超長互補決定區及其用途

2023-06-05 20:19:36 1

超長互補決定區及其用途
【專利摘要】本文公開了免疫球蛋白構建體，其包含至少一個免疫球蛋白結構域或其片段；以及連接到或插入所述免疫球蛋白結構域的治療性多肽或其衍生物或變體。本文還提供了免疫球蛋白構建體，其包含含有互補決定區3(CDR3H)或其片段中的隆突結構域的至少一部分的哺乳動物免疫球蛋白重鏈；以及連接到或插入所述CDR3H的隆突結構域的治療性多肽。本文還提供了免疫球蛋白構建體，其包含含有互補決定區3(CDR3H)或其片段中的莖結構域的至少一部分的哺乳動物免疫球蛋白重鏈；以及連接到和插入所述CDR3H的莖結構域的治療性多肽。本文還描述了用於治療和預防受試者的疾病或狀況的方法和包含本文所述免疫球蛋白構建體的組合物。
【專利說明】超長互補決定區及其用途 相關申請的奪叉引用
[0001] 本申請要求2012年1月9日提交的美國臨時申請No. 61/584,680和2012年7月 13日提交的美國臨時申請No. 61/671，629的權益，這兩篇申請均通過引用全部併入本文。

【技術領域】
[0002] 本文描述了包含超長CDR3的至少一部分的免疫球蛋白構建體，製備此類構建體 的方法，包含此類構建體的藥物組合物和藥物，以及利用此類構建體和組合物來預防、抑制 和/或治療受試者的疾病或狀況的方法。

【背景技術】
[0003] 抗體是脊椎動物免疫系統響應於外來物質（抗原）而形成的天然蛋白質，主要用 於防禦感染。一個世紀以來，在人工條件下，在動物中誘導並得到抗體以便用於疾病狀況的 治療或診斷或用於生物研究。每個產生個體抗體的細胞生成單一類型的具有化學上確定的 組合物的抗體，然而直接從動物血清中獲得的以應對抗原接種的抗體實際上包含由產生個 體抗體的細胞群組生成的不同分子群組（例如，多克隆抗體）。
[0004] 與其他脊椎動物抗體相比，一些牛抗體具有不尋常的長VH⑶R3序列。例如，約 10%IgM包含多達61個胺基酸長的"超長"⑶R3序列。這些不尋常的⑶R3通常具有多個 半胱氨酸。通過稱為V(D)J重組的過程形成功能性VH基因，其中D-區域編碼⑶R3的很大 一部分。編碼超長序列的獨特D-區域已經在牛中進行了確認。超長CDR3部分在牛基因 組中編碼，並與人相比為其抗體所有組成成分提供了獨有特徵。Kaushik等人（美國專利 6, 740, 747和No. 7, 196, 185)公開了闡明作為探針是有用的牛特有的多種牛種系D-基因序 列和闡明作為疫苗載體是有用的牛VDJ盒。


【發明內容】

[0005] 本發明提供了包含超長⑶R3的抗體，包括含有超長⑶R3的文庫，及其用途。
[0006] 本發明還提供了抗體或其結合片段的文庫，其中該抗體或其結合片段包含超長 CDR3。
[0007] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度、40個或更多個胺基酸長度、45個或更多個胺基酸長度、50個或更多 個胺基酸長度、55個或更多個胺基酸長度或60個或更多個胺基酸長度。
[0008] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度。
[0009] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基、4個或更多個半胱氨酸殘基、5個或更多個半胱氨酸殘基、6個或更 多個半胱氨酸殘基、7個或更多個半胱氨酸殘基、8個或更多個半胱氨酸殘基、9個或更多個 半胱氨酸殘基、10個或更多個半胱氨酸殘基、11個或更多個半胱氨酸殘基或12個或更多個 半胱氨酸殘基。
[0010] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基。
[0011] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 包含半胱氨酸基序。
[0012] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個或任何上文或下文提到的實施 方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個或任何上 文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQSEQIDN0S: 136-156 的組。
[0013] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0014] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含JH 序列或其衍生物。
[0015] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0016] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含位 於VH序列和DH序列之間的含有2個至6個或更多個胺基酸殘基的附加胺基酸序列。
[0017] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 牛序列。
[0018] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是非抗體 或人類序列。
[0019] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列取代超長 ⑶R3的至少一部分。
[0020] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細胞因子、毒素或其組合。
[0021] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是細胞因 子。
[0022] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞因子是粒細胞 集落刺激因子（G-SCF)。
[0023] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含是 接頭的附加序列。
[0024] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，接頭與非抗體序列 的C-端、N-端或兩個C-端和N-端連接。
