家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物的製作方法
2023-06-04 19:06:41 3
專利名稱：家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物。
背景技術：
家蠅(Musca domestica)是許多疾病的潛在媒介，是65種以上人或動物胃腸疾病的機械傳媒，如痢疾，胃腸炎，傷寒，肺結核等。滅蠅雖然強調以環境治理為主，但噴灑化學殺蟲劑仍然是常用的方法，特別在垃圾集散地，如生活小區或菜市場的垃圾箱、垃圾清潔站，各區垃圾中轉站及大中型垃圾填埋場等地方，用空間或滯留噴灑復配及混配的擬除蟲菊酯類殺蟲劑來控制蠅類密度。由於廣泛使用相對單一的化學藥物防制，用藥頻繁，而家蠅生活世代又較短，因此，近年來家蠅抗藥性問題日漸突出，引起廣泛關注。研究表明家蠅對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯等均產生了不同程度抗性。昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown resistance, kdr)，kdr基因在家蠅對擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標主要是昆蟲電壓依賴性神經細胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點對殺蟲劑降低了敏感性而產生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同於代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性及高抗性家蠅的部分及全部鈉通道序列，發現para型鈉通道Vsscl基因的L1014F (亮氨酸到苯丙氨酸)即CTT — TTT的突變及M918T(甲硫氨酸到絲氨酸)即ATG —ACG和擊倒抗性相關。我國也多次報導在多省市的野外家蠅擬除蟲菊酯抗性個體中發現L1014F的突變。kdr基因可以作為昆蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態。Huang等(2004)用特異性等位基因PCR方法，對採自丹麥農場的14個家蠅野外種群進行kdr基因頻率的檢測，在所有種群中均檢測到kdr純合子及雜合子，且kdr頻率與一定劑量的除蟲菊素或生物苄呋菊酯(均加ΡΒ0)作用下的存活個體比率呈正相關。曹曉梅等(2005)用特異性等位基因PCR 法檢測了北京、天津、張家口共17個野外種群家蠅個體kdr等位基因型，顯示家蠅野外種群的kdr基因頻率在8% 56%之間，並且發現LD5tl為代表的溴氰菊酯抗性與家蠅kdr等位基因頻率之間存在正相關關係。研究說明Kdr基因可以作為家蠅對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態，可以預測抗性的發生和發展。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的引物。本發明提供的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為
4序列表中序列2和序列表中序列4。所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。所述引物組A和所述引物組B為獨立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質量比為1 2 1;所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質量比為1 2 1;所述突變位點為L1014F。本發明的第二個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的PCR試劑。本發明提供的試劑，由試劑A和試劑B組成；所述試劑A由所述引物組A和PCR緩衝液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩衝液組成；所述各引物組中各引物在對應的所述PCR試劑中的濃度均為0. 4uM。所述突變位點為L1014F。PCR緩衝液為試劑T，購自寶生物工程有限公司，產品號DR011。本發明的第三個目的是提供一種製備檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)分別將所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A和獨立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A和步驟1)得到的獨立包裝引物組B進行包裝，得到的試劑。所述突變位點為L1014F。由所述方法製備得到的試劑也是本發明保護的範圍。本發明的第四個目的是提供一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑盒。本發明提供的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒；所述試劑盒B為含有所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有所述的試劑的試劑盒。所述突變位點為L1014F。所述引物或所述試劑或所述試劑盒在檢測家蠅中kdr基因突變位點、檢測家蠅抗藥性或製備檢測家蠅抗藥性產品中的應用也是本發明保護的範圍；所述突變位點為 L1014F，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本發明的第五個目的是提供一種檢測待測家蠅中kdr基因突變位點方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測家蠅進行PCR擴增，得到PCR擴增產物； 檢測各組引物擴增得到的產物，
