雙色單光子橫向超分辨成像的裝置的製作方法

2023-06-05 23:20:01 1

專利名稱：雙色單光子橫向超分辨成像的裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型與生物醫學有關，涉及雙色單光子螢光成像，特別是一種雙色單光子
橫向超分辨成像的裝置，以適用於醫學生物組織的檢測。
背景技術：
長期以來，遠場光學螢光顯微鏡憑藉其非接觸、無損傷、可探測樣品內部等優點， 一直是生命科學中最常用的觀測工具。但由於衍射極限的存在，使傳統的寬場光學顯微鏡 橫向解析度僅約為200nm。為了揭示細胞內分子尺度的動態和結構特徵，提高光學顯微鏡 解析度成為生命科學發展的迫切要求。在遠場螢光顯微鏡的基礎上，科學家們已經發展出 一些實用的提高解析度甚至超越解析度極限的成像技術。例如，採用橫向結構光照明，提高 橫向解析度到約100nm，這種技術需要複雜的解碼處理，耗費時間。受激螢光損耗顯微鏡利 用非線性效應實現了 30-50nm的三維解析度。應用螢光分子之間能量轉移共振原理以及單 螢光分子定位技術也可以突破衍射極限，但這些技術往往需要非常苛刻的條件和昂貴的設 備，過程也十分複雜。 近年來，光敏螢光蛋白作為一類新的螢光探針分子吸引了科研工作者們的廣泛關 注，這類螢光蛋白與普通螢光蛋白最大的不同之處是通過一束特定波長的光敏化之後，才 能夠被激發發射螢光，或者極大地增強原有的螢光，直至漂白。換言之，光敏螢光蛋白需要 兩種不同波長的光共同作用才能激發螢光(參見George H.Patterson et al. ， Science, vol. 297， 1873-1877， 2000)。如今，這種螢光分子被應用於細胞內物質追蹤等領域的研究。 在光敏螢光蛋白中，有一種非常特殊的螢光蛋白稱為可逆光敏螢光蛋白，這種可逆敏化蛋 白相對於一般光敏螢光蛋白的獨特性質表現在漂白之後可以通過一束恢復光使螢光蛋白 重新恢復到可激發態。例如Dronpa，KFPl (kindling fluorescent protein—1)(以上兩種 可逆螢光蛋白暫無中文名稱，市場上有商品)等。以下具體以Dro即a為例，它在405nm光照 射下敏化，488nm照射下激發螢光，進入暫時的漂白，接著再次用405nm光照射，Dronpa將再 次從漂白中恢復，敏化_激發_漂白_恢復這一循環可重複達上百次(參見Ryoko Andoet al. ， Science, vol. 306， 1370-1373， 2004)。在敏化光光強不太大的情況下，螢光強度與敏 化光強度近似呈線性關係(參見Peter Dedecker et al. ， BiophysicalLetters， vol. 91， 45-47,2006)。不難發現，Dronpa的敏化激發過程雖然需要兩種波長的光，但直接激發螢光 的只是其中一種波長的光，即488nm激發光，因此實質上是一種雙色單光子的線性過程，相 對於雙色雙光子非線性吸收過程效率有極大的提高。另外由於Dronpa敏化前無法激發熒 光，可以有效抑制敏化光和激發光非重疊區域的背景噪聲，可反覆激發的特性使得它可能 用於掃描成像。

發明內容本實用新型要解決的技術問題在於克服上述現有技術對生物組織橫向解析度不 足的問題，提供了一種雙色單光子橫向超分辨成像的裝置，該發明可提高生物組織中成像
3的橫向解析度。 本實用新型技術解決方案如下 —種雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特點是該裝置包括照明部分、探測收 集部分和掃描部分 照明部分包括敏化光源，沿該敏化光源輸出的敏化光束方向依次是敏化衰減片、 敏化準直系統和敏化雙色鏡，該敏化雙色鏡與所述敏化光源輸出的敏化光束成45。放置； 激發光源，沿該激發光源輸出激發光束方向依次是快門、激發衰減片、激發準直系統和激發 雙色鏡，該激發雙色鏡與所述激發光源輸出的激發光束成45。放置；所述的敏化雙色鏡與 所述的激發雙色鏡平行放置；所述的敏化光束和激發光束分別經過所述的敏化雙色鏡和激 發雙色鏡反射後平行出射，光斑寬度略小於物鏡後表面的寬度，平行出射的敏化光束和激 發光束經所述的物鏡聚焦後的點擴散函數重疊，中心相距L，照明所述的被可逆光敏螢光蛋 白分子標記的樣品； 探測收集部分由陷波濾光片、長通濾光片、聚焦透鏡、小孔光闌、雪崩二極體和計 算機組成，沿著經樣品發射的螢光方向，在激發雙色鏡的後，依次設置所述的陷波濾光片、 長通濾光片、聚焦透鏡、小孔光闌和雪崩二極體，所述的小孔光闌置於所述的聚焦透鏡的焦 平面，中心對準焦點，所述的雪崩二極體接收螢光信號後輸入計算機； 掃描部分包括供放置所述的被可逆光敏螢光蛋白分子標記的樣品的三維平移臺， 所述的計算機驅動並控制所述的三維平移臺的移動和所述的快門的開合，以實現對可逆光 敏螢光蛋白分子標記的樣品的掃描。 在所述的敏化準直系統和敏化雙色鏡之間還有敏化光瞳濾波器，在所述的激發準 直系統和激發雙色鏡之間還有激發光瞳濾波器。 所述的敏化光源輸出光束的波長為405nm，所述的激發光源輸出光束的波長為 488nm。 所述的敏化雙色鏡是對波長為405nm的光束高反，波長為488_550nm的光束高透 的雙色鏡。 所述的激發雙色鏡是對波長為488nm的光束高反，波長為500-550nm的光束高透 的雙色鏡。 所述的敏化光瞳濾波器和所述的激發光瞳濾波器為三區位相型光瞳濾波器，由內
向外三區位相依次為o、 Ji 、0，歸一化半徑依次為o. 12 : o. 6 : i。 所述的陷波濾光片是對波長為488nm的光束高反，其它波長的光束高透的濾光 片。 所述的長通濾光片是對波長為500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的 濾光片。 本實用新型的技術效果 所述的敏化光束和激發光束充滿物鏡後表面，充分利用物鏡的數值孔徑。 根據可逆光敏蛋白僅在所述的敏化光束和激發光束共同照明的區域才會被敏化
並激發螢光的特性，具有較高的信噪比。 本實用新型是雙色單光子激發的線性過程，具有很高的螢光激發效率。 本實用新型僅使用一個物鏡同時照明樣品 採集螢光信號，兩束光的強度可獨立控制，操作方便。
圖1為本實用新型雙色單光子螢光成像裝置具體實施例的光路原理圖；其中1為敏化光源(405nm) ， 2為激發光源(488nm) ， 3為物鏡，4為可逆光敏螢光
蛋白標記的樣品，5為敏化衰減片，6為敏化準直系統，7為敏化光瞳，8為敏化雙色鏡，9為快
門，10為激發衰減片，11為激發擴束系統，12為激發光瞳，13為激發雙色鏡，14為陷波濾光
片，15為長通濾光片，16為聚焦透鏡，17為小孔光闌，18為雪崩二極體，19為計算機，20為
三維平移臺。 圖2為螢光光強隨敏化光光強的變化示意圖。 其中曲線a、 b、 c分別對應在激發光在120kW/cm2、135kW/cm2、160kW/cm2時的情 形，分別對激發光在120kW/cm2、 135kW/cm2、 160kW/cm2時敏化光光強較低的部分進行線性 擬合。 圖3為三區位相型光瞳濾波器示意圖。 由內向外A、 B、 C三區同心，位相依次為0、 Ji 、0，歸 一 化半徑依次為
o. 12 : o. 6 : i。 圖4為488nm激發光點擴散函數。 圖5為雙束光同軸傳播，敏化光和激發光點擴散函數乘積，即此時的等效點擴散 函數。 圖6為雙束光平行非同軸傳播，且焦平面x軸向L = 220nm時，敏化光和激發光點 擴散函數乘積，即此時的等效點擴散函數。 圖7為兩束光都經過光瞳濾波器，平行非同軸傳播，且焦平面x軸向L = 1010nm 時，敏化光和激發光點擴散函數乘積，即此時的等效點擴散函數。
具體實施方式下面結合實施例和附圖對本實用新型作進一步說明，但不應以此限制本實用新型 的保護範圍。 首先請參閱圖1，圖1為本實用新型雙色單光子螢光成像裝置具體實施例的光路 原理圖，由圖可見，本實用新型雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，該裝置包括照明部分、 探測收集部分和掃描部分 照明部分包括敏化光源l，波長為A p沿該敏化光源1輸出的敏化光束方向依次 是敏化衰減片5、敏化準直系統6、敏化光瞳濾波器7和敏化雙色鏡8，該敏化雙色鏡8與所 述的敏化光源1輸出的敏化光束成45。放置；激發光源2，波長為入2，沿該激發光源2輸出 激發光束方向依次是快門9、激發衰減片10、激發準直系統11、激發光瞳濾波器12和激發雙 色鏡13，該激發雙色鏡13與所述激發光源2輸出的激發光束成45。放置；所述的敏化雙色 鏡8與所述的激發雙色鏡13平行放置；所述的敏化光束和激發光束分別經過敏化雙色鏡8 和激發雙色鏡13反射後平行出射，光斑寬度略小於物鏡3後表面的寬度，平行出射的敏化 光束和激發光束經所述的物鏡3聚焦後的點擴散函數重疊，中心相距L，照明所述的被可逆 光敏螢光蛋白分子標記的樣品4 ;[0035] 探測收集部分由陷波濾光片14、長通濾光片15、聚焦透鏡16、小孔光闌17、雪崩二 極管18和計算機19組成，沿著經所述的樣品4發射的螢光方向，在激發雙色鏡13的後，依 次設置所述的陷波濾光片14、長通濾光片15、聚焦透鏡16、小孔光闌17和雪崩二極體18， 所述的小孔光闌17置於所述的聚焦透鏡16的焦平面，中心對準焦點，所述的雪崩二極體18 接收螢光信號後輸入計算機19 ; 掃描部分包括供放置所述的被可逆光敏螢光蛋白分子標記的樣品4的三維平移 臺20，所述的計算機19驅動並控制所述的三維平移臺20的移動和所述的快門9的開合，以 實現對可逆光敏螢光蛋白分子標記的樣品4的掃描。 本實施例中，所述的可逆光敏螢光蛋白為Dronpa，因此，相應的所述的敏化光源1 輸出光束的波長A工為405nm，所述的激發光源2輸出光束的波長A 2為488nm。所述的敏 化雙色鏡8是對波長為405nm的光束高反，波長為488_550nm的光束高透的雙色鏡。所述 的激發雙色鏡13是對波長為488nm的光束高反，波長為500-550nm的光束高透的雙色鏡。 所述的敏化光瞳濾波器7和所述的激發光瞳濾波器12為三區位相型光瞳濾波器，由內向外 A、B、C三區位相依次為0、 Ji 、0，歸一化半徑依次為0. 12 : 0.6 : 1。所述的陷波濾光片14 是對波長為488nm的光束高反，其它波長的光束高透的濾光片。所述的長通濾光片15是對 波長為500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的濾光片。 基本工作過程如下所述 通過敏化衰減片5和激發衰減片9分別控制405nm敏化光和488nm激發光光強，再 分別通過敏化準直系統6和激發準直系統10將兩束光調節為平行光出射，且使光斑半徑其 略小於物鏡後表面半徑以充分利用物鏡的數值孔徑；接著兩束光分別經敏化雙色鏡8和激 發雙色鏡13反射進入物鏡3聚焦敏化螢光蛋白分子並激發螢光。為了說明本方法解析度提 高的程度，以普通螢光蛋白標記樣品時的解析度為參照依據。普通螢光蛋白標記的樣品時， 其解析度由激發光在物鏡3焦平面的點擴散函數的半高全寬決定，當激發光波長為488nm、 物鏡數值孔徑為1. 4時，解析度約為180nm，如圖4所示。採用可逆光敏螢光蛋白Dro即a標 記樣品4時，可逆光敏螢光蛋白僅在405nm敏化光和488nm激發光共同作用的區域被激發 螢光，由圖2可知，在敏化光強度不太高的情況下，螢光強度與敏化光強呈線性關係。此時， 可以認為有效點擴散函數PSFrff近似等于敏化光與激發光點擴散函數PSFa。t和PSF_的乘 積，即 PSFeff = PSFact PSFexc 此時的解析度由有效點擴散函數的半高全寬決定。 下面是本實用新型實施例的三種具體方案 1、實施例1 光路圖如圖l所示，光路中不加所述的敏化光瞳7和激發光瞳12，通過在x軸方向 上調節激發雙色鏡13使兩束光同軸傳播，經物鏡3聚焦後兩束光的點擴散函數中心重合， 即L = 0。此時等效點擴散函數如圖5所示，橫向半高全寬為116nm，橫向解析度提高1. 55倍。 2、實施例2 光路圖如圖l所示，光路中不加敏化光瞳7和激發光瞳12，通過在x軸方向上調節 激發雙色鏡13使兩束光平行非同軸傳播，但經物鏡3聚焦後兩束光點擴散函數中心在x軸
6向距離L = 220nm。此時僅在敏化光和激發光愛裡斑邊沿交疊區域可實現可逆光敏螢光蛋 白的螢光激發，其他非交疊區域無法滿足可逆光敏螢光蛋白螢光激發條件而不發射螢光。 等效點擴散函數如圖6所示，x軸向半高全寬為79nm， x方向上解析度提高2. 28倍；y軸向 半高全寬100nm， y方向上解析度提高1. 80倍。 3、實施例3 光路圖如圖l所示，光路中加入敏化光瞳7和激發光瞳12，所述的敏化光瞳7和激 發光瞳12為三區位相型光瞳濾波器，由內向外A、B、C三區位相依次為0、 Ji 、0，歸一化半徑 依次為O. 12 : 0.6 : 1。光瞳的加入改變原來點擴散函數分布，使三級衍射極大峰增強。 通過在x軸方向上調節激發雙色鏡13使兩束光平行非同軸傳播，且經物鏡3聚焦後兩束光 點擴散函數中心x軸向距離L = 1010nm。此時僅在敏化光和激發光愛裡斑第三級衍射環 焦點邊沿交疊區域可實現可逆光敏螢光蛋白的螢光激發，其他非交疊區域無法滿足可逆光 敏螢光蛋白螢光激發條件而不發射螢光。等效點擴散函數如圖7所示，x軸向半高全寬為 64nm， x方向上解析度提高2. 81倍；y軸向半高全寬186nm， y方向上解析度沒有提高。 以上三個實施例所激發的螢光由物鏡3收集，依次經過敏化雙色鏡8反射部分 405nm光；經過激發雙色鏡13，反射部分488nm光；經過陷波濾光片14，濾除488nm光；經過 長通濾光片15，濾除低於500nm光；通過聚焦透鏡16收集螢光信號；通過小孔光闌17濾除 點擴散函數中心附近的背景噪聲；雪崩二極體18測量螢光光強由計算機19記錄數據。每 採集完一點，在計算機19的控制下，關閉快門9，阻隔激發光源2發射的激發光光束，使光 敏螢光蛋白標記的樣品4中被暫時漂白的敏化螢光分子在敏化光源1發射的敏化光的照射 下重新回到可激發態。接下來在計算機19驅動三維平移臺20將樣品移動到下一個待測量 點。實施中，如圖1所示，以光束行進方向作為Z軸，逐步改變層析深度，依次獲取生物樣品 在不同深度處的X-Y圖像，從而重構樣品三維圖像。 實驗表明，本實用新型提高橫向解析度達1. 55-2. 81倍。本實用新型是雙色單光 子激發的線性過程，具有很高的螢光激發效率；由於可逆光敏蛋白僅在兩束光共同照明的 區域會被敏化並激發螢光，具有較高的信噪比；本實用新型僅使用一個物鏡同時照明樣品 和採集螢光信號，兩束光的波長和強度獨立控制，操作簡單，易於實現。
權利要求一種雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於該裝置包括照明部分、探測收集部分和掃描部分照明部分包括敏化光源(1)，沿該敏化光源(1)輸出的敏化光束方向依次是敏化衰減片(5)、敏化準直系統(6)和敏化雙色鏡(8)，該敏化雙色鏡(8)與所述敏化光源(1)輸出的敏化光束成45°放置；激發光源(2)，沿該激發光源(2)輸出激發光束方向依次是快門(9)、激發衰減片(10)、激發準直系統(11)和激發雙色鏡(13)，該激發雙色鏡(13)與所述激發光源(2)輸出的激發光束成45°放置；所述的敏化雙色鏡(8)與所述的激發雙色鏡(13)平行放置；所述的敏化光束和激發光束分別經過所述的敏化雙色鏡(8)和激發雙色鏡(13)反射後平行出射，所述的敏化光束和激發光束的光斑寬度略小於物鏡(3)後表面的寬度，平行出射的敏化光束和激發光束經所述的物鏡(3)聚焦後的點擴散函數重疊