一株唾液乳桿菌及其用途的製作方法

2023-04-23 03:39:56

本發明涉及微生物領域，具體涉及一株唾液乳桿菌及其用途。
背景技術：
：乳酸桿菌是公認的益生菌，其具有廣譜的抗菌性，對常見的有害菌具有一定的抑制效果。唾液乳桿菌是乳酸桿菌家族的一員，常存在於人體的消化道(如口腔)中。齲病是危害人類口腔健康的常見病，其繼發感染可以形成牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和頜骨炎症。目前，對於齲齒的治療最常見的是填充術，然而這種治療方式只能作為一種修復手段，並不能完全的還原牙齒本身的狀態，所以齲病治療的關鍵在於提早預防。齲病是一種細菌性疾病，主要的致齲菌是變異鏈球菌。因此，抑制變異鏈球菌在口腔中的繁殖或降低變異鏈球菌在口腔菌群中的百分比，可以有效的預防齲病。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何預防齲病。為解決上述技術問題，本發明首先提供了一株可以預防齲病的唾液乳桿菌。本發明所提供的唾液乳桿菌是唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJ，該菌株已於2016年08月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.12857。唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857簡稱唾液乳桿菌LJ。為解決上述技術問題，本發明還提供了菌劑。本發明所提供的菌劑，其活性成分為唾液乳桿菌LJ。所述菌劑的用途可為a1)或a2)或b1)或b2)或c1)或c2)或d1)或d2)：a1)製備預防齲病的產品；a2)預防齲病；b1)製備抑制鏈球菌的產品；b2)抑制鏈球菌；c1)製備減少口腔中有害菌的產品；c2)減少口腔中有害菌；d1)製備增加口腔中有益菌的產品；d2)增加口腔中有益菌。本發明所提供的菌劑，具體可為菌劑甲或菌劑乙。所述菌劑甲的製備方法可包括如下步驟：將唾液乳桿菌LJ接種至乳酸菌培養基並進行培養，獲得菌液，即為所述菌劑甲。所述菌液的OD600nm值具體可為0.5。所述乳酸菌培養基可為MRS液體培養基。所述MRS液體培養基的製備方法具體可如下：將蛋白腖10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、檸檬酸氫二銨2.00g、乙酸鈉5.00g、葡萄糖20.00g、吐溫-801mL、磷酸氫二鉀2.00g、硫酸鎂0.58g和硫酸錳0.28g溶於1L蒸餾水，調節pH值至6.4；然後121℃滅菌15min。所述菌劑甲的製備方法中，所述培養具體可為置於二氧化碳培養箱培養。所述培養的具體條件可為：37℃靜置培養24h。除了活性成分，所述菌劑甲還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、矽石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和澱粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑甲中，所述活性成分可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可溼性粉劑或水分散粒劑。根據需要，所述菌劑甲中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩定劑(如抗氧化劑)、pH調節劑等。所述菌劑乙的製備方法可包括如下步驟：(1)將唾液乳桿菌LJ接種至乳酸菌培養基並進行培養，獲得菌液；(2)將所述菌液接種至乳酸菌培養基並進行培養，獲得發酵液；(3)將所述發酵液離心，收集菌體；(4)取所述菌體，用保護劑重懸，凍幹，得到凍幹活性菌粉；(5)取所述凍幹活性菌粉，加入配方成分(常規藥片生產時添加的，如澱粉、可可粉、調味劑等)，即為所述菌劑乙。所述步驟(1)中，所述菌液的OD600nm值具體可為0.5。所述步驟(1)和所述步驟(2)中，所述乳酸菌培養基可為MRS液體培養基。所述MRS液體培養基的製備方法具體可如下：將蛋白腖10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、檸檬酸氫二銨2.00g、乙酸鈉5.00g、葡萄糖20.00g、吐溫-801mL、磷酸氫二鉀2.00g、硫酸鎂0.58g和硫酸錳0.28g溶於1L蒸餾水，調節pH值至6.4；然後121℃滅菌15min。