若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，則所述待測家蠅的kdr基因的突變位點為L1014F ；所述257bp產物1的核苷酸序列為序列表中的序列6所述257bp產物2的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發明的第六個目的是提供一種檢測待測家蠅中kdr基因型的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測家蠅進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A未擴增得到大小為 257bp產物1，則所述kdr基因為含有突變位點L1014F的純合型基因；若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A擴增得到大小為 257bp產物1，則所述kdr基因為含有突變位點L1014F的雜合型基因；若所述引物對B未擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A擴增得到大小為 257bp產物1，則所述待測家蠅的kdr基因為不含突變位點L1014F的純合型基因；所述257bp產物1的核苷酸序列為序列表中的序列6所述257bp產物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述PCR擴增中，以待測家蠅的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴增的退火溫度具體為65°C ；所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。以上PCR擴增中，所述引物組A或B中的引物1和引物2進行PCR擴增，得到擴增大小為381bp產物；所述381bp產物的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；該產物可以用來檢測PCR反應體系是否正確，如果有381bp產物，說明該體系正確。目前我國還沒有成型的針對家蠅的kdr抗性分子檢測方法和試劑盒。本發明旨在研製開發一種快捷、簡便、靈敏的抗性基因檢測試劑盒和檢測方法，能夠對家蠅kdr抗性基因型進行快速偵別。技術原理在家蠅Kdr基因突變的基礎上，以突變位點的鹼基為3'末端，設計兩條特異性內引物(突變型和非突變型)，分別只能與突變的靶DNA及非突變的靶DNA結合。 同時，在突變鹼基上下遊處設計兩條非特異性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特點，在以突變型引物擴增正常DNA模板時，延伸反應會因磷酸酯鍵難於形成而不能進行，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變。反之，表明有突變產生。 將突變型和非突變型引物分別用於同一 DNA模板的擴增，判斷有無特定位點基因的特定突變。本發明的實驗證明，本發明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的家蠅抗藥性檢測試劑盒，用來掌握家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性狀況。本發明的抗藥性檢測試劑盒針對家蠅kdr與抗性相關的基因型，分別設計了 2組特異性引物，經過一定的配比合成，可以檢測家蠅的kdr基因型。採用本發明的抗藥性檢測試劑盒，只需提取單只家蠅的DNA，因此對待測家蠅的數量沒有特殊的要求，另外還無需家蠅的飼養場所和設施，也不需要投入長時間的人力物力來觀察。獨立1人2小時內即可完成50份樣本的檢驗，被檢樣本能夠準確、有效、直接地檢測出點突變，不僅能夠區分抗性個體和敏感個體，而且能夠鑑定個體基因型。 判斷kdr相關的基因型為研究家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性奠定基礎。
圖1為特異性等位基因PCR法方法檢測家蠅Kdr基因敏感純合子(SS)、抗性雜合子(RS)及抗性純合子(RR)個體
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、家蠅抗藥性檢測一、PCR 擴增1、引物的設計針對家蠅與除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥相關的kdr(未突變，GenBank序列號 AY309437)基因設計特異性引物，其⑶1和⑶2為對照擴增引物；⑶2和⑶3、⑶4和⑶3均為特異擴增引物；CDl 5 『-GAATTTCACCGACTTCATGCAC-3，(序列 1，下遊引物)CD2 5 『-AGCAATACGATTGAAGGCCTC-3，(序列 2，上遊引物)CD3 5 『-ACGGTCGTGATCGGCAATC-3，(序列 3，下遊引物)根據kdr的突變體kdr L1014F型突變基因(序列8)設計的特異性引物CDl 5 『-GAATTTCACCGACTTCATGCAC-3，(序列 1，下遊引物)CD2 5 『-AGCAATACGATTGAAGGCCTC-3，(序列 2，上遊引物)CD4 5 『-ACGGTCGTGATCGGCAATT-3，(序列 4，下遊引物)2、基因組DNA獲得分別提取野外捕獲的編號為BJ01-BJ100的100隻家蠅的基因組DNA，具體如下(1)分別取單只家蠅在 300 μ 1 DNA 裂解緩衝液(IOOmM Tris-HCl, pH8. 0 ；50mM NaCl ；50mMEDTA ；1% SDS ；0. 15mM精胺；0. 5mM亞精胺)中用玻棒勻漿，加入2. 5 μ 1蛋白酶 K溶液，56 °C水浴過夜。(2)加飽合酚300 μ 1，氯仿-異戊醇(24 1) 300 μ 1，將離心管上下顛倒數次，混勻後在超速離心機中10，000rpm/min，4°C離心lOmin。(3)抽提上層水相，移入新的離心管中，加入0. 2體積的IOM乙酸銨溶液和2倍體積的無水乙醇。-20°C冷凍2小時。(4)取出離心12，000r/min，4°C，5min，用真空泵將無水乙醇抽乾。(5)用75%冷乙醇洗滌沉澱，12，OOOr/min，4°C，lOmin，重複該步驟一次。(6)用真空泵將乙醇抽乾，將DNA留於管中晾乾。(7)加入50 μ 1雙蒸滅菌水，_20°C保存備用，得到編號為BJD01-BJDlOO的待測樣本的DNA。3、待測樣本的DNA的PCR擴增(擴增體系如表1)(1)分別取12. 5uL試劑T (寶生物工程有限公司，產品號DROl 1)加入到2個PCR