[0025] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，接頭是（GGGGS) n(SEQIDN0:339)，其中n是0至5的整數。另外或此外，接頭是（GSG)n(SEQIDN0:342)、 GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS(SEQIDN0:338)。
[0026] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 X1X2X3X4X5Xn基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)， 其中&是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天 冬醯胺（N)，其中&是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是組氨 酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，其中&是穀氨醯 胺（Q)，且其中η是27-54。
[0027] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDΝ0:159)或TSVHQ(SEQIDΝ0:160)。
[0028] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3進一步 包含（XaXb)z基序，其中Xa是任何胺基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Υ)、丙氨酸（F)、色氨 酸（W)和組氨酸（H)的組的芳香族胺基酸，且其中ζ是1-4。
[0029] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，（XaXb)z基序是 YXYXYX。
[0030] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 X1X2X3X4X5Xn(XaXb)z基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸 (V) ，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V) 或天冬醯胺（N)，其中X3是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是 組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5是 穀氨醯胺（Q)，其中Xa是任何胺基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸 (W) 和組氨酸⑶，其中η是27-54且其中ζ是1-4。
[0031] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)，且其中（XaXb)z基序是YXYXYX。
[0032] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TSVHQETKKYQ(SEQIDNO. 157)〇
[0033] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VHQETKKYQ(SEQIDNO:158)〇
[0034] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CTTVHQXn(SEQIDNO. 223)。
[0035] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CTSVHQXn(SEQIDNO. 223)，其中η是 1-8。
[0036] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TTVHQ(SEQIDNO. 159)〇
[0037] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TSVHQ(SEQIDNO. 160)〇
[0038] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VHQ。
[0039] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 KKQ。
[0040] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VYQ。
[0041] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CX1X2X3X4Q(SEQIDN0:228)，其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，其中X3是V或 K，且其中X4是H、K或Y。
[0042] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CXfVHQGEQID勵:230)，其中父1是1\5、六或6，且其中父2是1\5、六、？或1。
[0043] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CXiX2VX3QGEQID勵:232)，其中乂1是1\5^或6，其中乂2是1\5、六、？或1，且其中乂 3是!1、 Y或K。
[0044] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CXfKKQGEQID勵:234)，其中父1是1\5、4或6，且其中父2是1\5、六、？或1。
[0045] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YTYNYEW(SEQIDNO:235)。
[0046] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YX1YX2GEQIDNO: 296)，其中X2是E或D。