所述步驟(1)和所述步驟(2)中，所述培養具體可為置於二氧化碳培養箱培養。所述培養的具體條件可為：37℃靜置培養24h。所述步驟(2)中，所述菌液和所述乳酸菌培養基的體積比具體可為1:500。所述步驟(3)中，還可包括如下步驟(A)：將所述菌體用緩衝液重懸，然後離心。所述步驟(3)和步驟(A)中，所述離心具體可為4000rpm離心20min。所述步驟(A)中，所述緩衝液具體可為pH7.0、20mM的PB緩衝液。所述步驟(4)中，所述菌體和所述保護劑的配比具體可為25g：150mL；所述保護劑具體可為含10％(質量百分比)脫脂奶粉的pH7.0、20mM的PB緩衝液。所述菌劑乙中，所述凍幹活性菌粉和所述配方成分的質量比具體可為1:9。所述唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857或上述任一所述菌劑在a1)或a2)中的應用也屬於本發明的保護範圍：a1)製備預防齲病的產品；a2)預防齲病。所述唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857或上述任一所述菌劑在b1)或b2)中的應用也屬於本發明的保護範圍：b1)製備抑制鏈球菌的產品；b2)抑制鏈球菌。所述唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857或上述任一所述菌劑在c1)或c2)中的應用也屬於本發明的保護範圍：c1)製備減少口腔中有害菌的產品；c2)減少口腔中有害菌。所述唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857或上述任一所述菌劑在d1)或d2)中的應用也屬於本發明的保護範圍：d1)製備增加口腔中有益菌的產品；d2)增加口腔中有益菌。上述應用中，所述有害菌具體可為鏈球菌和/或普雷沃菌和/或兼性雙球菌和/或放線菌和/或纖毛菌。上述應用中，所述鏈球菌具體可為變異鏈球菌。所述變異鏈球菌具體可為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)CGMCCNo.1.2500。上述應用中，所述有益菌具體可為唾液乳桿菌。為解決上述技術問題，本發明還提供了一種產品。本發明所提供的產品，其含有所述唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857；所述產品的功能為a2)或b2)或c2)或d2)：a2)預防齲病；b2)抑制鏈球菌；c2)減少口腔中有害菌；d2)增加口腔中有益菌。上述產品中，所述有害菌具體可為鏈球菌和/或普雷沃菌和/或兼性雙球菌和/或放線菌和/或纖毛菌。上述產品中，所述鏈球菌具體可為變異鏈球菌。所述變異鏈球菌具體可為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)CGMCCNo.1.2500。上述產品中，所述有益菌具體可為唾液乳桿菌。實驗證明，本發明提供的唾液乳桿菌LJ在預防齲病和/或抑制鏈球菌和/或減少口腔中有害菌和/或增加口腔中有益菌中起至關重要的作用，具有重要的應用價值。附圖說明圖1為實施例2的實驗結果。保藏說明菌種名稱：唾液乳桿菌拉丁名：Lactobacillussalivarius菌株編號：LJ保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期：2016年08月16日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12857具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。MRS液體培養基：將蛋白腖10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、檸檬酸氫二銨2.00g、乙酸鈉5.00g、葡萄糖20.00g、吐溫-801mL、磷酸氫二鉀2.00g、硫酸鎂0.58g和硫酸錳0.28g溶於1L蒸餾水，調節pH值至6.4；然後121℃滅菌15min。