7管中，標記為A管和B管。(2)在A管中加入IuL試劑P1，在B管中加入IuL試劑P2。(3)取10. 5uL去離子水至A管和B管中(多個樣本檢測時，根據以上的配比，分A 管和B管將試劑混合後分裝，效果更好)。(4)分別取IuL DNA加入到A管和B管中。(5)將以上的A管和B管中所有成分混合均勻後，放入PCR儀中，按以下條件設置反應條件(為了使試劑混勻，稍微離心效果更好)。
1 2
如下
表1為PCR擴增體系
權利要求
1.一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4。
2.根據權利要求1所述的引物，其特徵在於所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。
3.根據權利要求1或2所述的引物，其特徵在於 所述引物組A和所述引物組B為獨立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質量比為1 2 1; 所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質量比為1 2 1; 所述突變位點為L1014F。
4.一種檢測家蠅中kdr基因突變位點的PCR試劑，由試劑A和試劑B組成； 所述試劑A由所述引物組A和PCR緩衝液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩衝液組成； 所述各引物組中各引物在對應的所述PCR試劑中的濃度均為0. 4uM ； 所述突變位點為L1014F。
5.一種製備檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑的方法，包括如下步驟1)分別將權利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A和獨立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A和步驟1)得到的獨立包裝引物組B進行包裝，得到試劑；所述突變位點為L1014F。
6.由權利要求5所述方法製備得到的試劑。
7.—種檢測家蠅中kdr基因突變位點的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有權利要求4所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒； 所述試劑盒B為含有權利要求4所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有權利要求6所述的試劑的試劑盒； 所述突變位點為L1014F。
8.權利要求1-3中任一所述引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒在檢測家蠅中kdr基因突變位點、檢測家蠅抗藥性或製備檢測家蠅抗藥性產品中的應用； 所述突變位點為L1014F，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、 Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一種檢測待測家蠅中kdr基因突變位點的方法，包括如下步驟用權利要求1-3中任一所述的引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測家蠅進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，則所述待測家蠅的kdr基因的突變位點為 L1014F ；所述257bp產物2的核苷酸序列為序列表中的序列7。
10. 一種檢測待測家蠅中kdr基因型的方法，包括如下步驟用權利要求1-3中任一所述的引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測家蠅進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A未擴增得到大小為 257bp產物1，則所述kdr基因為含有突變位點L1014F的純合型基因；若所述引物對B擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A擴增得到大小為257bp 產物1，則所述kdr基因為含有突變位點L1014F的雜合型基因；若所述引物對B未擴增得到大小為257bp產物2，且所述引物對A擴增得到大小為 257bp產物1，則所述待測家蠅的kdr基因為不含突變位點L1014F的純合型基因； 所述257bp產物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 所述257bp產物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述PCR擴增中，以待測家蠅的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴增的退火溫度具體為65°C ； 所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發明公開了一種家蠅抗藥性檢測試劑盒及其專用引物。本發明提供了檢測家蠅中kdr基因突變位點的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A由引物1、引物2和引物3組成，所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列1、序列表中序列2和序列表中序列3；所述引物組B由引物1、引物2和引物4組成，所述引物1、引物2和引物7的核苷酸序列分別為序列表中序列1、序列表中序列2和序列表中序列4。本發明的實驗證明，本發明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的家蠅抗藥性檢測試劑盒，用來掌握家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性狀況。
文檔編號C12Q1/68GK102242217SQ201110197109
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月14日 優先權日2011年7月14日
發明者劉美德, 張映梅, 李春曉, 汪中明, 董言德, 趙彤言, 邢丹, 郭曉霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所