[0047] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YX1YX2Y(SEQIDNO:297) 〇
[0048] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YEX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0049] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YDX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0050] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 XYE，其中X是T、S、N或I。
[0051] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 XYD，其中X是T、S、N或I。
[0052] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 Y(E/D)X1XnWKSEQIDNOS:304-305)，其中X1是H、W、N、F、I或Y，且其中η是 1-4。
[0053] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0054] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是反芻 動物CDR3。
[0055] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，反芻動物是母牛。
[0056] 本公開還提供了多核苷酸編碼的抗體或其結合片段的文庫，其中編碼的抗體或其 結合片段包含超長⑶R3。
[0057] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度、40個或更多個胺基酸長度、45個或更多個胺基酸長度、50個或更多 個胺基酸長度、55個或更多個胺基酸長度或60個或更多個胺基酸長度。
[0058] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度。
[0059] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基、4個或更多個半胱氨酸殘基、5個或更多個半胱氨酸殘基、6個或更 多個半胱氨酸殘基、7個或更多個半胱氨酸殘基、8個或更多個半胱氨酸殘基、9個或更多個 半胱氨酸殘基、10個或更多個半胱氨酸殘基、11個或更多個半胱氨酸殘基或12個或更多個 半胱氨酸殘基。
[0060] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基。
[0061] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 包含半胱氨酸基序。
[0062] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個或任何上文或下文提到的實施 方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個或任何上 文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQIDN0S: 136-156 的組。
[0063] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0064] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含JH 序列或其衍生物。
[0065] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0066] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含位 於VH序列和DH序列之間的含有2個至6個或更多個胺基酸殘基的附加胺基酸序列。
[0067] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 牛序列。
[0068] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是非抗體 或人類序列。
[0069] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列取代超長 ⑶R3的至少一部分。
[0070] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非抗體序列是激 素、淋巴因子、白介素、趨化因子、細胞因子、毒素或其組合。
[0071] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是細胞因 子。
[0072] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞因子是粒細胞 集落刺激因子（G-CSF)。
[0073] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含是 接頭的附加序列。
[0074] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，接頭與非抗體序列 的C-端、N-端或兩個C-端和N-端連接。
[0075] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，接頭是（GGGGS) n(SEQIDN0:339)，其中η是0 至 5 的整數。另外，接頭是（GSG)n(SEQIDN0:342)、 GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS(SEQIDN0:338)。