MRS固體培養基：將蛋白腖10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、檸檬酸氫二銨2.00g、乙酸鈉5.00g、葡萄糖20.00g、吐溫-801mL、磷酸氫二鉀2.00g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.28g和瓊脂15.00g溶於1L蒸餾水，調節pH值至6.4；然後121℃滅菌15min。MRS固體平板：將20mL溫度為55℃左右的MRS固體培養基倒入培養皿，冷卻後即為MRS固體平板。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)CGMCCNo.1.2500保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編：100101)，公眾可從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得該菌株。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)CGMCCNo.1.2500在下文中簡稱變異鏈球菌。BHI液體培養基：將37gBrainHeartinfusion溶解於1L無菌水中，調節pH值至7.4，然後121℃高壓滅菌15min；其中，BrainHeartinfusion為美國BD公司的產品。BHI固體培養基：將37gBrainHeartinfusion和15g瓊脂溶解於1L無菌水中，調節pH值至7.4，然後121℃高壓滅菌15min；其中，BrainHeartinfusion為美國BD公司的產品。保護劑為含10％(質量百分比)脫脂奶粉的pH7.0、20mM的PB緩衝液。API50CH生化板條為梅裡埃公司的產品。GentraPuregeneBuccalCellKit為QIAGEN公司的產品。下述實施例中的二氧化碳培養箱均設置二氧化碳的水平為5％。實施例1、唾液乳桿菌的分離和鑑定一、分離取三名學齡前兒童(均為對試驗內容知情同意的志願者)的唾液，分別均勻塗布於MRS固體平板，然後置於二氧化碳培養箱，37℃靜置培養。培養至第2d，產生單菌落。挑取單菌落，反覆純化三次以上。將其中分離到的三株細菌分別命名為細菌LJ、細菌甲和細菌乙。二、鑑定1、形態學鑑定將步驟一分離的細菌(細菌LJ、細菌甲或細菌乙)接種於MRS固體平板上，然後置於二氧化碳培養箱，37℃培養，2d後觀察單菌落的形態。細菌LJ、細菌甲和細菌乙分別經革蘭氏染色後，通過光學顯微鏡觀察，均鑑定為革蘭氏陽性菌，短杆形，單獨存在。細菌LJ、細菌甲和細菌乙的形態學鑑定的結果均如下：菌落圓形，表面凸起，分布較為分散，邊緣整齊，呈乳白色，表面光滑水潤，菌落與MRS固體平板連接較為鬆散，菌落直徑為1-2mm。2、16SrDNA序列同源性分析對步驟一分離的細菌(細菌LJ、細菌甲或細菌乙)的16SrDNA序列進行同源性分析。結果表明，細菌LJ、細菌甲和細菌乙均與唾液乳桿菌的同源性最高。細菌LJ與唾液乳桿菌的同源性達到99％。細菌LJ的16SrDNA如序列表中的序列1所示。3、API生化板條檢測取API50CH生化板條，然後按照API50CH生化板條的說明書步驟對步驟一分離的細菌(細菌LJ、細菌甲或細菌乙)進行檢測。檢測結果表明，細菌LJ、細菌甲和細菌乙均為唾液乳桿菌。綜合上述各個鑑定結果，步驟一分離的細菌LJ、細菌甲和細菌乙均為唾液乳桿菌。將細菌LJ命名為唾液乳桿菌LJ。將細菌甲命名為唾液乳桿菌甲。將細菌乙命名為唾液乳桿菌乙。實施例2、唾液乳桿菌對變異鏈球菌的抑制效果實驗重複三次，取平均值。每次實驗的具體步驟如下：1、將唾液乳桿菌LJ的單菌落接種於裝有10mLMRS液體培養基的試管中，然後置於二氧化碳培養箱。37℃靜置培養24h後，得到唾液乳桿菌LJ的菌液(OD600nm值約為0.5)。按照上述方法，將唾液乳桿菌LJ的單菌落替換為唾液乳桿菌甲的單菌落，其它步驟均不變，得到唾液乳桿菌甲的菌液(OD600nm值約為0.5)。按照上述方法，將唾液乳桿菌LJ的單菌落替換為唾液乳桿菌乙的單菌落，其它步驟均不變，得到唾液乳桿菌乙的菌液(OD600nm值約為0.5)。2、取變異鏈球菌的單菌落，接種於BHI液體培養基，置於二氧化碳培養箱，37℃靜置培養24h，得到變異鏈球菌的菌液(OD600nm值約為0.5)。3、取20mLBHI固體培養基(溫度約40-45℃，即BHI固體培養基為融化狀態)，加入10μL步驟2製備的變異鏈球菌的菌液，混合均勻，獲得混合液。