含生物素生物合成基因的dna片段及其利用的製作方法

2023-06-06 16:04:36

專利名稱：含生物素生物合成基因的dna片段及其利用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含至少一個生物素生物合成中有關基因的DNA片段及其利用。
背景知識生物素是人類、動物、植物和一些微生物的必需維生素，並且被用作人及動物的食物添加劑。至於利用微生物生產生物素的方法，現已知利用鏈黴菌及其小單孢菌(JP-B-41-21756)的方法，利用擲孢酵母屬(JP-B-42-3074)的方法，利用桿菌、放線菌或假單孢菌(JP-A-56-160998)的方法，利用鞘氨醇單胞菌屬(JP-A-133790)的方法等。也有人提議通過基因工程技術將在生物素生物合成中涉及的從能夠合成生物素的微生物中分離的基因導入另一種微生物，以增加生物素生物合成中有關基因的表達的培養微生物的方法，由此，能催化生物素生物合成反應的酶的活性提高了，從而改進了生物素的產量(JP-A-61-202686，JP-A-2-27980，JP-A-7-231789，等)。
在微生物細胞內的生物素生物合成中涉及的基因，現已知的有來自大腸桿菌(大腸桿菌)的bioA，bioB，bioF，bioD，bioC，和bioH基因〔生物化學雜誌，Vol.263，19577-19585(1988)〕。bioA基因編碼具有7，8-二氨基壬酸氨酸轉移酶活性的酶。bioB基因編碼具有生物素合成酶活性的酶。bioF基因編碼具有7-酮-8-氨基壬酸合成酶活性的酶。bioD基因編碼具有脫硫生物素合成酶活性的酶。bioC基因參於生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊的生物合成階段。bioH基因的功能不清楚。在大腸桿菌的生物合成途徑中，細胞內的庚二醯輔酶A由7-酮-8-氨基壬酸合成酶催化生成7-酮-8-氨基壬酸，然後由7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶催化7-酮-8-氨基壬酸生成7，8-二氨基壬酸，脫硫生物素合成酶再催化二氨基壬酸生成脫硫生物素，最後脫硫生物素由生物素合成酶催化生成生成素，由此生物素得到合成。當bioC基因缺失時，生物素的產量下降，因此，人們認為bioC基因編碼一種酶，該酶具有催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段中某一反應的活性〔「發酵和工業」，46，102-111(1988)〕。來自大腸桿菌的bioA，bioB，bioF，bioD，bioC，bioH基因的鹼基序列已得到說明。現已知bioA，bioB，bioF，bioD，bioC基因形成一個操縱子，其轉錄由操縱基因控制。
關於來自除埃希氏菌屬以外其它屬的微生物的生物素生物合成中涉及的基因，已有報導來自粘質沙雷氏菌的基因(基因庫資料，錄入號D17468)及來自枯草桿菌的基因(JP-A-7-231789)。每一個這些基因的鹼基序列已得到說明。雖然這些基因的鹼基序列與來自大腸桿菌的基因不同，但前述基因的基因產物的功能和生物素生物合成途徑與後述基因(大腸桿菌)基本相同。另一方面，來自球狀桿菌的生物素生物合成中涉及的基因也已有報導〔Ohsawa等，基因80，39-48(1989)，Gloeckler等，基因87，63-70(1990)〕。球狀桿菌的基因在以下幾個方面與大腸桿菌的不同在庚二醯輔酶A上遊生物合成階段中涉及的基因，bio基因簇的形成及基因順序等〔Gloeckler等，基因87，63-70(1990)〕。
可是，關於來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因，它們的鹼基序列和基因產物的結構或功能完全不為人們所知。因此，還沒有利用來自鞘氨醇單胞菌屬的生物素生物合成中涉及的基因，通過基因工程培育生產生物素的微生物這方面的技術。
在這種情況下，本發明的發明者們認真地研究並隨後發現通過分離包含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中牽涉的基因的DNA片段，將該DNA片段插入到載體中，然後將載體導入宿主細胞來製備用於生產生物素或生物素前體的轉化子。至此，本發明得到完成。

發明內容
本發明有下列內容1)包含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中牽涉的基因的DNA片段。
2)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因選自於一組基因，這組基因由7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因、7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因，生物素合成酶基因，以及編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶的基因組成。
3)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因是編碼7-酮-8-氨基壬酸合成酶的基因。
4)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有7-酮-8-氨基壬酸合成酸活性，並具有如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列，或者在如SEQ ID NO1所示胺基酸序列中經過缺失，取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
5)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有7-酮-8-氨基壬酸合成酶活性，並具有如SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，或者在如SEQ ID NO2所示胺基酸序列中經過缺失，取代，修飾、或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
6)包含具有如SEQ ID NO3，4或5所示的鹼基序列的基因的DNA片段。
7)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因是編碼7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶的基因。
8)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO6所示，或者是在SEQ ID NO6所示胺基酸序列中經過缺失、取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
9)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO7所示，或者是在SEQ ID NO7所示胺基酸序列中經過缺失，取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
10)包含具有如SEQ ID NO8或9所示鹼基序列的基因的DNA片段。
11)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因是編碼脫硫生物素合成酶的基因。
12)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有脫硫生物素合成酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO10所示，或者是在SEQ IDNO10所示胺基酸序列中經過缺失、取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
13)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有脫硫生物素合成酶活性，其胺基酸的序列如SEQ ID NO11所示，或者是在如SEQID NO11所示胺基酸序列中經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
14)包含具有SEQ ID NO12或13所示鹼基序列的基因的DNA片段。
15)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因是編碼生物素合成酶的基因。
16)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有生物素全成酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO14所示，或者是在如SEQ IDNO14所示胺基酸序列中經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
17)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有生物素合成酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO15所示，或者是在SEQ ID NO15所示的胺基酸序列中經過缺失、取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
18)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有生物素合成酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO18所示。
19)包含具有如SEQ ID NO16，17或19所示鹼基序列的基因的DNA片段。
20)根據上述第1項所述的DNA片段，其中的基因編碼具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性的酶。
21)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO20所示，或者是在SEQ ID NO20所示胺基酸序列中經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
22)包含編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性。其胺基酸序列如SEQ ID NO21所示，或者是在SEQ ID NO21所示胺基酸序列中經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列。
23)包含具有如SEQ ID NO22或23所示鹼基序列的基因的DNA片段。
24)包含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的部分鹼基序列的DNA片段。
25)根據上述第24項所述的DNA片段，其中的基因是7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因，7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因，生物素合成酶基因，或編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶的基因。
26)包含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的蛋白編碼區的DNA片段。
27)根據上述第26項所述的DNA片段，其中的基因是7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因，7， 8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因，生物素合成酶基因，或編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性的酶的基因。
28)包含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的基因表達調控區域的DNA片段，該區域位於蛋白編碼區的上遊。
29)根據上述第28項所述的DNA片段，其中所述的基因是7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因，7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因，生物素合成酶基因，或編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性的酶的基因。
30)具有如SEQ ID NO24或25所述鹼基序列的DNA片段。
31)根據上述第1、2、3、7、11、15、20、24、25、26、27、28和29項中任何一項所述的DNA片段，其中屬於鞘氨醇單胞菌屬的微生物是少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511或鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405。
32)包含根據上述第1到31項中任何一項所述的DNA片段的載體。
33)一種構建載體的方法，包括將根據第1到31項中任何一項所述的DNA片段插入能在宿主細胞中複製的載體。
34)根據第32項所述的載體，其中的基因表達調控區域連入蛋白編碼區的上遊。
35)含有至少一個導入宿主細胞的根據上述第1到31項中任何一項所述的DNA片段或根據上述第32或34項所述的載體的轉化子。
36)根據上述第35項所述的轉化子，其中的宿主細胞是微生物。
37)一種構建轉化子的方法，包括將根據第32或34項所述的載體導入宿主細胞。
附圖簡述

圖1表示質粒pJAB2的結構及限制性圖譜圖2表示質粒pJAW的結構及限制性圖譜圖3表示質粒pJA41的結構及限制性圖譜圖4表示質粒pSP302的結構及限制性圖譜圖5表示質粒pSP304的結構及限制性圖譜圖6表示質粒pSS301的結構及限制性圖譜圖7表示質粒pSS305的結構及限制性圖譜圖8表示質粒pSS304的結構及限制性圖譜圖9表示質粒pSS306的結構及限制性圖譜本發明優選的實施方案在本說明書中，來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的在生物素生物合成中涉及的基因是指編碼在鞘氨醇單胞菌屬微生物的細胞中生物素生物合成中涉及的酶的基因。所述的基因包括，例如，7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因(下文稱為「本發明bioF基因」)，7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因(下文稱為「本發明bioA基因」)，脫硫生物素合成酶基因(下文稱為「本發明bioD基因」)，生物素合成酶基因(下文稱為「本發明bioB基因」)，以及編碼在生物素生物合成途徑中具有催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性的酶的基因(下文稱為「本發明bioC基因」)。
本發明bioF基因包括，例如，來自鞘氨醇單胞菌屬微生物，含編碼7-酮-8-氨基壬酸合成酶的約1.1-1.2kbp區域的基因。其更特定的例子是編碼具有7-酮-8-氨基壬酸合成酶活性，並具有如SEQ ID NO1或2所示胺基酸序列或由SEQ ID NO1或2所示胺基酸序列經過缺失，取代、修飾或插入一個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列的蛋白的基因；具有如SEQ ID NO3，4或5所述的鹼基序列的7-酮-8-氨基壬酸酶合成酶基因。
本發明bioA基因包括，例如來自鞘氨醇單胞菌屬微生物，含編碼7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶的約1.2-1.3kbp區域的基因。其更特定的例子是編碼具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性，並具有胺基酸序列如SEQ ID NO6或7所示胺基酸序列或由SEQ ID NO6或7所示胺基酸序列經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸後得到的胺基酸序列的蛋白的基因；具有如SEQ ID NO8或9所示鹼基序列的7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因。
本發明bioD基因包括，例如，來自鞘氨醇單胞菌屬微生物，含編碼脫硫生物素合成酶的約0.6kbp區域的基因。更特定的例子是編碼下述蛋白的基因，該蛋白具有脫硫生物素合成酶活性，其胺基酸序列如SEQID NO10或11所示或由SEQ ID NO10或11所示胺基酸序列經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸後得到的胺基酸序列；和具有SEQ ID NO如12或13所示鹼基序列的脫硫生物素合成酶基因。
本發明bioB基因包括，例如，來自鞘氨醇單胞菌屬微生物，含編碼生物素合成酶的約1.0-1.1kbp區域的基因。更特定的例子是編碼下述蛋白的基因，該蛋白具有生物素合成酶活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO14，15或18所示或由SEQ ID NO14，15，18所示胺基酸序列經過缺失，取代，修飾或插入一個或多個胺基酸後得到的胺基酸序列；和具有如SEQ ID NO16，17或19的所示鹼基序列的生物素合成酶基因。
本發明bioC基因包括，例如，來自鞘氨醇單胞菌屬微生物，含編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶的約0.8-0.9kbp的基因。更特定的例子是編碼下述蛋白的基因，該蛋白具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO20或21所示或由SEQ ID NO20或21所示胺基酸序列經過缺失、取代、修飾或插入一個或多個胺基酸後得到的胺基酸序列；和具有如SEQ ID NO22或23所示鹼基序列的編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶的基因。
用於從中分離任何本發明bioF，bioA，bioD，bioB和bioC基因的微生物可以是從自然界分離的菌株或通過將突變導入上述分離菌株得到的菌株，只要它是鞘氨醇單胞菌屬生物素合成菌，即，它有在生物素生物合成中涉及的基因。上述微生物包括，例如，在JP-A-133790中描述過的少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511菌株和鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405菌株，少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511菌株以可分裝的狀態貯存於生理和生化研究所的生物株系貯存設備中。鞘氨醇單胞菌種類SC42405株系在布達佩斯條約的規定下貯存在國際工業貿易部，工業科學和技術社，國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi-1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，貯存錄入號為FERM-BP3995，並已在美國專利號5,432,067中公開。
以下給出從鞘氨醇單胞菌屬生物素合成細菌製備含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段的方法的例子。
首先，分離鞘氨醇單胞菌屬微生物的基因組DNA，例如，通過在Biochemica.Biophysica.Acta.，Vol.72，619-629(1963)，等中描述的常規基因組DNA提取方法。用合適的限制性酶如Sau 3AI部分酶切分離的基因組DNA，接著將所得的DNA片段插入合適的載體以製備基因組DNA文庫。至於此實驗中所用的載體，只要能在基因組DNA文庫要導入的菌株中複製和繁殖的任何載體都可使用。載體可包括，例如，質粒，噬菌體，和粘粒。
關於從這樣製備的基因組DNA文庫中分離和鑑定生物素生物合成中涉及基因的方法，可提及的一種方法是，將基因組DNA文庫導入缺少生物素生物合成中涉及基因並需要生物素的基因缺失突變株，然後從得到的轉化子中篩選能夠重新合成生物素的菌株。至於該方法中用到的生物素依賴型突變株，任何菌株，只要鞘氨醇單胞菌屬微生物的DNA片段導入此菌株的細胞後能夠表達，都可使用。這樣的突變株可以通過，例如，在Proceeding of the National Academy of Sciences U.S.A.，Vol.69，2219(1972)，細菌學雜誌，Vol.115，662(1973)，等中描述的常規方法來製備。關於將基因組DNA文庫導入生物素依賴型突變株的方法，可以提到多種常規方法，如用CaCl2處理細胞的方法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕，電穿孔法〔分子生物學常用方法，Vol.1，John WileySons.Inc.ISBNO-471-50338-X(1987)〕，等。
將所獲得的生物素依賴型突變株的轉化子培養在不含生物素的合適的選擇性培養基中，篩選能夠生長的轉化子。這樣選擇出的轉化子可能是帶有含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因的DNA插入片段的載體的菌株。
例如，當載體是質粒或粘粒時，重組載體通過常規方法如鹼裂解法或煮沸法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕從上述轉化子中提取。當載體是噬菌體時，重組載體通過常規方法如密度梯度離心或離子交換層析〔分子生物學常用方法，Vol.1，John WileySons.Inc.ISBNO-471-50338-X(1987)〕從轉化子中提取。提出的重組載體的鹼基序列通過Sanger雙脫氧鏈終止法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕來分析。這樣就可確定插入到載體中DNA片段的鹼基序列。
當與下述每個已知基因有高度同源性的編碼蛋白的區域從已確定的鹼基序列中找到的500bp或更多的開放閱讀框中篩選出來時，其可以列為鞘氨醇單胞菌屬細菌生物素生物合成涉及的基因當DNA片段通過使用bioF缺失突變株而獲得時，該基因即為已知的bioF基因；當DNA片段通過使用bioA缺失突變株而獲得時，該基因即為已知的bioA基因；當DNA片段通過使用bioD缺失突變株而獲得時，該基因即為已知的bioD基因；當DNA片段通過使用bioB缺失突變株而獲得時，該基因即為已知的bioB基因；當DNA片段通過使用bioC缺失突變株而獲得時，該基因即為已知的bioC基因。下面情況也是可能的。每一個編碼區域用任何的限制性酶切割並製備含每一個編碼區域的亞克隆。每一個亞克隆按下述方法導入基因缺失突變株中當亞克隆是通過使用bioF缺失突變株得到的DNA片段，將其導入bioF缺失突變株；當亞克隆是通過使用bioA缺失突變株得到的DNA片段，將其導入bioA缺失突變株；當亞克隆是通過使用bioD缺失突變株得到的DNA片段，將其導入bioD缺失突變株；當亞克隆是通過使用bioB缺失突變株得到的DNA片段，將其導入bioB缺失突變株；當亞克隆是通過使用bioC缺失突變株得到的DNA片段，其被導入bioC缺失突變株。研究含有這樣導入的基因的突變株在合適的不含生物素的選擇性培養基上的生長情況。由此保留在可生長的突變株中的亞克隆上所含的編碼區使可確定為鞘氨醇單胞菌屬細菌生物素生物合成中涉及的基因。
此外，這樣獲得的目的基因的功能可被改進，例如，通過在分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)等中所述的常規突變引入方法。突變可導入任何參與生物素生物合成的基因。為了提高生物素的產量，在編碼生物素合成酶的bioB基因中引入突變尤其有效。因為bioB編碼生物素合成酶，催化脫硫生物素轉變為生物素，而這一步常常是生物素生物合成途徑中的限速步驟。導入的突變可以是編碼增加酶活性或提高蛋白穩定性的蛋白的編碼區，或在促進基因表達的基因表達調控區中的突變。引入突變的基因如上所述通過導入生物素依賴型基因缺失突變株中表達，比較其與野生型基因補充基因缺失的能力。這樣，就有可能篩選出有助於提高生物素產量的突變基因。有助於提高生物素產量的突變基因也可通過在微生物中表達引入突變的基因，與使用野生型基因的實驗比較導入基因所編碼酶的產量，酶活性，以及該酶催化的反應合成的化合物的量等等來篩選。具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶，7-酮-8-氨基壬酸合成酶，7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶，及脫硫生物素合成酶的活性可通過，例如，在Y.Izumi等，酶學方法，Vol.62，326-338(1979)，等中描述的方法來測量。生物素合成酶的活性可通過，例如在Sanyal等，Archives of Biochemistry and Biophysics.，Vol.326，48-56(1996)；A.Mejean等，生物化學和生物物理研究通訊，Vol.217，1231-1237(1995)，等中描述的方法來測量。
上述導入了突變的基因的具體例子是具有如SEQ ID NO19所示鹼基序列的生物素合成酶基因。當與具有如SEQ ID NO16所示鹼基序列的生物素合成酶基因相比，如果以起始密碼子(ATG)的A為第1位鹼基，該基因中第-57位鹼基和第706位鹼基都是取代的。作為引入了突變的基因可以以具有如SEQ ID NO5所述鹼基序列的7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因為例。當與具有如SEQ ID NO14所示鹼基序列的7-酮-8-氨基壬酸合成酶基因相比，如果以起始密碼子(ATG)的A為第1位鹼基，該基因中的第-11位鹼基是取代的。
在本說明書中，術語「含至少一種來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的DNA片段」意思是該DNA片段中至少含一個在鞘氨醇單胞菌屬微生物的細胞中編碼生物素生物合成中涉及的酶的基因。該DNA片段可以是按前述方法從微生物中分離的DNA片段，或通過連接編碼來自任何不同微生物菌株的參與生物素生物合成的酶的基因而製備的DNA片段，或者通過在前述基因引入突變而得到的基因。
本發明也提供含有來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因的部分鹼基序列的DNA片段。該DNA片段用作，例如，在雜交方法中使用的探針或PCR方法中使用的引物。當該DNA片段用作引物在PCR方法中使用時，其鹼基數一般優選大的以保證退火特異性。但是，隨著鹼基數目的增加，在PCR反應中引物自身易形成更高級結構，因而在某些情況下會降低退火的效率。因此，需要非常繁瑣的操作來進行合成後純化。考慮到這一缺點時，鹼基數目優選不要太大。一般地，優選由含不超過50和不少於15個鹼基的單鏈DNA組成的基因片段。這樣的DNA片段具體例子是具有表1所示引物BF，BR，BF1，BR1，C1和C6的鹼基序列中任何一種鹼基序列的DNA片段。
表1 PCR引物

