通過對關於其變化的高和低對照組的分離進行定量來判斷。Z′≥0並且≤1表示有意義的信號窗口，通過所述信號窗口，可在篩選過程中比較受試化學物質。在Phenamil不存在的情況下，通過478354高對照標準確定的信號窗口在超過90％的實驗中失效(圖2A)。然而，在Phenamil存在的情況下，在85％的實驗中478354顯著地增加了信號窗口，大多數Z′在0.26附近(圖2B)。
這些結果表明使用ENaC抑制劑例如Phenamil，在篩選一個或多個潛在的ENaC調節劑例如ENaC增強劑之前，增強信號強度，從而在基於細胞的通量測定中顯著地提高鑑定增強ENaC活性的分子的可能性。
實施例4使用表達功能性人ENaC的兩棲動物卵母細胞鑑定ENaC調節劑的電生理測定法卵母細胞表達系統具有固有的有利方面(表達水平，強勢(robust)，低內源離子通道表達等)，所述有利方面使其能夠用於檢查化合物對通過ENaC通道的鈉運輸的影響。這些化合物是增強鹽味感覺的候選者。卵母細胞表達系統早前在功能性研究(Dascal，CRCCrit.Rev.Biochem.(1987)22(4)317-387；Wagner，等人，Cellular Physiology and Biochemistry(2000)101-12；Canessa，等人，Nature(1994)367463-467)中已用於快速和強勢地表達離子通道，包括ENaC。因此，該系統被選擇用於使用下面描述的方法和材料進行的兩電極電壓鉗測定法。
卵母細胞表達系統由下列步驟和方法學構成，其總地包括篩選ENaC增強劑蛙手術和卵母細胞分離、cRNA製備、卵母細胞的顯微注射和使用兩電極電壓鉗電生理記錄測量卵母細胞中的ENaC電流。下列參考資料描述了用於蛙手術和卵母細胞分離的一般操作(Marcus-Sekura等人，Methods in Enzymology(1987)152284-288；Goldin，Methods in Enzymology(1992)207266-279)，cRNA製備(Swanson等人，Methods in Enzymology(1992)207310-319；Goldin等人，Methods in Enzymology(1992)207279-297)，卵母細胞顯微注射(Matten等人，Methods in Enzymology(1995)254458-466；Hitchcock等人，Methods in Enzymology(1987)152276-284)，和兩電極電壓鉗電生理記錄(Stuhmer，Methods in Enzymology(1992)207319-339；Wagner等人，Cellular Physiology and Biochemistry(2000)101-12)。這些方法學中的每一個方法，由於其與篩選ENaC增強劑有關，在下面進行更詳細地描述。
蛙手術和卵母細胞分離從NASCO(Fort Atkinson，WI)獲得長度超過或等於9cm的雌性非洲爪蟾南非爪蛙。用蒸餾水中的0.15％MS-222(tricaine或乙基-3-氨基苯甲醯甲磺酸(benzoate methanesulfonate)；Sigma)麻醉蛙並放置在冰上。使用無菌手術器械，在腹部切開外部皮膚層和內部腹膜層以產生連續的1-2cm的切口。將切出的卵巢瓣(包含1000-2000個卵母細胞)放置在OR-2無鈣培養基(82.5mM NaCl、2mM KCl、1mM MgCl2、5mM HEPES、使用NaOH的pH 7.5)上並隨後用2mg/ml IA型膠原蛋白酶(Sigma)(在使用前臨時配製)酶消化45分鐘，然後用1mg/ml IA型膠原蛋白酶在搖床上在室溫下酶消化15分鐘。酶消化後，此時大部分卵母細胞從卵巢瓣中釋放出來，在無膠原蛋白酶的OR-2中漂洗卵母細胞並轉移至裝有Barth′s鹽水(88mM NaCl、2mMKCl、0.82mM MgSO4、0.33mM Ca(NO3)2、0.41mM CaCl2、2.4mM NaHCO3，和5mM HEPES pH7.5；Specialty Media)和2.5mM丙酮酸鈉的培養皿中。選擇成熟階段V或VI的卵母細胞(直徑大約1mm)用於顯微注射，所述成熟階段的卵母細胞含有明顯的動物極，對應於包含黑色素色素顆粒的卵的較暗的一側，和植物極，對應於包含卵黃蛋白的卵的顏色較淺的一側。使用C6針頭用3-0黑色編織縫合線(HarvardApparatus)縫合蛙並在2-3個月的恢復期後重新用於卵母細胞分離。
cRNA製備根據廠商說明(Ambion)使用mMESSAGE mMACHINE試劑盒從描述於我們前面專利(PCT WO 02/087306 A2)中的α、β和γ人ENaC DNA質粒產生ENaC cRNA，使用T7 RNA聚合酶在體外從用Eco RI(針對α和γENaC)線性化的DNA和用Xho I(針對βENaC)線性化的DNA轉錄cRNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳和在260和280nm光譜吸收讀數來檢查cRNA的質量以確保全長、無降解的cRNA產生。
顯微注射在Model P-97 Flaming/Brown微量加液器拉制儀(MicropipettePuller)(Sutter Instrument Co.)上使用硼矽酸鹽玻璃毛細管(World Precision Instruments Inc.)拉制顯微注射針頭，後部充注礦物油(Sigma)，然後使用Nanoliter 2000注射器和Micro4微注射泵控制器(Micro4 MicroSyringe Pump Controller)(WorldPrecision Instruments)在前部充注ENaC cRNA。在動物極用各10-15nl含有1-3ng的α、β和γ人ENaC cRNA的溶液顯微注射卵母細胞。顯微注射後，將卵母細胞轉移至含有Barth′s溶液和2.5mM丙酮酸鈉的玻璃閃爍瓶中並在18-19℃下在正常大氣條件下溫育過夜。在此期間，所述卵母細胞將注射的ENaC cRNA翻譯成蛋白。
使用兩電極電壓鉗電生理記錄測量卵母細胞中的ENaC電流顯微注射後24小時，在OpusXpress 6000A平行卵母電壓鉗系統(Axon Instruments)中使用兩電極電壓鉗技術測量卵母細胞中的ENaC功能。兩電極電壓鉗技術是測量通過蛋白通道例如ENaC流經完整卵母細胞膜的宏觀電流的電生理方法(Stuhmer，Methods in Enzymology(1992)207319-339)。用電壓傳感電極和電流傳感電極刺穿卵母細胞；使用電壓傳感電極將穿過卵母細胞膜的電壓或勢位差鉗制在特定的值，使用電流傳感電極測量保持該電壓所需的穿過卵母細胞膜的電流或離子流。所述OpusXpress系統是允許同時產自8個卵母細胞的電生理記錄的半自動兩電極電壓鉗工作站。自動進行卵母細胞穿孔，並且通過計算機控制的流體輸送裝置從96孔化合物板遞送化合物。該中通量系統顯著地增加了化合物的數目，通過使用OpusXpress系統，我們可從使用常規單卵母細胞電壓鉗系統每周檢查大約1個化合物增加到每周檢查大約60個化合物。