4、取4個牛津杯置於培養皿，各牛津杯心之間相距25mm以上，與培養皿的周緣相距15mm以上，且各距離均勻；然後向牛津杯外的平皿中倒入步驟3製備的混合液，冷卻，待培養基凝固。5、完成步驟4後，移除4個牛津杯，形成4個杯孔。向第1個杯孔中加入200μL唾液乳桿菌LJ的菌液，向第2個杯孔中加入200μL唾液乳桿菌甲的菌液，向第3個杯孔中加入200μL唾液乳桿菌乙的菌液，向第4個杯孔中加入200μL無菌水(作為陰性對照)。6、完成步驟5後，將所述培養皿置於二氧化碳培養箱，37℃靜置培養24h，然後用遊標卡尺測量抑菌環的直徑。實驗結果判斷：(1)抑菌環直徑大於8mm者，判斷為有抑菌效果；抑菌環直徑為8mm以下者，判斷為無抑菌效果。(2)三次重複試驗均有抑菌作用結果者，判斷為有抑菌效果。(3)陰性對照應無抑菌環產生，否則實驗無效。實驗結果見圖1(A為唾液乳桿菌LJ的菌液，B為唾液乳桿菌甲的菌液，C為唾液乳桿菌乙的菌液，D為無菌水)和表2。結果表明，唾液乳桿菌LJ、唾液乳桿菌甲和唾液乳桿菌乙對變異鏈球菌均有一定的抑制效果，且唾液乳桿菌LJ對變異鏈球菌的抑制效果最好。因此，唾液乳桿菌LJ可預防齲病。表2註：「/」表示不存在。實施例3、唾液乳桿菌LJ對口腔菌群中各個菌屬的試驗效果本實施例中的試驗均是在志願者的知情同意的前提下進行的，且均籤署知情同意書。口腔中存在多種有害菌，部分有害菌的名稱和與疾病的關係見表3。表3有害菌名稱與疾病的關係變異鏈球菌引起齲齒普雷沃菌與齲齒、牙周病，牙髓炎的發生發展有關兼性雙球菌引起感染性心內膜炎放線菌與齲齒、牙周病的發生發展有關纖毛菌引起牙根部肉芽腫和纖毛菌性膿毒症一、片劑的製備1、片劑甲的製備(1)將唾液乳桿菌LJ的單菌落接種於裝有10mLMRS液體培養基的試管中，然後置於二氧化碳培養箱。37℃靜置培養24h後，得到唾液乳桿菌LJ的菌液(OD600nm值約為0.5)。(2)完成步驟(1)後，將10mL唾液乳桿菌LJ的菌液接種於5LMRS液體培養基，然後置於二氧化碳培養箱。37℃靜置培養24h後，得到唾液乳桿菌LJ的發酵液。(3)完成步驟(2)後，取唾液乳桿菌LJ的發酵液，4000rpm離心20min，收集菌體1；將所述菌體1用pH7.0、20mM的PB緩衝液重懸，然後4000rpm離心20min，收集菌體2。(4)完成步驟(3)後，取25g所述菌體2，用150mL保護劑重懸，然後凍幹，得到凍幹活性菌粉。由北京鑫福瑞康生物醫藥有限公司將所述凍幹活性菌粉進行壓片，得到片劑甲；壓片過程中，需加入配方成分(常規藥片生產時添加的，如澱粉、可可粉、調味劑等)。每片片劑甲由50mg凍幹活性菌粉(約含107cfu唾液乳桿菌LJ)和450mg配方成分組成。2、片劑乙的製備取片劑甲的配方成分，由北京鑫福瑞康生物醫藥有限公司進行壓片，得到片劑乙。每片片劑乙由500mg片劑甲的配方成分組成。二、唾液乳桿菌LJ對口腔菌群中各個菌屬的試驗效果現有技術不能對口腔菌群中的各個菌屬進行定量分析，因此通常通過各個菌屬在口腔菌群中的百分比含量來判斷是否發生了改變。口腔菌群中某菌屬的百分比含量(％)＝某菌屬的OTU值/口腔菌群總OTU值×100％。1、取50名志願者服用片劑前的唾液樣本，然後用GentraPuregeneBuccalCellKit分別提取總核酸，得到各個志願者服用片劑前的唾液樣本的總核酸，並放置於-20℃保存。2、完成步驟1後，將50名志願者隨機分成試驗組和對照組(每組25名)，然後進行如下試驗：試驗組：每個志願者每天服用步驟1製備的片劑甲，一天2次(分別為早和晚)，一次1片，連續服用30天；對照組：每個志願者每天服用步驟1製備的片劑乙，一天2次(分別為早和晚)，一次1片，連續服用30天。3、完成步驟2後，取50名志願者服用片劑30天後的唾液樣本，然後用GentraPuregeneBuccalCellKit分別提取總核酸，得到各個志願者服用片劑30天後的唾液樣本的總核酸，並放置於-20℃保存。4、完成步驟3後，由上海博豪生物技術有限公司分別對各個志願者服用片劑前的唾液樣本的總核酸和各個志願者服用片劑30天後的唾液樣本的總核酸進行二代高通量測序和數據分析，從而得到各個志願者口腔菌群總OTU值、各個菌屬的OTU值、試驗組口腔菌群中各個菌屬的平均百分比含量(％)和對照組口腔菌群中各個菌屬的平均百分比含量(％)。