，中心相距L，照明所述的被可逆光敏螢光蛋白分子標記的樣品(4)；探測收集部分由陷波濾光片(14)、長通濾光片(15)、聚焦透鏡(16)、小孔光闌(17)、雪崩二極體(18)和計算機(19)組成，沿著經樣品(4)發射的螢光方向，在所述的激發雙色鏡(13)的後，依次設置所述的陷波濾光片(14)、長通濾光片(15)、聚焦透鏡(16)、小孔光闌(17)和雪崩二極體(18)，所述的小孔光闌(17)置於所述的聚焦透鏡(16)的焦平面，中心對準焦點，所述的雪崩二極體(18)接收螢光信號後輸入計算機(19)；掃描部分包括供放置所述的樣品(4)的三維平移臺(20)，所述的計算機(19)驅動並控制所述的三維平移臺(20)的移動和所述的快門(9)的開合，以實現對所述的樣品(4)的掃描。
2. 根據權利要求1所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於在所述的敏化準直系統(6)和敏化雙色鏡(8)之間還有敏化光瞳濾波器(7)，在所述的激發準直系統 (11)和激發雙色鏡(13)之間還有激發光瞳濾波器(12)。
3. 根據權利要求2所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於所述的敏化 光瞳濾波器(7)和所述的激發光瞳濾波器(11)為三區位相型光瞳濾波器，由內向外三區 (A、B、C)位相依次為0、 Ji 、0，歸一化半徑依次為0. 12 : 0. 6 : 1。
4. 根據權利要求1所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於所述的敏化 光源(1)輸出光束的波長為405nm，所述的激發光源(2)輸出光束的波長為488nm。
5. 根據權利要求1所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於所述的敏化 雙色鏡(8)是對波長為405nm的光束高反，波長為488_550nm的光束高透的雙色鏡。
6. 根據權利要求1所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於所述的激發 雙色鏡(13)是對波長為488nm的光束高反，波長為500-550nm的光束高透的雙色鏡。
7. 根據權利要求1至6任一項所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於 所述的陷波濾光片(14)是對波長為488nm的光束高反，其它波長的光束高透的濾光片。
8. 根據權利要求1至6任一項所述的雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，其特徵在於 所述的長通濾光片(15)是對波長為500nm以上的光束高透，500nm以下的 光束高反的濾光 片。
專利摘要一種雙色單光子橫向超分辨的成像裝置，包括照明、探測收集和掃描三部分照明部分包括敏化光源，沿該敏化光源輸出的敏化光束方向依次是敏化衰減片、敏化準直系統和敏化雙色鏡；激發光源，沿該激發光源輸出激發光束方向依次是快門、激發衰減片、激發準直系統和激發雙色鏡；所述的敏化雙色鏡與所述的激發雙色鏡平行放置；探測收集部分由陷波濾光片、長通濾光片、聚焦透鏡、小孔光闌、雪崩二極體和計算機組成；掃描部分包括由所述計算機控制的供所述的被可逆光敏螢光蛋白分子標記的樣品放置的三維平移臺和所述的快門。本實用新型可提高超分辨螢光成像的橫向解析度1.55-2.81倍，並具有操作方便的特點。
文檔編號G01N33/48GK201444142SQ20082015761
公開日2010年4月28日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者喬玲玲, 毛崢樂, 王琛, 程亞 申請人:中國科學院上海光學精密機械研究