[0076] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 X1-X2-X3-X4-X5基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸 (V)，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V) 或天冬醯胺（N)，其中&是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是 組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中&是 穀氨醯胺（Q)。
[0077] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)。
[0078] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3進一步 包含（XaXb)z基序，其中Xa是選自包含酪氨酸（Y)、丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組氨酸⑶的 組的芳香族胺基酸，其中Xb是任何胺基酸殘基，且其中z是1-4。
[0079] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，（XaXb)z基序是 YXYXYX。
[0080] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含X1X 2X3X4X5Xn(X6X7)z基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸⑶或纈氨酸 (V)，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或 天冬醯胺（N)，其中X3是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是組 氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5是穀氨 醯胺（Q)，其中Xa是任何胺基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W) 和組氨酸（H)的組的芳香族胺基酸，其中η是27-54,且其中z是1-4。
[0081] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)，且其中（Xa-Xb)z基序是YXYXYX。
[0082] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TSVHQETKKYQ(SEQIDNO. 157)〇
[0083] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VHQETKKYQ(SEQIDNO:158)〇
[0084] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CTTVHQXn(SEQIDNO. 223)〇
[0085] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CTSVHQXn(SEQIDNO. 224)，其中η是 1-8。
[0086] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TTVHQ(SEQIDNO. 159)〇
[0087] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 TSVHQ(SEQIDNO. 160)〇
[0088] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VHQ。
[0089] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 KKQ。
[0090] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 VYQ。
[0091] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CX1X2X3X4Q,其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，其中X3是V或K，且其中X4是 H、K*Y。
[0092] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CX1X2VHQ,其中X1是T、S、A或G，且其中X2是T、S、A、P或I。
[0093] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CX1X2VX3Q,其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，且其中X3是H、Y或K。
[0094] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 CX1X2KKQ,其中X1是T、S、A或G，且其中X2是T、S、A、P或I。
[0095] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YTYNYEW(SEQIDNO:235)。
[0096] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YX1YX2,其中X2是E或D。
[0097] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YX1YX2Yo
[0098] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YEX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0099] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 YDX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0100] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 XYE，其中X是T、S、N或I。