表2 PCR引物

來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因包含蛋白編碼區和上遊或下遊的基因表達調控區。
含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的蛋白編碼區的DNA片段可用於，例如，將上述區域連接到能在宿主細胞中作用的啟動子上，及構建在宿主細胞中表達此基因的載體的步驟中。
基因表達調控區域是指位於蛋白編碼區上遊或下遊的幾十到幾百個鹼基對的區域，該區域對蛋白的基因表達調控有重要影響。特別地，位於蛋白編碼區上遊的啟動子是重要的基因表達調控區。基因表達調控區的具體例子是以起始密碼子(ATG)的A為第+1位鹼基，含在SEQ IDNO16中第-222位鹼基到第-1位鹼基序列的區域，以起始密碼子(ATG)的A為第+1位鹼基，含在SEQ ID NO4中第-201位鹼基到第-1位鹼基序列的區域。
基因表達調控區可通過下面步驟來確定，首先引入突變比如點突度，缺失或插入到來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因蛋白編碼區的上遊或下遊，然後在微生物中表達該基因，測量該蛋白編碼酶的產量，酶的活性，此酶所催化反應產生的化合物量等等，最後找出引入突變後顯著改變上述測量值的區域，也可以用編碼易於測量上述值或酶活性的蛋白的基因取代上述基因的蛋白編碼區來進行同樣的實驗。基因表達調控區可通過用上述方法來確定而得到。
通過例如用如前所述的PCR方法引入突變如取代，缺失或插入，所獲得的基因表達調控區可以修飾成允許高水平基因表達的基因表達調控區。也可以通過從由於突變等原因提高了所需蛋白產量或酶活性的突變株分離基因來獲得允許高水平基因表達的基因表達調控區。象這樣的基因表達調控區，可以提及的是具有如SEQ ID NO24和25所示鹼基序列的基因表達調控區。
含上述來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因的基因表達調控區的DNA片段可用來，例如，構建在鞘氨醇單胞菌屬微生物中表達這種基因的載體。
將這樣獲得的含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因或該基因的部分鹼基序列的DNA片段插入在宿主細胞中能複製的載體，由此得到用於將該基因或其一部分導入宿主細胞的載體。而且，基因表達調控區連到上述基因蛋白編碼區的上遊，接著插入載體中，由此在宿主細胞中表達該基因的載體得到構建。
這種情況下所用的DNA片段，可提及的有通過事先切割含按前述方法獲得的來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素合成中涉及基因的DNA片段而得到合適大小的具有方便將DNA片段連接到載體上的合適限制性酶位點的DNA片段；在沒有合適的限制性酶切位點存在的情況下，通過PCR方法在生物素生物合成中涉及基因兩端引入任意酶切位點，由此得到的DNA片段。
關於插入載體的基因，使用選自由上述本發明的bioF，bioA，bioD，bioB，bioC基因組成的一組基因中的至少一個基因就足夠了。例如，可以將上述所有基因或一些基因插入載體。另外，可以插入多數特定基因以增加特定酶活性。如果需要，選擇性標記基因，如對在下文所述的篩選轉化子有用的藥物抗性基因，用於與宿主基因組同源重組的基因組DNA可以與上述基因一起插入同樣一個載體中。
至於連到蛋白編碼區上遊的基因表達調控區，只要具有在宿主細胞中調控基因表達功能的任何鹼基序列都可使用。例如，當宿主細胞是鞘氨醇單胞菌屬微生物細胞時，可提及的有如上述的來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及基因的基因表達調控區。當宿主細胞是大腸桿菌細胞時，可以利用商業上可得到的在大腸桿菌中具有基因表達調控活性的啟動子。
至於DNA片段要插入其中的載體，只有能在宿主細胞例如，微生物細胞中複製的任何載體都可使用。例如，當宿主細胞是鞘氨醇單胞菌屬微生物細胞時，可使用的有，分離地位在不相容質粒P組的RK2和由RK2衍生的質粒載體〔質粒，Vol.13，149-153(1985)，細菌學雜誌，Vol.167，604-610(1986)〕，分類地位在不相容質粒Q組的RSF1010，和由RSF1010衍生的質粒載體〔基因，Vol.16，237-247(1981)〕，等。當宿主細胞是大腸桿菌細胞時，可以使用的有商業上可得到的在細胞中能複製的質粒，噬菌體等。
將這樣構建的含生物素生物合成中涉及基因的載體導入宿主細胞，例如，宿主微生物細胞製備轉化子。
含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段要導入的宿主細胞沒有特別地限制，只要在該細胞中，導入的DNA片段能夠由該細胞穩定地保存並且基因在該細胞中能夠表達。關於宿主細胞，可提及的有鞘氨醇單胞菌屬微生物細胞，大腸桿菌等。
至於將載體導入宿主細胞的方法，可用常規基因工程的方法。例如，關於將載體導入微生物宿主的方法，可提及的有常規方法如氯化鈣處理細胞的方法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕，電穿孔法〔分子生物學常規方法，Vol.1，John Wiley Sons.Inc，ISBNO-471-50338-X(1987)〕，等。也可使用通過利用同源重組將所需DNA片段導入宿主細胞基因組的基因導入方法。例如，將含生物素生物合成中涉及的基因的DNA片段兩端連上來自宿主細胞的基因組DNA片段，然後將連好的片段插入載體再將載體導入宿主細胞。當載體上的基因組DNA和宿主細胞的基因組DNA之間發生同源重組時，含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段就被導入宿主細胞基因組中形成轉化子。
按上述方法通過導入含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段得到的轉化微生物，可在選擇性標記基因的表型的基礎上有效選擇，該選擇性標記基因包含於載體中且與基因一起轉入宿主細胞。例如，如果選擇性標記基因是氨苄青黴素抗生基因，在基因轉化後，細胞可在含氨苄青黴素的合適培養基上劃線培養，然後可用釣菌法(hooking upmethod)分離長出的克隆，由此可獲得轉化子。這樣，可獲得導入了含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段的轉化子。該轉化子可用於生產生物素，和作為生物系生物合成前體的7-酮-8-氨基壬酸，和7，8-二氨基壬酸和脫硫生物素。
下面參考實施例進一步解釋了本發明的細節，但本發明並不受限於所舉的實施例。
實施例1.分離生物素生物合成中涉及的基因(1-A)製備少動鞘氨醇單胞菌的基因組DNA將-環少動鞘氨醇單胞菌JCM7511接種於200毫升LB培養液(1％蛋白腖，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉)中，拿去在30℃下搖瓶培養15小時，離心(8000rpm，10分鐘)收集對數生長期細菌細胞。收集的細胞重懸於20ml緩衝液A〔25％蔗糖，50mM Tris-HCl(pH8，0)〕中，再加入2.5ml溶菌酶氯化物溶液(50mg/ml)，37℃溫育30分鐘。然後，再加入2.5ml SDS溶液〔10％(v/v)和0.25ml EDTA溶液(0.5M)〕，得到的混合物在37℃溫育16小時，溫育的混合物中加入等體積TE飽和的酚，緩慢攪拌得到的混合物，然後離心(10,000rom，10分鐘)，然後回收上清來去除蛋白。上述去蛋白過程再重複5次。在回收的上清中加兩倍於上清體積的無水乙醇以沉澱DNA，沉澱的DNA通過纏在玻璃棒上回收，用70％乙醇洗，風乾後溶於20毫升TE緩衝液中，加入20微升RNA酶(10mg/ml)，然後在37℃溫育16小時。這樣，得到了含大約21毫克少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511基因組DNA的DNA溶液。(1-B)製備基因組DNA文庫在(1-A)中得到的43mg基因組DNA用15單位限制性酶Sau3A I在37℃下處理2分鐘以使其部分消化。經過部分消化得到的基因組DNA片段與通過用限制性酶BamH I切割pUC19質粒載體並去磷酸得到的DNA片段(可從TAKARA SHUZO有限公司得到)混合。通過使用連接反應試劑盒(可從TAKARA SHUZO有限公司得到)，按照所附的操作手冊，將通過部分消化得到的基因組DNA片段與pUC19質粒載體連接，以製備含不同DNA片段的重組質粒。(1-C)篩選含生物素生物合成中涉及DNA片段的重組質粒通過電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗室公司製造)將(1-B)中獲得的重組質粒分別導入bioF缺失大腸桿菌突變株(R874)，bioA缺失大腸桿菌突變株(R879)，bioB缺失大腸桿菌突變株(R875)，bioC缺失大腸桿菌突變株(R876)〔細菌學雜誌，Vol.94，2065-2066(1972)，細菌學雜誌，Vol.112，830-839(1972)〕。由此處理後的菌株在不含生物素的選擇性瓊脂平板(1.48％Na2HPO4-7H2O，0.3％KH2PO4，0.05 NaCl，0.1％NH4Cl，0.005％氨苄青黴素，1.5％瓊脂)上劃線，瓊脂平板於37℃溫育兩天。挑取在培養基上生長並形成菌落的菌株，在37℃下LB培養基中溫育16小時。用鹼裂解法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕從這些菌株提取質粒，用限制性酶切割後觀察瓊脂糖凝膠電泳結果發現，導入每個缺失突變株的重組質粒包含了如表3所示大小的插入片段。
表3與生長缺陷型菌株互補的重組質粒

(1-D)含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段的鹼基序列分析對(1-C)中獲得的重組質粒pBC01，pBC02，pBC03，pBC04，pBC05，用下述方法通過使用千鹼基序列缺失試劑盒(可從TAKARASHUZO有限公司得到)製備含不同大小插入片段的缺失克隆。
重組質粒pBC01，pBC02，pBC03，pBC04和pBC05各20毫克用以下酶切割；pBC01SmaI和KpnI，pBC02pstI和XbaI，pBC03，pBC04和pBC05XbaI和Sse 8387I。可用酚抽去酶，然後用乙醇沉澱DNA。所得的DNA溶於100μl外切核酸酶III緩衝液〔50mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，5mM MgCl2，10mM 2-巰基乙醇〕中，再加入180單位外切核酸酶III，所得的混合物混勻後在37℃溫育。每隔1分鐘取出10微升溶液與預冷的100微升綠豆核酸酶緩衝液〔40mM醋酸鈉(pH4.5)，100mM NaCl，2mM ZnCl2，10％甘油〕混合，在65℃處理5分鐘後使外切核酸酶III失活。這樣所得的溶液冷卻到37℃後再加入50單位綠豆核酸酶，溫育60分鐘。用酚抽提去酶，然後用乙醇沉澱DNA。所得的DNA溶於50微升klenow緩衝液〔7mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，20mM NaCl，7mM MgCl2，每種dNTP各0.1mM〕，加2單位klenow片段，接著在37℃溫育15分鐘，每10微升所得的溶液中加入100微升連接溶液A和12微升連接溶液B，然後在16℃溫育1小時。然後用乙醇通過沉澱濃縮DNA，溶於5微升無菌水中，得到的溶液導入大腸桿菌JM109，然後處理後的大腸桿菌JM109在含氨苄青黴素(0.005％)的LB培養基瓊脂平板(1％蛋白腖，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，1.5％瓊脂)上劃線，平板在37℃溫育16小時。從長出的菌落提取質粒並檢測其插入DNA片段的大小。對於缺失克隆pBC01，有8個含插入DNA片段的克隆分別被篩選出來，大小從250bp到1.8kb，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC02，有12個含插入片段的克隆被挑出，大小從250bp到2.8kb之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC03，有6個含插入片段的克隆分別被篩選出來，大小從250bp到1.4kb之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC04，有6個含插入片段的克隆分別被挑出，大小從250bp到1.4kb之間變動，相差約為250bp。對於缺失克隆BC05，有15個含插入片段的克隆分別被挑出，大小在250bp到3.7kb之間，相差約為250bp。
每個缺失克隆通過鹼裂解法提取質粒〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕。用30納克提取物作模板和M13引物M4(可從TAKARA SHUZO有限公司得到)或M13引物RV(可從TAKARASHUZO有限公司得到)作引物，通過使用ABI稜晶體染料終止循環測序備好反應試劑盒(由Perkin-Elmer公司製造)進行測序反應，用自動鹼基序列分析儀373A(由Perkin-Elmer公司製造)分析鹼基序列。
為從重組質粒的插入片段的鹼基序列中確定生物素生物合成中涉及的基因，從在片段中存在的500bp或更大的開放閱讀框架中選出分別與已知bioF基因，bioA基因，bioD基因，bioB基因和bioC基因在鹼基序列中有高度同源性的蛋白編碼區，並被確定為分別對應於上述基因的鞘氨醇單胞菌屬細菌的基因。pBC01含bioF(SEQ ID NO3)，pBC02含bioD(SEQ ID NO12)和bioA(SEQ ID NO8)，pBC03含bioD(SEQ ID NO16)，pBC04和pBC05各含bioD(SEQ ID NO22)。比較獨立得到的pBC01和pBC02的插入片段的鹼基序列，發現pBC01、pBC02插入片段的組合是基因組中連續的DNA。因此，很明顯bioF，bioD和bioA形成一個操縱子。實施例2分離生物素生物合成中涉及的基因(2-A)製備鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405基因組DNA接種一環鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405到200毫升LB培養液(1％蛋白腖，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉)中，拿去在30℃下搖瓶培養15小時，離心(8000rpm，10分鐘)收集對數生長期的細菌細胞。收集的細胞重懸於20毫升緩衝液A〔25％蔗糖，50mM Tris-HCl(pH8.0)〕中，再加入2.5ml溶菌酶氯化物(50mg/ml)溶液，37℃溫育30分鐘。然後，再加入2.5ml SDS溶液〔10％(v/v)和0.25ml EDTA溶液(0.5M)〕。得到的混合物在37℃溫育16小時。溫育混合物中加入等體積的Tris飽和酚，輕輕混勻得到的混合物，然後離心(10,000rpm，10分鐘)，然後回收上清來去除蛋白。上述去蛋白過程再重複5次，在回收的上清中加兩倍體積的乙醇以沉澱DNA。通過纏到玻璃棒上回收DNA，用70％乙醇洗，風乾後溶於20ml TE緩衝液中，加入20微升RNA酶(10mg/ml)，然後37℃溫育16小時。這樣，得到了含大約21mg鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405基因組DNA的DNA溶液。
(2-B)製備基因組DNA文庫(2-A)中獲得的40毫克基因組DNA用15單位限制性酶Sau3AI在37℃下處理2.5分鐘以部分消化。經過部分消化得到的基因組DNA片段與用限制性酶BamH I切割並脫磷酸的pUC19載體(可以TAKARASHUZO有限公司得到)混合。通過使用連接反應試劑盒(可從TAKARASHUZO有限公司得到)，按所附的操作手冊，將通過部分消化得到的基因組DNA片段與pUC19質粒載體連接，以製備含不同DNA片段的重組質粒。(2-C)篩選含生物素生物合成中涉及的DNA片段的重組質粒通過電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗室公司製造)將(2-B)中獲得的重組質粒分別導入bioF缺失大腸桿菌突變株(R874)，bioA缺失大腸桿菌突變株(R879)，缺失bioB的大腸桿菌突變株(R875)，bioC缺失大腸桿菌突變株(R876)〔細菌學雜誌，Vol.94，2065-2066(1972)，細菌學雜誌，Vol.112，830-839(1972)〕。由此處理後的菌株在不含生物素的選擇性瓊脂平板平板(1.71％Na2HPO4-7H2O，0.3％KH2PO4，0.05NaCl，0.1％NH4Cl，0.005％氨苄青黴素，0.2mM IPTG，1.5％瓊脂)上劃線，瓊脂平板在37℃中溫育兩天。挑取在培養基上生長並形成菌落的菌株，在37℃下LB培養基中溫育16小時。用鹼裂解法〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕從這些菌株中提取質粒，用限制性酶切割後觀察瓊脂糖凝膠電泳結果，發現導入每個缺失突變株的重組質粒包含了如表4所示大小的插入片段表4與生長缺陷型菌株互補的重組質粒