結果表明，服用片劑前和服用片劑30天後，試驗組口腔菌群中唾液乳桿菌、鏈球菌、普雷沃菌、兼性雙球菌、放線菌和纖毛菌的變化有統計學意義，具體結果見表5：與服用片劑前相比，服用片劑30天後，試驗組口腔菌群中唾液乳桿菌的平均百分比含量顯著增加、試驗組口腔菌群中鏈球菌的平均百分比含量顯著減少、試驗組口腔菌群中普雷沃菌的平均百分比含量顯著減少、試驗組口腔菌群中兼性雙球菌的平均百分比含量顯著減少、試驗組口腔菌群中放線菌的平均百分比含量顯著減少和試驗組口腔菌群中纖毛菌的平均百分比含量顯著減少；與服用片劑前相比，服用片劑30天後，對照組口腔菌群中唾液乳桿菌、鏈球菌、普雷沃菌、兼性雙球菌、放線菌和纖毛菌的平均百分比含量無顯著差異。因此，唾液乳桿菌LJ可增加口腔菌群中有益菌(如唾液乳桿菌)的百分比含量，降低口腔菌群中有害菌(如鏈球菌和/或普雷沃菌和/或兼性雙球菌和/或放線菌和/或纖毛菌)的百分比含量。表5乳酸菌LJ已於2016年08月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.12857。乳酸菌LJ的全稱為唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)LJCGMCCNo.12857。中國人民解放軍疾病預防控制所一株唾液乳桿菌及其用途1PatentInversion3.511147DNA唾液乳桿菌（Lactobacillussalivarius）1caaactatctgtcaccttagacggctggctccttgcggttaccccaccggctttgggtgt60tacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcga120catgctgattcgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaat180ccgaactgagaacggctttaagagattagctaaacctcgcggtcttgcgactcgttgtac240cgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgacttgacgtcgtcc300ccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcgccagagtgcccaacttaatgctggcaa360ctgacaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctga420cgacagccatgcaccacctgtcactttgtccccgaagggaaagcctaatctcttaggtgg480tcaaaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctc540caccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactcccc600aggcggaatgcttattgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctag660cattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccacgcttt720cgaacctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccactggtgttcttccatat780atctacgcatttcaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcactcaagtcttc840cagtttccaatgcactactccggttaagccgaaaggctttcacatcagacttaaaagacc900gcctgcgttccctttacgcccaataaatccgggacaacgcttgccacctacgtattaccg960cggctgctggcacgtagttagccgtgacttgctggttagataccgtcatcgaatgaacag1020ttactctcactcgtgttcttcctctaacaacagagttttacgatccgaagacttcttcac1080ctcacgcgcgtgctcaatcagactgcgtcatgtgagatcctactgctgccctccgtagag1140ttggccc1147當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp