一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌及其構建方法與應用的製作方法

2023-06-06 05:20:11 4

一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌及其構建方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌及其構建方法與應用，屬於基因工程【技術領域】。本發明所提供的基因工程菌是共表達乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS，同時過表達乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB。同時本發明還提供了基因工程菌的構建方法。本發明所提供的基因工程菌能夠以乙酸為原料合成甲羥戊酸，具有生產成本低，產量高的特點，適用於產業化推廣。
【專利說明】一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌及其構建方法與應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌及其構建方法與應用，屬於基因工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002]甲羥戊酸是生物體內生成異物烯焦磷酸(IPP)的中間代謝產物，是合成留醇、萜類、類異戊二烯的重要中間體，同時，在化工行業也有重要的用途。目前，甲羥戊酸合成主要有酶法合成、生物催化和化學催化相結合合成、化學合成等方法，但存在步驟繁瑣、收率過低或不適於產業化製備等問題。經微生物發酵合成甲羥戊酸，反應條件溫和，環境友好，可很好的解決以上問題。
[0003]目前生物法合成甲羥戊酸，主要以葡萄糖為碳源，經過糖酵解，產生丙酮酸；丙酮酸在丙酮酸脫氫酶系的作用下生成乙醯輔酶A ；乙醯輔酶A進入甲羥戊酸代謝途徑，在乙醯乙醯-輔酶A硫解酶，HMG-CoA合酶及HMG-CoA還原酶的催化劑下生成甲羥戊酸。研究者已經在大腸桿菌內過表達乙醯乙醯-輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因(mvaE)以及HMG-CoA合酶基因OwaS)，以葡萄糖為碳源進行發酵，最終甲羥戊酸產量能夠達到47g.^(Tabataet al., B1technology Letters 26, 1487-1491, 2004) ? 然而，由於葡萄糖成本較高，限制了生物法的廣泛應用，尋找更廉價的碳源，降低生物法製備甲羥戊酸的成本是現有技術亟待解決的問題。
[0004]乙酸作為一種價廉易得的可替代碳源，從工業廢液中回收乙酸，作為工程大腸桿菌的碳源，發酵生產甲羥戊酸，既可回收利用資源，又可減輕環境汙染，同時還能降低生產成本，具有廣闊的應用前景。乙酸在大腸桿菌體內的代謝途徑，有2種代謝方式，一是以由乙醯輔酶A合成酶(ACS)催化生成乙醯輔酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸轉乙醯酶(PTA)催化生成乙醯輔酶A (Alan J.Wolfe, Microb1l.Mol.B1l.Rev.2005，69 (I): 12-50)。但目前尚沒有利用乙酸發酵生成甲羥戊酸的菌株報導，以乙酸為原料生物合成甲羥戊酸是否可行尚無法確定。


【發明內容】

[0005]為解決以葡萄糖為原料生產甲羥戊酸成本過高的問題，本發明提供了一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌，所採取的技術方案如下:
[0006]本發明的目的之一在於提供一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌，該基因工程菌是共表達乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS,同時過表達乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB。
[0007]上述基因可來源於化學合成、擴增自微生物或擴增自重組質粒。
[0008]優選地，所述乙醯輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因meaB，來源於枯草芽孢杆囷、煙麴黴囷或大腸杆囷。
[0009]優選地，乙醯輔酶A合成酶基因acs來自大腸桿菌的，Gene ID =12933681 ;所述蘋果酸酶基因meaB，來自大腸桿菌的，Gene ID: 12931931。
[0010]本發明的另一目的在於提供了一種所述基因工程菌的構建方法，該方法的步驟如下:
[0011]I)獲得乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB ；
[0012]2)構建含有乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS的重組質粒；
[0013]3)構建含有乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB的重組質粒；
[0014]4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到宿主菌中，獲得基因工程菌。
[0015]所述方法中乙醯輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因meaB,來源於枯草芽孢杆囷、煙麴黴囷或大腸杆囷。
[0016]所述方法中所述乙醯輔酶A合成酶基因acs優選來源於大腸桿菌的，Gene ID:12933681 ;所述蘋果酸酶基因meaB優選來源於來自大腸桿菌的，Gene ID:12931931。
[0017]所述方法的具體步驟如下:
[0018]I)獲得乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB ；
[0019]所述乙醯輔酶A合成酶基因acs,優選來自大腸桿菌，Gene ID:12933681 ;所述蘋果酸酶基因meaB，優選來自大腸桿菌，Gene ID =12931931 ；
[0020]2)將步驟I)所得乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS克隆到質粒載體pACY-Duet上,構建重組質粒pACY-mvaE-mvaS ；
[0021]3)將步驟I)中所得的乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB克隆到質粒載體pCOLA-Duet上,構建重組質粒pCOLA-maeB-acs ；
[0022]4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到重組大腸桿菌。
[0023]本發明的另一目的在於提供一種利用所述基因工程菌生產甲羥戊酸的方法，該方法的步驟如下:
[0024]I)獲得乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB ；
[0025]所述乙醯輔酶A合成酶基因acs,來自大腸桿菌，Gene ID:12933681 ;所述蘋果酸酶基因meaB，來自大腸桿菌，Gene ID:12931931 ；
[0026]2)將步驟I)所得乙醯乙醯輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS克隆到質粒載體pACY-Duet上,構建重組質粒pACY-mvaE-mvaS ；
[0027]3)將步驟I)中所得的乙醯輔酶A合成酶基因asc和蘋果酸酶基因meaB克隆到質粒載體pCOLA-Duet上,構建重組質粒pCOLA-maeB-acs ；
[0028]4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到重組大腸桿菌；
[0029]5)將步驟4)所得的重組大腸桿菌按體積比1% -5%的接種量接種到乙酸培養基中發酵生產甲羥戊酸，發酵條件為:發酵溫度為30-37°C、pH 6-8和培養至0D_為0.6-0.8，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.1-1.0mmol.?Λ培養48小時。
[0030]所述應用中步驟5)所述乙酸培養基，每升含有6g乙酸、2g牛肉粉、Ig甜菜鹼、KH2P042.5g、(NH4) 2S043g、檸檬酸-H2O lg, KCl 1.86g、FeS04_7H20 80mg、MgS04_7H20 0.24g,用NaOH將pH回調至7.0。
[0031]本發明所提供的基因工程菌，用於發酵生產以甲羥戊酸為中間產物的代謝產品。
[0032]進一步，本發明還提供了一種以甲羥戊酸為中間產物，生產目的產物的方法。是在高產甲羥戊酸的基礎上，進一步利用甲羥戊酸發酵生產目的產物異戊二烯以及異戊二烯基單元合成的萜類化合物。
[0033]本發明有益效果:
[0034]1.本發明構建的大腸桿菌能夠轉化乙酸生成甲羥戊酸。
[0035]2.利用本發明方法以乙酸為碳源，甲羥戊酸的產量可達到lg/L以上，最高產率可達到35%，為理論產率的60%。
[0036]3.本發明不僅可以生產甲羥戊酸，本發明方法還可用於發酵生產以甲羥戊酸為中間產物的發酵產品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖lpCOLA-acs 質粒圖譜。
[0038]圖2pC0LA-maeB_acs 質粒圖譜。