[0101] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 XYD，其中X是T、S、N或I。
[0102] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含 Y(EzD)X1XnW，其中Xl是H、W、N、F、I或Y，且其中η是 1-4。
[0103] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0104] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含反 芻動物CDR3。
[0105] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，反芻動物是母牛。
[0106] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 以空間尋址的格式（spatiallyaddressedformat)存在。
[0107] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，多核苷酸編碼的抗 體或其結合片段以空間尋址的形式存在。
[0108] 本發明還提供了包含本文公開的多核苷酸的任何文庫的載體文庫。
[0109] 本發明還提供了包含本文公開的載體的任何文庫的宿主細胞文庫。
[0110] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞是細菌、病毒 或噬菌體。
[0111] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 在細胞表面上展示。
[0112] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞分泌抗體或其 結合片段。
[0113] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 以空間尋址的形式出現。
[0114] 本發明還提供了包含超長CDR3的抗體或其結合片段，其中超長CDR3包含非牛序 列。
[0115] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度、40個或更多個胺基酸長度、45個或更多個胺基酸長度、50個或更多 個胺基酸長度、55個或更多個胺基酸長度或60個或更多個胺基酸長度。
[0116] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是35個 或更多個胺基酸長度。
[0117] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基、4個或更多個半胱氨酸殘基、5個或更多個半胱氨酸殘基、6個或更 多個半胱氨酸殘基、7個或更多個半胱氨酸殘基、8個或更多個半胱氨酸殘基、9個或更多個 半胱氨酸殘基、10個或更多個半胱氨酸殘基、11個或更多個半胱氨酸殘基或12個或更多個 半胱氨酸殘基。
[0118] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含3個 或更多個半胱氨酸殘基。
[0119] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 包含半胱氨酸基序。
[0120] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個或任何上文或下文提到的實施 方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個或任何上 文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQIDN0S: 136-156 的組。
[0121] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是非抗體 序列或人類序列。
[0122] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0123] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含JH 序列或其衍生物。
[0124] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3包含：非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0125] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長⑶R3包含位 於VH序列和DH序列之間的含有2個至6個或更多個胺基酸殘基的附加胺基酸序列。
[0126] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列取代超長 ⑶R3的至少一部分。
[0127] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細胞因子、毒素或其組合。
[0128] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，非牛序列是細胞因 子
[0129] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞因子是粒細胞 集落刺激因子（G-CSF)。
[0130] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0131] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，超長CDR3是反芻 動物CDR3。
[0132] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，反芻動物是母牛。
[0133] 本發明還提供了本文公開的多核苷酸編碼的任何抗體或其結合片段。
[0134] 本發明還提供了包含本文公開的任何多核苷酸編碼的抗體或其結合片段。
[0135] 本發明還提供了包含本文公開的任何載體的宿主細胞。
