食慾調節組合物的製作方法

2023-06-06 01:16:16 4

專利名稱：食慾調節組合物的製作方法
技術領域：
本發明範圍本發明範圍屬生物學，更具體地說，是食物攝取、食慾和飽足感控制和體重控制的生物學。本發明涉及含有支鏈澱粉激動劑和縮膽囊素(「CCK」)激動劑的組合物，或在此描述的各種雜化的組合物，和它們在抑制食物攝取時的應用。本發明亦涉及控制食物攝取、食慾和飽足感的方法，以及控制體重的方法。
背景技術：
為闡明本說明書，在此引用出版物和包括專利以及專利申請的其它材料作為參考。肥胖在發達國家越來越普及。如，在美國估計約有30％的成年人高於標準體重20％-可接受的影響健康危險的肥胖範圍(「Harrison’s Principles of Internal Medicine 12th Edition，」McGrawHill，Inc.(1991).第411頁)。在這些個體中，肥胖可能成為心血管系統疾病、高血壓、血膽固醇過多、II型糖尿病(也指非胰島素依賴性糖尿病)和某些癌症發病率增高的因素[Kolata，Science 2271019-1020(1985)]。例如在臨床和流行病學研究中，高血壓、肥胖和不耐葡萄糖(損害的葡萄糖耐受性和II型糖尿病)是相關聯的[Chiang等，Girculation 39403-421(1960)；Sims，Hypertension 4(Suppl.3)43-49(1982)；Bray，Dis.Mon.261-85(1979)；West，Epidemiology of Diabetesand its Vascular Lesions，Elsevier/North Holland，New York，pp.191-284，351-389(1978)；Medalie等，Arch，Int.Med.135811-817(1975)；Zimmett，Diabetologia 22399-411(1982)；Barrett-Connor，Am.J.Epidemiol.113276-284(1981)；Jarrett等，Int.J.Epidemiol. 715-24(1978)；Butler等，Am.J.Epidemiol.16971-980(1982)]，並且可能有共同的致病機理(Modan等，J.Clin.Invest.75809-817(1985)。對於患II型糖尿病、高血壓、血膽固醇過多、冠狀動脈心臟病、痛風和骨關節炎的病人往往推薦降低體重作為第一行動療程。
然而，醫生可以用來降低病人體重的治療方法很少。目前所用的藥用製劑短時期治療有效，而長期應用時由於可能產生耐受性和可能不需要的副作用而不能接受。在低劑量時，通過模仿人體自身飽足感信號而降低食物攝取的製劑比目前在慢性治療中所用的減輕體重劑更具優勢。比現有製劑更具有所需的副作用。CCKCCK(膽囊收縮素)是在1928年由於其刺激膽囊收縮的能力從小腸提取物製劑中鑑定的。此後報導了CCK的其它生物學作用，包括刺激胰腺分泌、延緩胃排空、刺激小腸蠕動和胰島素的分泌[SeeLieverse等，Ann N.Y.Acad.Sci.713268-272(1994)]。報導的CCK的作用也包括心血管系統功能、呼吸系統功能、神經毒性和癲癇發作、癌細胞增生、痛覺缺失、睡眠、性和生殖行為、記憶、焦慮和多巴胺介導的行為[Crawley和Corwin，Peptides 15731-755(1994)]。報導CCK的其它作用包括刺激胰腺生長、刺激膽囊收縮、抑制胃酸分泌、胰腺多肽釋放及蠕動的收縮成分。報導的CCK的另外的作用包括血管舒張[Walsh，「Gastrointestinal Hormones」，In Physiology of theGastrointestinal Tract(3d ed.1994；Raven Press，New York)]。
已有報導胰高血糖素、CCK和韓蛙皮素(bombesin)組合物注射劑能顯示比單獨使用混合物中的一種化合物有更強的對未剝奪大鼠濃縮牛奶實驗食物攝取的抑制作用[Hinton等，Brain Res Bull.17615-619(1986)。也有報導胰高血糖素和CCK協同抑制大鼠假飼[LeSauter和Geary，Am.J.Physiol.253R217-225(1987)；Smith和Gibbs，AnnalsN.Y.Acad.Sci.713236-241(1994)]。亦有顯示雌二醇和CCK對飽足感有協同作用[Dulawa等，Peptides 15913-918(1994)；Smith和Gibbs，supra]。也提出由小腸對其中的營養素反應發出的信號可以同CCK協同作用以減少食物攝取[Cox Behav.Brain Res.3835-44(1990)]。此外，有報導CCK能在幾個屬種誘導飽足感。如，有報導大鼠腹膜內注射、豬動脈注射、貓和豬靜脈注射、猴、大鼠、狗和羊大腦室注射和肥胖、不肥胖人靜脈注射CCK可起餵養抑制[See Lieverse等，Supra]。幾個實驗室研究報告通過比較猴子和大鼠對食物和非食物增強因子的反應和通過CCK得出的食物攝入後正常觀察到的行為順序(如飯後飽足感順序)證實低劑量CCK對餵養抑制作用的行為特異性。另外，比較CCK後的行為和單獨或同CCK結合食物攝入後的行為報告顯示CCK和食物攝入後具有行為相似性[Gawley和Corwin，supra]。亦有報導生理血漿CCK濃度在瘦人和肥胖人都能抑制食物攝取和增加飽足感[SeeLieverse等，supra]。
1966年發現CCK具有33-胺基酸肽的特徵[Crawley和Corwin，supra]。人的CCK-33具有下列胺基酸順序Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(順序鑑定號1)鑑定了CCK胺基酸序列的屬種特異性分子變種。有報導已鑑定出豬、大鼠、雞、灰鼠、豬和人的33-胺基酸序列和切斷的肽，一種8-胺基酸C-末端序列(CCK-8)。報導豬、狗和豚鼠具有39-胺基酸序列。報導貓、狗和人具有58-胺基酸序列。報導顯示青蛙和海魚為47-胺基酸序列，與CCK和胃泌素同源。已報導非常新鮮的人腸中含有小量的更大的分子，為CCK-83。在大鼠中，報導鑑定一主要中間體，並稱為CCK-22[Walsh，「Gastroinstinal Hormones」，InPhysiology of the Gastrointestinal Tract(3d ed.1994；Raven Press，NewYork)]。報導大鼠腦中有非硫酸化的CCK-8和一個四肽(稱為CCK-4(CCK30-33))。C-末端的五肽(CCK-4(CCK29-33))保持了CCK的結構同源性，並且也與神經肽、胃泌素同源。報導C-末端硫酸化的八肽序列，CCK-8，Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2〔序列鑑定號2〕在屬種之間具有相對保留性。對大鼠甲狀腺癌、豬腦和豬腸的前縮膽囊素cDNA編碼的克隆和序列分析報告揭示CCK前體含有345個核苷酸密碼子，為115個胺基酸並含有前述報告所有分離的CCK序列[Crawley和Corwin，supra]。
CCK分布於整個中樞神經系統和內分泌細胞以及上部小腸的腸神經。CCK激動劑包括CCK本身(亦指CCK-33)，CCK-8(CCK26-33)，非硫酸化CCK-8，五肽胃泌素(CCK-5或CCK(29-33))和四肽，CCK-4(CCK30-33)。在胰腺CCK受體上，CCK-8顯示比未硫酸化的CCK-8或CCK-4強1000-5000倍的結合能力，在刺激胰腺澱粉酶分泌時CCK-8比未硫酸化CCK-8或CCK-4具有約1000倍的能力[Crawley和Corwin，Supra]。在由大腦皮層得到的勻漿中，在相同摩爾濃度時未硫酸化的CCK-8和CCK-4所顯示的對CCK受體的結合力為硫酸化的CCK-8的10倍或100倍。Id。
報導已鑑定出各種組織中存在CCK受體並描述了兩種主要亞型A型受體和B型受體。A型受體存在於外周組織中包括胰腺、膽囊、幽門括約肌和傳入迷走神經纖維和腦分離區。報導A型受體亞型(CCKA)對硫酸化八肽是選擇的。已鑑定B型受體亞型(CCKB)存在於整個腦中和胃中，並不需要硫酸化或所有八胺基酸[SeeReidelberger，J.Nutr.124(8 Suppl.)1327S-1333S(1994)；Crawley和Corwin，supra]。CCKA激動劑也包括A-71623和A-708874，它們是在CCK-4結構基礎上發展的。另一系列的CCKA激動劑，包括JMV-180，具有刺激胰腺澱粉酶釋放和抑制餵養的活性[Crawley和Corwin，supra]。非肽CCKA激動劑的例子為L-364718和FPL15849KF[Crawley和Corwin，supra.Morley等，Am.J.Physiol.267R178-R184(1994)]。CCKB激動劑包括CCK-8，未硫酸化CCK-8，CCK-4和BC264(抗多肽酶的CCK衍生物)[Crawley和Corwin，supra]。支鏈澱粉支鏈澱粉為-37-胺基酸蛋白激素。人支鏈澱粉的結構如下Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2(序列鑑定號3)人類II型糖尿病胰島中澱粉樣沉積物的主要組分已得到分離、純化和化學鑑定(Cooper等，Proc.Natl Acad.Sci.，USA 848628-8632(1987))。支鏈澱粉分子有兩個重要的轉化後修飾型C-末端醯胺化，和2，7位的半胱氨酸交聯形成N-末端環。人支鏈澱粉基因開放的可讀框架順序表明存在Lys-Arg二元胺基酸蛋白水解切割信號，N末端密碼子前的Lys和CLAIMS末端Lys-Arg蛋白水解信號前的Gly，一種蛋白醯胺化酶(PAM)醯胺化的典型序列(Cooper等，Biochem.Biophys.Acta 1014247-258(1989))。支鏈澱粉是英國專利申請號8709871(1989年4月27日申請)和美國專利號5367052，(1994年11月22日授權)的主題。在J.Cell.Biochem.55S19-28(1994)，Pittner等，可發現關於支鏈澱粉的結構、合成、分泌和分子生理學綜述。
據稱支鏈澱粉的化學結構和基因序列都支持其為具有生物活性的或為「信使」分子這一鑑定。化學結構幾乎有50％等同於降鈣素基因關聯的肽(CGRP)，也是具有多種潛在生物作用包括血管舒張的廣泛神經遞質的37胺基酸的蛋白。支鏈澱粉和CGRP具有共同的2Cys-7Cys二硫鍵和C末端醯胺化，二者是完整生物活性所必需的(Cooper等，Proc.Natl Acad.Sci.857763-7766(1988))。
支鏈澱粉主要在胰腺β細胞合成並對營養素如葡萄糖和精氨酸刺激產生反應而分泌。對克隆的腫瘤β細胞系(Moore等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1791-9(1991)，分離島(Kanatsuka等，FEBSLetts.259199-201(1989))和擴散大鼠胰腺(Ogawa等，J.Clin.Invest.85973-976(1990))研究表明營養促分泌素如葡萄糖和精氨酸的短時衝擊，10至20分鐘，可刺激支鏈澱粉和胰島素的釋放。分泌蛋白的支鏈澱粉與胰島素比例在製劑內的變化為約0.0l至0.4，但同一製劑不同刺激間變化不會太大。然而，通過升高葡萄糖延長刺激時，支鏈澱粉與胰島素比例可顯著增加(Gedulin等，Biochem.Biophys.Res.Commun.180782-789(1991))。因此，可能由於基因表達和轉譯速率不依賴於控制，所以支鏈澱粉和胰島素不總是以恆定比例分泌。
通過多种放射免疫測定法測定齧齒動物和人循環血中支鏈澱粉樣的免疫活性，所有方法都用兔的抗支鏈澱粉抗血清，並且絕大多數都應用提取和濃縮方法以提高測定靈敏性。報導在正常人，飢餓時支鏈澱粉水平為1至10pM而飯後或用葡萄糖後為5至20pM(如，Hartter等，Diabetologia 3452-54(1991)；Sanke等，Diabetologia34129-132(1991)；Koda等，The Lancet 3391179-1180(1992)。在肥胖人中，耐胰島素的個體，進食後支鏈澱粉水平可升高，達到約50pM。作為比較，健康人飢餓和飯後胰島素的值分別為20至50pM和100至300pM，在耐胰島素人中可能高達3倍至4倍。在I型糖尿病中，β細胞已破壞，支鏈澱粉水平在或低子檢測水平並且不隨葡萄糖升高(Koda等，supra)。在正常小鼠和大鼠中，報導基礎支鏈澱粉水平為30至100pM，而在耐胰島素的糖尿族的齧齒動物中，其值可高達600pM(e.g.，Huang等，Hypertension 19I101-I109(1991)；Gill等，LifeSciences 48703-710(1991))。
已發現支鏈澱粉的某些作用同CGRP和降鈣素的已知的非代謝作用相似；然而，在此新鑑定的蛋白的調查中發現支鏈澱粉的代謝作用似乎反應了其基本生物作用。CGRP至少可以模仿某些代謝作用，即使在顯著的血管舒張的劑量(見Leighton等，Nature 335632-635(1988)；Molina等，Diabetes 39260-265(1990))。
第一個發現的支鏈澱粉的作用是降低胰島素刺激的葡萄糖在大鼠骨骼肌肉中合成糖原(Leighton等，Nature 335632-635(1988)；肌肉為「耐胰島素」的。隨後對大鼠比目魚肌肉所做工作表明支鏈澱粉能降低糖原合酶活性，促進糖原磷酸化酶由無活性的b型轉化為有活性的a型，促進糖原的減少(有胰島素存在或無胰島素存在)，提高葡萄糖-6-磷酸鹽水平，提高乳酸鹽產量(見，如.，Deems等，Biochem.Biophys.Res.Commun.181116-120(1991))；Young等，FEBS Letts.281149-151(1991))。還不確定支鏈澱粉本身是否幹擾葡萄糖轉運(見Young等，Am.J.Physiol.259E457-E461(1990)；Zierath等，Diabetologia 3526-31(1992))。對支鏈澱粉和胰島素劑量反應關係研究表明在骨骼肌中支鏈澱粉作為胰島素的非競爭或功能拮抗劑(Young等，Am.J.Physiol.263E274-E281(1992))。因此，在支鏈澱粉有效濃度時，任何濃度的胰島素都不能克服支鏈澱粉的作用。還沒有證據表明支鏈澱粉幹擾胰島素同其受體結合，或者幹擾胰島素受體酪氨酸激酶的激活作用(Follett等，Clinical Research 3939A(1991))；Koopmans等，Diabetologia 34218-224(1991))。
據信支鏈澱粉通過血漿膜中存在的受體起作用[Beaumont等，Mol.Pharmacol.44493-497(1993)]。已報導骨骼肌中支鏈澱粉通過受體介導機制起作用，該機制通過激活糖原分解速率限制酶，磷酸化酶a而促進糖原分解(Young等，FEBS Letts.281149-151(1991))。對支鏈澱粉和CGRP以及拮抗劑8-37CGRP的作用研究表明，支鏈澱粉通過其本身受體起作用(Wang等，FEBS Letts.219195-198(1991))，而反對其它工作者支鏈澱粉主要作用於CGRP受體的結論(如.，Chantry等，Biochem.J.277139-143(1991))；Galeazza等，Peptides 12585-591(1991))；Zhu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.177771-776(1991))。美國專利號5264372(1993年11月23日公開)描述支鏈澱粉受體在各種支鏈澱粉激動劑和拮抗劑化合物篩選和測定中應用的各種方法。
Young等，在J.Cell.Biochem.55512-18(1994)中討論支鏈澱粉有關能量代謝的生物作用。在體內支鏈澱粉對肝能量代謝具有顯著作用，而對於分離的肝細胞或灌注肝支鏈澱粉起何作用還無一致意見。現有數據並不支持支鏈澱粉促進肝糖原分解的觀點。即其作用並不似胰高血糖素(如，Stephens，等，Diabetes 40395-400(1991)；Gomez-Foix等，Biochem.J.276607-610(1991))。認為支鏈澱粉可能作用於肝臟促進乳酸鹽轉化為糖原並提高由胰高血糖素釋放的葡萄糖的量(見Roden等，Diabetologia 35116-120(1992))。因此，支鏈澱粉在肝臟中可以作為胰島素同化的配體，不同於在肌肉中的異化作用。
最近報導了支鏈澱粉對有意識大鼠局部血液動力學包括腎血液的作用，(Gardiner等，Diabetes 40948-951(1991))。作者指出同人輸注α-CGRP相比觀察到對大鼠輸注支鏈澱粉與腎血管擴張有更大的相關性，而與腸繫膜血管作用的相關性較小。得出結論支連澱粉通過比α-CGRP更強程度地促進腎充血，鼠友鏈澱粉可引起較小的腎血管緊張素刺激作用，因此，也引起較小的血管緊張素II介導的繼發性血管收縮作用。也指出，在人α-8-37CGRP和大鼠支鏈澱粉共同輸液時，腎和腸繫膜血管收縮作用是明顯的，設想是由於血管緊張素II未對抗血管收縮劑作用，此發現同人α-CGRP和人α-8-37CGRP共同輸液時觀察到的結果相似。
支鏈澱粉在齧齒動物體內的顯著作用為刺激血漿乳酸鹽急劇升高，和其後血漿葡萄糖的升高(Young等，FEBS Letts.281149-151(1991))。證據表明乳酸鹽升高可以為葡萄糖產生提供底物並且支鏈澱粉可以不依賴胰島素或胰高血糖素變化而產生作用。在「葡萄糖夾(clamp)」試驗中，支鏈澱粉輸液可以通過降低外周葡萄糖處理和限制肝葡萄糖輸出量的胰島素介導的抑制作用而引起「胰島素耐受性」。(如.，Frontoni等，Diabetes 40568-573(1991))；Koopmans等，Diabetologia34218-224(1991))。
在脂肪細胞中，同在肌肉中腎上腺素樣的作用相反，沒有檢測到支鏈澱粉對胰島素刺激的葡萄糖吸收、葡萄糖合成甘油三酯、CO2產生(Cooper等，Proc.Natl Acad.Sci.857763-7766(1988))，腎上腺素刺激的脂肪分解，或脂肪分解的胰島素抑制作用(Lupien和Young，Diabetes Nutrition，and Metabolism-Clinical and Experimental 613-18(1993))。因此支鏈澱粉顯示出組織特異性，對骨骼肌有直接作用，對肝臟有顯著的非直接(通過提供底物)和可能的直接作用，而脂肪細胞似乎無視於支鏈澱粉的存在與否。考慮到支鏈澱粉對肌肉、肝臟和脂肪組織的作用，提出過多的支鏈澱粉與肥胖有關，肥胖可以用支鏈澱粉拮抗治療〔美國專利號5280014，1994年1月18日授權〕。
支鏈澱粉的非代謝作用包括同CGRP血管受體相互作用介導的血管舒張作用[Brain等，Eur J.Pharmacol.1832221(1990)。
也發現當以一種避免幹擾血壓的方式皮下給與完整大鼠時，支鏈澱粉顯著增加血漿腎素的活性。美國專利號5376638，1994年12月27日授權，描述了用支鏈澱粉拮抗劑治療腎素相關的紊亂的方法。
已表明支鏈澱粉激動劑可延緩胃排空(Young等，Diabetologia(June 1995，in press))，認為其作用有助於降低飯後血漿葡萄糖水平(Moyses和Kolterman，Drugs ofthe Future(May，1995))。包括給與支鏈澱粉激動劑(包括支鏈澱粉)以降低胃蠕動和減慢胃排空的方法為美國專利申請號08/118381(1993年9月7日申請)和美國專利申請號08/302069，(1994年9月7日申請)的主題。
已報導當給與大鼠和小鼠腦以支鏈澱粉時可以減少食物攝取[Balasubramaniam等，Ptptides 12919-924(1991)；Chance等，BrainRes.539352-354(1991)]。給大鼠和小鼠腹膜內(IP)注射支鏈澱粉可觀察到對肛門的作用[Morley和Flood，Peptide 12865-869(1991)；Morley等，Pharmacol.Biochem.Behav.44577-580(1993)]。亦有報導，當以0.5μg/kg的劑量IP給大鼠時可顯著減少食物攝取[Lutz等，Physiology Behavior.55891-895(1994)。
報導的給人注射支鏈澱粉劑量依賴的副作用包括噁心、嘔吐、腹瀉、面部潮紅和體位性低血壓。見Moyses和Kolterman，supra。
本發明概述申請者發現當共同給與支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑時，它們對減少食物攝取具有協同作用。本發明描述支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑一起控制食物攝取的應用。如，給大鼠IP注射1.0μg/kg CCK-8或1.0μg/kg大鼠支鏈澱粉沒有檢測到對食物攝取的作用。但每種肽都給0.1μg/kg時產生的食物攝取的減少大約相當於單一肽100μg/kg觀察到的作用。
一方面，本發明涉及降低哺乳動物包括人食物攝取、控制食慾和體重的方法及組合物。由於減少每餐食物攝取量或者延長兩餐間隔時間可控制食慾從而控制體重。此方法包括給與抑制食物攝取的最好的組合物。最好的組合物包括一種支鏈澱粉激動劑和一種CCK激動劑的組合。最好的組合物也包括共同給與支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑。
另一方面，本發明涉及以適於治療給藥的適當形式混合的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑組合物，組合物在本發明所述的減少食物攝取、控制食慾和/或控制體重的方法中是有用的。支鏈澱粉意味著一種含有一種或多種所知支鏈澱粉活性的化合物，尤指具有降低哺乳動物食物攝取的能力，包括具有與已知的支鏈澱粉(如人支鏈澱粉、大鼠支鏈澱粉和狗支鏈澱粉)或支鏈澱粉激動劑(如鮭降鈣素或CGRP)相似的胺基酸序列的肽或等價物。術語支鏈澱粉激動劑包括支鏈澱粉如人支鏈澱粉(h-支鏈澱粉)。一般認為，有用的支鏈澱粉激動劑在比目魚肌測定中顯示EC50≤500nM/l。一般的支鏈澱粉激動劑EC50≤250nM/l。較好的支鏈澱粉激動劑EC50≤100nM/l，但最好的小於約1至5nM，小於1nM或小於50pM。在此描述的好的支鏈澱粉激動劑連同美國專利申請題目為「Novel Amylin Agonist Peptides andUses Therefor」，1995年5月30日申請(申請者概要213/080)和相應PCT申請公開號WO 93/10146，1993年5月27日公開的相同。本權利要求方法和組合物最好的支鏈澱粉激動劑包括25，28，29pro-h-支鏈澱粉，S-降鈣素和h-支鏈澱粉。其它支鏈澱粉激動劑包括在N末端具有附加胺基酸的化合物，包括(Pro-NH)支鏈澱粉和[Pro，Arg-NH-]支鏈澱粉。
CCK激動劑意味著具有一種或多種CCK已知的生物活性的化合物，但至少具有減少哺乳動物食物攝取的能力，包括具有同已知的CCK或其部分相似的胺基酸序列的多肽或等價物。術語CCK激動劑包括CCKS(如人CCK)。最好的CCK激動劑包括作用於CCK亞型A受體的激動劑。最好的CCKA激動劑為CCK-8。
降低食物攝取指同無治療或安慰劑治療相比減少食物攝取。
在該組合物中，每種所述支鏈澱粉激動劑和所述CCK激動劑的劑量最好在約0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day之間，最好在約0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day之間，其中激動劑多肽結構大體上或全部分別同支鏈澱粉、25，28，29Pro-h-支鏈澱粉、鮭降鈣素、或CCK和CCK-8相關。在這些方法中使用非肽類激動劑時，通過25，28，29Pro-h-支鏈澱粉(用支鏈澱粉激動劑時)或CCK(用CCK激動劑時)與此類非肽激動劑的效價之比增加(或減少)非肽激動劑的劑量。
另一方面，本發明涉及包括給與哺乳動物有效食物攝取減少的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的組合而抑制哺乳動物食物攝取的方法。
另一方面，本發明涉及包括共同給與治療有效量的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑控制哺乳動物食慾的方法。
另一方面，本發明涉及給與受治療者有效食物攝取減少量的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑而控制受治療者體重的方法。
在此方法最好的實施例中，支鏈澱粉激動劑為25，28，29Pro-h-支鏈澱粉、s-降鈣素或h-支鏈澱粉。在本方法的其它較好的實施例中，CCK激動劑為CCK激動劑，最好為CCK-8。
在本方法其它較好的實施例中，給與的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的量為約0.1μg/kg/day至約10μg/kg/day，最好為約0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day。
另一方面，本發明涉及具有支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽特徵的雜交肽，其中雜交肽具有共價連接CCK激動劑肽的支鏈澱粉激動劑肽的特徵。也提供其它雜交肽化合物，其中有些應用鍵合劑，有些具有支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的各種特徵。
在一類實施例中，將雜交肽在體內切割以使其組分獨立作用。在此種情況下，為使雜交肽在體內切割，鍵合劑構架上至少一個雜原子為氧，倘若為酯合鍵。在另一類實施例中，雜交肽不在體內切割，而是保持完整。此類雜交肽在同一分子中既具有支鏈澱粉激動劑的生物活性又具有CCK激動劑的生物活性。在此情況下，需要有一定的體內穩定性，為使雜交肽在體內不被切割，鍵合劑構架的所有雜原子要求為氮，因此產生了醯胺鍵或脲合鍵。
在另一方面，本發明涉及支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽由下列結構共價連接的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過肽N末端的NH2和/或通過側鏈NH2(只要該肽存在含NH2的側鏈)相連；並且(a)R1為CONH(CH2)N，COO(CH2)n，或CO(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過羧基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過羧基連接的任何羧酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；和(e)R5為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6；另一方面，本發明涉及包含支鏈澱含粉激動劑肽和CCK激動劑肽通過下列結構相連的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動肽通過肽N末端NH2和肽側鏈NH2(只要該肽中存在含有NH2的側鏈)相連；並且(a)R1為CONH(CH2)n，COO(CH2)N，或CO(CH2)N；和(b)R2為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6；最好的此類雜交肽包括結合到支鏈澱粉激動劑肽中的雜交肽KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，支鏈澱粉激動劑肽KCNTATCATQKLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，或者支鏈澱粉激動劑肽CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2，其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連的雜交肽。
最好的此類雜交肽也包括結合到CCK激動劑肽中的雜交肽DY(OSO3H)MGWMDF-NH2，DYMGWMDF-NH2，MGWMDF-NH2，GWMDF-NH2，WMDF-NH2，KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2，KDYMGWMDF-NH2，KMGWMDF-NH2，KGWMDF-NH2，或KWMDF-NH2.
另一方面，本發明涉及含有通過下列共價結構相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動肽和所述CCK激動肽通過肽的側鏈羧酸基(只要該肽存在含有羧酸基的側鏈)連於R1，和通過肽N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含有NH2的側鏈)連於R5；(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n，其中n＝1-6(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位相連)，COOC6H4O(鄰、間或對位相連)，COOC6H4(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位相連)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過羧基相連的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過羧基相連的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；(e)R5為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6；另一方面，本發明涉及含有通過下列結構共價相連的支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動肽和所述CCK激動肽通過側鏈羧酸基(只要該肽存在含有羧酸基的側鏈)連於R1，和通過肽N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含有NH2的側鏈)連於R2；(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n；(b)R2為(CH2)nNHCO、(CH2)nOCO、(CH2)nCO，其中n＝1-6。
最好的此類雜交肽包括結合進支鏈澱粉激動肽的雜交肽KCNTATCATQRLANELVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，或支鏈澱粉激動肽CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2，其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連的雜交肽。
其它較好的雜交肽包括接合到CCK激動劑中的雜交肽DY(OSO3H)MGWMDF-NH2，DYMGWMDF-NH2，MGWMDF-NH2，GWMDF-NH2，WMDF-NH2，KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2，KDYMGWM-DF-NH2，KMGWMDF-NH2，KGWMDF-NH2，或KWMDF-NH2.
另一方面，本發明指出包括支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽通過下列結構共價相連的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽通過肽N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含有NH2的側鏈)連於R1，和通過肽側鏈羧酸基(只要該肽存在含有羧酸基的側鏈)連於R5；且(a)R1為CONH(CH2)N、COO(CH2)n、或CO(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為COONH(CH2)n(其中n＝1-6)，COO(CH2)n(其中n＝1-6)，CO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位取代)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過羧酸基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；(e)R5為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6；另一方面，本發明涉及含有支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽通過下列結構共價相連的雜交肽；-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動肽和所述CCK激動肽通過N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含NH2的側鏈)連於R1，通過肽側鏈羧酸基(只要該肽存在含羧酸基的側鏈)連於R2；並且(a)R1為CONH(CH2)n，COO(CH2)N，或CO(CH2)N；(b)R2為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6；
最好的此類雜交肽包括結合到支鏈澱粉激動肽中的雜交肽KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，KCNTATCATQKLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，或CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYP RTNTGSGTP-NH2，其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連的雜交肽。
其它較好的此類雜交肽包括結合到CCK激動肽的雜交肽DY(OSO3H)MGWMDF-NH2，DYMGWMDF-NH2，MGWMDF-NH2，GWMDF-NH2，WMDF-NH2，KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2，KDYMGWMDF-NH2，KMGWMDF-NH2，KGWMDF-NH2，或KWMDF-NH2。
另一方面，本發明涉及含有支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽由下列共價結構相連的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動肽和所述CCK激動肽通過側鏈羧酸基相連(只要該肽存在含有羧基的側鏈)；(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，CONHC6H4(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過羧酸基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；(e)R5為(CH2)nNHCO或(CH2)nO，其中n＝1-6；
另一方面，本發明涉及含有支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽通過下列結構共價相連的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動肽和所述CCK激動肽通過肽側鏈羧酸基相連(只要該肽存在含羧酸基的側鏈)；(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n；(b)R2為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6；最好的此類雜交肽包括結合到支鏈澱粉激動肽中的雜交肽KCNTATCATQRLANELVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2，其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連，或CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2，其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連的雜交肽。
其它較好的此類雜交肽包括結合到CCK激動肽的雜交肽DY(OSO3H)MGWMDF-NH2，DYMGWMDF-NH2，MGWMDF-NH2，GWMDF-NH2，WMDF-NH2。
在其一實施例中，雜交肽在體內是可以切割的並且雜交肽鍵合劑構架中至少有一個雜原子為氧。
在另一實施例中，雜交肽在體內是穩定的並且雜交肽鍵合劑構架上所有的雜原子均為氮。
本發明範圍也包括含有鍵合劑的雜交分子，連接劑可以用偶合的其它方法產生，如向適當的單或雙馬來醯亞胺鍵合劑中通過麥可加成反應加入適當巰基。通過在支鏈澱粉激動肽或CCK激動肽序列中插入半胱氨酸或者用Trut’s試劑[α-亞胺基巰基烷(2-iminothiolane)]在支鏈澱粉激動劑或CCK激動劑以及賴氨酸殘基衍生物提供巰基。可由商業獲得雙馬來醯亞胺如1，6-二馬來醯亞胺己烷。用賴氨酸殘基進行偶合的其它可能性包括氯乙醯基氯，用乙二醛和氫硼化鈉雙還原胺化，血糖降低化及隨後預期鄰二醇過碘酸鹽的切割和所得醛的還原胺化。此方法已用於化學中酶聯免疫測定和半抗原與載體蛋白的結合。
另一方面，本發明涉及具有支鏈澱粉激動肽和CCK激動肽特徵的雜交肽，雜交肽沒有應用鍵合劑。因此，本發明涉及包括下列結構分子的雜交肽R1-C-R2-C-R3-R4-R5其中(a)R1為游離N末端或者乙醯胺、丙醯胺、丁醯胺、異丁醯胺、或異己胺醯胺化的N末端；或為乙醯胺、丙醯胺、丁醯胺、異丁醯胺、或異己醯胺(isocarproramide)胺化的賴氨酸(L)。
(b)R2為由下列選擇的胺基酸序列NTAT、GTAT、NTVT、NMAT、SNLST、ASLST和GNLST。
(c)R3為由下列選擇的胺基酸序列ATQRLANFLVH和VLGKLSQELHK；(d)R4從下列選擇的胺基酸序列SSNNFGPILPP和LQTYPR；(e)R5為由下列選擇的胺基酸序列DYMGWMDF-NH2，TNTGWMDF-NH2，TNVGWMDF-NH2，TNTGWLDF-NH2，TNVGWLDF-NH2，TNTGSNDF-NH2，TNVGSNDF-NH2，TNTGSNDY-NH2和TNVGSNDY-NH2.
最好的此類非鍵合劑雜交肽包括下列序列KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPDYMGWMDF-NH2；CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRDYMGWMDF-NH2；KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNTGWMDF-NH2；CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGWMDF-NH2；KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNTGWLDF-NH2；CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGWLDF-NH2；KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNDF-NH2；CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNVGSNDF-NH2；KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNDY-NH2；andCSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNVGSNDY-NH2。
本發明範圍也包括此類化合物即通過取代其中具有相似性質的胺基酸並保留其生物學活性而對支鏈澱粉激動劑、CCK激動劑和雜交肽進行修飾。典型取代為亮氨酸取代甲硫氨酸或反之，纈氨酸取代異亮氨酸或反之，穀氨醯胺取代天冬醯胺或反之，苯丙氨酸取代酪氨酸或反之，精氨酸取代賴氨酸或反之，天冬氨酸取代穀氨酸或反之，蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸互換，組氨酸和色氨酸互換，組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸互換。此外，本發明也包括其它非天然胺基酸取代，如t-亮氨酸或青黴胺及其衍生物取代纈氨酸或異亮氨酸，對位取代苯丙氨酸取代苯丙氨酸或者酪氨基異丁酸取代丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
本發明也包括上述化合物的生物學活性的衍生物，其中單個胺基酸的立體化學可在一個或多個特異位點由(L)/S轉為(D)/R型。
本發明範圍也包括下述化合物，其中支鏈澱粉激動劑或CCK激動劑被Asn、Ser和/或Thr殘基糖基化修飾而得的化合物。
本發明範圍也包括上述具有較少多肽特徵的生物學活性的化合物。如，此種多肽模擬物包括下列一種或多種取代-CO-NH-醯胺鍵depsipeptides(-CO-O-)、亞氨基亞甲基(-CH2-NH)、反烯烴基(-CH＝CH-)、β-烯胺基腈(-C(＝CH-CN)-NH-)、硫代醯胺(-CS-NH-)、硫代亞甲基(-S-CH2-或-CH2-S)、甲撐(-CH2-CH2-)和反醯胺(-NH-CO-)。
本發明雜交肽組合物在權利要求方法中用於減少食物攝取、控制食慾和控制體重。
雜交肽組合物的劑量可根據組合物變化，最佳量在約0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day之間，較好的量為0.1μg/kg/day至約10μg/kg/day，最好在0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day之間。附圖簡介參照附圖進一步說明本發明。


圖1表明大鼠支鏈澱粉(開放三角)、CCK-8(開放園圈)和大鼠支鏈澱粉+CCK-8(開放方形)對小鼠食慾抵製劑量反應。單獨的大鼠支鏈澱粉(0.1μg/kg)和CCK-8(1.0μg/kg)及其組合在30分鐘時對小鼠食物攝取的抑制。大鼠支鏈澱粉+CCK-8抑制72.3±7.5％(p＜0.0006)的食物攝取。大鼠支鏈澱粉單獨抑制-10.5±10.3％的食物攝取。CCK-8單獨抑制10.6±16.9％的食物攝取。
本發明詳細介紹支鏈澱粉激動劑各種支鏈澱粉激動劑的命名可用於表明所基於的多肽序列和對基於的支鏈澱粉序列所作的修飾，如人支鏈澱粉。在一胺基酸前面加上標數字表明命名的胺基酸取代正常存在於基本胺基酸序列上標胺基酸位置的胺基酸。如，18Arg25.28Pro-h-支鏈澱粉是指基於「h-支鏈澱粉」或「人-支鏈澱粉」的序列作下列取代的肽Arg取代18位殘基His，Pro取代25位殘基Ala和Pro取代28位殘基Ser。術語「des-1Lys-h-支鏈澱粉」指基於人支鏈澱粉序列，在第一位或N末端胺基酸缺失的肽。
作為支鏈澱粉激動劑的活性可用下述受體結合測定和比目魚肌測定的活性表示。化合物的支鏈澱粉激動劑樣活性可由在此描述的能力評價誘導哺乳動物高乳酸過多症和/或高血糖症、降低飯後血漿葡萄糖水平、減慢胃排空，或減少食物攝取。在此描述最好的支鏈澱粉激動劑。
優選的支鏈澱粉激動劑化合物在治療試驗動物體內顯示支鏈澱粉的活性，化合物有des-1Lys-h-支鏈澱粉，28Pro-h-支鏈澱粉，25.28.29Pro-h-支鏈澱粉，18Arg25，28Pro-h-支鏈澱粉和des-1Lys18Arg25，28Pro-h-支鏈澱粉，可引起顯著的高乳酸血症及隨後的高血糖症。除具有支鏈澱粉的活性特徵外，當同人支鏈澱粉相比時某些最好的化合物還具有所需要的溶解性和穩定性特徵。這些最好的化合物包括25Pro26val28.29Pro-h-支鏈澱粉，25.28.29Pro-h-支鏈澱粉(也指「AC-0137」)，和18Arg25.28Pro-h-支鏈澱粉。
本發明方法和組合物應用支鏈澱粉激動劑，包括支鏈澱粉或支鏈澱粉激動劑類似物，如支鏈澱粉受體激動劑類似物如18Arg25.28Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys25.28Pro-h-支鏈澱粉、18Arg25-28.29Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys18Arg25.28.29Pro-h-支鏈澱粉、25-28.29Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys25，28，29Pro-h-支鏈澱粉、和25Pro26Val25，28Pro-h-支鏈澱粉。其它適當的支鏈澱粉激動劑類似物包括23Leu25Pro26Val28，29Pro-h-amylin；23Leu25Pro26Val28Pro-h-amylin；des-1Lys23Leu25Pro26Val28Pro-h-amylin；18Arg23Leu25Pro26Val28Pro-h-amylin；18Arg23Leu25，28，29Pro-h-amylin；18Arg23Leu25，28Pro-h-amylin；17Ile23Leu25，28，29Pro-h-amylin；17Ile25，28，29Pro-h-amylin；des-1Lys17Ile23Leu25，28，29Pro-h-amylin；17Ile18Arg23Leu-h-amylin；17Ile18Arg23Leu26Val29Pro-h-amylin；17Ile18Arg23Leu25Pro26Val28，29Pro-h-amylin；13Thr21His23Leu26Ala28Leu29Pro31Asp-h-amylin；13Thr21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amylin；des-1Lys13Thr21His23Leu26Ala28Pro31Asp-h-amylin；13Thr18Arg21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amylin；13Thr18Arg21His23Leu28，29Pro31Asp-h-amylin；and，13Thr18Arg21His23Leu25Pro26Ala28，29Pro31Asp-h-amylin.公開包括支鏈澱粉激動劑類似物在內的另外一些支鏈澱粉激動劑同美國專利申請題為「Novel Amylin Agonist Peptides and UsesTherefor」，1995年5月30日申請(卷號213/080)，和相應在PCT申請，公開號WO 93/10146，1993年5月27日公開的相同，在此引入作參考。
其它支鏈澱粉激動劑包括降鈣素及其修飾物。術語「降鈣素」用於該技術領域熟知的方式(見Azria，Calcitonins-Physiological andPharmacological Aspects，PP.1-31，Springer-Verlag，1989)。如，術語的意思包括同豬甲狀腺分離的32胺基酸的肽相類似的肽。該激素由哺乳動物甲狀腺副濾泡C細胞合成並分泌。已排出由幾種亞哺乳脊椎動物所得的降鈣素的序列。在這些亞哺乳屬種中，降鈣素被貯存在後鰓體內細胞中，可由甲狀腺分離。由魚(如鮭和鯨)得的降鈣素和密切相關的雞降鈣素由於它們存在後鰓體內有時被稱為後鰓體降鈣素。
術語的意思也包括與已知降鈣素有相似胺基酸序列和具有一種或多種已知生物活性的多肽或等價物，但至少應具有在哺乳動物中降低食物攝取的活性。該部分肽包括功能類似物或功能的降鈣素片段及其保持活性的變異物。
如美國專利號5321008所述，發現後鰓體降鈣素在下面討論的受體測定時具有很高的結合力，其結合力同支鏈澱粉本身相似。大鼠和人降鈣素同支鏈澱粉受體的結合力很低。作為支鏈澱粉激動劑的其它降鈣素在本發明中是有用的。
表I肌肽nM 受體結合 比目魚肌(IC50，nM) (EC50，nM)人支鏈澱粉0.05 1.6雞降鈣素 0.03 0.7鮭降鈣素 0.07 0.4鯨降鈣素 0.09 0.41.7-Asn-鯨降鈣素 0.05 0.3CCK激動劑CCK和各種CCK激動劑都是本技術領域中熟知的。CCK激動劑包括CCKS和CCK胺基酸序列的種屬變種，如，在人中鑑定的第一個33-胺基酸序列和8-胺基酸C末端已被報導存在於豬、大鼠、雞、灰鼠、狗和人中。其它種屬變種包括在豬、狗和豚鼠中發現的39-胺基酸序列，和在貓、狗和人中發現的58-胺基酸序列，以及47-胺基酸序列的CCK和胃泌素的類似物。胃泌素也是CCK激動劑。硫酸化C末端八肽序列，Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，為跨屬種相對保存，可能為齧齒動物外圍具有生物活性的最小序列。因此，CCK激動劑包括人CCK-33本身，硫酸化CCK-8(CCK26-33)，未硫酸化CCK-8，五肽胃泌素(CCK-5或CCK(29-33))，和四肽CCK-4(CCK30-33)。
據報導A受體亞型(CCKA)對硫酸化八肽有選擇。B受體亞型(CCKB)存在於腦和胃中，且不需硫酸化或所有8種胺基酸。CCKA激動劑也包括A-71623和A-708874，是以CCK-4的結構為基礎產生的。另一系列的CCKA激動劑包括JMV-180，據報導具有刺激胰蛋白支鏈澱粉酶釋放和抑制食物攝取的活性。非肽CCKA激動劑的例子為L-364718和FPL 15849KF(Hpa(SO3H)-Nle-Gly-Trp-Nle-MeAsp-Phe-NH2)。CCKB激動劑包括CCK-8，未硫酸化CCK-8，CCK-4，和BC264(抗多肽酶的CCK的衍生物)。
在該技術領域中已知各種體內和體外篩選CCK激動劑的方法。實例包括快速靜注待測CCK樣活性的化合物後體內測定的狗或豚鼠膽囊收縮，和用兔膽囊條體外測定[見Walsh，「GastrointestinalHormones」，In Physiology of the Gastrointestinal Tract(3d ed.1994；Raven Press，New York)]。測定支鏈澱粉激動劑的活性可用在此描述的某些生物測定評價。受體結合測定可以鑑定支鏈澱粉激動劑和拮抗劑候選物並且可用於評價結合，而比目魚肌測定可區分支鏈澱粉激動劑和拮抗劑。
較好的支鏈粉激動劑化合物經上述支鏈受體結合測定顯示EC50S，更佳，如引述，以低於約1-5nM級為好，更好為＜約1nM，最好為低於約50pM。在比目魚肌測定時，最好的化合物以小於約1至10μM級顯示EC50。
美國專利號5264372，1993年11月23日受權，描述支鏈澱粉受體結合測定，在此引入作參考。受體結合測定為檢測化合物與膜結合的支鏈澱粉受體特異性結合能力的競爭測定。用於本測定的最好的膜製劑來源為基底前腦包括由橫臥核和周圍區域得到的膜。被測定的化合物與125I Bolton Hunter大鼠支鏈澱粉競爭性與這些受體結合。由計算機用4-參數對數方程非線性回歸分析競爭曲線，其中結合的量(B)是以結合濃度的對數繪圖(Inplot Program；Graph PAD Software，San Diego，California)或者用Delean等ALLFIT程序分析[(ALLFIT，Version 2.7(NIH，Bethesda，MD 20892))。Munson，P.和Rodbard.D.，Anal.Biochem.107220-239(1980)]。
用前述方法(Young等，Am.J.Physiol.263E274-281(1992)測定比目魚肌中支鏈澱粉激動劑，包括支鏈澱粉激動劑類似物製劑的生物活性。總之，可通過測定比目魚肌中胰島素刺激的糖原合成的抑制測定支鏈澱粉激動劑活性。通過測定100nM大鼠支鏈澱粉和支鏈澱粉拮抗劑存在時胰島素刺激的糖原合成的恢復測定支鏈澱粉拮抗劑活性。用在此描述的定量胺基酸分析測定無載體的緩衝液中溶解多肽的量。通過測量EC50測定在本測定中作為激動劑化合物的活性。通過用4-參數對數方程S形劑量依賴曲線的符合性測定標準誤(De Lean，A.，Mumson，P.J.，Guardabasso，V.和Rodbard，D.(1988)ALLFIT，Version2.7，National Institute of Child Health and Human Development，N.I.H.Bethesda，MD，1 diskette)。用這些生物測定法已鑑定了許多支鏈澱粉激動劑。如，已發現化合物18Arg25.28Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys18Arg25.28Pro-h-支鏈澱粉、18Arg25.28.29Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys18Arg25，28，29Pro-h-支鏈澱粉、25.28.29Pro-h-支鏈澱粉、des-1Lys25，28，29Pro-h-支鏈澱粉和25Pro26Val25.28Pro-h-支鏈澱粉都可以在受體結合測定時與支鏈澱粉競爭。在比目魚肌測定中這些化合物的拮抗劑活性可忽略並表明作為支鏈澱粉激動劑起作用。化合物的製備最好選用基於Fmoc化學和Rink樹脂(如，4-甲基二苯甲基胺樹脂)的標準固相合成法合成肽支鏈澱粉激動劑、肽CCK激動劑和雜交肽，此方法可使在合成結束時在C末端直接產生醯胺。所有縮膽囊素樣肽都可用Fmoc化學和Rink樹脂標準固相合成法合成，此法(可在合成結束時直接產生C末端醯胺)或者通過標準溶液化學合成。
最好用自動或半自動多肽合成儀進行該方法。一般將α-N-氨甲醯基保護的胺基酸和在樹脂上連有增長肽鏈的胺基酸在室溫下惰性溶劑中偶合，惰性溶劑可為二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，並且有偶合劑如二環己基碳二亞胺和1-羥基苯並三唑和鹼如二異丙基乙胺存在。用試劑如三氟乙酸或哌啶除去生成的肽樹脂上的α-N-氨基甲醯基保護基團，用下一個所需的待加於肽鏈上的N-保護的胺基酸重複偶合反應。本技術領域熟知適合的N-保護基，在此優選t-丁氧基碳醯(tBoc)和芴基甲氧基碳醯(Fmoc)。
可從Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA)購買肽合成儀中所用的溶劑、胺基酸衍生物和4-甲基二苯甲基胺樹脂。可由AppliedBiosystems Inc.購買側鏈保護的胺基酸，並包括下述Boc-Arg(Mts)，Fmoc-Arg(Pmc)，Boc-Thr(Bzl)，Fmoc-Thr(t-Bu)，Boc-Ser(Bzl)，Fmoc-Ser(t-Bu)，Boc-Tyr(BrZ-)，Fmoc-Tyr(t-Bu)，Boc-Lys(Cl-Z)，Fmoc-Lys(Boc)，Boc-Glu(Bzl)，Fmoc-Glu(t-Bu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，和Fmoc-Gln(Trt).從Applied Biasystems，Inc.或Bachem Inc.(Torrance，CA)購買Boc-His(BOM)。從Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)獲得茴香醚、二甲硫、酚、乙二硫醇和硫代茴香醚。Air Products and Chemicals(Allentown，PA)提供HF。從Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)購買乙醚、乙酸和甲醇。
用NMP/HOBt(選擇1)系統和Tboc或Fmoc化學(見AppliedBiosystems User′s Manual for the ABI 430A Peptide Synthe-sizer，Version 1.3B July 1，1988，section 6，pp.49-70，Applied Biosystems，Inc，，Foster city，CA)封端在自動多肽合成儀上(Model 430A，Applied Biosystems Inc.，FosterCity，CA)進行固相多肽合成。用HF(-5℃至0℃，1小時)切割Boc-肽-樹脂。用交替水和乙酸從樹脂中提取肽，將過濾物冷凍乾燥。根據標準方法(Introduction to Cleavage Techniques，Applied Biosystems，Inc.，1990，PP.6-12)切割Fmoc-肽樹脂。用Advanced Chem Tech合成儀(Model MPS 350，Louisville，Kentucky)合成多肽。用Waters DeltaPrep 3000系統RP-HPLC純化多肽。用C4、C8或C18製備柱(10μ，2.5×25cm；Vydac，Hesperia，CA)分離多肽，用C4、C8或C18分析柱(5μ，0.46×25cm Vydac)測定純度。溶劑(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/CH3CN)以1.0ml/min流速通過分析柱和以15ml/min流速通過製備柱。在Waters Pico Tag系統上進行胺基酸分析並用Maxima程序處理。用氣相酸水解(115℃，20-24h)法水解多肽。用標準方法 (Cohen，S.A.，Meys，M.，和Tarrin，T.L.(1989)，The Pico Tag MethodA Manual ofAdvanced Technigues for Amino Acid Analysis，pp.11-52，Millipore Corporation，Milford，MA).衍化和分析水解物。通過M-Scan，Incorporated(West Chester，PA)進行快速原子衝擊分析。碘化銫或碘化銫/甘油進行質量校正。在AppliedBiosystems Bio-Ion 20質譜儀上，用漂移時間檢測進行血漿解吸離子化分析。
也可以用重組DNA技術，用該技術領域所知的方法製備本發明中有用的化合物[見Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor(1989)。
在製備由鍵合劑連接的雜交肽時，一般按下述取得兩個肽的N末端鍵將支鏈澱粉激動劑以完全保護的形式置於樹脂上。在枝脂上形成二硫鍵。除去N末端Fmoc基團並與適當活化的雙功能鍵合劑反應，雙功能鍵合劑可由商業獲得或由有機合成的標準方法製備。如，Weber等，Bioconj.Chem.1431-437(1990)；Arano等，Bioconj.Chem.271-76(1991)；Quadri等，在「Cancer Imaging withRadiolabelled Antibodies」(Goldenberg，ed.1990)第201-213頁；King等，Cancer Research 546176-6185(1994)描述製備雙功能 鍵合劑的方法。典型的活化是N-羥基琥珀醯亞胺與二環己基碳二亞胺形成N-羥基琥珀醯亞胺酯。若需要，將雙功能鍵合劑的另一端去保護，並如上述活化然後同完全保護的、N末端游離的CCK激動劑類似物反應。在標準條件下獲得側鏈的去保護和從樹脂中除去。用反相C18高效液相色譜，乙腈/含水TFA梯度洗脫純化交聯雙肽，隨後凍幹。用電子噴射質譜鑑定所有交聯的雙肽，用反相C18高效相色譜測純度。除鹼的側鏈選擇性暴露保護和羧酸鹽側鏈選擇性暴露活化保護外，側鏈的連接和其它轉化都可通過上述步驟完成。對兩種選擇的保護性基團是該項技術領域中熟知的。鹼側鏈保護性基團的一個例子為化學穩定而光化學不穩定的NVOC基團。保護酸側鏈的基團的例子為三氯乙酯，其後可用鋅/乙酸選擇性切割。
上述參考的化合物可同各種無機和有機酸和鹼形成鹽。鹽包括用有機和無機酸製備的鹽，酸包括HCl、HBr、H2SO4、H3PO4、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、馬來酸、富馬酸和樟腦磺酸。用鹼製備的鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，和鹼土金屬鹽，如鈣和鎂鹽。最好選乙酸鹽、鹽酸鹽和三氟乙酸鹽。鹽可由常規方法形成，如游離酸或鹼同一種或多種適當的鹼或酸的等價物在鹽不溶解的溶液或介質中反應，或者在溶劑如水中反應然後通過真空或冷凍乾燥或在適當離子交換樹脂上交換鹽離子除去溶劑。製劑本發明有用組合物可以適於腸道外(包括肌肉和皮下)或鼻腔或透皮或適當膠囊化或由本技術領域所知口服給藥方法製備的形式提供。在某些情況下，在一個組合物或者溶液中共同給與支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑是方便的。在另外情況下，單獨給與CCK激動劑和支鏈澱粉激動劑更具優勢。以由醫師決定單個病人的適當的給藥方案最好。在標準製劑專著中描述了藥學上可接受的載體和製劑，見E.W.Martin著的Remington’s Pharmaceutical Sciences.亦見Wang.Y.J.和Hanson，M.A.「Parenteral Formulations of Protein and PeptidesStabilityand Stabilizers.」Journal of Parenteral Science and Technology技術報告號10，Supp.422S(1988)。本發明中有用的化合物可以以腸道外組合物注射液或輸液提供。最好將它們溶於水溶性載體中，如pH為4.3至7.4等滲緩衝液。這些化合物可用常規滅菌技術滅菌或除菌過濾。組合物可以含有為穩定製劑所需的藥學上可接受的輔助物質，如pH緩衝劑。有用的緩衝劑包括乙酸鈉/乙酸緩衝劑。可用長效藥物或「貯存」方式緩釋製劑使在注射或給藥後幾小時或幾天製劑有效量可緩慢釋放進入血液。
可用氯化鈉或其它藥劑可接受的試劑如葡萄糖、硼酸、酒石酸鹽、丙二醇、多元醇(如甘露糖醇和山梨醇)或其它無機或有機溶質調節所需的等滲性。特別優選氯化鈉作含有鈉離子的緩衝劑。若需要，可用增稠劑如甲基纖維素對上述組合物溶液增稠。
通過按照一般接受的步驟混合各組分製備本發明有用的組合物。如共混機或其它標準化裝置中將選擇的組分混合製成濃縮混合物，然後調至最終濃度，通過加入水或增稠劑調粘度和緩衝劑控制pH或附加溶質控制張力。劑量為便於醫師使用，可提供含有一定量本發明組合物的劑型(有或無另一種食物抑制劑)，可以以一種或多種劑量將食慾控制在選擇水平上。用於抑制食物攝取或食物攝取被有益降低情況下支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑或雜交肽治療有效量為可根據需要降低食物攝取的量。支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的劑量為約0.1μg/kg/day至約10μg/kg/day，最好為約0.1μg/kg/day至約1μg/kg/day，每種激動劑以單劑量或多劑量給與。雜交肽的劑量為約0.1μg/kg/day至約1mg/kg/day，較好為約0.1μg/kg/day至約10μg/kg/day，最好為約0.1μg/kg/day至1μg/kg/day。一般在抑制食慾時，可按治療需要同上述相似的劑量範圍給與病人組合物，然而，可以更頻繁給藥，一天一次、二次或三次。該領域技術人員將會認識到，治療劑的有效劑量隨許多因素變化，包括病人年齡和體重、病人的體質和基它因素。口服活性化合物可以口服，但劑量應增加5-10倍或者根據前述比例增(減)。如上所述，發明者發現支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的協同優勢為可以使劑量充分低而給與具有低生物利用度(約10-20％)的多肽、修飾肽或膠囊化肽製劑，如鼻腔、透皮或口服即可獲得足以產生食物攝取抑制的水平。
下列實施例為說明性的，但並不限制本發明方法和組合物。可經修飾或改造應用的其它合適的化合物也是適合的並屬於本發明範疇。
實施例1由Harlan Sprague Dawley，Madison，Wisconsin獲得8-10周齡的NIH/Swiss Webster(HsdNIHS)雄性小鼠。將動物以1212小時循環暴露於亮和暗條件下，在1800時關燈，室溫22°至25℃。除下述指明外，隨意供給水和食物。將動物在實驗前至少一周置於自然棲息環境下。
用Fmoc固相合成法合成大鼠支鏈澱粉(AC 128)。由PeninsulaLaboratories(Belmont，California)獲得縮膽囊素八肽26-33(CCK-8)。將肽溶於無菌水得到1mg/ml貯備液。腹膜內注射前進一步用無菌生理鹽水稀釋。
在實驗前將動物單獨放置並剝奪食物18-20小時。實驗前和實驗過程中允許動物隨意接近水。腹膜內注射大鼠支鏈澱粉或CCK-8或生理鹽水後，立即供給動物預稱重的食物團。在注射和供給食物30分鐘後通過稱食物團重測出每一動物食物攝取。如圖1所示，30分鐘時大鼠支鏈澱粉(AC 128)(1.0μg/kg)和CCK-8(1.0μg/kg)單獨和結合時對小鼠食物攝取的抑制。大鼠支鏈澱粉+CCK-8可抑制食物攝取72.3±7.5％(P＜0.0006)。單獨的大鼠支鏈澱粉抑制食物攝取-10.5±10.3％(不顯著)。單獨CCK-8抑制食物攝取10.6±16.9％(不顯著)。大鼠支鏈澱粉(AC 128)(實心圈)、CCK-8(空心圈)和大鼠支鏈澱粉+CCK(實心方形)對小鼠食慾抑制的劑量反應也用圖1顯示。
因此，大鼠支鏈澱粉+CCK-8在小鼠中30分鐘後有協同作用，劑量依賴性抑制食物攝取達93％(100μg劑量時)，ED50為0.28μg/kg±0.65對數單位。這些實驗表明在小鼠中聯合使用支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑可在劑量低於各自肽在小鼠中的ED50約100至3倍和在劑量約等於或者10倍低於單獨肽的最低有效劑量時產生有效的食物攝取調節作用。
權利要求
1.含有支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑以適合臨床給藥形式混合的組合物。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述支鏈澱粉激動劑為25，28，29Pro-h-支鏈澱粉。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述支鏈澱粉激動劑為S-降鈣素。
4.根據權利要求1的組合物，其中所述支鏈澱粉激動劑為h-支鏈澱粉。
5.根據權利要求1的組合物，其中所述CCK激動劑為CCKA激動劑。
6.根據權利要求1的組合物，其中所述CCK激動劑為CCK-8。
7.包含給與所述哺乳動物能有效減少食物攝取的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑的組合物以減少哺乳動物食物攝取的方法。
8.包含共同給與所述哺乳動物治療有效量的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑以控制哺乳動物食慾的方法。
9.包含共同給與所述受治療者有效減少食物攝取的支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑組合物以控制受治療者體重的方法。
10.根據權利要求7，8或9的方法，其中所述支鏈澱粉激動劑為h-支鏈澱粉。
11.根據權利要求7，8或9的方法，其中所述支鏈澱粉激動劑為S-降鈣素。
12.根據權利要求7，8或9的方法，其中所述支鏈澱粉激動劑為25，28，29Pro-h-支鏈澱粉。
13.根據權利要求7，8或9的方法，其中所述CCK激動劑為CCKA激動劑。
14.根據權利要求7，8或9的方法，其中所述CCKA激動劑為CCK-8。
15.根據權利要求7，8或9中任一項的方法，其中所述支鏈澱粉激動劑和所述CCK激動劑各以約0.1μg/kg/ady至約10μg/kg/ady的量給藥。
16.根據權利要求7，8或9中任一項的方法，其中所述支鏈澱粉激動劑和所述CCK激動劑各以約0.1μg/kg/ady至約1μg/kg/ady的量給藥。
17.包含通過下列結構共價連接的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過每個肽N末端NH2或/和通過每個肽側鏈NH2(只要該肽中存在含NH2的側鏈)相連；並且(a)R1為CONH(CH2)N，COO(CH2)n，或CO(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位取代)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH2；和(e)R5為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6；
18.包含通過下列結構共價相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過每個肽N末端NH2和每個肽側鏈NH2(只要該肽存在含有NH2的側鏈)相連；並且(a)R1為CONH(CH2)n，COO(CH2)N，或CO(CH2)N；和(b)R2為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6。
19.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有如下序列KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並且其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
20.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列KCNTATCATQKLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並且其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
21.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
22.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DY(OSO3H)MGWMDF-NH2
23.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DYMGWMDF-NH2
24.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列MGWMDF-NH2
25.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列GWMDF-NH2
26.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列WMDF-NH2
27.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2
28.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDYMGWMDF-NH2
29.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KMGWMDF-NH2
30.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KGWMDF-NH2
31.根據權利要求17或18的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KWMDF-NH2
32.包含通過下列結構共價連接的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過每個肽側鏈羧基(只要在該肽中存在含羧基的側鏈)連於R1，及通過每個肽N末端NH2或側鏈NH2(只要在該肽中存在含有NH2的側鏈)連於R5；和(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4b(鄰、間或對位相連)，COOC6H4(鄰、間或對位相連)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4b(鄰、間或對位相連)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；(e)R5為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6；
33.包含通過下列結構共價相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-其中上述支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽通過每個肽側鏈羧基(只要該肽存在含有羧基的側鏈)連於R1，及通過每個肽的N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含NH2的側鏈)連於R2；並且(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n；(b)R2為(CH2)nNHCO，(CH2)nOCO，(CH2)nCO，其中n＝1-6。
34.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列KCNTATCATQRLANELVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並且其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
35.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
36.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DY(OSO3H)MGWMDF-NH2
37.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DYMGWMDF-NH2
38.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列MGWMDF-NH2
39.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列GWMDF-NH2
40.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列WMDF-NH2
41.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2
42.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDYMGWMDF-NH2
43.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KMGWMDF-RH2
44.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KGWMDF-NH2
45.根據權利要求32或33的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KWMDF-NH2
46.包含通過下列結構共價相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過每個肽N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽中存在含NH2的側鏈)連於R1，及通過每個肽側鏈羧酸(只要該肽中存在含羧基的側鏈)連於R5；(a)R1為CONH(CH2)N、COO(CH2)n、或CO(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為COONH(CH2)n(其中n＝1-6)，COO(CH2)n(其中n＝1-6)，CO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，NHCOC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；(e)R5為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6；
47.包含通過下列結構共價相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過每個肽N末端NH2或側鏈NH2(只要該肽存在含有NH2的側鏈)連於R1，通過每個肽側鏈羧酸(只要該肽存於含羧基的側鏈)連於R2；和(a)R1為CONH(CH2)n，COO(CH2)N，或CO(CH2)N；和(b)R2為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6。
48.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並且其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
49.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列KCNTATCATQKLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並且其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
50.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2其中1和7位胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
51.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DY(OSO3H)MGWNDF-NH2
52.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DYMGWMDF-NH2
53.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列MGWMDF-NH2
54.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列GWMDF-NH2
55.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列WMDF-NH2
56.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDY(OSO3H)MGWMDF-NH2
57.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KDYMGWMDF-NH2
58.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列 KMGWMDF-NH2
59.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KGWMDF-NH2
60.根據權利要求46或47的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列KWMDF-NH2
61.包含通過下列結構共價連接的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-R3-R4-R5-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過兩種肽側鏈羧基(只要該肽中存在含羧基的側鏈)相連；並且(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n，其中n＝1-6；(b)R2為OCO(CH2)n(其中n＝1-6)，NHCO(CH2)n(其中n＝1-6)，OCOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4(鄰、間或對位連接)，COOC6H4O(鄰、間或對位取代)，NHCOC6H4(鄰、間或對位連接)，CONHC6H4(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4O(鄰、間或對位取代)，CONHC6H4NH(鄰、間或對位取代)，O-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)，和NH-X(其中X為通過其羧基連接的任何胺基酸)；(c)R3為CH2、CF2、CO、CS或CNH；(d)R4為O或NH；和(e)R5為(CH2)nNHCO或(CH2)nO，其中n＝1-6。
62.包含通過下列結構相連的支鏈澱粉激動劑肽和CCK激動劑肽的雜交肽組合物-R1-R2-其中所述支鏈澱粉激動劑肽和所述CCK激動劑肽通過兩種肽側鏈羧基.(只要該肽中存在含有羧基的側鏈)相連；並且(a)R1為NH(CH2)n或O(CH2)n；和(b)R2為(CH2)nNH或(CH2)nO，其中n＝1-6
63.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列KCNTATCATQRLANELVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2並直其中2和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
64.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述支鏈澱粉激動劑肽具有下列序列CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2其中1和7位半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連。
65.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DY(OSO3H)MGWMDF-NH2
66.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列DYMGWMDF-NH2
67.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列MGWMDF-NH2
68.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列GWMDF-NH2
69.根據權利要求61或62的雜交肽，其中所述CCK激動劑肽具有下列序列WMDF-NH2
70.根據權利要求17，32，33，46，47，61或62中任一項的雜交肽，其中鍵合劑骨架中至少有一個雜原子為氧。
71.根據權利要求17，32，33，46，47，61或62中任一項的雜交肽，其中鍵合劑骨架中所有雜原子為氮。
72.包含下列結構的分子的雜交肽組合物R1-C-R2-C-R3-R4-R5其中(a)R1為游離N末端或用乙醯胺、丙醯胺、丁醯胺、異丁醯胺、或異己醯胺醯胺化N-末端；或用乙醯胺、丙醯胺、丁醯胺、異丁醯胺或異己醯胺醯胺化的賴氨酸(L)；(b)R2為選自NTAT、GTAT、NTVT、NMAT、SNLST、ASLST和GNLST的一種胺基酸序列；(c)R3為選自ATQRLANFLVH和VLGKLSQELHK的一種胺基酸序列；(d)R4為選自SSNNFGPILPP和LQTYPR的一種胺基酸序列；(e)R3為選自DYMGWMDF-NH2，TNTGWMDF-NH2，TNVGWMDF-NH2，TNTGWLDF-NH2，TNVGWLDF-NH2，TNTGSNDF-NH2，TNVGSNDF-NH2，TNTGSNDY-NH2和TNVGSNDY-NH2的一種胺基酸序列。
73.含有下列胺基酸序列的組合物KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPDYMGWMDF-NH2。
74.含有下列胺基酸序列的組合物CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRDYMGWMDF-NH2。
75.含有下列胺基酸序列的組合物KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNTGWMDF-NH2。
76.含有下列胺基酸序列的組合物CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGWMDF-NH2。
77.含有下列胺基酸序列的組合物KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNTGWLDF-NH2。
78.含有下列胺基酸序列的組合物CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGWLDF-NH2。
79.含有下列胺基酸序列的組合物KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNDF-NH2。
80.含有下列胺基酸序列的組合物CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNVGSNDF-NH2。
81.含有下列胺基酸序列的組合物KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNDY-NH2。
82.含有下列胺基酸序列的組合物CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNVGSNDY-NH2。
83.包括給與所述哺乳動物有效治療量的權利要求1-6、17、18、32、33、46、47、61、63或72中任一項的組合物抑制哺乳動物食物攝取的方法。
84.包括給與所述哺乳動物有效治療量的權利要求1-6、17、18、32、33、46、47、61、63或72中任一項的組合物控制哺乳動物食慾的方法。
85.包括給與所述哺乳動物有效治療量的權利要求1-6、17、18、32、33、46、47、61、63或72中任一項的組合物控制哺乳動物體重的方法。
全文摘要
提供降低食物攝取、抑制食慾和控制體重的組合物和方法。該組合物可包括支鏈澱粉激動劑和CCK激動劑或雜交肽。
文檔編號A61K38/22GK1192689SQ96196092
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者T·J·林克, A·A·楊, N·R·A·比萊, K·S·普裡克特 申請人:安米林藥品公司