將卵母細胞放入OpusXpress系統內並在ND-96溶液(96mM NaCl、2.5mM KCl、1mMCaCl2、1mM MgCl2和5mM HEPES，使用NaOH的pH7.5)水浴。用電壓傳感和電流傳感電極刺穿卵母細胞，在Model P-97Flaming/Brown Micropipette Puller(Sutter Instrument Co.)上使用硼矽酸鹽玻璃毛細管(World Precision Instruments Inc.)拉制所述電極，後部充注3M KCl，含有氯化銀導線。電極表現2-10Mohm之間(電壓傳感電極)和0.5-2Mohm之間(電流傳感電極)的電阻。刺穿後，將卵母細胞的電壓鉗制在-60mV並開始實驗記錄。在50Hz獲得數據，使用4極Bessel濾波器在5Hz過濾低通濾波。
根據本發明用於在卵母細胞測定中篩選用於ENaC增強作用的化合物的方法如下(圖8)。首先，使用氨氯吡嗪脒(1uM；Sigma)。氨氯吡嗪脒是阻斷通過ENaC通道的鈉運輸的抑制劑並且用作內部對照以驗證卵母細胞表達功能性ENaC蛋白(Canessa等人，Nature(1994)367463-467)。其次，在表現氨氯吡嗪脒抑制的卵母細胞中，通過在氨氯吡嗪脒處理後流經卵母細胞膜的離子流減少獲得驗證，然後使用化合物(濃度在大約0.1μM至大約100μM之間)。如果所述化合物發揮ENaC增強劑的作用，那麼通過卵母細胞膜上ENaC通道的離子流將增加。為對化合物對ENaC功能的影響進行定量，我們使用下式[(A-Ao)/(B-Bo)]x-100，其中A是化合物處理後的電流，Ao是化合物處理前的電流，B是氨氯吡嗪脒處理後的電流，Bo是氨氯吡嗪脒處理後前的電流(圖8)。該值產生％增強因子，所述％增強因子用於在我們的測定中測量化合物活性。例如，如果％增強因子等於100％，那麼化合物增加ENaC活性，超過基礎對照值(在化合物不存在的情況下)100％。在OpusXpress系統中單個地對各卵母細胞計算％增強因子，然後確定各化合物的平均值和標準差(圖9)。
在沒有用ENaC cRNA注射過的卵母細胞中進行陰性對照實驗以證明在表達ENaC的卵母細胞中觀察到的使用化合物的效應歸因於流經ENaC通道的電流而不是流經在所述卵母細胞膜上內源表達的通道的電流造成的。(Dascal，CRC Crit.Rev.Biochem.(1987)22(4)317-387)。特異性增強ENaC的化合物不應當影響未注射的卵母細胞中的電流並且應當展現值為0的％增強因子(圖10)。
對表現大％增強因子和對未注射ENaC cRNA的卵母細胞沒有影響的化合物進行更複雜的分析。所述測定包括電流/電壓(I/V)曲線、氨氯吡嗪脒競爭實驗和劑量反應曲線。對於I/V曲線，在氨氯吡嗪脒存在和不存在的情況下，在從-100至+60mV的電壓梯度(以20mV為增量)中測量電流以確定上述ENaC表達，和在化合物存在和不存在的情況下，確定化合物增強作用(圖11)的量級(magnitude)。減去所有非ENaC電流(定義為不被氨氯吡嗪脒阻斷的電流)並繪製I/V曲線。I/V曲線的斜率表示由目的化合物產生的電流增加量的量級。強增強劑展現具有大的正斜率的I/V曲線。此外，I/V曲線的X-截距表示在兩電極電壓鉗實驗中被運輸的離子類型。對於鈉離子運輸，X截距落在10-40mV的範圍之內，依賴於卵母細胞內鈉離子荷載的程度。在沒有注射ENaC cRNA的卵母細胞中，在化合物存在的情況下繪製的I/V曲線應當與在化合物不存在的情況下(圖11)繪製的I/V曲線一致並且重合(superimposible)。
希望進行氨氯吡嗪脒競爭實驗以驗證化合物的效應是ENaC依賴性的(圖12)。首先，如上所述使用氨氯吡嗪脒以證明ENaC在卵母細胞中表達。然後，使用化合物以確定％增強因子。最後，共同施用氨氯吡嗪脒和化合物。對於直接對ENaC起作用的增強劑，氨氯吡嗪脒和化合物的共同使用應當表現氨氯吡嗪脒表型，就是指電流被抑制並且未增強。該測定顯示當ENaC通道因為氨氯吡嗪脒被關閉時，化合物不能具有增加的作用；因此，化合物一定直接調節ENaC通道功能。
繪製劑量反應曲線以確定所述化合物表現最大活性一半(EC50)(圖13)時的濃度。EC50越低，所述化合物作為ENaC增強劑的活性越高。通過系列使用不斷增加的從低劑量(約1nM)開始並逐步增加至高劑量(約1mM)的增強劑濃度來繪製劑量反應曲線。如上所述計算％增強因子並將其標繪為以對數值為標度的化合物濃度的函數，從而確定化合物的EC50值。
示意性說明實驗順序的流程圖描述於圖14中，所述實驗用於檢查化合物對ENaC功能的影響，其包括在-60mV的固定電位上進行篩選，I/V曲線、氨氯吡嗪脒競爭實驗、劑量反應曲線和檢驗未注射的卵母細胞。
結果分析在我們前面的專利申請(PCT WO 02/087306 A2)中，我們在HEK293T人胚胎腎細胞使用了基於哺乳動物細胞的高通量測定法，所述測定通過測定用電壓敏感螢光探針荷載的ENaC轉染的細胞從而間接地測量了ENaC活性。儘管該方法是高通量的，並且鑑定了一些調節ENaC的活合物，然而不幸的是，其是非特異性的，並且大約90％的經鑑定的化合物不直接調節ENaC功能，相反地可能調節其它在HEK293T細胞中內源性表達的離子通道的活性。通過使用上面描述的Phenamil和類似的ENaC抑制劑在此提高了該高通量測定法的效率。此外，本申請也提供了了更直接的(特異性的)但低通量的測定方法學，所述測定使用兩電極電壓鉗技術在卵母細胞內測量ENaC鈉通道。該系統允許離子通道的快速和強勢表達(僅在大約18-24小時後，在卵母細胞的膜上可表達大約1百萬ENaC通道)。卵母細胞表達系統的其它有利方面包括卵母細胞很大(直徑大約為1mm)並且堅固耐用，使其容易操作和使用；可從相同卵母細胞中對相同或不同目的化合物獲得多個和重複的記錄；卵母細胞很少以足以產生高背景電流(和來自外源表達的離子通道的電流相比)的水平表達內源通道；卵母細胞允許直接測量離子通道功能。因此，與使用電壓敏感探針在HEK293T細胞中間接測量ENaC功能的測定法相反，卵母細胞表達系統允許直接測量ENaC鈉通道電流並且實際上不產生背景。
用於實施例中的ENaC亞基的核酸和胺基酸序列SEQ ID NO1長度2010個核苷酸DNA人hENaCα克隆#3-1-1編碼序列atggaggggaacaagctggaggagcaggactctagccctccacagtccactccagggctcatgaaggggaacaagcgtgaggagcaggggctgggccccgaacctgcggcgccccagcagcccacggcggaggaggaggccctgatcgagttccaccgctcctaccgagagctcttcgagttcttctgcaacaacaccaccatccacggcgccatccg