(2-D)含生物素生物合成中涉及基因的DNA片段的鹼基序列分析對(2-C)中獲得的重組質粒pBC11，pBC12，pBC13，pBC14和pBC15，用下述方法通過使用千鹼基序列缺失試劑盒(可從TAKARASHUZO有限公司得到)製備含不同大小插入片段的缺失克隆。
20毫克重組質粒pBC11，pBC12，pBC13，pBC14，pBC15用以下酶切割；pBC11XbaI和Sse8387I，pBC12和pBC13PstI和XbaI，pBC14和pBC15XbaI和KpnI。可用酚抽提去酶，然後用乙醇沉澱DNA。所得的DNA溶於100微升外切核酸酶III緩衝液〔50mMTris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl，5mM MgCl2，10mM2-巰基乙醇〕中，再加入180單位外切核酸酶III，得到的混合物在37℃溫育。每隔1分鐘取出10微升溶液與預冷的100微升綠豆核酸酶緩衝液〔40mM醋酸鈉(pH4.5)，100mM NaCl，2mM ZnCl2，10％甘油〕混合，在65℃處理5分鐘後使外切核酸酶III失活。這樣所得的溶液冷卻到37℃後再加入50單位綠豆核酸酶，溫育60分鐘。用酚抽提去酶，然後用乙醇沉澱DNA。所得的DNA溶於50微升klenow緩衝液〔7mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mMEDTA，20mM NaCl，7mM MgCl2，各0.1mM每種dNTP〕，加2單位klenow片段，接著在37℃溫育15分鐘，每10微升所得的溶液中加入100微升連接溶液A和12微升連接溶液B，然後在16℃溫育1小時。然後用乙醇通過沉澱濃縮DNA，溶於5微升無菌水中，得到的溶液導入大腸桿菌JM109中。然後處理後的大腸桿菌JM109在含氨苄青黴素(0.005％)的LB培養基瓊脂平板(1％蛋白腖，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，1.5％瓊脂)上劃線，平板在37℃溫育16小時。從長出的菌落中提取質粒並檢測其插入DNA片段的大小。對於缺失克隆pBC11，有9個含插入片段的克隆分別被篩選出來。大小從250bp到2.3kb之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC12，有8個含插入片段的克隆分別被篩選出來，大小從250bp到2.2kbp之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC13，有10個含插入片段的克隆分別被篩選出來，大小從250bp到2.6kbp之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC14有8個含插入片段的克隆分別被篩選出來，大小在250bp到1.9kbp之間，以約250bp間隔變動。對於缺失克隆pBC15有8個含插入片段的克隆分別被篩選出來，大小從250bp到2.0kb之間，以約250bp間隔變動。
每個缺失克隆通過鹼裂解法提取質粒〔分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)〕，用30納克提取物作模板和M13引物M4(可從TAKARA SHUZO有限公司得到)或M13引物RV(從TAKARASHUZO有限公司得到)作引物，通過使用ABI稜晶體染料終止循環備好反應試劑盒(由Perkin-Elmer公司製造)進行測序反應，鹼基序列用自動鹼基序列分析儀373A(由Perkin-Elmer公司製造)來分析。
為從重組質粒的插入片段的鹼基序列中確定生物素生物合成中涉及基因，從在片段中存在的500bp或更大的開放閱讀框架中選出分別與已知的bioF基因，bioA基因，bioD基因，bioB基因和bioC基因在鹼基序列中有高度同源性的蛋白編碼區，並被確定為分別對應於上述基因的鞘氨醇單胞菌屬細菌的基因。pBC11含bioF(SEQ ID NO4)，pBC12和pBC13都含bioD(SEQ ID NO13)和bioA(SEQ IDNO9)，pBC14含bioB(SEQ ID NO17)，pBC15含bioC(SEQ ID NO23)。比較獨立得到的pBC12，pBC13和pBC15的插入片段的鹼基序列，很明顯，pBC12，pBC13，pBC15插入片段的組合在基因組中是連續的DNA，bioC基因的終止密碼子TGA的TG和bioD基因的起始密碼子ATG在鹼基序列TG處重疊，bioC，bioD和bioA基因形成一個操縱子。
實施例3製備重組質粒pJAW(E)製備質粒載體pJAβ21mg來源於質粒載體RK2〔細菌學雜誌，Vol.162，604-614(1986)〕的質粒載體pJAJ7用限制性酶PstI和BamHI切割，所得片段的兩端通過使用DNA補平試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附的操作手冊補平。這樣處理後的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分開以分離大小約10kb的DNA片段。另外，2微克質粒載體pBlue sciipt Sk(+)(可從Stratagene Cloning Systems得到)用限制性酶Hae III切割。然後所得片段的兩端通過使用DNA補平試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附的操作手冊補平。這樣處理後的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分開以分離大小約0.7kb的DNA片段。混合這樣得到的全部約10kb的DNA片段和全部約0.7kb的片段，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)根據所附的操作手冊連接兩種片段，所得的質粒命名為pJAβ2(如圖1)。
(F)製備質粒pJAW用實施例1，(1-A)中獲得的基因組DNA作為模板和表5中所示的BF和BR引物進行PCR反應〔反應組合物10mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，0.002(v/v)％Tween 20，1.5mM MgCl2，40μM每種dNTP，20pmol每種引物，0.5到100納克基因組DNA，3單位ULTTMDNA聚合酶(可從Perkin-Elmer公司得到)/100微升；反應循環於97℃，2分鐘的反應循環一次，分別於97℃，1分鐘，於55℃，1分鐘，然後72℃，1.5分鐘的反應循環30次，並且於72℃，7分鐘的反應循環一次〕。這樣，得到全長含1325bp的DNA片段，該DNA片段從bioB編碼區上遊145bp到編碼區下遊154bp，並在1356bp序列兩端各引入一個XbaI位點。用限制性酶XbaI切割該DNA片段，得到的DNA片段與通過用限制性酶XbaI切開質粒載體並脫磷的處理切開的質粒載體而得到的DNA片段混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARASHUZO公司得到)，按所附的操作手冊連接。這樣獲得的質粒命名為pJW(圖2)。
表5 PCR引物

實施例4製備導入了pJAW的轉化子通過按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗室公司製造)將實施例3中獲得的質粒pJAW導入少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511，得到JCM 7511/pJAW轉化子。
實施例5製備重組質粒pJA41用限制性內切酶Eco 52I和Bsp 1286I部分消化實施例3中獲得的質粒pJAW後得到的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以回收約11.8kbp的DNA片段。此片段由pJAW從第-72位鹼在到第718位鹼基缺失形成(在以bioB基因起始密碼子ATG的A為第1位鹼基的情況下)。另一方面，以實施例1，(1-A)中獲得的基因組DNA為模板和表5所示引物BF1和BR1為引物進行PCR反應〔反應組合物10mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，0.002(v/v)％Tween 20，1.5mM MgCl2，40μM每種dNTP，20pmol每種引物，0.5到100ng基因組DNA，3單位ULTmaTMDNA聚合酶(可從Perkin-Elmer公司得到)/100μl；反應循環於97℃，1分鐘的反應循環1次，分別於97℃，0.5分鐘、60℃，1分鐘、然後72℃1.5分鐘的反應循環30次，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。這樣，在以bioB基因起始密碼子ATG的A為第1位鹼基的情況下，含從第-75位鹼基到721位鹼基的鹼基序列的DNA片段得到製備。然後，用限制性酶Eco 52I和Bsp 1286I部分消化該DNA片段，所獲得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以回收約0.8kbp的DNA片段。分析回收的DNA片段的鹼基序列以確定在SEQ ID NO19中所示的第1到1336鹼基的鹼基序列。這樣得到的DNA片段通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHOZO公司得到)按所附操作手冊使它們互相連接。這樣所獲得的質粒命名為pJA41(圖3)。
實施例6製備導入了pJA41的轉化子通過按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad公司製造)將實施例5中獲得的質粒pJA41導入少動鞘氨醇單胞菌JCM7511，得到少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJA41轉化子。
實施例7少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJAW和JCM7511/pJA41的生物素產量分別接種一環少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJAW和少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJA41到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，0.005％四環素(pH7.2)〕的小試管(18×50mm)中。作為對照，接種一環沒有導入基因的少動鞘氨醇單胞菌JCM7511到裝有3毫升培養基〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O(pH7.2)〕的小試管中。上述三種細菌在30℃培養2天(250rpm)以獲得預培養菌液。然後，接種200微升這樣得到的少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJAW和少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pJA41預培養菌液到裝有10毫升培養液〔4％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4-7H2O，0.001％FeSO4-7H2O，0.001％MnSO4-4～6H2O，0.000002％鹽酸硫胺素，0.005％四環素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。作為對照，接種200微升少動鞘氨醇單胞菌JCM 7511的預培養菌液到裝有10毫升培養基〔4％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％Kcl，0.05％MgSO4-7H2O，0.001％FeSO4-7H2O，0.001％MnSO4-4-6H2O 0.000002％鹽酸硫胺素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。上述三種細菌在30℃培養4天(250rpm)。通過使用植物乳桿菌IFO 3070菌株的微生物學定量方法(Izumi和Yamada「維生素學實驗方法II.水溶維生素」，p.481-499，日本維生素學學會，Tokyo Kagaku Dojin，1985)來確定每種培養菌液中合成和積累的生物素的濃度，並且得到的合成的生物素濃度如表6所示。
表6

*相對於未導入基因的菌株的生物素產量的數值實施例8製備重組質粒pSP302用限制性酶PstI和BamH I切割實施例1中獲得的質粒pBC01，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以獲得含bioF基因大部分編碼區和位於bioF基因上遊控制bioF、bioD和bioA基因表達的區域的約1.4kbp DNA片段。這樣所得的DNA片段和用限制性酶BamHI和PstI消化後的質粒載體pBluscript SKII(+)(可從Stratagene CloningSystems得到)，混合，然後通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附的操作手冊將它們相互連接，這樣獲得的質粒命名為pBC06。
另外，用限制性酶PstI和EcoRI切割實施例1中獲得的質粒pBC02，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以獲得合bioF部分編碼區，bioD和bioA編碼區和位於bioA基因下遊bioF，bioD和bioA的3′-非編碼區的約2.2kbp DNA片段。這樣所得的DNA片段與限制性酶PstI和EcoRI消化的質粒pBC06混合，然後通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHOZO公司得到)按所附的操作手冊將它們相互連接。這樣獲得的質粒命名為pSP105。
此外，用限制性酶BamH I和Hind III切割質粒pSP105，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以獲得含bioF，bioD和bioA的編碼區和bioF，bioD和bioA表達調控區的約3.6kbp DNA片段。這樣所得的DNA片段與限制性酶BamH I和Hind III切割的質粒pJA41混合，然後通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)，按所附的操作手冊將它們相互連接。這樣獲得的質粒命名為pSP302(圖4)。實施例9製備導入了pSP302的轉化子。
通過按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗室公司製造)將實施例8中獲得的質粒pSP302導入少動鞘氨醇單胞菌JCM7511得到少動鞘氨醇胞菌JCM7511/pSP302轉化子。
實施例10製備重組質粒pSP304用實施例1，(1-A)，中獲得的基因組DNA作模板，表5中所示的C1和C6引物進行PCR反應，以製備全長含1435bp的DNA片段，該片段從bioC基因編碼子上遊387bp到編碼區下遊196bp，並且在1435bp序列的上遊末端引入了Hind III位點，下遊末端引入XhoI位點。用限制性酶Hind III和XhoI切割該DNA片段得到的片段和通過用限制性酶Hind III和XhoI切割質粒pSP302得到的DNA片段混合，然後通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)，按所附操作手冊將它們相互連接。這樣獲得的質粒命名為pSP304(圖5)。
實施例11製備導入了pSP304的轉化子通過按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗室公司製造)將實施例10中獲得的質粒pSP304導入少動鞘氨醇單胞菌JCM7511得到少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP304轉化子。
實施例12少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP302和JCM7511/pSP304的生物素產量分別接種一環少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP302和少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP304到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，0.005％四環素(pH7.2)〕的小試管中(18×150mm)。作為對照，接種一環沒有導入基因的少動鞘氨醇單胞菌JCM7511到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O(pH7.2)〕的小試管(18×150mm)中。上述三種細菌在30℃培養2天(250rpm)以獲得預培養菌液。然後各接種200微升這樣得到的少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP302和少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP304預培養菌液到裝有10毫升培養液〔4％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4-7H2O，0.001％FeSO4-7H2O，0.001％MnSO4-4-6H2O，0.005％四環素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。作為對照，接種200微升少動鞘氨醇單胞菌JCM7511的預培養菌液到裝有10毫升培養基〔4％甘油。2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4-7H2O，0.001％FeSO4-7H2O，0.001％MnSO4-4-6H2O，(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。上述三種細菌在30℃培養4天(250rpm)。通過使用植物乳桿菌IFO 3070菌株的微生物學定量方法(Izumi和Yamada「維生素學實驗方法II。水溶維生素」，P481-499，日本維生素學學會，Tokyo kagaku Dojin，1985)來確定每種培養菌液中合成和積累的生物素的濃度，並得到合成的生物素濃度如表7所示。
表7少動鞘氨醇單胞菌JCM7511/pSP305的生物素產量