[0039]圖3不同菌株甲羥戊酸產量、產率。
[0040]圖4甲羥戊酸發酵過程曲線。

【具體實施方式】
[0041]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0042]以下實施例所採用的分子生物學方法均為常規技術手段，而發酵生產甲羥戊酸或以甲羥戊酸為中間產物的目標產物的方法也均為普通發酵過程優化。
[0043]以下實施例所用試劑、材料和儀器，未經特殊說明，均為本領域常規試劑、材料和儀器，可從商業渠道獲取。
[0044]實施例1
[0045]乙醯輔酶A合成酶基因acs,蘋果酸酶基因maeB共表達載體的構建,具體過程如下:以寡核苷酸 5』-GCC CAT ATG ATG AGC CAA ATT CAC AAA C-3』和 5』-TAG AGA TCT TTACGA TGG CAT CGC G_3』為引物，以大腸桿菌基因組DNA為模版，採用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增出乙醯輔酶A合成酶基因acs，並在5』端和3』端分別引入Bgl II和NaeI酶切位點，然後用上述酶切位點將此基因克隆到pCOLA-Duet載體上，得到重組質粒pC0LA_acs (圖
1);以寡核苷酸5』-CCG GGA TCC ATG GAT GAC CAG TTA AAA CAA A-3』和 5』_TTG GAA TTCTTA CAG CGG TTG GGT TTG-3』為引物，以大腸桿菌基因組DNA為模版，採用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增出蘋果酸酶maeB，並在5』端和3』端分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，然後用上述酶切位點將此基因克隆到pCOLA-acs載體上，得到重組質粒pCOLA-maeB-acs (圖2)。
[0046]實施例2
[0047]合成甲羥戊酸的工程大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/pCOLA-maeB-acs/pYJMlI的製備，並用該菌株發酵轉化乙酸為甲羥戊酸，其具體過程如下:
[0048]採用鹼裂解法提取實施例1中構建得到的重組質粒pCOLA-maeB-acs與發明人所在實驗室已構建的重組質粒pYJMll (Jianming Yang et al., B1resourceTechnologyl04, 642-647，2012)，採用熱擊轉化法將5 μ I重組質粒至轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，然後取50 μ I轉化後的菌液塗布於含有34 μ g.mL—1氯黴素與50μ g.mL-1卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆，長出的菌落即為共表達乙醯輔酶A合成酶基因及蘋果酸酶基因的重組大腸桿菌菌株。挑取構建好的重組大腸桿菌單菌落，接種至LB液體培養基，370C、180rpm振蕩培養過夜，然後將菌液按體積比I %的接種量接種到添加34 μ g.mL—1氯黴素與50 μ g.mL—1卡那黴素的以乙酸為唯一碳源的培養基中，乙酸濃度為0.lmol/L，加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mmol.171，發酵48小時；將培養液進行離心，分離細胞和上清，採用液相色譜法檢測發酵液上清中的乙酸與甲羥戊酸含量，並以購買的乙酸與甲羥戊酸標準品作為對照。通過外標法計算得到，甲羥戊酸的產量可達到530mg/L，產率可達12%，產率為理論產率的20.7%。未過表達兩酶的菌株甲羥戊酸產量為280mg/L，產率為6.8%，結果如附圖3所不。
[0049]實施例3
[0050]用構建好的菌株BL21 (DE3)/pC0LA-maeB-acs/pYJMll發酵生成甲羥戊酸，其步驟如下:將培養好的發酵種子按5%的體積比接種到裝有2L發酵培養基的5L發酵罐中。培養溫度37°C，誘導前調整為32°C，溶氧控制在50%。當OD6tltl為1.0左右時，加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mmol.L'發酵過程通過自動流加氨水，硫酸將pH控制在7.0，補料為3M的乙酸以I %速率流加，每3h取樣測定0D，乙酸，甲羥戊酸。發酵48小時結束後，將樣品進行離心，分離細胞和上清，採用液相色譜法檢測發酵液上清中的乙酸與甲羥戊酸含量，並以購買的乙酸與甲羥戊酸標準品作為對照。通過外標法計算得到，結束髮酵時，甲羥戊酸的產量可達到1.06g/L，最高產率可達35%，為理論產率的60%。結果如附圖4所示。