cctggtgtgctcccagcacaaccgcatgaagacggccttctgggcagtgctgtggctctgcacctttggcatgatgtactggcaattcggcctgcttttcggagagtacttcagctaccccgtcagcctcaacatcaacctcaactcggacaagctcgtcttccccgcagtgaccatctgcaccctcaatccctacaggtacccggaaattaaagaggagctggaggagctggaccgcatcacagagcagacgctctttgacctgtacaaatacagctccttcaccactctcgtggccggctcccgcagccgtcgcgacctgcgggggactctgccgcaccccttgcagcgcctgagggtcccgcccccgcctcacggggcccgtcgagcccgtagcgtggcctccagcttgcgggacaacaacccccaggtggactggaaggactggaagatcggcttccagctgtgcaaccagaacaaatcggactgcttctaccagacatactcatcaggggtggatgcggtgagggagtggtaccgcttccactacatcaacatcctgtcgaggctgccagagactctgccatccctggaggaggacacgctgggcaacttcatcttcgcctgccgcttcaaccaggtctcctgcaaccaggcgaattactctcacttccaccacccgatgtatggaaactgctatactttcaatgacaagaacaactccaacctctggatgtcttccatgcctggaatcaacaacggtctgtccctgatgctgcgcgcagagcagaatgacttcattcccctgctgtccacagtgactggggcccgggtaatggtgcacgggcaggatgaacctgcctttatggatgatggtggctttaacttgcggcctggcgtggagacctccatcagcatgaggaaggaaaccctggacagacttgggggcgattatggcgactgcaccaagaatggcagtgatgttcctgttgagaacctttacccttcaaagtacacacagcaggtgtgtattcactcctgcttccaggagagcatgatcaaggagtgtggctgtgcctacatcttctatccgcggccccagaacgtggagtactgtgactacagaaagcacagttcctgggggtactgctactataagctccaggttgacttctcctcagaccacctgggctgtttcaccaagtgccggaagccatgcagcgtgaccagctaccagctctctgctggttactcacgatggccctcggtgacatcccaggaatgggtcttccagatgctatcgcgacagaacaattacaccgtcaacaacaagagaaatggagtggccaaagtcaacatcttcttcaaggagctgaactaca
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ctcagatctacagatgagcgtggcgcagagagagacctgcattggcatgtgcaaggagtcctgcaatgacacccagtacaagatgaccatctccatggctgactggccttctgaggcctccgaggactggattttccacgtcttgtctcaggagcgggaccaaagcaccaatatcaccctgagcaggaagggaattgtcaagctcaacatctActtccaagaatttaactatcgcaccattgaagaatcagcagccaataacatcgtctggctgctctcgaatctgggtggccagtttggcttctggatggggggctctgtgctgtgcctcatcgagtttggggagatcatcatcgactttgtgtggatcaccatcatcaagctggtggccttggccaagagcctacggcagcggcgagcccaagccagCtacgctggcccaccgcccaccgtggccgagctggtggaggcccacaccaactttggcttccagcctgacacggccccccgcagccccaacactgggccctaccccagtgagcaggccctgcccatcccaggcaccccgccccccaactatgactccctgcgtctgcagccgctggacgtcatcgagtctgacagtgagggtgatgccatctaaSEQ ID NO3長度1950個核苷酸DNA人hENaCγ克隆#3編碼序列atggcacccggagagaagatcaaagccaaaatcaagaagaatctgcccgtgacgggccctcaggcgccgaccattaaagagctgatgcggtggtactgcctcaacaccaacacccatggctgtcgccgcatcgtggtgtcccgcggccgtctgcgccgcctcctctggatcgggttcacactgactgccgtggccctcatcctctggcagtgcgccctcctcgtcttctccttctatactgtctcagtttccatcaaagtccacttccggaagctggattttcctgcagtcaccatctgcaacatcaacccctacaagtacagcaccgttcgccaccttctagctgacttggaacaggagaccagagaggccctgaagtccctgtatggctttccagagtcccggaagcgccgagaggcggagtcctggaactccgtctcagagggaaagcagcctagattctcccaccggattccgctgctgatctttgatcaggatgagaagggcaaggccagggacttcttcacagggAggaagcggaaagtcggcggtagcatcattcacaaggcttcaaatgtcatgcacatcgagtccaagcaagtggtgggattccaactgtgctcaaatgacacctccgactgtgccacctacaccttcagctcgggaatcaatgccattcaggagtggtataagctacactacatgaacatcatggcacaggtgcctctggagaagaaaatcaacatgagctattctgctgaggagctgctggtgacctgcttctttgatggagtgtcctgtgatgccaggaatttcacgcttttCcaccacccgatgcatgggaattgctatactttcaacaacagagaaaatgagaccattctcagcacctccatggggggcagcgaatatgggctgcaagtcattttgtacataaacgaagaggaatacaacccattcctcgtgtcctccactggagctaaggtgatcatccatcggcaggatgagtatcccttcgtcgaagatgtgggaacagagattgagacagcaatggtcacctctataggaatgcacctgacagagtccttcaagctgagtgagccctacagtcagtgcacgg