*相對於沒有導入基因的菌株的生物素產量的數值實施例13製備重組質粒pSS301用實施例2，(2-A)，中獲得的基因組DNA作模板和表8所示的BF4和BR4引物進行PCR反應〔反應組合物1×Expand HF緩衝液，1.5mM MgCl2，300mM每種dNTP，300nM每種引物，0.5到100ng基因組DNA，2.6單位ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(可從Perkin-Elmer公司得到)/50微升體系；反應循環於97℃，2分鐘的反應循環1次，分別於97℃，15秒、60℃，30秒、然後72℃，1.5分鐘的反應循環10次，97℃，15秒、60℃，30秒、然後72℃。1.5分鐘(72℃1.5分鐘的反應時間在一個循環中增加20秒)的反應循環15次，於72℃，7分鐘的反應循環1次〕。這樣，全長含1358bp的DNA片段得到製備，該DNA片段從bioB基因編碼區上遊151bp到編碼區下遊151bp，並在1358bp序列的每一端各引入一個Xba I位點。用限制性酶Xba I酶切該DNA片段所得的DNA片段與通過使用Xba I酶切質粒載體pJAβ2和脫磷酸處理質粒載體得到的DNA片段混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們互相連接，這樣獲得的質粒命名為pSS301(圖6)。
表8

例14製備導入pSS301的轉化子通過按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由bio-Rad實驗室公司製造)將實施例13中獲得的質粒pSS301導入鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405，便可獲得鞘氨醇單胞菌屬種類SC4404/pSS301。
實施例15鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS301的生物素產量接種一環鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS301到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，0.005％四環素(pH7.2)〕的小試管中(18×150mm)中。作為對照，接種一環沒有導入基因的鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，(pH 7.2)〕的小試管(18×150mm)中。上述二種細菌在30℃培養2天(250rpm)以獲得預培養菌液。然後，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS301的預培養菌液到裝有8毫升培養液〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O，0.005％四環素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。作為對照，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405的預培養菌液到裝有8毫升培養液〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。上述三種細菌在30℃培養4天(250rpm)。
通過使用植物乳桿菌IFO 3070株的微生物學定量方法(Izumi andYamada「維生素學實驗方法II。水溶維生素」，P481-499，日本維生素學學會，Tokyo Kayaku Dojin，1985)來確定每種培養菌液中生物素合成和積累的濃度，以得到如表9所示的生物合成的濃度。
表9

*相對於沒有導入基因的菌株的生物素產量的數值實施例16製備重組質粒pSS305用實施例2，(2-A)，中獲得的基因組DNA作模板和表8所示的引物F2和F3進行PCR反應〔反應組合物1×Expand HF緩衝液，1.5mM MgCl2，200μM每種dNTP，300nm每種引物，0.5到100ng基因組DNA，2.6單位ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(可從Boehringer Mancheim公司得到)/50μl；反應循環於97℃2分鐘的反應循環1次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環15次(72℃1.5分鐘的反應時間每循環1次時間延長20秒)，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。這樣，全長含1408bp的DNA片段得到製備，該DNA片段從bioF基因編碼區上遊201bp到編碼區下遊46bp，並在此1408序列的上遊末端引入一個Spe I位點，下遊末端引入一個PstI位點。用限制性酶SpeI和PstI切割該DNA片段所得的DNA片段與通過用限制性酶SpeI和PstI切割質粒載體pBluscript SK(+)(可從Stratagene Cloning Systems得到)得到的DNA片段混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們互相連接。這樣獲得的質粒命名為pSS302。
另外，用實施例2，(2-A)，中獲得的基因組DNA作模板和表8所示的引物CDA1和CDA6進行PCR反應〔反應組合物1×Expand HF緩衝液，1.5mM MgCl2，200μM每種dNTP，300nm每種引物，0.5到100ng基因組DNA，2.6單位ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(可從Boehringer Mannheim公司得到)/50微升；反應循環於97℃2分鐘的反應循環1次，分別於97℃15秒，60℃30秒，然後72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒、60℃30秒、72℃1.5分鐘的反應循環15次(72℃1.5分鐘的反應時間每循環一次延長20秒)，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。這樣，含bioC編碼區上遊209bp，bioC編碼區726bp，和bioD基因編碼區前半部分大約300bp的全長1287bp的DNA片段得到製備，並且在1287bp序列的上遊末端引入Pst I位點，下遊末端引入了Hind III位點。同限制性酶Pst I和HindIII切割該DNA片段，所得的DNA片段與通過用限制性酶Pst I和HindIII切割質粒載體pBluescript SK(+)(可從TAKARA SHUZO公司得到)得到的DNA片段混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們互相連接。這樣獲得的質粒命名為pSS3205。
進一步用實施例2，(2-A)，中獲得的基因組DNA作模板和表8所示引物CNAS和CDA7進行PCR反應〔反應組合物1×ExpandHF緩衝液，1.5mM MgCl2，200μM每種dNTP，300nM每種引物，0.5到100ng基因組DNA，2.6單位ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(可從Boehringer Mannheim公司得到)/50微升；反應循環於97℃2分鐘的反應循環1次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環15次(於72℃1.5分鐘的反應時間每循環一次延長20秒)，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。這樣，含bioD基因後半部分編碼區約400bp，bioA基因編碼區1251bp，以及bioA基因編碼區下遊208bp序列的1653bp(全長)的DNA片段得到製備，並且在1653bp序列上遊末端引入Hind III位點，下遊末端引入XboI位點。用限制酶Hind III和XhoI切割該DNA片段，所得的DNA片段與通過使用限制性酶Hind III和XhoI切割質粒載體pBluscript SK(+)(可從Stratagene Cloning Systems公司得到)得到的DNA片段混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARASHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們相互連接。這樣所得到的質粒命名為pSS206。
用限制性酶和PstI和Hind III切割按上述方法獲得的質粒pSS205，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以製備含1287bp(全長)的DNA片段，該DNA片段包含bioC基因編碼區上遊209bp序列，bioC基因編碼區762bp以及bioD基因編碼區前半部分的300bp序列，並且在1287序列上遊末端引入了PstI位點，下遊末端引入了Hind III位點。這樣獲得的DNA片段與用限制性酶Pst I和Hind III切割的質粒pSS206混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHOZO公司得到)按所附操作手冊將它們連接。這樣獲得的質粒命名為pSS2071。
下一步，用限制性酶ClaI切割pSS2071，所得的DNA片段用來通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊自連。這樣獲得的質粒命名為pSS 207。
另外，用限制性酶SpeI和PstI切割質粒pSS 202，通過瓊脂糖凝膠電泳分離所得的片段以製備含從bioF編碼區上遊201bp到編碼區下遊46bp全長1408bp的DNA片段，並且該1406bp序列的上遊末端導入了SpeI位點。下遊末端導入了PstI位點。這樣獲得的DNA片段與經過限制性酶SpeI和PstI切割的pSS207混合，通過使用連接反應試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們相互連接，這樣獲得的質粒命名為pSS209。
用限制性酶SpeI和XhoI切割質粒pSS204，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以製備含bioF，bioC，bioD和bioA基因的DNA片段，並且該片段的上遊末端含引入的SpeI位點，下遊末端含引入XhoI位點。這樣所獲得的DNA片段與經過限制性酶SpeI和XhoI切割的pJAβ2混合，通過使用連接反應試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將它們相互連接。這樣所獲得的質粒命名為pSS305(圖7)。
實施例17製備重組質粒pSS304用實施例16中獲得的質粒pSS305作為模板，M13引物RV(可從TAKARA SHUZO公司得到)和表8所示的引物R1的組合及M13引物M4(可從TAKARA SHUZO公司得到)和MUTB1引物(可從TAKARA SHUZO公司得到)的組合之一作為引物進行PCR反應〔反應組合物1×Expand HF緩衝液，1.5mM MgCl2，200μM每種dNTP，300nM每種引物，0.5到100納克模板DNA，2.6單位ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(可從Boehringer Mannheim公司得到)/50微升；反應循環於97℃2分鐘的反應循環1次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒，60℃30秒，72℃1.5分鐘的反應循環15次(於72℃7分鐘的反應時間每一循環延長20秒)，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。PCR後，用Centricon-100(由Amico公司製造)的方法從反應溶液中去除過剩的引物和過剩dNTP，然後向殘留液中加TF緩衝液使總體積為50微升。然後，這樣得到溶液各0.5μl混合。向所得的混合液中加入50微升10×Expand HF緩衝液，4微升2.5mM每種dNTP，38.62微升滅菌雙蒸水和0.38微升ExpandTM高可信度PCR系統酶混合物(3.5單位/微升)(可從Boehringer Mannheim公司得到)。這樣得到的混合液於94℃加熱10分鐘，在超過60分鐘的時間範圍冷至37℃，然後於37℃溫育15分鐘。向此反應溶液中加入0.5微升20pmol M13引物RV(可從TAKARASHUZO公司得到)和0.5微升20pmol M13引物M4(可從TAKARASHUZO公司得到)，然後進行PCR〔反應循環於97℃2分鐘的反應循環1次，分別於97℃15秒，60℃30秒，然後72℃1.5分鐘的反應循環10次，分別於97℃15秒，60℃30秒、然後72℃1.5分鐘的反應循環15次，(72℃1.5分鐘的反應時間每循環1次延長20秒)，於72℃7分鐘的反應循環1次〕。用限制性酶NotI和Hind III切割所得的DNA片段，與經過限制性酶NotI和Hind III切割的質粒載體pBluescriptSK(+)(可從Stratagene Cloning Systems得到)混合，然後通過使用連接反應試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊連接，從獲得的克隆中，通過鹼基序列分析篩選出含bioF突變體的鹼基序列(SEQ ID NO5)的克隆，在以bioF基因的起始密碼子(ATG)中的A為第1位鹼基的情況下，該突變體第-11位的鹼基C被G取代。所得的質粒命名為pSS201。然後，用限制性酶SpeI和PstI切割質粒pSS201，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以製備含從bioF基因編碼區上遊201到編碼區下遊46bp的全長408bp的DNA片段，並且在該片段上遊末端引入一個SpeI位點，下遊末端引入一個PstI位點。所得的DNA片段與經過限制性酶SpeI和PstI切割的pSS207混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊使它們相互連接。這樣所得的質粒命名為pSS208。
另外，用限制性酶SpeI和XhoI切割質粒pSS208，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以製備含BioF突變體，bioC，bioD和bioA的DNA片段，並且該片段的上遊末端有引入的SpeI位點，下遊末端有引入的XhoI位點。所得的DNA片段與經過限制性酶SpeI和XhoI切割的質粒pJAβ2混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊將這些DNA片段連接。這樣所獲得的質粒命名為pSS304(圖8)。
實施例18製備導入pSS304的轉化子和導入pSS305的轉化子按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器(由Bio-Rad實驗製造)將實施例17中所得的質粒pSS304和質粒pSS305分別導入鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405，便可獲得鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS304和鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS305轉化子。
實施例19鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS304和鞘氨醇單胞菌屬種類SC420405/pSS305的生物素產量和生物素相關產物的產量分別接種一環鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS304和鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS305到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，0.005％四環素(pH7.2)〕的小試管(18×150mm)中。作為對照，接種一環沒有基因導入的鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，(pH7.2)〕的小試管(18×150mm)中。上述三種菌在30℃下培養2天(250rpm)以獲得預培養菌液。然後，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS304和鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS305的預培養菌液到裝有8毫升培養液〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％ MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O，0.005％四環素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。作為對照，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405到裝有8毫升培養液〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O，(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。上述三種細菌在30℃下培養4天(250rpm)。通過分別使用植物乳桿菌IFO 3070和釀酒酵母的微生物學定量方法(Izumi and Yamada「維生素學實驗方法II。水溶維生素」，p.481-499，日本維生素學學會，TokyoKayaku Dojin，1985)來確定每種培養菌液中合成和積累的生物素及生物素相關產物的濃度。結果，生物素和生物素生物合成中前體，例如，7-酮-8-氨基壬酸，7，8-二氨基壬酸和脫硫生物素(下文稱為「生物素-同效維生素」)的濃度如表10所示。
表10鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS304和鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS305的生物素產量和與生物素一同效維生素產量

*相對於沒有導入基因的菌株的生物素產量的數值實施例20製備重組質粒pSS306用限制性酶SpeI和XhoI切割pSS209，所得的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離以製備含bioF，bioC，bioD和bioA的DNA片段，並且該片段的上遊末端有導入的SpeI位點，下遊末端有導入的XhoI位點。所得的DNA片段與經過限制性酶SpeI和XhoI酶切的pSS301混合，通過使用連接試劑盒(可從TAKARA SHUZO公司得到)按所附操作手冊使它們相互連接。這樣所獲得的質粒命名為pSS306(圖9)。
實施例21製備導入了pSS306的轉化子按電穿孔法(工作電壓18kv/cm，電容25μF，電阻400Ω)用基因脈衝發生器將實施例20中得到的質粒pSS306導入鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405中，便可獲得鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS轉化子。實施例22鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS306的生物素產量接種一環鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS306到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，0.005％四環素(pH7.2)〕的小試管(18×150mm)中。作為對照，接種一環沒有導入基因的鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405到裝有3毫升培養液〔1％甘油，2％蛋白腖，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4·7H2O，(pH7.2)〕的小試管(18×150mm)中。上述兩種細菌在30℃下培養2天(250rpm)以獲得預培養菌液。然後，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS306的預培養菌液到裝有8毫升培養液〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O，0.005％四環素(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。作為對照，接種160微升鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405的預培養菌液到裝有8毫升培養基〔6％甘油，2％酵母提取物，0.5％酪蛋白胺基酸，0.1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05 MgSO4·7H2O，0.01％FeSO4·7H2O，0.1％MnSO4·4～6H2O(pH7.0)〕的大試管(22×220mm)中。上述兩種細菌在30℃下培養2天(250rpm)。通過分別使用植物乳桿菌IFO 3070菌株和釀酒酵母的微生物學定量方法(Izumi and Yamada「維生素學實驗方法II。水溶維生素」，p.481-499，日本維生素學學會，Tokyo Kayaka Dojin，1985)來確定每種培養菌液中合成和積累的生物及生物素相關產物的濃度。結果，得到合成的生物素的濃度如表11所示。
表11鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405/pSS306的生物素產量

