多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗及其製備方法

2023-06-06 07:42:06 3

專利名稱：多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗及其製備方法。
背景技術：
在過去的兩個世紀，沒有幾種傳染性病原體在全球的發病率和死亡率可與肺炎鏈 球菌相匹敵，每年導致全球1百萬5歲以下兒童死亡。肺炎鏈球菌仍然是社區獲得性肺炎 的主要原因，在成人中主要引起大葉性肺炎，在兒童中常引發細菌性肺炎、腦膜炎、中耳炎、 胸膜炎等疾病。在沒有抗生素之前，有70%以上因肺炎菌血症住院的病人死亡。嬰幼兒的 20% -48%的急性中耳炎和50%的化膿性中耳炎是由肺炎鏈球菌引起的，菌血症感染會引 起較高的死亡率。據估計肺炎鏈球菌性肺炎在成人的發病率每年為0. 1-0. 47%，病死率為 11%。我國肺炎發病率一直很高，近40多年來，其菌血症死亡率一直俳徊在25% 之 間，院外獲得性肺炎中肺炎鏈球菌性肺炎可達46% -76%。針對肺炎鏈球菌的感染，多年來 一直採用抗生素治療。但是現在耐藥菌株多達96%以上，且呈現多重耐藥性狀。因此發展 疫苗以預防該菌引起的疾病是十分重要的。已發現的肺炎鏈球菌有90多個血清型，是建立在莢膜抗原的微少差異及家兔 免疫器官對莢膜化學成份之間的微小差異加以識別，並產生對每種抗原的特異性抗體基 礎上來分型的。肺炎鏈球菌的莢膜抗原是迄今為止細菌性疫苗中抗原結構最複雜的，其 型特異性多糖是由許多重複結構單元組成的大分子聚合體，構成了一胸腺非依賴性抗原 (thymus-independent,Tl)的特性。莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)即是細菌 的毒性因子又是一種重要的保護性抗原。用化學方法純化細菌的莢膜多糖製備組分疫苗是20世紀疫苗發展的重要成就之 一，也是第二次疫苗革命的標誌之一。在世界範圍內廣泛使用的多糖疫苗如流行性腦膜炎 球菌A、C、Y、W135等4價多糖疫苗，肺炎^價多糖疫苗，傷寒Vi多糖疫苗等。大量臨床試 驗結果表明，接種多糖疫苗引起的副反應十分罕見，這些疫苗對於預防成人和大齡兒童的 相應感染方面效果顯著。令人遺憾的是多糖疫苗在年幼兒童中產生的抗體親合力低，對嬰 幼兒的效果有限或無效。將細菌莢膜多糖與蛋白載體通過化學方式結合可以解決這個缺 點，可將多糖胸腺不依賴性抗原轉變為胸腺依賴性抗原，從而啟動T輔助淋巴細胞產生一 系列的免疫增強效應，並產生免疫記憶應答；1987年B型流感嗜血桿菌(Hib)結合疫苗的 成功研製開創了結合疫苗發展史上的又一個立程碑，結合疫苗成為兒童疫苗研究中的一個 熱點。之後國際市場上陸續出現了 C群腦膜炎結合疫苗和7價、10價肺炎鏈球菌結合疫苗。 其它各類莢膜型或含脂多糖細菌的結合疫苗也陸續進入II、III期臨床研究。CTB為霍亂毒素的無毒亞單位，可以和大多數哺乳動物細胞膜上的神經結苷脂 (GMl)受體結合。CTB約為12kDa ；編碼基因(ctxB)長37^p，編碼IM個胺基酸，其中前21 個胺基酸為信號肽序列(Yamamoto et al.，1995)。CTB可作為免疫載體，因為其具有結合GMl的功能，可使與其融合的蛋白更易與消 化道黏膜作用，進而引起一系列生理生化反應，產生更強的免疫效果。CTB還可以作為某些外源多肽的穩定載體，當它與化學偶聯或基因融合的抗原同時進入體內之後，會激起融 合表位抗原的免疫原性，使機體產生強烈的免疫反應，有可能達到免疫保護作用(Gonzales et al.，1993)。CTB可作為良好的蛋白半抗原和弱抗原的載體，同時還可以賦予半抗原免疫原性， 增強弱抗原的免疫原性(Tochikubo et al.，1998 ；Wu et al.，1998)。儘管新型抗生素不斷問世，現代護理水平不斷提高，但由肺炎鏈球菌感染造成的 發病率和死亡率仍居高不下。發展中的肺炎鏈球菌結合疫苗能誘導功能增強的免疫應答， 並誘導免疫記憶和持久的免疫保護，為保護侵襲性肺炎鏈球菌在高危人群中的感染提供了 新的機會。

發明內容
本發明的目的是提供一種多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗及其製備方法和應用。本發明提供的結合疫苗，包含分離純化的23種血清型肺炎球菌的莢膜多糖和載 體蛋白的偶聯物，所述的23種血清型肺炎球菌的血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、 10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F 和 33F。本發明提供的多價疫苗，還可包括佐劑，其中，所述的佐劑為含鋁鹽佐劑，優選為 氫氧化鋁、硫酸鋁或磷酸鋁，其中所述的鋁鹽佐劑的含量(以鋁含量計)優選為0. 2mg/ml疫苗。其中，所述的莢膜多糖和載體蛋白的質量比為0.2 3 1。其中，所述的載體蛋白為白喉類毒素或霍亂毒素B亞單位，優選為霍亂毒素B亞單 位。本發明還提供純化肺炎球菌莢膜多糖的方法，包括1)向肺炎球菌培養物中加入脫氧膽酸鈉，進行殺菌；2)離心去菌體，收集上清；3)加入乙醇使其終濃度達到30 50%，離心去除核酸；4)加入乙醇使其終濃度達到60 80%，離心，收集沉澱；5)重新溶解沉澱，加入1-2倍體積的冷酚抽提數次，去除蛋白；6)加入乙醇使其終濃度達到60% 80%，離心，收集沉澱物，獲得純化的肺炎鏈 球菌多糖。本發明提供的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，其為噴霧劑型、液體劑型、凍幹劑 型、膠囊劑型、片劑和丸劑中的任何一種。本發明還提供製備所述的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，包括如下步驟分離 和純化 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F
和33F血清型肺炎球菌的莢膜多糖，將所述的莢膜多糖分別與載體蛋白進行共價偶聯獲得 單價偶聯物，將所述的單價偶聯物進行混合獲得多價結合疫苗。本發明提供的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，可應用於預防或治療肺炎球菌誘 發的疾病的藥物，其可通過皮膚、注射、口服、滴鼻或黏膜噴霧的方法進行免疫，優選的，可 採用滴鼻的方式進行免疫，從而減少患者免疫時的痛苦。本發明提供的多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，採用的23個肺炎球菌亞型，現有的7價肺炎結合疫苗，覆蓋更加廣泛。此外，本發明採用的化學偶聯方法溴化氰活化方法， 此方法結合率高，免疫原性好。本發明提供的不加入佐劑的23價肺炎結合疫苗成品也能達 到很好的免疫效果。本發明提供的23價結合疫苗使用CTB蛋白載體，使用滴鼻的免疫途徑， 減少患者免疫時的痛苦。


圖1為CTB離子交換層析譜圖。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1莢膜多糖製備分別選用1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、 20、22F、23F和33F亞型的肺炎球菌，從生產種子批中劃線挑取菌種，接種於5ml培養液中， 擴大到500ml培養液，再擴大到5L培養液。培養條件為本領域公知的肺炎球菌培養條件。當肺炎球菌的培養液OD6tltl > 1. 5時，向肺炎球菌培養物中加入重量體積比為1%。 的脫氧膽酸鈉，進行殺菌。離心去菌體，收集上清；加入乙醇使其終濃度達到40%，離心去除核酸；加入乙醇使其終濃度達到70%，離心，收集沉澱；重新溶解沉澱，加入2倍體積的冷酚抽提數次，去除蛋白；加入乙醇使其終濃度達到80%，離心，收集沉澱物，獲得純化的1、2、3、4、5、6B、 7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F 和 33F 亞型的肺炎球菌
莢膜多糖。實施例2霍亂弧菌B亞單位工程菌的構建1、根據NCBI公布的霍亂弧菌B亞單位編碼基因(GenBank登錄號EU8M477. 1)設 計引物，上遊引物 CTB-F =GATAT AGATCT ATGATTAAATTAAAATTTG (SEQ ID No. 1)，下遊引 ^ CTB-R =CCG CTCGAG TTAATTTGCCATACTAATTGC (SEQ ID No. 2)；2、以霍亂弧菌01菌株V. cholerae 569B (購自中國醫學細菌保藏管理中心)基因 組DNA為模板，經PCR擴增獲得37^p的霍亂弧菌B亞單位的編碼基因片段；3、將該目的基因片段用Bgl II和B10 I進行雙酶切，與用相同核酸內切酶酶切的 表達載體pET-22b進行連接，導入宿主細胞E. coli BL21 (DE3)，經篩選得到高效分泌表達 霍亂毒素B亞單位的工程菌株，命名為E. coli MHCTB03 ；4、按照「生物製品生產檢定用菌毒種管理規程」的要求，進行霍亂毒素B單位表達 菌株三級菌種庫的建立。實施例3霍亂B亞單位製備霍亂B亞單位的製備分為幾個階段種子液製備、大罐培養、離心、濃縮純化、過濾 除菌和低溫保存。先將實施例2製備的工作種子批菌種接種於含終濃度為50 μ g/mL氨苄青黴素的 新鮮LB液體培養基，32°C培養過夜製備種子液，供發酵罐接種用，發酵培養可選擇適宜大腸桿菌生長的培養基。在發酵罐中，當細菌生長到0D_ = 20時，加入終濃度為0. 2mmol/L 的IPTG誘導，繼續培養6 他後，停止培養，調節發酵液pH至6. 5,8000rpm, 4°C連續離心， 收集上清液，不大於IOkD的超濾膜濃縮CTB溶液、離子交換層析純化，用含2mol/L NaCl的 Tris緩衝液洗脫目標蛋白，在^Onm波長下檢測層析峰，收集26min左右的目標峰(圖1)， 得到CTB溶液。純化後的CTB溶液進行除菌過濾，分裝於大瓶中，於2 8°C保存。實施例4多糖偶聯蛋白(澳化氰活化、碳二亞胺結合法)將實施例1 製備的 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、 19F、19A、20、22F、23F或33F亞型的莢膜多糖以質量比1 1，在pHIO 11之間活化1小 時，調pH8 9之間，加入0. IM己二醯胼反應10分鐘後4°C靜置過夜。第2天用100KD的 膜包超濾換液，衍生後的多糖與載體蛋白CTB按質量比1 1混合，調pH5 6加入碳二亞 胺反應5小時，經4FF瓊脂糖凝膠柱純化樣品，收外水附近的峰。實施例5多糖偶聯蛋白(碘酸鈉活化、硼氰氫化鈉)將實施例1 製備的 12卩、14、158、17 、18(、19 、19六、20、22 、23 或33 亞型的莢膜 多糖中加入高碘酸鈉氧化，(多糖與高碘酸鈉之比為IM 1.6M)，檢測醛基，分子量大小和 糖含量，再加入白喉類毒素和硼氰氫化鈉(多糖與硼氰氫化鈉之比IM 1.6M)，反應得多 糖-蛋白結合物。採用100KD的超濾器純化，以去除殘留的，硼氰氫化鈉，得到初步純化的偶聯物。實施例6多價莢膜多糖結合疫苗的製備將實施例4 製備的 1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、 19A、20、22F、23F、33F各型單價結合物按4 μ g/ml,6B單價結合物8 μ g/ml混合後組成23價 肺炎多糖結合疫苗。實施例7多價莢膜多糖結合疫苗的製備將實施例4 製備的 1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、 19八、20、22 、23 、33 各型單價結合物按4 48/1111，68單價結合物8 μ g/ml混合加入磷酸鋁 佐劑組成23價肺炎多糖結合疫苗，其中鋁含量為0. 2mg/ml疫苗。實施例8多價莢膜多糖結合疫苗的製備將實施例4 製備的 1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、 19八、20、22 、23 、33 各型單價結合物按41^/1111，68單價結合物8 μ g/ml混合後低溫真空 乾燥組成23價凍幹肺炎多糖結合疫苗。實驗例1根據實施例6配製結合疫苗，免疫12_14g的小鼠，免疫3次於第1、14、觀天滴鼻 免疫，40天經眼眶後靜脈採血，以ELISA法測定肺炎抗體。免疫組分別1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、 20、22卩、23卩、33 各型單價結合物、1、2、3、4、5、68、7卩、8、抓、911(^、1認、12卩、14、158、17卩、 18C、19F、19A、20、22F、23F、33F各型莢膜多糖、混合後的23價結合疫苗、陰性生理鹽水組。 各型單價疫苗、各型多糖、多價結合疫苗和陰性生理鹽水均試驗15隻上述的小鼠。每次免 疫時，1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F# 型單價結合物為 2μ g，6B 單價結合物 4μ g ；1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、 17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F各型莢膜多糖為2 μ g，6B莢膜多糖4μ g ；結合疫苗中，1、2、3、4、5、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F 各型單 價結合物為2 μ g，6B單價結合物4 μ g。結果表明，經23個型肺炎莢膜多糖三次免疫後，小鼠血清IgG的濃度(0D值)與 生理鹽水組無顯著差異(P>0.(^)；各型多糖蛋白結合物和23價肺炎球菌結合疫苗免疫 的小鼠，第二次和第三次採血的血清IgG的濃度(0D值)比第一次採血的血清IgG的濃度 (0D值)顯著提高(P 0.05)。說明含佐劑23價肺炎結合 疫苗也有很好的免疫原性，並且有明顯的免疫記憶。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，其特徵在於，包含分離純化的23種血清型肺 炎球菌的莢膜多糖和載體蛋白的偶聯物，所述的23種血清型肺炎球菌的血清型為1、2、3、 4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F 和 33F。
2.根據權利要求1所述的結合疫苗，其特徵在於，還包括佐劑，所述的佐劑為含鋁鹽佐劑。
3.根據權利要求2所述的結合疫苗，其特徵在於，所述的莢膜多糖和載體蛋白的質量 比為0. 2 3 1。
4.根據權利要求3所述的結合疫苗，其特徵在於，所述的載體蛋白為白喉類毒素或霍 亂毒素B亞單位。
5.根據權利要求4所述的結合疫苗，其特徵在於，所述的載體蛋白為霍亂毒素B亞單位。
6.根據權利要求1所述的結合疫苗，其特徵在於，所述的肺炎球菌的莢膜多糖按如下 方式進行純化1)向肺炎球菌培養物中加入脫氧膽酸鈉，進行殺菌；2)離心去菌體，收集上清；3)加入乙醇使其終濃度達到30 50%，離心去除核酸；4)加入乙醇使其終濃度達到60 80%，離心，收集沉澱；5)重新溶解沉澱，加入1-2倍體積的冷酚抽提數次，去除蛋白；6)加入乙醇使其終濃度達到60% 80%，離心，收集沉澱物，獲得純化的肺炎鏈球菌多糖。
7.根據權利要求1所述的結合疫苗，其特徵在於，該疫苗為噴霧劑型、液體劑型、凍幹 劑型、膠囊劑型、片劑和丸劑中的任何一種。
8.製備權利要求1 7任一項所述的結合疫苗的方法，其特徵在於，包括如下步驟分 離和純化 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F 和33F血清型肺炎球菌的莢膜多糖，將所述的莢膜多糖分別與載體蛋白進行共價偶聯獲得 單價偶聯物，將所述的單價偶聯物進行混合獲得多價結合疫苗。
9.權利要求1 7任一項所述的結合疫苗在預防或治療肺炎球菌誘發的疾病的藥物中 的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於，通過下述方式進行免疫皮膚、注射、口 服、滴鼻或黏膜噴霧。
全文摘要
本發明公開了一種多價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，包含分離純化的23種血清型肺炎球菌的莢膜多糖和載體蛋白的偶聯物，所述的23中血清型肺炎球菌的血清型為1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F。本發明提供的結合疫苗可以刺激受體產生免疫應答，從而對於產生莢膜多糖成分的同類肺炎球菌病原體產生保護。本發明提供的採用的23價肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗，與現有技術相比，覆蓋更加廣泛，免疫效果更好。
文檔編號A61K47/48GK102068690SQ20101062406
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者任濤, 何佳琦, 唐秀麗, 張明華, 張美香, 曹欣, 王婷婷, 胡鵬, 郝倩, 韓菲, 魏文進 申請人:北京民海生物科技有限公司