aggacgggagtgacgtgccaatcaggaacatctacaacgctgcctactcgctccagatctgccttcattcatgcttccagacaaagatggtggagaaatgtgggtgtgcccagtacagccagcctctacctcctgcagccaactactgcaactaccagcagcaccccaactggatgtattgttactaccaactgcatcgagcctttgtccaggaagagctgggctgccagtctgtgtgcaaggaagcctgcagctttaaagagtggacactaaccacaagcctggcacaatggccatctgtggtttcggagaagtggttgctgcctgttctcacttgggaccaaggccggcaagtaaacaaaaagctcaacaagacagacttgGccaaactcttgatattctacaaagacctgaaccagagatccatcatggagagcccagccaacagtattgagatgcttctgtccaacttcggtggccagctgggcctgtggatgagctgctctgttgtctgcgtcatcgagatcatcgaggtcttcttcattgacttcttctctatcattgcccgccgccagtggcagaaagccaaggagtggtgggcctggaaacaggctcccccatgtccagaagctccccgtagcccacagggccaggacaatccagccctggatatagacgatgacctacccactttcaactctgctttgcacctgcctccaGccctaggaacccaagtgcccggcacaccgccccccaaatacaataccttgcgcttggagagggccttttccaaccagctcacagatacccagatgctAgatgagctctgaSEQ ID NO4長度669個胺基酸PRT人hENaCα克隆#3-1-1胺基酸序列MEGNKLEEQDSSPPQSTPGLMKGNKREEQGLGPEPAAPQQPTAEEEALIEFHRSYRELFEFFCNNTTIHGAIRLVCSQHNRMKTAFWAVLWLCTFGMMYWQFGLLFGEYFSYPVSLNINLNSDKLVFPAVTICTLNPYRYPEIKEELEELDRITEQTLFDLYKYSSFTTLVAGSRSRRDLRGTLPHPLQRLRVPPPPHGARRARSVASSLRDNNPQVDWKDWKIGFQLCNQNKSDCFYQTYSSGVDAVREWYRFHYINILSRLPETLPSLEEDTLGNFIFACRFNQVSCNQANYSHFHHPMYGNCYTFNDKNNSNLWMSSMPGINNGLSLMLRAEQNDFIPLLSTVTGARVMVHGQDEPAFMDDGGFNLRPGVETSISMRKETLDRLGGDYGDCTKNGSDVPVENLYPSKYTQQVCIHSCFQESMIKECGCAYIFYPRPQNVEYCDYRKHSSWGYCYYKLQVDFSSDHLGCFTKCRKPCSVTSYQLSAGYSRWPSVTSQEWVFQMLSRQNNYTVNNKRNGVAKVNIFFKELNYKTNSESPSVTMVTLLSNLGSQWSLWFGSSVLSVVEMAELVFDLLVIMFLMLLRRFRSRYWSPGRGGRGAQEVASTLASSPPSHFCPHPMSLSLSQPGPAPSPALTAPPPAYATLGPRPSPGGSAGASSSTCPLGGP
SEQ ID NO5長度640個胺基酸PRT人hENaCβ克隆#5胺基酸序列MHVKKYLLKGLHRLQKGPGYTYKELLVWYCDNTNTHGPKRIICEGPKKKAMWFLLTLLFAALVCWQWGIFIRTYLSWEVSVSLSVGFKTMDFPAVTICNASPFKYSKIKHLLKDLDELMEAVLERILAPELSHANATRNLNFSIWNHTPLVLIDERNPHHPMVLDLFGDNHNGLTSSSASEKICNAHGCKMAMRLCSLNRTQCTFRNFTSATQALTEWYILQATNIFAQVPQQELVEMSYPGEQMILACLFGAEPCNYRNFTSIFYPHYGNCYIFNWGMTEKALPSANPGTEFGLKLILDIGQEDYVPFLASTAGVRLMLHEQRSYPFIRDEGIYAMSGTETSIGVLVDKLQRMGEPYSPCTVNGSEVPVQNFYSDYNTTYSIQACLRSCFQDHMIRNCNCGHYLYPLPRGEKYCNNRDFPDWAHCYSDLQMSVAQRETCIGMCKESCNDTQYKMTISMADWPSEASEDWIFHVLSQERDQSTNITLSRKGIVKLNIYFQEFNYRTIEESAANNIVWLLSNLGGQFGFWMGGSVLCLIEFGEIIIDFVWITIIKLVALAKSLRQRRAQASYAGPPPTVAELVEAHTNFGFQPDTAPRSPNTGPYPSEQALPIPGTPPPNYDSLRLQPLDVIESDSEGDAISEQ ID NO6長度650個胺基酸PRT人hENaCγ克隆#3胺基酸序列MAPGEKIKAKIKKNLPVTGPQAPTIKELMRWYCLNTNTHGCRRIVVSRGRLRRLLWIGFTLTAVALILWQCALLVFSFYTVSVSIKVHFRKLDFPAVTICNINPYKYSTVRHLLADLEQETREALKSLYGFPESRKRREAESWNSVSEGKQPRFSHRIPLLIFDQDEKGKARDFFTGRKRKVGGSIIHKASNVMHIESKQVVGFQLCSNDTSDCATYTFSSGINAIQEWYKLHYMNIMAQVPLEKKINMSYSAEELLVTCFFDGVSCDARNFTLFHHPMHGNCYTFNNRENETILSTSMGGSEYGLQVILYINEEEYNPFLVSSTGAKVIIHRQDEYPFVEDVGTEIETAMVTSIGMHLTESFKLSEPYSQCTEDGSDVPIRNIYNAAYSLQICLHSCFQTKMVEKCGCAQYSQPLPPAANYCNYQQHPNWMYCYYQLHRAFVQEELGCQSVCKEACSFKEWTLTTSLAQWPSVVSEWLLPVLTWDQGRQVNKKLNKTDLAKLLIFYKDLNQRSIMESPANSIEMLLSNFGGQLGLWMSCSVVCVIEIIEVFFIDFFSIIARRQWQKAKEWW
AWKQAPPCPEAPRSPQGQDNPALDIDDDLPTFNSALHLPPALGTQVPGTPPPKYNTLRLERAFSNQLTDTQMLDELSEQ ID NO7長度1917個核苷酸DNAgi|1066456|gb|U38254.1|HSU 38254人氨氯吡嗪脒敏感性鈉通道Δ亞基(ΔNaCh)mRNA，完整編碼序列ATGGCTGAGCACCGAAGCATGGACGGGAGAATGGAAGCAGCCACACGGGGGGGCTCTCACCTCCAGGCTGCAGCCCAGACGCCCCCCAGGCCGGGGCCACCATCAGCACCACCACCACCACCCAAGGAGGGGCACCAGGAGGGGCTGGTGGAGCTGCCCGCCTCGTTCCGGGAGCTGCTCACCTTCTTCTGCACCAATGCCACCATCCACGGCGCCATCCGCCTGGTCTGCTCCCGCGGGAACCGCCTCAAGACGACGTCCTGGGGGCTGCTGTCCCTGGGAGCCCTGGTCGCGCTCTGCTGGCAGCTGGGGCTCCTCTTTGAGCGTCACTGGCACCGCCCGGTCCTCATGGCCGTCTCTGTGCACTCGGAGCGCAAGCTGCTCCCGCTGGTCACCCTGTGTGACGGGAACCCACGTCGGCCGAGTCCGGTCCTCCGCCATCTGGAGCTGCTGGACGAGTTTGCCAGGGAGAACATTGACTCCCTGTACAACGTCAACCTCAGCAAAGGCAGAGCCGCCCTCTCCGCCACTGTCCCCCGCCACGAGCCCCCCTTCCACCTGGACCGGGAGATCCGTCTGCAGAGGCTGAGCCACTCGGGCAGCCGGGTCAGAGTGGGGTTCAGACTGTGCAACAGCACGGGCGGCGACTGCTTTTACCGAGGCTACACGTCAGGCGTGGCGGCTGTCCAGGACTGGTACCACTTCCACTATGTGGATATCCTGGCCCTGCTGCCCGCGGCATGGGAGGACAGCCACGGGAGCCAGGACGGCCACTTCGTCCTCTCCTGCAGTTACGATGGCCTGGACTGCCAGGCCCGACAGTTCCGGACCTTCCACCACCCCACCTACGGCAGCTGCTACACGGTCGATGGCGTCTGGACAGCTCAGCGCCCCGGCATCACCCACGGAGTCGGCCTGGTCCTCAGGGTTGAGCAGCAGCCTCACCTCCCTCTGCTGTCCACGCTGGCCGGCATCAGGGTCATGGTTCACGGCCGTAACCACACGCCCTTCCTGGGGCACCACAGCTTCAGCGTCCGGCCAGGGACGGAGGCCACCATCAGCATCCGAGAGGACGAGGTGCACCGGCTCGGGAGCCCCTACGGCCACTGCACCGCCGGCGGGGAAGGCGTGGAGGTGGAGCTGCTACACAACACCTCCTACACCAGGCAGGCCTGCCTGGTGTCCTGCTTCCAGCAGCTGATGGTGGAGACCTGCTCCTGTGGCTACTACCTCCACCCTCTGCCGGCGGGGGCT
GAGTACTGCAGCTCTGCCCGGCACCCTGCCTGGGGACACTGCTTCTACCGCCTCTACCAGGACCTGGAGACCCACCGGCTCCCCTGTACCTCCCGCTGCCCCAGGCCCTGCAGGGAGTCTGCATTCAAGCTCTCCACTGGGACCTCCAGGTGGCCTTCCGCCAAGTCAGCTGGATGGACTCTGGCCACGCTAGGTGAACAGGGGCTGCCGCATCAGAGCCACAGACAGAGGAGCAGCCTGGCCAAAATCAACATCGTCTACCAGGAGCTCAACTACCGCTCAGTGGAGGAGGCGCCCGTGTACTCGGTGCCGCAGCTGCTCTCCGCCATGGGCAGCCTCTACAGCCTGTGGTTTGGGGCCTCCGTCCTCTCCCTCCTGGAGCTCCTGGAGCTGCTGCTCGATGCTTCTGCCCTCACCCTGGTGCTAGGCGGCCGCCGGCTCCGCAGGGCGTGGTTCTCCTGGCCCAGAGCCAGCCCTGCCTCAGGGGCGTCCAGCTCAAGCCAGAGGCCAGTCAGATGCCCCCGCCTGCAGGCGGCACGTCAGATGACCCGGAGCCCAGCGGGCCTCATCTCCCACGGGTGATGCTTCCAGGGGTTCTGGCGGGAGTCTCAGCCGAAGAGAGCTGGGCTGGGCCCCAGCCCCTTGAGACTCTGGACACCTGASEQ ID NO8長度638個核苷酸PRTgi|1710872|sp|P51172|SCAD_人氨氯吡嗪敏感性鈉通道Δ亞基胺基酸序列(上皮Na+通道Δ亞基)(ΔENaC)(非電壓門控的鈉通道1Δ亞基)(SCNED)(ΔNaCh)MAEHRSMDGRMEAATRGGSHLQAAAQTPPRPGPPSAPPPPPKEGHQEGLVELPASFRELLTFFCTNATIHGAIRLVCSRGNRLKTTSWGLLSLGALVALCWQLGLLFERHWHRPVLMAVSVHSERKLLPLVTLCDGNPRRPSPVLRHLELLDEFARENIDSLYNVNLSKGRAALSATVPRHEPPFHLDREIRLQRLSHSGSRVRVGFRLCNSTGGDCFYRGYTSGVAAVQDWYHFHYVDILALLPAAWEDSHGSQDGHFVLSCSYDGLDCQARQFRTFHHPTYGSCYTVDGVWTAQRPGITHGVGLVLRVEQQPHLPLLSTLAGIRVMVHGRNHTPFLGHHSFSVRPGTEATISIREDEVHRLGSPYGHCTAGGEGVEVELLHNTSYTRQACLVSCFQQLMVETCSCGYYLHPLPAGAEYCSSARHPAWGHCFYRLYQDLETHRLPCTSRCPRPCRESAFKLSTGTSRWPSAKSAGWTLATLGEQGLPHQSHRQRSSLAKINIVYQELNYRSVEEAPVYSVPQLLSAMGSLYSLWFGASVLSLLELLELLLDASALTLVLGGRRLRRAWFSWPRASPASGASSIKPEASQMPPPAGGTSDDPEPSGPHLPRVMLPGVLAGVSAEESWAGPQPLETLDT
儘管已通過實施例和優選的實施方案描述了本發明，但應當理解此處所用的詞語是描述性的詞語，而不是限定性詞語。在附錄中的權利要求的範圍內可產生變化，而在其更廣的方面不背離本發明的範圍和精神。儘管用特定的方法、材料和實施方案描述了本發明，但應當理解本發明並不限定於公開的特例中。本發明擴展至在附錄的權利要求範圍內的所有等同的結構、方法和用途。
權利要求
1.用於表徵和篩選上皮鈉通道(ENaC)的假定調節劑的基於哺乳動物細胞的高通量測定方法，其包括在至少部分地抑制ENaC功能的條件下將受試細胞與至少一個已知的ENaC抑制劑接觸，之後在鈉或鋰存在的情況下將所述受試細胞與至少一種假定的調節劑化合物接觸，所述受試細胞表達α、β和γ亞基或δ、β和γ亞基或這三個亞基中各亞基的變體、片段或功能性等同物，並且所述受試細胞預先荷載了膜電位螢光染料或鈉螢光染料；和監控在所述假定的調節劑/ENaC相互作用存在的情況下陰離子介導的所述受試細胞的螢光變化，將所述變化與所述調節劑不存在的情況下的變化相比較以確定ENaC調節的程度。
2.權利要求1的方法，其中所述已知的ENaC抑制劑是氨氯吡嗪脒衍生物。
3.權利要求2的方法，其中所述化合物選自Phenamil、benzamil，乙基異丙基氨氯吡嗪脒；2′，4′-dimethylbenzamil(DMB)，5-(N-4-Chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil(CBDMB)；3′，4′-dichlorobenzamil；5-(N-甲基-N-胍基羰基)甲基氨氯吡嗪脒、5-(N，N-環己烷)氨氯吡嗪脒；5-(N-乙基-N-異丙基)氨氯吡嗪脒(EIPA)；5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil；2′，4′-dimethyl 2′，3′-benzamil 2′，3′-benzobenzamil；和5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethyl benzamil.
4.權利要求3的方法，其中所述化合物是Phenamil。
5.權利要求1的測定方法，其中所述陰離子是鈉。
6.權利要求1的測定方法，其中所述陰離子是鋰。
7.權利要求1的測定方法，其中所述受試細胞選自MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3和CHO細胞。
8.權利要求7的測定方法，其中所述細胞是HEK293細胞。
9.權利要求7的測定方法，其中所述HEK293細胞是HEK293T細胞。
10.權利要求1的測定方法，其中所述方法基於可檢測的螢光變化用於鑑定作為特定地調節味道的調節劑的化合物。
11.權利要求10的測定方法，其中所述味道是鹽味。
12.權利要求1的測定方法，其中所述受試細胞被接種到多孔測試板的孔中。
13.權利要求12的測定方法，其中通過加入所述假定的調節劑至所述多孔測試板的孔中將所述受試細胞與假定的調節劑接觸。
14.權利要求13的測定方法，其中用允許螢光變化被檢測到的膜電位染料荷載所述受試細胞。
15.權利要求14的測定方法，其中所述受試細胞表達各α、β和γENaC亞基。
16.權利要求15的測定方法，其中所述亞基分別由SEQ ID NO1、2和3、或其片段、或與其雜交和編碼功能性hENaC亞基的DNA序列編碼。
17.權利要求1的測定方法，其中所述亞基由SEQ ID NO1、2和3編碼。
18.權利要求1的測定方法，其中所述受試細胞表達hENaCβ、γ和δ亞基或其片段或變體。
19.權利要求18的測定方法，其中所述β、γ和δ亞基分別由SEQID NO2、3和7編碼。
20.權利要求1的測定方法，其中所述ENaC亞基都包含從人腎cDNA中克隆的人ENaC亞基。
21.權利要求1的測定方法，其中所述ENaC亞基包含從人肺cDNA中克隆的人ENaC亞基。
22.權利要求1的測定方法，其中所述ENaC是由克隆自人味覺細胞cDNA的人ENaC DNA序列編碼的人ENaC。
23.權利要求1的測定方法，其中所述ENaC由α(或δ)、β和γ亞基組成並且選自天然發生的人ENaC、可變拼接的人ENaC、其功能性變體或其組合物。
24.權利要求1的測定方法，其中使用螢光板讀出計監控螢光的變化。
25.權利要求1的測定方法，其中使用電壓成像板讀出計監控螢光的變化。
26.權利要求1的測定方法，其中所述膜電位染料選自MolecularDevices Membrane Potential Kit(cat#R8034)、Di-4-ANEPPS(吡啶鎓4-(2-(6-二丁基氨基)-2-萘基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-，氫氧化物，內鹽)，DiSBACC4(2)(二-(1，2-二巴比土酸)-trimethine oxanol)，DiSBAC4(3)(二-(1，3-二巴比土酸)-trimethine oxanol)，CC-2-DMPE(Pacific BlueTM1，2-dietradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolmine，triethylammonium salt)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane-7，13-diylbis(5-Methoxy-6，12-benzofurandiyl)]bis-，tetrakis[(acetyloxy)methyl]ester；(Molecular probes)。
27.用於監控上皮鈉通道(ENaC)活性的方法，其包括提供用功能性ENaC轉染的受試細胞，所述功能性ENaC由α(或Δ)、β和γENaC亞基、其拼接變體、其片段和亞基組合組成；將所述受試細胞接種在多孔板的孔中並溫育足以達到至少大約70％匯合的時間；在多孔板的孔中用膜電位染料使所述接種的細胞荷載染料；將荷載染料的宿主細胞與至少一種以至少部分地抑制ENaC功能的濃度的已知的ENaC抑制劑接觸；進一步在多孔板的孔中將所述荷載染料的受試細胞與至少一種假定的調節性化合物和鈉接觸；和使用螢光板讀出計或電壓強度板讀出計監控任何由於調節劑/ENaC相互作用引起的膜電位染料的螢光變化。
28.權利要求27的方法，其中所述受試細胞是HEK293細胞。
29.權利要求27的方法，其中所述受試細胞是HEK293T細胞。
30.權利要求27的方法，其中所述α、β和γ亞基分別由SEQ IDNO1、2和3編碼。
31.權利要求27的方法，其中所述已知的ENaC抑制劑是氨氯吡嗪脒衍生物。
32.權利要求31的方法，其中所述化合物選自Phenamil、benzamil，乙基異丙基氨氯吡嗪脒；2′，4′-dimethylbenzamil(DMB)，5-(N-4-Chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil(CBDMB)；3′，4′-dichlorobenzamil；5-(N-甲基-N-胍基羰基)甲基氨氯吡嗪脒、5-(N，N-環己烷)氨氯吡嗪脒；5-(N-乙基-N-異丙基)氨氯吡嗪脒(EIPA)；5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil；2′，4′-dimethyl 2′，3′-benzamil 2′，3′-benzobenzamil；和5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethyl benzamil.
33.權利要求32的方法，其中所述化合物是Phenamil。
34.權利要求27的方法，其中所述δ、β和γ亞基分別由SEQ IDNO7、2和3編碼。
35.權利要求31的方法，其中所述受試細胞是HEK293。
36.權利要求27的方法，其中通過向其中具有所述接種的受試細胞的多孔板的孔中加入膜電位染料使所述受試細胞荷載染料，並溫育足以允許使通過所述受試細胞的膜的染料平衡的時間。
37.權利要求36的方法，其中以大約2μM至大約5μM的終濃度向多孔板的孔中加入膜電位染料。
38.權利要求27的方法，其中膜電位染料選自Molecular DevicesMembrane Potential Kit(cat#R8034)、Di-4-ANEPPS(吡啶鎓4-(2-(6-二丁基氨基)-2-萘基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-，氫氧化物，內鹽)，DiSBAC4(2)(二-(1，2-二巴比土酸)-trimethine oxanol)，DiSBAC4(3)(二-(1，3-二巴比土酸)-trimethine oxanol)，CC-2-DMPE(PacificBlueTM1，2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，triethylammonium salt)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane-7，13-diylbis(5-Methoxy-6，12-benzofurandiyl)]bis-，tetrakis[(acetyloxy)methyl]ester；(Molecular probes)。
39.權利要求27的方法，其中所述ENaC是由從人腎cDNA克隆的ENaC亞基DNA編碼的人ENaC。
40.權利要求27的方法，其中所述ENaC是由從人肺cDNA克隆的ENaC亞基DNA編碼的人ENaC。
41.權利要求27的方法，其中所述ENaC是由從人味覺細胞cDNA克隆的ENaC亞基DNA編碼的人ENaC。
42.權利要求27的方法，其中所述ENaC選自天然發生的人ENaC亞基、可變拼接的人ENaC亞基、其功能性變體和組合物，其中所述細胞表達α、β和γ亞基。
43.權利要求27的方法，其中所述ENaC包含天然發生的人ENaC的α(或Δ)、β和γ亞基，或其可變拼接形式或其組合。
44.權利要求27的方法，其中所述受試細胞選自MDCK、HEK293、HEK293T、COS、BHK、NIH3T3、Swiss3T3和CHO細胞。
45.權利要求27的方法，其中將所述受試細胞培養至80％匯合。
46.用於鑑定鹽味調節性化合物的方法，其包括提供用功能性人ENaC、其拼接變體、嵌合體或片段轉染或轉化的受試細胞；將所述受試細胞接種在多孔板的孔中並溫育足以達到至少大約70％匯合的時間；在多孔板的孔中用膜電位染料使所述接種的受試細胞荷載染料；將所述受試細胞與至少一種以至少部分地抑制ENaC功能的濃度的已知的ENaC抑制劑化合物接觸；進一步在多孔板的孔中將所述荷載染料的受試細胞與至少一種假定的調節性化合物和鈉接觸；使用螢光板讀出計或電壓強度板讀出計監控任何由於調節劑/ENaC相互作用引起的膜電位染料的螢光變化；和基於監控到的螢光變化，鑑定至少一個假定的調節劑為鹽味調節性化合物。
47.權利要求46的方法，其中所述已知的ENaC抑制劑是氨氯吡嗪脒衍生物。
48.權利要求47的方法，其中所述化合物選自Phenamil、benzamil，乙基異丙基氨氯吡嗪脒；2′，4′-dimethylbenzamil(DMB)，5-(N-4-Chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil(CBDMB)；3′，4′-dichlorobenzamil；5-(N-甲基-N-胍基羰基)甲基氨氯吡嗪脒、5-(N，N-環己烷)氨氯吡嗪脒；5-(N-乙基-N-異丙基)氨氯吡嗪脒(EIPA)；5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil；2′，4′-dimethyl 2′，3′-benzamil 2′，3′-benzobenzamil；和5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethyl benzamil.
49.權利要求48的方法，其中所述抑制劑是Phenamil。
50.權利要求46的方法，其進一步包括評估經鑑定的ENaC調節性化合物對鹽味感覺的影響。
51.權利要求46的方法，其中所述受試細胞選自MDCK、HEK293、HEK2933T、COS、BHK、NIH3T3、Swiss3T3和CHO。
52.權利要求51的方法，其中所述受試細胞是HEK293細胞。
53.權利要求52的方法，其中所述受試細胞是HEK2933T細胞。
54.權利要求46的方法，其中所述細胞是HEK293細胞。
55.權利要求54的方法，其中所述HEK293細胞是HEK293T細胞。
56.權利要求46的方法，其中所述方法基於可檢測的螢光的變化用於鑑定作為特定地調節味道的化合物的化合物。
57.權利要求56的方法，其中所述味道是鹽味。
58.權利要求46的測定方法，其中將所述受試細胞接種在多孔板的孔中並培養至大約80％的匯合。
59.權利要求58的方法，其中通過向所述多孔測定板的孔中加入所述假定的調節劑將所述受試細胞與假定的調節劑接觸。
60.權利要求59的方法，其中用允許螢光變化可被檢測的膜電位染料荷載所述受試細胞。
61.權利要求60的方法，其中所述受試細胞表達各α、β和γENaC亞基。
62.權利要求61的方法，其中所述亞基分別由SEQ ID NO1、2和3、或其片段、或與其雜交和編碼功能性hENaC亞基的DNA序列編碼。
63.權利要求62的方法，其中所述亞基由SEQ ID NO1、2和3編碼。
64.權利要求46的方法，其中所述受試細胞表達hENaCβ、γ和δ亞基或其片段或變體。
65.權利要求18的方法，其中所述β、γ和δ亞基分別由SEQ IDNO2、3和7編碼。
66.權利要求46的測定方法，其中所述ENaC亞基都包含從人腎cDNA中克隆的人ENaC亞基。
67.權利要求46的測定方法，其中所述ENaC亞基都包含從人肺cDNA中克隆的人ENaC亞基。
68.權利要求46的測定方法，其中所述ENaC是由克隆自人味覺細胞cDNA的人ENaC DNA序列編碼的人ENaC。
69.權利要求46的測定方法，其中所述ENaC由α(或δ)、β和γ亞基組成並且選自天然發生的人ENaC、可變拼接的人ENaC、其功能性變體或其亞基組合物。
70.權利要求46的測定方法，其中使用螢光板讀出計監控螢光的變化。
71.權利要求46的測定方法，其中使用電壓成像板讀出計監控螢光的變化。
72.權利要求46的測定方法，其中所述膜電位染料選自Molecular Devices Membrane Potential Kit(cat#R8034)、Di-4-ANEPPS(吡啶鎓4-(2-(6-二丁基氨基)-2-萘基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-，氫氧化物，內鹽)，DiSBACC4(2)(二-(1，2-二巴比土酸)-trimethineoxanol)，DiSBAC4(3)(二-(1，3-二巴比土酸)-trimethine oxanol)，CC-2-DMPE(Pacific BlueTM1，2-dietradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolmine，triethylammonium salt)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane-7，13-diylbis(5-Methoxy-6，12-benzofurandiyl)]bis-，tetrakis[(acetyloxy)methyl]ester；(Molecular probes)。
73.用於鑑定調節hENaC的化合物的方法，其包括(i)將表達功能性ENaC的重組哺乳動物細胞與已知抑制ENaC功能的化合物接觸和進一步將該細胞與假定地調節上皮鈉通道的候選化合物接觸；和(ii)確定所述候選化合物是否調節或結合所述hENaC和/或影響所述hENaC的活性。
74.權利要求73的方法，其中所述哺乳動物細胞選自MDCK、BHK、HEK293、HEK293T、COS、NIH3T3、Swiss3T3和CHO。
75.權利要求74的方法，其中所述哺乳動物細胞是HEK293細胞。
76.權利要求75的方法，其中所述細胞瞬時或穩定地表達α(或Δ)、β和γENaC亞基。
77.權利要求73的方法，其中所述哺乳動物細胞包含於多孔測定板設備中。
78.權利要求77的方法，其中用膜電位染料荷載所述哺乳動物細胞，將其與假定的ENaC調節劑和鈉接觸，使用電壓強度板讀出計或螢光板讀出計監控螢光變化。
79.權利要求78的方法，其中將所述哺乳動物細胞培養至大約80％匯合。
80.權利要求79的方法，其中所述膜電位染料是CC2-DMPVE或DiSBAC2(3)和ESS-CY4。
81.權利要求80的方法，其中所述染料包含於荷載緩衝液中。
82.權利要求81的方法，其中在用染料荷載細胞後，測定細胞密度的變化。
83.權利要求80的方法，其中已知的ENaC抑制劑是氨氯吡嗪脒衍生物。
84.權利要求83的方法，其中所述化合物選自Phenamil、benzamil，乙基異丙基氨氯吡嗪脒；2′，4′-dimethylbenzamil(DMB)，5-(N-4-Chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil(CBDMB)；3′，4′-dichlorobenzamil；5-(N-甲基-N-胍基羰基)甲基氨氯吡嗪脒、5-(N，N-環己烷)氨氯吡嗪脒；5-(N-乙基-N-異丙基)氨氯吡嗪脒(EIPA)；5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethylbenzamil；2′，4′-dimethyl 2′，3′-benzamil 2′，3′-benzobenzamil；和5-(N-4-chlorobenzyl)-2′，4′-dimethyl benzamil.