*相對於沒有導入基因的菌株的生物素產量的數值工業應用本發明提供含至少一個來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的生物素生物合成中涉及的基因的DNA片段，和利用該DNA片段得到的生物素合成轉化子，並且本發明在提高生物素(動物，植物及一些微生物的必需維生素)的產量中有用。
序列表SEQ ID NO1序列長度369序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCW7511序列描述Met Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Leu Ala Arg Leu Ala Ala Arg Asp5 10 15Arg Leu Arg Val Leu Ala Pro Gln Arg Gly Lys Asp Phe Ala Ser Asn20 25 30Asp Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Ser Pro Arg Leu Ala Ala Ala Ile Ala35 40 45Ala Ala Val Glu Glu Gly Val Pro Val Gly Ser Gly Gly Ser Arg Leu50 55 60Leu Arg Gly Asn His Pro Glu His Glu Ala Leu Glu Ala Asp Ala Ala65 70 75 80Ala Phe Phe Gly Ala Glu Ala Ser Leu Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Gly85 90 95Ala Asn Val Ala Ile Leu Ala Thr Leu Pro Gln Arg Gly Asp Leu Ile100 105 110Val His Asp Ser Leu Val His Ala Ser Met Arg Leu Val His His Gln115 120 125
His Arg Ile Val Pro Ile Gly Gly Arg Leu Glu Ile Gly Glu Arg Arg130 135 140Gly Val Ala Val His Ala Val Lys Ala Phe Asp Arg Asp Pro His Gly145 150 155 160Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Pro Cys Pro Asp Arg Ile Leu Glu Gly165 170 175Arg Cys Ile Val Met Arg Arg Arg His Gly Leu Gly Thr Arg Gln Ala180 185 190His Pro Leu Met His Ala Thr Gly Val Phe Gly Glu Arg Gly Gln Gly195 200 205Leu Ser Ile Ala Gly Glu Arg Val Val Thr Leu His Thr Cys Gly Lys210 215 220Ala Met Gly Cys Glu Gly Ala Leu Val Ala Gly Pro Thr Ile Val Arg225 230 235 240Asp Tyr Leu Val Asn Arg Gly Arg Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ala Pro245 250 255Ser Pro Leu Met Ala Arg Gly Val Arg Glu Ala Leu Arg Ile Leu Ala260 265 270Asp Glu Pro Glu Arg Arg Thr Ala Leu His Asp Arg Ile Ala Leu Ala275 280 285Gly Ala Arg Leu Gly Arg Arg Gly Ala Leu Ala Gln Gly Thr Pro Ile290 295 300Leu Pro Leu Ile Leu His Asp Asn Gly Arg Thr Met Arg Ala Ala Glu305 310 315 320Ala Leu Gln Ala Leu Gly Tyr Asp Ile Arg Gly Ile Arg Pro Pro Thr325 330 335Val Pro Val Gly Ser Ala Arg Leu Arg Leu Ser Ile Thr Leu Asn Val340 345 350
Glu Ala Ala Asp Ile Leu Ala Leu Asp Gln Ala Leu Gln Glu Val Leu355 360 365Ala369SEQ ID NO2序列長度387序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405序列描述Met Ser Arg Leu Asp Ser Phe Phe Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ile Asp5 10 15Arg Ala Gly Gln Arg Arg Thr Leu Arg Pro Ala Ala Leu Glu Lys Gly20 25 30Gly Arg Val His Arg Asp Gly His Glu Leu Ile Asp Phe Ser Ser Asn35 40 45Asp Tyr Leu Gly Leu Ala Arg His Pro Leu Leu Ile Glu Arg Ala Arg50 55 60Ala Trp Thr Glu Ala His Gly Thr Gly Ser Gly Ala Ser Arg Leu Val65 70 75 80Thr Gly Thr Ser Ala Thr His Leu Ala Ile Glu Ala Arg Ile Ala Arg85 90 95Phe Lys His Ala Glu Ala Ala Leu Val Phe Ala Ser Gly Trp Gln Ala100 105 110
Asn Ala Ala Val Ile Pro Ala Leu Leu Ala Ala Val Pro Gly Ser Ala115 120 125Val Phe Thr ASp Arg Leu Ile His Ala Ser Met His Ala Gly Leu Ala130 135 140Ile Ser Gly Thr Arg Gln His Arg Phe Arg His Asn Asp Leu Asp His145 150 155 160Leu Glu Glu Leu Leu Ala Ser Lys Gly Ala Glu Ala Ser Ala Arg Leu165 170 175Ile Leu Thr Glu Ser Val Phe Ser Met Asp Gly Asp Arg Ala Asp Ile180 185 190Ala Arg Leu Ala Glu Ile Ala Ala Arg His Asp Ala Phe Leu Phe Val195 200 205Asp Glu Ala His Ala Thr Gly Val Leu Gly Pro Gly Gly Ala Gly Leu210 215 220Ser Ala Glu Val Pro Gly Gly Ile Asp Leu Val Met Gly Thr Phe Ser225 230 235 240Lys Ala Leu Gly Gly Phe Gly Ala Tyr Val Ala Gly Ser Gln Val Met245 250 255Ile Asp Tyr Leu Val Asn Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Thr Thr Ala260 265 270Pro Pro Pro Ala Val Leu Gly Ala Ile Asp Ala Ala Leu Asp Leu Val275 280 285Pro Gly Met Asp Ala Glu Arg Ala His Leu Ala Ala Leu Gly Gln Gln290 295 300Leu Arg Ser Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ile Asp His Gly Ala Ser Ser305 310 315 320Thr Gln Ile Val Pro Ala Val Ile Gly Ala Glu Val Ala Ala Leu Asp325 330 335
Leu Ser Arg Lys Leu Glu Glu Arg Gly Leu Leu Ala Ser Ala Ile Arg340 345 350Pro Pro Thr Val Pro Pro Gly Thr Ser Arg Leu Arg Leu Ala Leu Arg355 360 365Ala Thr His Ala Pro Ser Asp Ile Asp Ala Leu Leu Asn Ala Ile Glu370 375 380Ala Cys Arg385 387SEQ ID NO3序列長度1536序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS位置427..1536決定特徵的方法S序列描述GATCCTGATC GCGGTCCCGG CGCATCAATG GATGTGGTCG GCGCATGACG TGGTGAACCA60TCACCATCGT CGGTATTCGA AGACGACCTT GGGGTCCGCG ATCGAGAAGG CGGGCCTGAA 120ACCCCGCAAG CTCGGCTATT TCAACTCGCT GCTCTTCCCG CTCGCCGCGG CCGCGCGGAT 180CGCCGGACGG ATCACGGGGC GCGACGACAG CGACGACTCG CCACCGCCCG CGCCGCTCAA 240CAAAACGTTC GAGGCGATCT TCCGGTTGGA GCGGCATCTG GTCGGCCGTG TGCCGATGAC 300
CCCGGGGGTT TCGATCGTGA CCTTGGCGGA GCCTGCCTGA CGGCGGGTGG AGCGAAGTCG 360AAGGCCACGG GAATCCCTAA CCTTTCCGGG TTCCGCTCTC CTGCCTAGCT GGGTAGGGAA 420GCCCCC ATG CTG GAC TTT CAT CGC GCC GAT CTG GCC CGA CTG GCC GCG 468CGG GAC CGA TTG CGG GTG CTG GCC CCG CAG CGT GGC AAG GAT TTC GCG 516TCC AAC GAT TAT CTG GGC TTG GCG AAC AGC CCC CGC CTC GCC GCC GCC 564ATC GCC GCC GCG GTC GAG GAG GGC GTC CCC GTT GGG TCG GGC GGA TCG 612CGA TTG CTG CGC GGC AAT CAC CCC GAA CAT GAG GCG CTG GAG GCG GAC 660GCC GCC GCG TTC TTC GGG GCG GAG GCG AGC CTG TAT TTC TCC TCG GGC 708TAC GGT GCC AAT GTC GCG ATC CTG GCG ACG CTG CCA CAG CGC GGC GAC 756CTG ATC GTC CAC GAC TCG CTC GTC CAT GCC AGC ATG CGC CTC GTC CAC 804CAC CAG CAT CGC ATC GTG CCG ATC GGC GGC CGC CTG GAG ATC GGC GAG 852CGG CGC GGT GTC GCC GTC CAT GCT GTA AAG GCT TTC GAC CGC GAT CCA 900CAC GGT GCC CTT GCC GCC CTG GTC GCG CCA TGC CCG GAT CGC ATC CTC 948GAA GGC CGA TGC ATC GTT ATG CGC CGC CGC CAC GGC CTC GGC ACG CGA 996CAG GCG CAT CCC CTC ATG CAT GCC ACC GGC GTC TTC GGC GAG CGG GGA1044CAG GGG CTG AGC ATC GCA GGC GAG CGG GTG GTG ACG CTC CAC ACC TGT1092GGC AAG GCG ATG GGC TGC GAG GGT GCG CTG GTC GCC GGG CCG ACG ATC1140GTG CGC GAC TAT CTG GTC AAT CGC GGG AGG GGC TTC ATC TTC TCG ACC1188GCG CCC TCG CCG CTG ATG GCA CGC GGG GTG CGC GAG GCG CTT CGC ATC1236CTG GCC GAC GAG CCC GAG CGG CGC ACC GCG CTG CAC GAC CGG ATC GCG1284CTG GCG GGC GCG CGG CTG GGC CGC CGC GGT GCG CTG GCG CAG GGC ACG1332CCG ATC CTG CCG CTG ATC CTG CAC GAC AAT GGC CGC ACC ATG CGC GCC1380GCT GAG GCG CTG CAG GCG CTT GGC TAT GAC ATA CGC GGC ATC CGC CCG1428CCG ACC GTG CCC GTG GGC TCG GCG CGG CTG CGG CTG TCG ATC ACT TTG1476AAT GTC GAG GCG GCG GAC ATC CTC GCC CTC GAC CAA GCA TTG CAA GAG1524GTT CTG GCA TGA1536
SEQ ID NO4序列長度1408序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置202..1365決定特徵的方法S序列描述ACCGGAATGA CAGGCGGACA GCAGCAATAG GGCGGCAAGA GAGAGCGGCA GGGATCGCAT60CAGACGGGCA TCCTTCGGTT TTTCCTTTGC CGTTCCAACG CGCGAGGAAG GCGGCGGCTT 120CACGTCCCGC CGCGAAATCG ATGCCCCTCC CGGCCAGCCA AGCATTGTGC CGGACGCCCG 180CTTGCCATAC CGGCAGGGGC G ATG AGC AGG CTC GAT TCC TTC TTC GCA GCG 231GCG CTC GAC CGG ATC GAC CGC GCC GGA CAA CGC CGC ACC TTG CGC CCC 279GCC GCA CTC GAA AAG GGT GGC CGC GTC CAC CGC GAC GGG CAC GAA CTG 327ATA GAT TTC TCC AGC AAC GAC TAT CTC GGC CTC GCC CGC CAC CCG CTG 375CTG ATC GAG CGC GCC CGC GCC TGG ACG GAA GCC CAC GGC ACC GGC TCC 423GGC GCC TCG CGA CTG GTG ACG GGA ACC AGC GCC ACC CAT CTC GCG ATC 471GAG GCC CGC ATC GCC CGG TTC AAG CAT GCC GAA GCC GCG CTG GTC TTC 519GCC AGC GGC TGG CAG GCC AAT GCC GCG GTG ATC CCC GCC CTG CTC GCC 567GCC GTA CCC GGT TCA GCA GTC TTC ACC GAC CGG CTG ATC CAT GCC TCG 615ATG CAC GCG GGC CTC GCG ATC TCG GGC ACC CGC CAG CAC CGC TTC CGC 663CAT AAC GAC CTC GAT CAT CTG GAG GAA CTG CTG GCG AGC AAG GGC GCC 711
GAA GCC TCC GCC CGC CTG ATC CTC ACC GAG AGC GTG TTC TCG ATG GAC759GGC GAC CGC GCC GAC ATT GCC CGC CTG GCC GAG ATC GCC GCC CGC CAC807GAC GCA TTC CTG TTC GTG GAC GAA GCC CAT GCC ACC GGC GTG CTC GGC855CCC GGC GGC GCG GGC CTC TCG GCG GAA GTG CCC GGC GGG ATC GAC CTC903GTC ATG GGC ACC TTC AGC AAG GCG CTC GGC GGT TTC GGC GCC TAT GTC951GCC GGG TCA CAA GTG ATG ATC GAC TAC CTC GTC AAC GCG GCG AGC GGC999TTC ATC TTC ACC ACC GCC CCG CCG CCT GCC GTG CTG GGC GCC ATC GAC 1047GCC GCG CTC GAC CTC GTG CCG GGC ATG GAT GCC GAG CGC GCC CAT CTT 1095GCC GCG CTG GGT CAG CAG CTG CGC TCC GGC CTC GCC GCG CTC GGC ATC 1143GAT CAC GGC GCA TCG AGC ACG CAG ATC GTC CCC GCC GTG ATC GGC GCG 1191GAG GTC GCC GCG CTC GAC CTC TCC CGC AAG CTG GAA GAG CGC GGA CTG 1239CTC GCT TCC GCG ATC CGC CCG CCC ACG GTG CCG CCC GGC ACC AGC CGC 1287CTG CGC CTG GCG CTG CGC GCG ACC CAT GCG CCA AGC GAT ATC GAT GCC 1335CTG CTG AAC GCG ATC GAG GCC TGC CGG TGA AGCTGCTTTT CGCCCATGGC 1385TGGGGCTTCG ACCACACGTT CTG 1408SEQ ID NO5序列長度1408序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置202..1365決定特徵的方法S
序列描述ACCGGAATGA CAGGCGGACA GCAGCAATAG GGCGGCAAGA GAGAGCGGCA GGGATCGCAT60CAGACGGGCA TCCTTCGGTT TTTCCTTTGC CGTTCCAACG CGCGAGGAAG GCGGCGGCTT 120CACGTCCCGC CGCGAAATCG ATGCCCCTCC CGGCCAGCCA AGCATTGTGC CGGACGCCCG 180CTTGCCATAC GGGCAGGGGC G ATG AGC AGG CTC GAT TCC TTC TTC GCA GCG 231GCG CTC GAC CGG ATC GAC CGC GCC GGA CAA CGC CGC ACC TTG CGC CCC 279GCC GCA CTC GAA AAG GGT GGC CGC GTC CAC CGC GAC GGG CAC GAA CTG 327ATA GAT TTC TCC AGC AAC GAC TAT CTC GGC CTC GCC CGC CAC CCG CTG 375CTG ATC GAG CGC GCC CGC GCC TGG ACG GAA GCC CAC GGC ACC GGC TCC 423GGC GCC TCG CGA CTG GTG ACG GGA ACC AGC GCC ACC CAT CTC GCG ATC 471GAG GCC CGC ATC GCC CGG TTC AAG CAT GCC GAA GCC GCG CTG GTC TTC 519GCC AGC GGC TGG CAG GCC AAT GCC GCG GTG ATC CCC GCC CTG CTC GCC 567GCC GTA CCC GGT TCA GCA GTC TTC ACC GAC CGG CTG ATC CAT GCC TCG 615ATG CAC GCG GGC CTC GCG ATC TCG GGC ACC CGC CAG CAC CGC TTC CGC 663CAT AAC GAC CTC GAT CAT CTG GAG GAA CTG CTG GCG AGC AAG GGC GCC 711GAA GCC TCC GCC CGC CTG ATC CTC ACC GAG AGC GTG TTC TCG ATG GAC 759GGC GAC CGC GCC GAC ATT GCC CGC CTG GCC GAG ATC GCC GCC CGC CAC 807GAC GCA TTC CTG TTC GTG GAC GAA GCC CAT GCC ACC GGC GTG CTC GGC 855CCC GGC GGC GCG GGC CTC TCG GCG GAA GTG CCC GGC GGG ATC GAC CTC 903GTC ATG GGC ACC TTC AGC AAG GCG CTC GGC GGT TTC GGC GCC TAT GTC 951GCC GGG TCA CAA GTG ATG ATC GAC TAC CTC GTC AAC GCG GCG AGC GGC 999TTC ATC TTC ACC ACC GCC CCG CCG CCT GCC GTG CTG GGC GCC ATC GAC1047GCC GCG CTC GAC CTC GTG CCG GGC ATG GAT GCC GAG CGC GCC CAT CTT1095GCC GCG CTG GGT CAG CAG CTG CGC TCC GGC CTC GCC GCG CTC GGC ATC1143GAT CAC GGC GCA TCG AGC ACG CAG ATC GTC CCC GCC GTG ATC GGC GCG1191GAG GTC GCC GCG CTC GAC CTC TCC CGC AAG CTG GAA GAG CGC GGA CTG1239CTC GCT TCC GCG ATC CGC CCG CCC ACG GTG CCG CCC GGC ACC AGC CGC1287