[0136] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞是細菌、病毒 或噬菌體。
[0137] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，抗體或其結合片段 在細胞表面上展示。
[0138] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，細胞分泌抗體或其 結合片段。
[0139] 本發明還提供了製備包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段的方法，包括： 在其中表達多核苷酸序列且產生包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段的條件下， 培養包含編碼本文公開的任何抗體的多核苷酸的宿主細胞。
[0140] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，該方法進一步包括 從宿主細胞培養回收包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段。
[0141] 本發明還提供了包含本文公開的任何抗體或其結合片段的藥物組合物。
[0142] 本發明還提供了治療有需要的哺乳動物的方法，其包括向哺乳動物施用一定量的 本文公開的任何抗體。
[0143] 在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，哺乳動物是人類。
[0144] 在一些實施方案中是組合抗體或其片段，其中組合抗體或其片段的至少一部分是 基於或來源於超長⑶R3的至少一部分。
[0145] 在一些實施方案中是包含超長⑶R3序列的至少一部分和非牛序列的至少一部分 的抗體或其片段。
[0146] 在一些實施方案中是抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中第一抗體序 列的至少一部分是來源於超長CDR3的至少一部分；(b)非抗體序列；以及（c)任選地，第二 抗體序列，其中第二抗體序列來源於超長CDR3的至少一部分。
[0147] 本文公開的抗體可以是嵌合的、人工程化的或人源化的抗體。本文公開的抗體可 以是牛工程化的、牛源化的或全牛的抗體。本文公開的抗體可包含：Fab、scFv、dsFv、雙抗 體、（dsFv)2、微抗體、柔性微抗體或雙特異性片段。本文公開的抗體可以是分離的抗體。
[0148] 本文公開的抗體可進一步包含非抗體序列。非抗體序列可源自哺乳動物。該哺乳 動物可以是牛、人或非牛哺乳動物。本文公開的抗體可包含源自非牛動物的非抗體序列。非 牛動物可以是蠍子。非牛動物可以是蜥蜴。蜥蜴可以是希拉毒蜥。非抗體序列可以是來源 於生長因子。生長因子可以是GCSF、GMCSF或FGF21。GCSF可以是牛GCSF。另外，GCSF可以 是人GCSF。GMCSF和/或FGF21可以是來自人類。非抗體序列可以來源於細胞因子。細胞 因子可以是β-幹擾素。非抗體序列可以來源於激素。激素可以是毒蜥外泌肽-4、GLP-1、 生長激素抑制素或紅細胞生成素。GLP-I和/或紅細胞生成素可以是來自人類。非抗體序列 可以是來源於毒素。毒素可以是Mokal、VM-24、齊考諾肽、氯代毒素或原毒素2 (Pr0TxII)。 非抗體序列可以是IL8、齊考諾肽、生長激素抑制素、氯代毒素、SDFl(α)或IL21。非抗體序 列可包含基於或來源於SEQIDN0S:317-332的胺基酸序列。非抗體序列可取代超長⑶R3 的至少一部分。非抗體序列可插入至超長⑶R3的序列。非抗體序列可與抗體的至少一部 分（例如，超長CDR3、可變區、重鏈、輕鏈）偶聯。非抗體序列可與超長CDR3、接頭、切割位 點、非牛序列、非超長CDR3抗體序列或其組合連接。非抗體序列可與超長CDR3、接頭、切割 位點、非牛序列、非超長CDR3抗體序列或其組合毗鄰。
[0149] 本文公開的抗體可包含基於或來源於母牛超長CDR3的超長CDR3。本文公開的抗 體的至少一部分可源自哺乳動物。本文公開的抗體的第一抗體序列的至少一部分和/或第 二抗體序列的至少一部分可源自哺乳動物。哺乳動物可以是牛、人或非牛哺乳動物。
[0150] 本文公開的抗體可包含3個或更多個胺基酸長度。本文公開的抗體可包含基於或 來源於超長CDR3的序列。本文公開的抗體可包含基於或來源於超長CDR3的莖結構域的1 個或多個胺基酸殘基。本文公開的抗體可包含基於或來源於超長CDR3的隆突結構域的1 個或多個胺基酸殘基。
[0151] 本文公開的抗體的至少一部分可基於或來源於本文公開的超長⑶R3的至少一部 分。基於或來源於超長CDR3的至少一部分的部分抗體可以是20個或更少個胺基酸長度。 基於或來源於超長CDR3的至少一部分的部分抗體可以是3個或更多個胺基酸長度。
[0152] 本文公開的抗體可包含來源於超長CDR3的莖結構域的1個或多個保守基序。來 源於超長CDR3的莖結構域的1個或多個保守基序可包含本文公開的任何莖結構域保守基 序。
[0153] 本文公開的部分超長⑶R3可包含超長⑶R3的莖結構域的至少一部分、超長⑶R3 的隆突結構域的至少一部分或其組合。
[0154] 本文公開的抗體可包含選自SEQIDN0S: 157-307和SEQIDN0S: 333-336中任一 個的序列。本文公開的抗體可包含與選自SEQIDN0S: 157-224和235-295中任一個的序 列具有50%或更1?同源的序列。
[0155] 部分本文公開的任何抗體可基於或來源於超長CDR3序列的至少一部分。部分本 文公開的抗體可基於或來源於兩個或更多個不同超長CDR3序列的至少一部分。
[0156] 在本文公開的任何實施方案中，部分超長CDR3基於或來源於BLV1H12超長CDR3 序列。部分超長〇01?3可基於或來源於與^^1!112超長001?3序列具有50(%或更高同源的序 列。部分超長CDR3可基於或來源於BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18超長 CDR3序列。部分超長CDR3可基於或來源於與BLV5B8、BLVCV1、BLV?3、BLV8C11、BF1H1或 F18超長⑶R3序列具有50%或更高同源的序列。
[0157] 本文公開的抗體可包含含有3個或更多個胺基酸長度的第一和/或第二抗體序 列。來源於超長⑶R3的至少一部分的部分第一抗體序列和/或來源於超長⑶R3的至少一 部分的部分第二抗體序列可以是20個或更少胺基酸長度。來源於超長CDR3的至少一部分 的部分第一抗體序列和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列可以是3個或 更多個胺基酸長度。
[0158] 在本文公開的任何實施方案中，第一和/或第二抗體序列包含基於或來源於超長 CDR3的莖結構域的一個或多個胺基酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含基於或來源於 超長CDR3的隆突結構域的一個或多個胺基酸殘基。來源於超長CDR3的隆突結構域的一個 或多個胺基酸殘基可以是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含來 源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。來源於超長CDR3的莖結構域的一個或 多個保守基序可包含選自任一SEQIDN0S:157-307和SEQIDN0S:333-336的序列。
[0159] 在本文公開的任何實施方案中，來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列 的部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的部分包含選自任一SEQID N0S:157-307和SEQIDN0S:333-336的序列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的部分可包含與選自任 一SEQIDN0S: 157-224和235-295的序列具有50%或更高同源的序列。來源於超長CDR3 的至少一部分的部分第一抗體序列可包含選自任一SEQIDN0S: 157-234的序列。來源於 超長⑶R3的至少一部分的部分第一抗體序列可包含與選自任一SEQIDNOS:157-224序列 具有50%或更商同源的序列。
[0160] 在本文公開的任何實施方案中，來源於超長CDR3的至少一部分的部分第二抗體 序列包含選自任一SEQIDNOS:235-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來源於超長CDR3 的至少一部分的部分第二抗體序列可包含可與選自任一SEQIDN0S:235-295的序列具有 50%或更高同源的序列。來源於超長CDR3的至少一部分的部分第一抗體序列和/或來源 於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列可來源於相同的超長CDR3序列。
[0161] 在本文公開的任何實施方案中，來源於超長CDR3的至少一部分的部分第一抗體 序列和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列是由兩個或更多個不同超長 CDR3序列衍生。第一和/或第二抗體序列的部分超長CDR3可基於或來源於BLV1H12超長 CDR3序列。第一和/或第二抗體序列的部分超長CDR3可基於或來源於與BLV1H12超長 CDR3序列具有50%或更高同源的序列。第一和/或第二抗體序列的部分超長CDR3可基於 或來源於BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 超長CDR3 序列。第一和 / 或第 二抗體序列的部分超長CDR3可基於或來源於與BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl 或F18超長⑶R3序列具有50 %或更高同源的序列。
[0162] 在本文公開的任何實施方案中，超長CDR3基於或來源於具有35個或更多個氨基 酸長度的超長CDR3。超長CDR3可基於或來源於包含3個或更多個半胱氨酸殘基的超長CDR3。
[0163] 在本文公開的任何實施方案中，超長CDR3基於或來源於可包含一個或多個半胱 氨酸基序的超長⑶R3。一個或多個半胱氨酸基序可選自包含SEQIDN0S:45-156的組。在 每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQID NOS: 45-99的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基 序選自包含SEQIDN0S:45-135的組。在每個或任何上文或下文提到的實施方案的一些實 施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135的組。在每個或任何上文或下文提 到的實施方案的一些實施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 136-156的組。
[0164] 本文公開的抗體可基於或來源於具有35個或更多個胺基酸長度的超長CDR3。本 文公開的抗體可基於或來源於包含3個或更多個半胱氨酸殘基的超長CDR3。本文公開的抗 體可基於或來源於包含1個或多個半胱氨酸基序的超長CDR3。
[0165] 本文公開的抗體可包含具有35個或更多個胺基酸長度的超長CDR3。本文公開的 抗體可包含含有3個或更多個半胱氨酸殘基的超長CDR3。本文公開的抗體可包含含有一個 或多個半胱氨酸基序的超長CDR3。
[0166] 在本文公開的任何實施方案中，超長⑶R3可以是重鏈⑶R3。超長⑶R3可包含來 源於或基於非人DH序列的胺基酸序列。超長CDR3可包含來源於或基於JH序列的胺基酸 序列。超長CDR3可包含來源於或基於非人VH序列的胺基酸序列、來源於或基於非人DH序 列的胺基酸序列和/或來源於或基於JH序列的胺基酸序列。超長CDR3可包含位於在VH 衍生的胺基酸序列和DH衍生的胺基酸序列間的含有至少約2個胺基酸殘基的附加胺基酸 序列。
[0167] 本文公開的任何抗體可包含基於或來源於選自SEQIDN0S: 24-44的序列的序列、 編碼基於或來源於SEQIDNOS:2-22的DNA的DNA序列的抗體或其結合片段。本文公開的 任何抗體可包含基於或來源於選自SEQIDN0:23的序列的序列，該抗體或其結合片段由基 於或來源於SEQIDNO: 1的DNA的DNA序列編碼。