85.權利要求84的方法，其中所述化合物是Phenamil。
86.表達功能性人ENaC鈉通道的卵母細胞，所述人ENaC鈉通道包含α、β和γ亞基或包含δ、β和γ亞基，所述α、β和γ亞基由包含於SEQ ID NOS.1、2和3中的核酸序列或在嚴緊雜交條件下與其雜交的核酸序列編碼，所述δ、β和γ亞基由包含於SEQ ID NOS.7、2和3中的核酸序列編碼。
87.權利要求1的卵母細胞，其是哺乳動物、兩棲動物、鳥類或爬行類動物的卵母細胞。
88.權利要求1的卵母細胞，其是蛙的卵母細胞。
89.權利要求88的卵母細胞，其表達包含於SEQ ID NOS.1、2和3中的核酸序列。
90.權利要求88的卵母細胞，其表達包含於SEQ ID NOS.7、2和3中的核酸序列。
91.用於鑑定人ENaC的調節劑的方法，其利用表達功能性人ENaC鈉通道的卵母細胞與假定的人ENaC調節性化合物接觸，測定所述化合物對通過ENaC通道的鈉運輸的影響並基於其增加或抑制對鹽運輸的作用鑑定所述化合物是否是ENaC調節劑。
92.權利要求91的方法，其是電生理測定法。
93.權利要求92的方法，其中所述測定法是兩電極電壓鉗技術。
94.權利要求91的方法，其中所述卵母細胞是哺乳動物、鳥類或爬行類動物的卵母細胞。
95.權利要求94的方法，其中所述卵母細胞是兩棲動物的卵母細胞。
96.權利要求95的方法，其中所述卵母細胞是蛙卵母細胞。
97.權利要求96的方法，其中所述測定法是電生理測定法。
98.權利要求97的方法，其中所述測定法是兩電極電壓鉗技術。
99.權利要求98的方法，其用於鑑定人ENaC增強劑。
100.權利要求98的方法，其用於鑑定人ENaC抑制劑。
101.權利要求96的方法，其中所述蛙卵母細胞表達含於SEQ IDNOS.1、2和3中的核酸序列或包含於SEQ ID NOS.7、2和3中的核酸序列。
102.權利要求97的方法，其中在與假定的人ENaC增強劑接觸之前將所述卵母細胞與人ENaC的抑制劑接觸。
103.權利要求102的方法，其中所述已知的抑制劑是氨氯吡嗪脒或Phenamil。
104.權利要求99的方法，其中在至少一個另外的測定中測定所述假定的人ENaC增強劑特異性增強人ENaC的能力，所述測定選自電流/電壓(I/V)曲線分析、氨氯吡嗪脒競爭分析和劑量反應分析。
105.權利要求99的方法，其進一步包含使用沒有顯微注射人ENaC cRNAs的卵母細胞的陰性對照。
106.權利要求103的方法，其中對表達人ENaC的蛙卵母細胞同時使用假定的人ENaC增強劑和氨氯吡嗪脒。
107.權利要求99的方法，其中以從大約1nM至大約1mM範圍內的濃度使用所述假定的調節劑。
108.權利要求99的方法，其中所述人ENaC增強劑表現至少20％的增強因子。
109.權利要求108的方法，其中所述人ENaC增強劑表現至少50％的增強因子。
110.權利要求108的方法，其中所述人ENaC增強劑表現至少100％的增強因子。
全文摘要
在一個方面，本發明涉及基於哺乳動物細胞的高通量測定法，所述測定法用於表徵和篩選從人腎cDNA文庫中克隆的人上皮鈉通道(hENaC)，所述hENaC也在其它組織包括人味覺組織中表達。本發明進一步涉及基於兩棲動物卵母細胞的中通量ENaC電生理測定法，所述測定法用於鑑定人ENaC調節劑，優選的是ENaC增強劑。在基於細胞的測定法中調節ENaC功能的化合物預期影響人的鹽味覺。此處描述的測定法具有優於現存的細胞表達系統的有利方面。在哺乳動物細胞的情況下，這些測定法可在標準的96或384孔培養板上以高通量的模式進行，通過使用抑制ENaC功能的化合物(優選氨氯吡嗪脒染生物，如Phenamil)獲得提高的測定結果。在獨特的卵母細胞電生理測定法(兩電極電壓鉗技術)的情況下，這些測定法促進對特異性調節人ENaC的化合物的鑑定。本發明的測定法提供了強有力的用於檢測促進(增強)或抑制hENaC功能的化合物。因此，增強或阻斷人ENaC通道活性的化合物應當調節人的鹽味覺。
文檔編號G01N33/53GK1842709SQ200480024254
公開日2006年10月4日 申請日期2004年7月9日 優先權日2003年7月10日
發明者G·瑟文特, H·常, C·雷德克勞, S·雷, I·克拉克 申請人:塞諾米克斯公司