CTG CGC CTG GCG CTG CGC GCG ACC CAT GCG CCA AGC GAT ATC GAT GCC1335CTG CTG AAC GCG ATC GAG GCC TGC CGG TGA AGCTGCTTTT CGCCCATGGC 1385TGGGGCTTCG ACCACACGTT CTG 1408SEQ ID NO6序列長度415序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCW7511序列描述Met Thr Ser Pro Val Trp His Pro Phe Thr Gln His Gly Leu Gly Glu5 10 15Pro Ile Pro Lys Val Ala Ser Ala Ser Gly Ala Val Leu Thr Thr Val20 25 30Asp Gly Arg Glu Val Ile Asp Ala Ile Ser Ser Trp Trp Val Thr Thr35 40 45His Gly His Asn His Pro Arg Ile Ser Ala Ala Ile Ala Glu Gln Ala50 55 60Gly Lys Leu Asp Gln Ile Ile Phe Ala Gly Trp Thr His Glu Pro Ala65 70 75 80Glu Glu Val Ala Ala Glu Leu Val Arg Ile Thr Pro Pro Lys Leu Thr85 90 95Arg Val Phe Phe Ser Asp Ser Gly Ser Thr Ala Val Glu Val Ala Leu100 105 110
Lys Met Ala Leu Gly Tyr Trp Leu His Arg Gly Glu Pro Arg His Arg115 120 125Ile Leu Val Leu Glu His Ser Tyr His Gly Asp Thr Ile Gly Ala Met130 135 140Ser Val Gly Ala Arg Gly Val Tyr Asn Gln Ala Tyr Ala Pro Leu Leu145 150 155 160Phe Asp Val Gly Thr Ile Pro Tyr Pro Thr Asp Ile Gln Ala Thr Leu165 170 175Asp Thr Leu Glu Ala Glu Cys Arg Ala Gly Ala Ala Ala Phe Ile Val180 185 190Glu Pro Leu Val Leu Gly Ala Gly Gly Met Leu Phe Tyr Ala Ala Glu195 200 205Thr Leu Ala Ala Met Arg Glu Ile Cys Ala Ala His Gly Val Leu Phe210 215 220Ile Ala Asp Glu Val Met Thr Gly Trp Gly Arg Thr Gly Thr Ile Phe225 230 235 240Ala Cys Asp Gln Ala Gly Val Val Pro Asp Ile Leu Cys Leu Ser Lys245 250 255Gly Leu Thr Gly Gly Ala Val Pro Leu Ala Val Thr Leu Ala Thr Glu260 265 270Ala Ile Phe Gln Ala His Trp Ser Glu Thr Asp Arg Ser Lys Gln Phe275 280 285Phe His Ser Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Pro Ile Ala Cys Ala Ala Ala290 295 300Ala Ala Asn Leu Ala Ile Trp Arg Glu Glu Pro Val Gln Ala Arg Ile305 310 315 320Asp Ala Leu Ala Glu Arg Gln Arg Ala His Leu Ala Thr Ile Ala Gly325 330 335
Arg Asp Ala Val Arg Asn Pro Arg Ala Leu Gly Thr Ile Ala Ala Phe340 345 350Glu Leu Gly Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Ser Asp Leu Gly Pro Arg Leu355 360 365Leu Ala His Phe Arg Glu Arg Asp Leu Leu Val Arg Pro Met Gly Asn370 375 380Ser Ile Tyr Val Met Pro Pro Tyr Ser Ile Thr Pro Glu Gln Leu Ala385 390 395 400Arg Ile Trp Gly Gly Ile Asp Glu Ala Ile Ala Arg Phe Gly Ser405 410 415SEQ ID NO7序列長度417序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物鞘氨醇單胞菌屬種類菌株SC42405序列描述Met Thr Ser Ser Val Trp His Pro Phe Thr Gln His Gly Leu Gln Glu5 10 15Pro Val Pro Leu Val Thr His Ala Glu Gly Ala Leu Leu His Thr Ala20 25 30Asp Gly Lys Ala Val Val Asp Ala Val Ser Ser Trp Trp Val Thr Thr35 40 45His Gly His Ser His Pro Arg Ile Lys Ala Ala Ile Ala Glu Gln Ala50 55 60
Gln Lys Leu Asp Gln Ile Ile Phe Ala Gly Trp Thr His Glu Pro Ala65 70 75 80Glu Gln Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Ile Met Pro Glu Ser Leu Thr85 90 95Arg Val phe Phe Ser Asp Ser Gly Ser Thr Ser Val Glu Val Ala Leu100 105 110Lys Met Ala Leu Gly Tyr Trp His Trp Arg Gly Glu Asn Arg His Arg115 120 125Ile Val Val Met Glu Asn Ser Tyr His Gly Asp Thr Ile Gly Ala Met130 135 140Ser Val Gly Glu Arg Gly Val Phe Asn Gln Pro Tyr Glu Pro Leu Leu145 150 155 160Phe Asp Val Gly Arg Ile Pro Phe Pro Ala Ala Gly Ala Glu Gln Ala165 170 175Thr Leu Asp Ala Leu Glu Ala Ile Cys Arg Gln Pro Asp Thr Ala Ala180 185 190Leu Ile Val Glu Pro Leu Ile Leu Gly Ala Gly Gly Met Leu Val Tyr195 200 205Ser Ser Glu Thr Leu Ala Ala Met Gln Ala Ile Cys Ala Arg His Gly210 215 220Val Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Met Thr Ala Trp Gly Arg Thr Gly225 230 235 240Thr Leu Leu Ala Cys Glu Gln Ala Ser Val Val Pro Asp Ile Leu Cys245 250 255Leu Ser Lys Gly Leu Thr Gly Gly Ala Val Pro Leu Ala Val Thr Met260 265 270Ala Ser Glu Ala Ile Phe Glu Ala His Tyr Ser Thr Asp Arg Ala Arg275 280285
Met Phe Phe His Ser Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Pro Ile Ala Cys Ala290 295 300Ala Ala Ala Ala Asn Leu Ala Ile Trp Arg Glu Glu Pro Val Leu Glu305 310 315 320Arg Ile Ala Ala Leu Ala Gly Lys Gln Ala Thr Trp Ile Glu Lys Leu325 330 335Gly Gln Phe Cys His Phe Asp Asn Pro Arg Thr Ile Gly Thr Ile Ala340 345 350Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Ser Gly Tyr Met Ser Asp Leu355 360 365Ala Pro Arg Leu Met Ala Phe Phe Arg Glu Arg Asp Val Leu Leu Arg370 375 380Pro Leu Gly Asn Thr Val Tyr Val Met Pro Pro Tyr Cys Ile Ser Asp385 390 395 400Asn Gln Leu Gly Gln Val Trp Glu Ala Val Gly Glu Ala Val Ile Ser405 410 415Phe417SEQ ID NO8序列長度1448序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS
位置1..1248決定特徵的方法S序列描述ATG ACC TCG CCG GTC TGG CAT CCC TTC ACC CAG CAT GGT CTG GGC GAG48CCG ATT CCT AAG GTG GCT TCC GCC TCT GGC GCG GTG CTG ACC ACC GTC96GAT GGC CGC GAG GTG ATC GAT GCC ATC TCT AGC TGG TGG GTG ACC ACG 144CAC GGG CAC AAC CAT CCC CGC ATC AGC GCC GCC ATC GCC GAG CAG GCA 192GGC AAG CTC GAC CAG ATC ATC TTC GCC GGC TGG ACC CAT GAG CCG GCC 240GAG GAG GTT GCC GCC GAG CTG GTA CGG ATC ACG CCG CCC AAG CTG ACG 288CGG GTG TTC TTT TCC GAT TCT GGT TCG ACG GCG GTC GAG GTC GCG CTG 336AAG ATG GCG CTG GGC TAC TGG CTC CAC CGG GGC GAG CCG CGC CAC CGC 384ATC CTC GTC CTC GAA CAC AGC TAT CAT GGC GAC ACG ATC GGC GCG ATG 432TCG GTC GGC GCG CGG GGG GTA TAC AAC CAG GCT TAT GCG CCG TTG CTG 480TTC GAT GTC GGC ACC ATC CCC TAT CCG ACC GAC ATA CAG GCG ACG CTC 528GAC ACG CTG GAG GCG GAG TGC CGG GCG GGC GCG GCG GCG TTC ATC GTC 576GAG CCG CTG GTG CTG GGG GCG GGG GGC ATG CTC TTC TAC GCC GCC GAA 624ACG CTG GCC GCG ATG CGT GAG ATA TGC GCG GCG CAT GGC GTG CTG TTC 672ATC GCT GAT GAG GTG ATG ACC GGA TGG GGG CGC ACC GGC ACG ATC TTC 720GCC TGT GAC CAG GCG GGC GTG GTC CCC GAT ATC CTC TGC CTG TCC AAG 768GGG CTG ACC GGC GGT GCG GTA CCG CTG GCG GTG ACA CTG GCG ACC GAG 816GCG ATC TTC CAG GCG CAC TGG TCG GAA ACC GAT CGG TCG AAG CAG TTC 864TTC CAC TCG TCC AGC TAC ACC GCC AAC CCG ATC GCC TGC GCG GCG GCG 912GCC GCC AAT CTG GCG ATC TGG CGC GAG GAG CCG GTG CAG GCG CGG ATC 960GAC GCG CTC GCC GAG CGG CAG CGG GCG CAT CTG GCG ACG ATC GCG GGG 1008CGG GAT GCG GTG CGA AAC CCG CGC GCG CTC GGC ACC ATC GCG GCG TTC 1056GAA CTG GGG GCG GGG CAG GAT TAT CTC TCC GAT CTG GGA CCC CGG TTG 1104
CTG GCC CAT TTC CGG GAG CGC GAT CTG CTC GTC CGG CCG ATG GGC AAT1152AGC ATC TAT GTC ATG CCG CCC TAT TCC ATT ACG CCC GAG CAA CTG GCG1200CGC ATT TGG GGC GGC ATC GAT GAG GCG ATT GCC CGC TTC GGG AGT1245TGA GACGGGCCGG GGCCTTTGAC TTTACGGCAT TTCATTTGCT TTATCCGGCG 1298ACGATCGAAA AGGGAGCGGG CATGGGCGTG GCGAAGACTG GGGCGATGGG GGCTCTGGCA 1358TCGGTGACGG CGCTGATGTG GGGCCTGGCC GCCACCGCGC AGACGACCCC GCCCGCCGCC 1418AACCCGGCCA CCCCGCCGCT GGGCCCGATC 1448SEQ ID NO9序列長度1459序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置1..1253決定特徵的方法S序列描述ATG ACG TCA TCG GTC TGG CAC CCC TTC ACC CAG CAC GGC CTG CAA GAG48CCG GTC CCG CTG GTC ACC CAT GCC GAG GGC GCG CTG CTC CAC ACG GCT96GAC GGC AAG GCA GTG GTG GAC GCG GTG TCC TCG TGG TGG GTG ACG ACC 144CAC GGC CAC TCC CAT CCG CGC ATC AAG GCC GCC ATC GCG GAG CAG GCG 192CAG AAG CTC GAC CAG ATC ATC TTC GCC GGA TGG ACC CAC GAA CCC GCC 240GAG CAA GTC GCA GCA GGC CTG CGC GCG ATC ATG CCG GAA AGC CTG ACG 288
CGG GTG TTC TTC TCC GAT TCG GGT TCG ACC AGC GTG GAA GTC GCG CTG336AAG ATG GCG CTC GGC TAC TGG CAC TGG CGC GGC GAG AAC CGC CAC CGC384ATC GTC GTG ATG GAA AAC TCC TAC CAC GGC GAC ACC ATC GGC GCG ATG432TCG GTG GGC GAG CGC GGC GTG TTC AAC CAG CCC TAC GAA CCG CTG CTG480TTC GAC GTG GGC CGC ATT CCC TTC CCC GCC GCC GGG GCC GAG CAG GCA528ACG CTG GAC GCA CTC GAA GCG ATC TGC CGC CAG CCG GAC ACC GCC GCG576CTG ATC GTC GAG CCG CTG ATC CTC GGC GCC GGC GGC ATG CTG GTC TAT624TCG TCC GAG ACG CTC GCC GCG ATG CAG GCG ATC TGC GCC CGC CAC GGC672GTG CTC TTC ATC GCC GAC GAA GTG ATG ACC GCC TGG GGC CGC ACC GGC720ACC CTC CTC GCC TGC GAA CAG GCA AGC GTG GTC CCG GAC ATC CTC TGC768CTC TCC AAG GGC CTG ACC GGC GGT GCC GTC CCG CTC GCT GTC ACG ATG816GCC AGC GAA GCG ATC TTC GAG GCG CAC TAC TCC ACC GAC CGC GCG CGG864ATG TTC TTC CAC TCC TCC AGC TAC ACC GCG AAC CCG ATC GCC TGC GCC912GCC GCC GCC GCC AAC CTG GCT ATC TGG CGC GAG GAA CCG GTG CTG GAA960CGC ATC GCC GCG CTG GCC GGG AAA CAG GCG ACG TGG ATC GAG AAG CTC 1008GGC CAG TTC TGC CAC TTC GAC AAT CCC CGC ACG ATC GGC ACC ATC GCC 1056GCG CTC GAC CTC AGG ACC TCA GGC ACC AGC GGC TAC ATG AGC GAC CTC 1104GCC CCG CGC CTG ATG GCG TTC TTC CGC GAG CGG GAC GTG CTG TTG CGG 1152CCG CTG GGG AAC ACC GTC TAC GTC ATG CCG CCT TAC TGC ATT TCC GAT 1200AAT CAG CTT GGG CAG GTT TGG GAG GCT GTC GGG GAA GCG GTG ATT TCG 1248TTT TAA GAACGATTTT AAGATGAAGG ATGAAGAGCA GGGGTCAAAA CCCCTGCACC1304CCATTACTGT CGAGGTCAGG TACGACCTAT CCGTCTTGCG CCCATGGCAG CGTCGGGAGG 1364CATATTGGCT GCGCCGCAAG GAGCGCACTA CGCATAGGGC GCGCGCGACG TCGACATTCC 1424GAGGGTCTGG GGGATCATCC CCCAGGACTT CTCCC1459SEQ ID NO10序列長度206序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCW7511序列描述Met Ser Ala Ile Ile Val Thr Gly Thr Asp Thr Glu Ile Gly Lys Thr5 10 15Val Phe Ser Ala Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Ala Ser Tyr Trp Lys20 25 30Pro Val Gln Ala Gly Thr Asp Glu Glu Gly His Gly Asp Ala Glu Thr35 40 45Val Ser Ala Leu Ser Gly Arg Pro Val Leu Pro Ser Ala Tyr Arg Leu50 55 60Lys Thr Pro Cys Ser Pro His Leu Ala Ala Glu Ile Asp Gly Val Thr65 70 75 80Ile Glu Ile Asp Arg Leu Val Leu Pro Gln Val Asp Gly Pro Leu Val85 90 95Ala Glu Gly Ala Gly Gly Val Leu Val Pro Val Thr Arg Gln Leu Leu100 105 110Phe Ala Asp Leu Phe Ala Arg Trp Gly Arg Pro Val Val Leu Val Ala115 120 125Arg Thr Gly Leu Gly Thr Ile Asn His Ser Leu Leu Ser Ile Glu Ala130 135 140Leu Arg Ala Arg Gly Val Asp Val Leu Gly Val Ala Phe Val Gly Asp145 150 155 160Ala Val Glu Asp Ser Glu Ala Thr Ile Ala Ala Ile Gly Gly Val Lys165 170 175
Arg Leu Gly Arg Leu Pro Arg Leu Ala Thr Leu Asn Arg Glu Thr Leu180 185 190Thr Glu Ala Phe Ala Ala His Phe Arg Ser Glu Asp Phe Arg195 200 205 206SEQ ID NO11序列長度209序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物鞘氨醇單胞菌屬種類菌株SC42405序列描述Met Arg Pro Leu Ile Val Thr Gly Thr Asp Thr Glu Ile Gly Lys Thr5 10 15Val Phe Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Leu Gly Ser His Tyr Trp Lys20 25 30Pro Val Gln Ala Gly Leu Glu Glu Asp Gly Gly Asp Gly Asp Arg Val35 40 45Ala Arg Leu Ser Gly Leu Pro Ala Ser His Ile Leu Pro Glu Ala Tyr50 55 60Arg Leu Ala Thr Pro Cys Ser Pro His Leu Ala Ala Glu Ile Asp Gly65 70 75 80Val Glu Ile Asp Pro Glu Arg Leu Ala Leu Pro Gln Val Asp Gly Pro85 90 95Leu Val Val Glu Gly Ala Gly Gly Val Met Val Pro Leu Thr Arg Thr100 105 110
Thr Thr Tyr Ala Asp Gln Phe Ala Arg Trp Asn Ala Pro Val Val Leu115 120 125Val Ala Arg Thr Met Leu Gly Thr Ile Asn His Ser Leu Leu Ser Ile130 135 140Glu Ala Leu Arg Ala Arg Gly Val Glu Val Leu Gly Val Ala Phe Val145 150 155 160Gly Asp Pro Met Glu Asp Ser Glu Ala Thr Ile Cys Ala Met Ala Asn165 170 175Val Arg Arg Leu Gly Arg Leu Pro Arg Leu Ala Ser Leu Thr Pro Glu180 185 190Asn Leu Ala Lys Ala Phe Ala Glu Asn Phe His Ile Gly Asp Phe Thr195 200 205Gln209SEQ ID NO12序列長度621序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS位置1..621決定特徵的方法S
序列描述ATG AGC GCC ATC ATC GTC ACC GGC ACT GAT ACC GAG ATC GGC AAG ACC48GTC TTC TCC GCC GCG CTG ACC GGC GCG TTG GGG GCG AGC TAT TGG AAG96CCG GTC CAG GCG GGA ACC GAC GAG GAA GGG CAT GGC GAT GCC GAG ACG 144GTG TCG GCC CTG AGC GGA CGT CCG GTC CTG CCC TCC GCC TAT CGG TTG 192AAG ACG CCC TGC TCG CCG CAT CTG GCC GCC GAG ATC GAC GGG GTG ACG 240ATC GAG ATC GAT CGG CTG GTG CTG CCG CAG GTG GAC GGG CCG CTG GTC 288GCC GAG GGG GCG GGC GGC GTG CTG GTG CCG GTG ACG CGG CAG TTG CTG 336TTC GCC GAT CTC TTC GCC CGC TGG GGC CGG CCG GTG GTG CTG GTC GCG 384CGG ACC GGG CTG GGG ACG ATC AAC CAC AGC CTG TTG TCG ATC GAG GCG 432TTG CGC GCG CGC GGC GTG GAC GTG CTG GGG GTC GCG TTC GTC GGT GAC 480GCA GTC GAG GAT AGC GAG GCC ACC ATC GCC GCG ATC GGC GGG GTG AAG 528CGA CTC GGC CGC CTG CCG CGT CTG GCC ACG CTA AAT CGC GAG ACA CTG 576ACC GAG GCG TTC GCG GCG CAT TTC CGG AGC GAG GAT TTC CGA TGA 621SEQ ID NO13序列長度627序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置1..627決定特徵的方法S
序列描述ATG AGA CCG CTT ATC GTC ACC GGA ACC GAT ACC GAG ATC GGC AAG ACC 48GTC TTC GCC GCC GCG CTC GCG GGC GCC CTC GGC TCA CAT TAC TGG AAG 96CCG GTG CAG GCA GGC CTC GAA GAA GAC GGC GGC GAC GGC GAC CGC GTG144GCG CGC CTC TCC GGC CTG CCT GCC AGC CAT ATT CTG CCC GAA GCC TAT192CGC CTC GCC ACC CCC TGC TCG CCG CAC CTC GCC GCC GAG ATC GAC GGG240GTG GAA ATC GAT CCC GAG CGC CTC GCC TTG CCG CAA GTG GAC GGT CCG288CTG GTG GTC GAA GGC GCA GGC GGC GTC ATG GTC CCG CTC ACC CGG ACC336ACG ACT TAT GCC GAC CAG TTC GCG CGG TGG AAC GCC CCG GTC GTG CTG384GTG GCG CGC ACG ATG CTC GGC ACG ATC AAC CAT TCG CTG CTC TCC ATC432GAG GCC CTG CGC GCG CGC GGC GTC GAA GTG CTG GGC GTG GCC TTC GTC480GGC GAT CCG ATG GAA GAC AGC GAG GCG ACG ATC TGC GCC ATG GCC AAT528GTC CGC CGC CTC GGC CGC CTG CCC CGC CTC GCC TCG CTG ACC CCG GAG576AAC CTC GCC AAG GCC TTC GCC GAA AAC TTC CAT ATC GGA GAT TTC ACG624CAA627SEQ ID NO14序列長度341序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCW7511序列描述Met Thr Thr Thr Pro Ala Leu Ser Ser Glu Ala Thr Pro Arg Thr Asp5 10 15
Trp Thr Arg Ala Glu Ile Ala Ala Leu Phe Asp Leu Pro Phe Thr Glu20 25 30Leu Leu Phe Arg Ala Ala Glu Val His Arg Ala His His Ala Ala Asp35 40 45Gln Val Gln Leu Ser Thr Leu Leu Ser Ile Lys Thr Gly Gly Cys Pro50 55 60Glu Asp Cys Gly Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Ala Asp Thr Gly Leu65 70 75 80Lys Ala Thr Lys Leu Met Asp Pro Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Ala85 90 95Gln Ala Lys Asp His Gly Ser Thr Arg Phe Cys Met Gly Ala Ala Trp100 105 110Arg Asn Pro Lys Asp Arg Asp Met Pro Ala Ile Val Glu Met Val Lys115 120 125Gly Val Arg Ala Met Gly Met Glu Thr Cys Met Thr Leu Gly Met Leu130 135 140Thr Asp Ala Gln Ala Gln Thr Leu Ala Glu Ala Gly Leu Asp Tyr Tyr145 150 155 160Asn His Asn Ile Asp Thr Ser Pro Glu Arg Tyr Gly Asp Val Ile Thr165 170 175Thr Arg Ser phe Gly Glu Arg Leu Glu Thr Leu Glu His Val Arg Asp180 185 190Ala Gly Ile Asn Val Cys Cys Gly Gly Ile Val Gly Met Gly Glu Thr195 200 205Arg Gly Asp Arg Val Gly Phe Ile His Ala Leu Ala Thr Leu Pro Val210 215 220His Pro Gly Ser Val Pro Val Asn Ala Leu Val Pro Val Lys Gly Thr225 230 235 240
Val Leu Gly Asp Met Leu Ala Asp Thr Pro Leu Ala Lys Ile Asp Asp245 250 255Ile Glu Phe Val Arg Thr Val Ala Val Ala Arg Ile Thr Met Pro His260 265 270Ser Met Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu Ser Met Ser Asp Ala Thr275 280 285Gln Ala Leu Cys Phe Leu Ala Gly Ala Asn Ser Ile Phe Thr Gly Asp290 295 300Lys Leu Leu Thr Ala Gly Asn Ala Gly Asp Asp Lys Asp Ala Ala Leu305 310 315 320Phe Ala Arg Leu Gly Leu Thr Pro Met Ala Ala Glu Cys Lys Val Glu325 330 335Leu Glu Ala Ala Glu340 341SEQ ID NO15序列長度352序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物鞘氨醇單胞菌屬種類菌株SC42405序列描述Met Thr Met Thr Asp Thr Pro Ala Ile Thr Ala Arg Thr Asp Trp Thr5 10 15Arg Glu Glu Ile Ala Ala Leu Phe Asp Leu Pro Phe Thr Glu Leu Val20 25 30
Phe Arg Ala Ala Glu Val His Arg Ala Ser His Pro His Asn Glu Val35 40 45Gln Leu Ser Thr Leu Leu Ser Ile Lys Thr Gly Gly Cys Val Glu Asp50 55 60Cys Gly Tyr Cys Ser Gln Ser Val Ser Ala Asn Ser Gly Val Lys Ala65 70 75 80Thr Lys Leu Met Glu Val Gln Gln Val Leu Gln Arg Ala Ala Gln Ala85 90 95Ala Asp Gln Gly Ser Thr Arg Phe Cys Met Gly Ala Ala Trp Arg Asn100 105 110Pro Lys Asp Arg Asp Met Pro Ala Ile Ile Glu Met Val Lys Gly Val115 120 125Arg Ala Met Gly Met Glu Thr Cys Met Thr Arg Gly Met Leu Thr Pro130 135 140Asp Gln Ala Asp Met Leu Ser Glu Ala Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His145 150 155 160Asn Ile Asp Thr Ser Pro Glu Arg Tyr Asp Gln Val Ile Thr Thr Arg165 170 175Thr Met Asp Asp Arg Leu Asp Thr Leu Ser Asn Val Arg Met Ala Gly180 185 190Ile Asn Val Cys Ser Gly Gly Ile Val Gly Met Gly Glu Thr Arg Ala195 200 205Asp Arg Val Gly phe Val His Thr Leu Ala Thr Leu Pro Asp His Pro210 215 220Gln Ser Val Pro Val Asn Ala Leu Val Pro Val Lys Gly Thr Val Leu225 230 235 240Gly Asp Met Leu Ala Asp Thr Pro Leu Ala Lys Ile Asp Asp Val Glu245 250 255
Phe Val Arg Thr Val Ala Val Ala Arg Ile Thr Met Pro Leu Ser Met260 265 270Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu Ser Met Ser Glu Met Thr Gln Ala275 280 285Met Cys Phe Met Ala Gly Ala Asn Ser Ile Phe Thr Gly Asp Lys Leu290 295 300Leu Thr Ala Pro Asn Ser Gly Asp Asp Asn Asp Ala Ala Met Phe Ala305 310 315 320Arg Leu Gly Ile Lys Pro Met Ala Ile Glu Leu Thr Pro Ala Gln Val325 330 335Glu Ala Gln Arg Met Pro Lys Gly Cys Ala Lys Leu Glu Ala Ala Glu340 345 350 352SEQ ID NO16序列長度1420序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS位置223..1248決定特徵的方法S序列描述GATCCCCGAG CTGATCGGCC ATCTGCGCGA GGCGGGCCGC GCGGATATCA AGGTCATCGC60
GGGTGGCGTT ATTCCCGCAC AGGACTATCA GGCACTCTAC GATGCCGGGG TACAGGCGAT 120TTTCGGTCCC GGCACCAATC TTGTGAAAGC GGCCGAGGAT GTGCTGAGGC TGCTGGGACA 180TAATATGCCG CCCGAGGCGG GCGAATGACA GGACGACACG TG ATG ACG ACG ACA 234CCC GCG CTG AGC TCC GAG GCG ACC CCG CGC ACC GAC TGG ACC CGC GCC 282GAG ATC GCC GCG CTG TTC GAC CTG CCC TTC ACC GAG CTG TTG TTC CGC 330GCG GCC GAG GTG CAC CGC GCG CAT CAC GCC GCC GAT CAG GTT CAG CTG 378TCG ACG CTG TTG TCG ATC AAG ACG GGC GGC TGC CCC GAG GAT TGC GGC 426TAT TGC AGC CAG TCG ACC CAT GCC GAT ACC GGG CTG AAG GCG ACC AAG 474CTG ATG GAC CCG CGC GCC GTG CTG CAG GCG GCG GCG CAG GCC AAG GAT 522CAC GGC TCG ACG CGC TTC TGC ATG GGC GCG GCC TGG CGC AAC CCC AAG 570GAT CGC GAC ATG CCC GCC ATC GTG GAG ATG GTG AAG GGC GTG CGC GCC 618ATG GGC ATG GAA ACC TGC ATG ACG CTG GGC ATG CTG ACC GAT GCA CAG 666GCG CAG ACG CTC GCC GAG GCG GGG CTG GAC TAT TAC AAT CAC AAT ATC 714GAC ACG TCG CCC GAG CGT TAT GGC GAC GTC ATC ACC ACG CGC AGC TTC 762GGC GAG CGG TTG GAG ACG TTG GAG CAT GTC CGC GAT GCC GGC ATC AAT 810GTA TGC TGT GGC GGT ATT GTC GGC ATG GGT GAG ACG CGC GGC GAC CGG 858GTC GGC TTC ATC CAT GCG CTT GCC ACC CTG CCG GTC CAT CCG GGC AGC 906GTG CCG GTG AAC GCG CTG GTG CCG GTC AAG GGC ACG GTA TTG GGC GAT 954ATG TTG GCC GAC ACG CCG CTG GCC AAG ATC GAC GAT ATC GAA TTC GTC1002CGC ACC GTC GCG GTT GCG CGC ATC ACC ATG CCG CAT TCG ATG GTC CGC1050CTG TCG GCG GGG CGC GAG AGC ATG TCG GAT GCC ACC CAG GCT TTG TGC1098TTC CTG GCG GGC GCG AAC TCG ATC TTC ACC GGC GAC AAG CTG CTG ACT1146GCG GGC AAT GCG GGC GAC GAC AAG GAC GCA GCG CTC TTC GCC CGG CTG1194GGG CTC ACG CCC ATG GCG GCG GAG TGC AAG GTG GAA TTG GAA GCG GCG1242GAG TAA ACAGGCTTCG CCGGTTGTCC CCGGCGAAAG CCGGAGCCCA GTTGCGGTGA 1298AGTAGGGGTG GTGCGCCACC CGAATGGCAT TCGACACGGA CCAACGACAT AATAGGAGAG 1358GTATCCCCGT GTTCCAGAAA ATCCTGATCG CCAATCGCGG GGAAATCGCG TGCCGGGTGA 1418TC 1420
SEQ ID NO17序列長度1358序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置152..1210決定特徵的方法S序列描述TGCTGCGCCT GCTCGGCCAC AACATGCCGC CGCTCGGTTC TTCGCTGGAA GCGGCGGAAT60AAGGATGGCC ACGCTGGATC GACGCCGCGC TTGCCCCTAT GACCGGGGTT TGGCCGCGCG 120TCATCCCGCG CGCAGACCGG CCGCCTGAGG A ATG ACT ATG ACT GAC ACC CCC 172GCC ATC ACT GCA CGT ACC GAC TGG ACC CGT GAG GAA ATC GCG GCG CTG 220TTC GAC CTG CCG TTC ACC GAA CTG GTG TTC CGC GCA GCC GAA GTC CAT 268CGC GCC AGC CAT CCG CAC AAC GAA GTG CAG CTT TCC ACG CTG CTT TCG 316ATC AAG ACC GGC GGC TGC GTG GAA GAC TGC GGC TAT TGC TCA CAG TCG 364GTT TCG GCC AAC AGC GGC GTC AAG GCG ACC AAG CTG ATG GAA GTG CAG 412CAG GTG CTG CAG CGC GCG GCG CAG GCG GCG GAT CAG GGC TCT ACC CGC 460TTC TGC ATG GGC GCC GCC TGG CGC AAC CCC AAG GAC CGC GAC ATG CCC 508GCC ATC ATC GAG ATG GTG AAG GGC GTG CGC GCC ATG GGC ATG GAA ACC 556TGC ATG ACG CGG GGC ATG CTG ACG CCC GAT CAG GCG GAC ATG CTC TCC 604GAA GCG GGT CTC GAT TAC TAC AAC CAC AAC ATC GAC ACC TCG CCC GAG 652CGT TAC GAT CAG GTG ATC ACC ACG CGC ACG ATG GAT GAC CGC CTC GAT 700
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Ile Glu Phe Val Arg Thr Val Ala Val Ala Arg Ile Thr Met Pro His260 265 270Ser Met Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu Ser Met Ser Asp Ala Thr275 280 285Gln Ala Leu Cys Phe Leu Ala Gly Ala Asn Ser Ile Phe Thr Gly Asp290 295 300Lys Leu Leu Thr Ala Gly Asn Ala Gly Asp Asp Lys Asp Ala Ala Leu305 310 315 320Phe Ala Arg Leu Gly Leu Thr Pro Met Ala Ala Glu Cys Lys Val Glu325 330 335Leu Glu Ala Ala Glu340 341SEQ ID NO19序列長度1336序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS位置151..1176決定特徵的方法S序列描述TCTAGAACAG GACTATCAGG CACTCTACGA TGCCGGGGTA CAGGCGATTT TCGGTCCCGG60