[0051]雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種以乙酸為原料合成甲羥戊酸的基因工程菌，其特徵在於，是共表達乙醯輔酶八合成酶基因38(3、蘋果酸酶基因1116518、乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油和1116-00^合酶基因蕭必的基因工程菌。
2.權利要求1所述基因工程菌，其特徵在於，所述乙醯輔酶八合成酶基因和蘋果酸酶基因III冊8，來源於枯草芽孢桿菌、煙麴黴菌或大腸桿菌。
3.權利要求2所述基因工程菌，其特徵在於，所述乙醯輔酶八合成酶基因％8，來自大腸桿菌，(^611610:12931931。
4.一種權利要求1所述基因工程菌的構建方法，其特徵在於，步驟如下: 1)獲得乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油、八合酶基因蕭必、乙醯輔酶八合成酶基因￡180和蘋果酸酶基因1116&8 ； 2)構建含有乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油和冊(^-(?八合酶基因^88的重組質粒； 3)構建含有乙醯輔酶八合成酶基因￡180和蘋果酸酶基因1116218的重組質粒； 4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到宿主菌中，獲得基因工程菌。
5.權利要求4所述方法，其特徵在於，所述乙醯輔酶八合成酶基因和蘋果酸酶基因腕池，來源於枯草芽孢桿菌、煙麴黴菌或大腸桿菌。
6.權利要求4所述方法，其特徵在於，所述乙醯輔酶八合成酶基因％8，來自大腸桿菌，6611610:12931931。
7.權利要求4所述方法，其特徵在於，具體步驟如下: 1)獲得乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油、八合酶基因蕭必、乙醯輔酶八合成酶基因￡180和蘋果酸酶基因1116&8 ； 所述乙醯輔酶八合成酶基因，來自大腸桿菌，66116 10:12933681 ；所述蘋果酸酶基因 1116218，來自大腸桿菌，(^6116 10:12931931 ； 2)將步驟1)所得乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油和冊(^-(?八合酶基因蕭必克隆到質粒載體上，構建重組質粒？八； 3)將步驟1)中所得的乙醯輔酶八合成酶基因和蘋果酸酶基因III冊8克隆到質粒載體上，構建重組質粒胍68-狀8 ； 4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到大腸桿菌8121(023)中，得到重組大腸桿菌。
8.一種利用權利要求1所述基因工程菌生產甲羥戊酸的方法，其特徵在於，步驟如下: 1)獲得乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油、八合酶基因蕭必、乙醯輔酶八合成酶基因￡180和蘋果酸酶基因1116&8 ； 所述乙醯輔酶八合成酶基因，來自大腸桿菌，66116 10:12933681 ；所述蘋果酸酶基因 1116218，來自大腸桿菌，(^6116 10:12931931 ； 2)將步驟1)所得乙醯乙醯輔酶八硫解酶八還原酶基因蕭油和冊(^-(?八合酶基因蕭必克隆到質粒載體上，構建重組質粒？八； 3)將步驟1)中所得的乙醯輔酶八合成酶基因和蘋果酸酶基因III冊8克隆到質粒載體上，構建重組質粒胍68-狀8 ； 4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到大腸桿菌8121(023)中，得到重組大腸桿菌； 5)將步驟4)所得的重組大腸桿菌按體積比1% -5%的接種量接種到乙酸培養基中發酵生產甲羥戊酸，發酵條件為:發酵溫度為30-371、邱6-8和培養至006。。為0.6-0.8，加入誘導劑1？16至終濃度為0.1-1.0臟01.1—沁培養48小時。
9.權利要求8所述方法，其特徵在於，步驟5)所述乙酸培養基，每升含有叱乙酸、牛肉粉、18甜菜鹼、狃2？042丨58、(順丄⑷化、檸檬酸-只2018、1(011.868、？6304-7！！2080呢、18804-7^00.24。用制只將邱回調至7.0。
10.權利要求1所述基因工程菌，其特徵在於，用於發酵生產以甲羥戊酸為中間產物的代謝產品。
【文檔編號】C12P7/42GK104371967SQ201410636877
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】鹹漠, 徐鑫, 謝萌, 劉輝 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所