CACCAATCTT GTGAAAGCGG CCGAGGATGT GCTAAGGCTG CTGGGACATA ATATGCCGCC120CGAGGCGGGC GAATGACAGG ACGACACGTG ATG ACG ACG ACA CCC GCG CTG AGC 174TCC GAG GCG ACC CCG CGC ACC GAC TGG ACC CGC GCC GAG ATC GCC GCG 222CTG TTC GAC CTG CCC TTC ACC GAG CTG TTG TTC CGC GCG GCC GAG GTG 270CAC CGC GCG CAT CAC GCC GCC GAT CAG GTT CAG CTG TCG ACG CTG TTG 318TCG ATC AAG ACG GGC GGC TGC CCC GAG GAT TGC GGC TAT TGC AGC CAG 366TCG ACC CAT GCC GAT ACC GGG CTG AAG GCG ACC AAG CTG ATG GAC CCG 414CGC GCC GTG CTG CAG GCG GCG GCG CAG GCC AAG GAT CAC GGC TCG ACG 462CGC TTC TGC ATG GGC GCG GCC TGG CGC AAC CCC AAG GAT CGC GAC ATG 510CCC GCC ATC GTG GAG ATG GTG AAG GGC GTG CGC GCC ATG GGC ATG GAA 558ACC TGC ATG ACG CTG GGC ATG CTG ACC GAT GCA CAG GCG CAG ACG CTC 606GCC GAG GCG GGG CTG GAC TAT TAC AAT CAC AAT ATC GAC ACG TCG CCC 654GAG CGT TAT GGC GAC GTC ATC ACC ACG CGC AGC TTC GGC GAG CGG TTG 702GAG ACG TTG GAG CAT GTC CGC GAT GCC GGC ATC AAT GTA TGC TGT GGC 750GGT ATT GTC GGC ATG GGT GAG ACG CGC GGC GAC CGG GTC GGC TTC ATC 798CAT GCG CTT GCC ACC CTG CCG GTC CAT CCG GGC AGC GTG CCG GTG AAC 846GCG CTG GTG CTG GTC AAG GGC ACG GTA TTG GGC GAT ATG TTG GCC GAC 894ACG CCG CTG GCC AAG ATC GAC GAT ATC GAA TTC GTC CGC ACC GTC GCG 942GTT GCG CGC ATC ACC ATG CCG CAT TCG ATG GTC CGC CTG TCG GCG GGG 990CGC GAG AGC ATG TCG GAT GCC ACC CAG GCT TTG TGC TTC CTG GCG GGC 1038GCG AAC TCG ATC TTC ACC GGC GAC AAG CTG CTG ACT GCG GGC AAT GCG 1086GGC GAC GAC AAG GAC GCA GCG CTC TTC GCC CGG CTG GGG CTC ACG CCC 1134ATG GCG GCG GAG TGC AAG GTG GAA TTG GAA GCG GCG GAG TAA 1176ACAGGCTTCG CCGGTTGTCC CCGGCGAAAG CCGGAGCCCA GTTGCGGTGA AGTAGGGGTG 1236GTGCGCCACC CGAATGGCAT TCGACACGGA CCAACGACAT AATAGGAGAG GTATCCCCGT 1296GTTCCAGAAA ATCCTGATCG CCAATCGCGG GGAATCTAGA 1336
SEQ ID NO20序列長度283序列類型胺基酸拓撲結構線型分子類型蛋白質原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCW7511序列描述Met Ala Glu Asp Ser Pro Ser Arg Ala Arg Ile Ala Gln Ala Phe Asp5 10 15Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Ala Tyr Ala Val Val Gln Arg Gln Val Ala20 25 30Ala Trp Leu Ala Glu Arg Ile Val Ala Val Ala Pro Pro Arg Pro Arg35 40 45Val Leu Glu Val Gly Cys Gly Thr Gly Phe Leu Thr Gln Ala Ala Trp50 55 60Pro Arg Leu Asp Arg Pro Glu Trp Leu Met Thr Asp Ile Ala Pro Glu65 70 75 80Met Leu Ala Arg Gly Arg Ala Gln Met Pro Asp Leu Cys Ala Arg Val85 90 95Met Asp Gly Glu Arg Pro Asp Leu Ala Gly Glu Ala Pro Phe Asp Leu100 105 110Ile Val Ser Ser Leu Ala Val Gln Trp Phe Ser Asp Leu Glu Gly Gly115 120 125Leu Gln Arg Leu Ala Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Arg Met Leu Val130 135 140
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序列描述Met Asn Ala Pro Arg Glu Arg Val Ser Arg Ala Phe Ala Ala Ala Pro5 10 15Asp Tyr Asp Gly His Ala Arg Ile Gln Arg Glu Val Ala Gln Thr Leu20 25 30Ala Ala Arg Ile Ala Ala Leu Asp Leu Pro Pro Asn Pro Arg Val Leu35 40 45Glu Ile Gly Cys Gly Thr Gly Phe Leu Thr Gln Ala Leu Ala Gly Leu50 55 60Asp Gly Asp Trp Leu Val Thr Asp Leu Ala Pro Glu Met Leu Glu Arg65 70 75 80Cys Arg Ser Arg Leu Gly Glu Ser Ala Arg His Arg Phe Ala Val Leu85 90 95Asp Gly Glu Tyr Gly Ala Pro Asp Gly Ala Pro Phe Asp Leu Ile Cys100 105 110Ser Ser Leu Ala Val Gln Trp Phe Asp Asp Thr Pro Ala Ala Leu Ala115 120 125Arg Met Ala Gly Trp Leu Ala Pro Gly Gly His Leu Met Val Thr Thr130 135 140Leu Gly Pro Gly Ser Phe Ala Glu Trp Arg Ala Ala His Glu Ala Glu145 150 155 160Gly Leu Glu Pro Gly Thr Pro His Phe Ala Asp Ile Ala Ala Phe Gly165 170 175Asp Leu Val His Ala Val Glu His Pro Val Glu His His Ala Asp Pro180 185 190Leu Ala Phe Leu His Ala Leu Lys Ala Ile Gly Ala Gln Thr Ala Glu195 200 205
Ala Gly His Arg Pro Leu Ser Pro Gly Gln Leu Arg Arg Val Met Ala210 215 220Arg Phe Ala Gln Ser Gly Cys Pro Gln Asn Gly Cys Lys Val Thr Tyr225 230 235 240Glu Val Val Thr Cys His Leu His Arg Glu Ser Ser Leu Ser245 250 254SEQ ID NO22序列長度1582序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌菌株JCM7511特徵特徵鍵CDS位置489..1340決定特徵的方法S序列描述GATCTGGGTC GCGGCGCTGT TGGCGGCGTT GTTGCCGGTC GATCGGCTGG TCGCGCCCGA60TTGCGAGTCG GGCTGGTTCG ATCAGGTCGT GGTGCGCGGG GTGTCGCTGC CGCTCGTCAT 120GCTGTTGCGG ATCGTCGCGC ATTGGCTGGC CTTTGCGCCG CCGCTGATGC TGGCGGCGAT 180GGTCGCAGGC GGTTTGTTCG GGCTGGATGG CGCCGCGTTG GTGAGGGTCG AGACCGGATT 240GCTGCTCGGT ACGCCGGGGC TCGCCGCGCT GGCGGTGGCG ACGGGGGCGC TGACGGCGGG 300CTTGCGCGGT GCGGGAGCGG TGGCGGGGTT GCTGCTGTTA CCGCTCGCCC TGCCGCTGCT 360GATCGATCTT CGGGGCTAGC GATGACGGCA TGGGCGGGGC CAAGCTGCTC GCCGCCGTGT 420
CGCTGTTGCT GGTCGCGGGT GCGCCCTGGC TGGCGGCGGC GGCGATCCGG TCGGTGCGCG480ACTGAGCC ATG GCC GAA GAC AGT CCA TCG CGC GCG CGG ATC GCG CAG GCC 530TTT GAC GCG GCG GCG GCC TAT GAC GCC TAT GCG GTG GTG CAG CGC CAA 578GTG GCC GCG TGG CTA GCC GAA CGA ATC GTC GCG GTC GCC CCG CCG AGG 626CCC CGC GTG CTG GAG GTC GGG TGC GGC ACA GGC TTC CTG ACA CAG GCG 674GCA TGG CCC CGG CTT GAT CGC CCC GAA TGG TTG ATG ACC GAT ATC GCA 722CCC GAG ATG CTG GCC CGG GGC AGG GCG CAG ATG CCG GAT CTG TGT GCG 770CGG GTG ATG GAT GGC GAG CGC CCC GAT CTG GCG GGC GAA GCG CCG TTC 818GAC CTG ATC GTC AGC AGC CTG GCG GTG CAG TGG TTT TCC GAT CTG GAG 866GGC GGC CTG CAG CGG CTG GCG GCG CTG CTC GCC CCT GGC GGG CGG ATG 914CTG GTG ACG ACT CTG GCG CAA GGG ACA TTC GCC GGC TGG CAT GCC GCG 962CAT CGG GCG GAG GGA TAT GAG GCG GGG AGT CAC GCC TAT CCA ACG GTC 1010GAG GCG CTC GCG GCC ATG GCG TTG CCG GGG CTT GGG GTC GCC ACG CGA 1058CGC TTC GAG CAG CGG CAC GAG ACG GCG GCG GAC TTC ATG CGC GCA CTA 1106CGG GCG ATC GGG GCG GGG ACA CCG CGT GTT GGG CAC CGC CCG ATC CCG 1154CCG GGC GCG ATG CGG CGG ATC GCG AAG CGC TTT GAG GTA GGC GGG GCG 1202GTG GCG ACC TAT GAG GTC GCG TTG ATG GAC ATT CCC AAC CCC GTT CAG 1250CCT GAG CGA AGT CGA AGG CCA CGC GCG ACG CGA GAG GCG GGG CGT GTG 1298CTT CGA TTT CGC TCA GCA CGA ACG GAG GTT GGA GGT AAG TAG 1340GCTTGGGTTG GCGTTTATCG GCTCCACCGC GCCCAGATGG CCGTGGGCAG GATCAGCCCG 1400CGTGCTTCCT CGCGCACACC GAGTTCGCCG CATTCGACCT TGCCCGGCAG GTCGCCCATC 1460ACTTGGCGGA GCATCTCGCC GATCGCCAGC GCCGACATGC GCACCGCATA GACGGTCAGG 1520AACAGGAAGC GCGAATTCGC GTCGAGCAGC TTGCGGCAAT CGGCGATCAG GCCGGGCAGA 1580TC 1582SEQ ID NO23序列長度971序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405特徵特徵鍵CDS位置210..971決定特徵的方法S序列描述TTGCGCGATG AGGAGGCCAC CTTGCCCGCC GTCCCCATCA TCTCGCTTCA AGGCGCGCGC60GACCCGCTTC TGCCCGAAGC GATGCGCGCA CATGTCTTCC GGAACGCCGC CGTGCGCCGG 120ATCGAATGCG AGACCGGAGG GCACCTCCTC CCGCTCGAAG TGCCGGAATT CTGCGCGCAA 180GCCGTGCGCG ACATGATCGA GACGCTGGC ATG AAC GCC CCC CGC GAG CGC GTC 233AGC CGC GCC TTT GCC GCC GCG CCC GAC TAC GAC GGC CAT GCC CGC ATC 281CAG CGT GAG GTC GCA CAA ACA CTC GCC GCC CGG ATC GCC GCG CTC GAC 329CTG CCT CCA AAC CCG CGC GTG CTG GAG ATC GGC TGC GGC ACC GGT TTT 377CTC ACG CAG GCG CTG GCC GGG CTG GAT GGC GAC TGG CTC GTC ACC GAT 425CTT GCG CCC GAA ATG CTG GAG CGC TGT CGC AGC CGC CTG GGC GAA AGC 473GCC CGG CAC CGC TTT GCC GTG CTC GAT GGC GAA TAT GGC GCA CCG GAC 521GGC GCA CCG TTC GAC CTG ATC TGC TCC AGC CTC GCC GTG CAA TGG TTC 569GAC GAT ACC CCG GCC GCC CTC GCC CGC ATG GCA GGC TGG CTG GCA CCG 617GGC GGG CAC CTC ATG GTG ACG ACA CTC GGC CCC GGC AGC TTC GCC GAA 665TGG CGC GCC GCG CAT GAA GCG GAG GGG CTG GAA CCC GGC ACG CCC CAC 713TTC GCG GAC ATC GCC GCC TTC GGC GAC CTC GTC CAC GCG GTC GAG CAC 761CCC GTC GAG CAT CAC GCC GAT CCG CTG GCC TTC CTC CAC GCC CTC AAG 809GCC ATC GGC GCG CAG ACC GCC GAA GCC GGA CAC CGC CCC CTT TCC CCC 857
GGC CAG CTT CGC CGC GTC ATG GCA CGT TTC GCC CAA AGC GGA TGC CCC905CAA AAC GGA TGC AAA GTG ACT TAC GAA GTC GTG ACC TGC CAC CTA CAC953CGA GAA TCG AGC CTT TCA971SEQ ID NO24序列長度150序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物少動鞘氨醇單胞菌株JCM7511序列描述TCTAGAACAG GACTATCAGG CACTCTACGA TGCCGGGGTA CAGGCGATTT TCGGTCCCGG60CACCAATCTT GTGAAAGCGG CCGAGGATGT GCTAAGGCTG CTGGGACATA ATATGCCGCC 120CGAGGCGGGC GAATGACAGG ACGACACGTG150SEQ ID NO25序列長度201序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線型分子類型基因組DNA原始來源生物鞘氨醇單胞屬種類菌株SC42405
序列描述ACCGGAATGA CAGGCGGACA GCAGCAATAG GGCGGCAAGA GAGAGCGGCA GGGATCGCAT60CAGACGGGCA TCCTTCGGTT TTTCCTTTGC CGTTCCAACG CGCGAGGAAG GCGGCGGCTT 120CACGTCCCGC CGCGAAATCG ATGCCCCTCC CGGCCAGCCA AGCATTGTGC CGGACGCCCG 180CTTGCCATAC GGGCAGGGGC G20權利要求
1.一種DNA片段，該片段具有編碼SEQ ID NO6、7、10、11、14、15、18、20或21所示的胺基酸序列的蛋白質的基因，可獲自少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)或鞘氨醇單胞屬(Sphingomonas Sp.)微生物。
2.根據權利要求1所述的DNA片段，其中的基因選自於一組基因，這組基因由7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因、脫硫生物素合成酶基因和生物素合成酶基因，以及編碼具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應活性的酶的基因組成。
3.根據權利要求1所述的DNA片段，其中的基因是編碼7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶、並具有SEQ ID NO8或9所示鹼基序列的基因。
4.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO6所示胺基酸序列，並具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性。
5.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO7所示胺基酸序列，並具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性。
6.根據權利要求1所述的DNA片段，其中的基因是編碼脫硫生物素合成酶、並具有SEQ ID NO12或13所示鹼基序列的基因。
7.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQID NO10所示胺基酸序列，並具有脫硫生物素合成酶活性。
8.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO11所示胺基酸序列，並具有脫硫生物素合成酶活性。
9.根據權利要求1所述的DNA片段，其中的基因是編碼生物素合成酶、並具有SEQ ID NO16、17或19所示的鹼基序列的基因。
10.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO14所示胺基酸序列，並具有生物素全成酶活性。
11.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO15所示胺基酸序列，並具有生物素合成酶活性。
12.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO18所示胺基酸序列，並具有生物素合成酶活性。
13.根據權利要求1所述的DNA片段，其中的基因編碼具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性的酶，並具有SEQ ID NO22或23所示的鹼基序列。
14.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO20所示的胺基酸序列，並具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性。
15.具有編碼一種蛋白的基因的DNA片段，該蛋白具有如SEQ IDNO21所示的胺基酸序列，並具有催化生物素生物合成途徑中庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性。
16.權利要求1的DNA片段，其中所述片段具有基因的蛋白質編碼區。
17.根據權利要求16所述的DNA片段，其中的基因是7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因或生物素合成酶基因。
18.權利要求1的DNA片段，其中所述片段具有基因的基因表達調控區。
19.根據權利要求18所述的DNA片段，其中所述的基因是7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶基因，脫硫生物素合成酶基因或生物素合成酶基因。
20.DNA片段具有如SEQ ID NO24或25所述鹼基序列，可獲自少動鞘氨醇單胞菌或鞘氨醇單胞菌屬微生物。
21.根據權利要求1、2、3、6、9、12、16、17、18和19中任何一項所述的DNA片段，其中的微生物是少動鞘氨醇單胞菌JCM7511或鞘氨醇單胞菌屬種類SC42405。
22.包含根據權利要求1到21中任何一項所述的DNA片段的載體。
23.一種構建載體的方法，包括將根據權利要求1到21中任何一項所述的DNA片段插入能在宿主細胞中複製的載體。
24.根據權利要求23所述的載體，其中將基因表達調控區域連入蛋白編碼區的上遊。
25.含有至少一個導入宿主細胞的根據權利要求1到21中任何一項所述的DNA片段或根據權利要求22或24所述的載體的轉化子。
26.根據權利要求25所述的轉化子，其中的宿主細胞是微生物。
27.一種構建轉化子的方法，包括將根據權利要求22或24所述的載體導入宿主細胞。
28.由權利要求3到5的任何一項的DNA片段編碼的蛋白，該蛋白具有7，8-二氨基壬酸氨基轉移酶活性。
29.由權利要求6到8的任何一項的DNA片段編碼的蛋白，該蛋白具有脫硫生物素合成酶活性。
30.由權利要求9到12的任何一項的DNA片段編碼的蛋白，該蛋白具有生物素合成酶活性。
31.由權利要求13到15的任何一項的DNA片段編碼的蛋白，該蛋白具有在生物素生物合成途徑中催化庚二醯輔酶A上遊生物合成階段某一反應的活性。
全文摘要
含來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的在生物素生物合成中涉及的基因的DNA片段，包含該DNA片段的質粒，包含該質粒的生物素合成轉化子。提供了利用來自鞘氨醇單胞菌屬微生物的在生物素生物合成中涉及的基因，用基因工程方法培育生物素合成微生物的技術。
文檔編號C12N15/52GK1590546SQ200410063478
公開日2005年3月9日 申請日期1998年3月2日 優先權日1997年3月3日
發明者椋本藤夫, 西尾昌一, 秋丸仁朗, 光田賢 申請人:住友化學工業株式會社