[0168] 本文公開的任何超長⑶R3可包含基於或來源於選自SEQIDN0S: 24-44的序列的 序列。本文公開的任何抗體可包含基於或來源於選自SEQIDN0:23的序列的序列。本文 公開的任何超長CDR3可由來源於或基於SEQIDN0S: 2-22的DNA序列進行編碼。本文公 開的任何抗體可包含：由來源於或基於SEQIDNO: 1的DNA序列編碼的部分。
[0169] 本文公開的任何抗體可包含一個或多個接頭。本文公開的任何抗體可包含第一接 頭序列。本文公開的任何抗體可包含第二接頭序列。第一和第二接頭序列可包含相同序列。 第一和第二接頭序列可包含不同的序列。第一和第二接頭序列可以是相同的長度。第一和 /或第二接頭序列可以是不同的長度。第一和/或第二接頭序列可以是3個或更多個氨基 酸長度。
[0170] 第一和/或第二接頭序列可將非抗體序列連接到基於或來源於超長CDR3的部分 的部分。第一和/或第二連接序列可將非抗體序列連接到第一抗體徐列。第一和/或第二 接頭序列可將非抗體序列連接到第二抗體序列。第一和/或第二接頭序列可與非抗體序 列、超長CDR3序列的部分、切割位點序列、非牛序列、抗體序列或其組合毗鄰。
[0171] 第一和/或第二接頭序列可包含一個或多個甘氨酸殘基。第一和/或第二接頭序 列可包含兩個或多個連續的甘氨酸殘基。第一和/或第二接頭序列可包含一個或多個絲氨 酸殘基。第一和/或第二接頭序列可包含一個或多個極性胺基酸殘基。一個或多個極性氨 基酸殘基可選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺。極性胺基酸殘基可包含不帶電荷的 側鏈。第一和/或第二接頭序列可包含（GGGGS)J^^l」，其中η= 1至5 ;GGGSGGGGS序列； GGGGSGGGS序列；(GSG)n序列，其中η> 1 ;或其組合。
[0172] 本文公開的任何抗體可包含一個或多個切割位點。該一個或多個切割位點可包含 蛋白酶的識別位點。蛋白酶可以是Xa或凝血酶因子。一個或多個切割位點可包含IEGR的 胺基酸序列。
[0173] 一個或多個切割位點可在第一抗體序列和非抗體序列之間。一個或多個切割位點 可在一個或多個接頭和非抗體序列之間。一個或多個切割位點可在第一抗體序列和一個或 多個接頭之間。一個或多個切割位點可在第二抗體序列和一個或多個接頭之間。一個或多 個切割位點可與非抗體序列、超長CDR3序列的一部分、接頭序列、抗體序列或其組合毗鄰。
[0174] 在一些實施方案中是抗體或其結合片段的文庫，其中抗體或其片段可包含超長 CDR3。
[0175] 在一些實施方案中是抗體或其結合片段的文庫，其中抗體或其結合片段可包含本 文公開的任何抗體。
[0176] 在一些實施方案中是包含多個多核苷酸的核酸文庫，所述多核苷酸含有編碼抗體 或其結合片段的序列，其中抗體或其結合片段可包含超長CDR3。
[0177] 在一些實施方案中是包含多個多核苷酸的核酸文庫，所述多核苷酸含有編碼抗體 或其結合片段的序列，其中抗體或其結合片段可包含本文公開的任何抗體。
[0178] 在一些實施方案中是包含編碼可變區的核酸序列的多核苷酸，其中可變區可包含 超長CDR3。
[0179] 在一些實施方案中是包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼可變區的核 酸序列，其中可變區可包含超長⑶R3。
[0180] 在一些實施方案中是包含多核苷酸的宿主細胞，其中該多核苷酸包含編碼可變區 的核酸序列，其中該可變區可包含超長CDR3。
[0181] 在一些實施方案中是包含核酸序列的多核苷酸，該核酸序列編碼本文公開的任何 抗體的所述抗體或其結合片段。
[0182] 在一些實施方案中是包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含核酸序列，所述 核酸序列編碼本文公開的任何抗體的所述抗體和其結合片段。
[0183] 在一些實施方案中是包含多核苷酸的宿主細胞，其中該多核苷酸包含核酸序列， 該核酸序列編碼本文公開的任何抗體的所述抗體或其結合片段。
[0184] 在一些實施方案中是生產包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段的方法， 包括在其中可表達多核苷酸序列和可產生包含超長⑶R3或其片段的抗體或其結合片段的 條件下，培養包含多核苷酸的宿主細胞，其中多核苷酸可包含核酸序列，該核酸序列編碼本 文公開的任何抗體的所述抗體或其結合片段。該方法可包括從宿主細胞培養回收包含超長 CDR3或其片段的抗體或其結合片段。
[0185] 在一些實施方案中是包含本文公開的任何抗體的藥物組合物。藥物組合物可包含 兩個或更多個抗體，其中兩個或更多個抗體中的至少一個包含超長CDR3的至少一部分。
[0186] 在一些實施方案中是藥物組合物，該藥物組合物包含：(a)包含基於或來源於超 長CDR3的至少一部分的序列的抗體或其片段；以及（b)藥學上可接受的斌形劑。
[0187] 在一些實施方案中是在有需要的受試者中治療疾病或狀況的方法，該方法包括： 向哺乳動物施用治療有效劑量的本文公開的任何抗體。在一些情況下，本文公開的抗體 包含超長⑶R3序列和非抗體序列。在一些情況下，非抗體序列選自包含Mokal、Vm24、人 GLP-1、毒蜥外泌肽-4、β-幹擾素、人ΕΡ0、人FGF21、人GM-CSF、人幹擾素-β、牛GCSF、人 GCSF、beIL8、齊考諾肽、生長激素抑制素、氯代毒素、SDFl(a)、IL21以及其衍生物或變體。 非抗體序列可包含基於或來源於任何SEQIDN0S:317-332的胺基酸序列。
[0188] 疾病或狀況可選自包含自身免疫性疾病、異種免疫疾病或狀況、炎性疾病、病原性 感染、血栓栓塞性障礙、呼吸道疾病或狀況、代謝性疾病、中樞神經系統（CNS)障礙、骨疾 病、癌症、血液疾病、肥胖症、糖尿病、骨質疏鬆症、貧血或疼痛的組。
[0189] 疾病或狀況可受益於離子通道的調製。離子通道可選自包含鉀離子通道、鈉離子 通道或酸敏感離子通道的組。離子通道可選自包含KvL3離子通道、NavL7離子通道和酸 敏感離子通道（ASIC)的組。
[0190] 疾病或狀況可受益於受體的調製。受體可選自包含 FGF21R、CSFR、GMCSFR、IL8R、IL21R和GCSFR的組。
[0191] 疾病或狀況可以是乳腺炎。
[0192] 受試者可以是哺乳動物。該哺乳動物可以是牛或人。
[0193] 在一些實施方案中是基於或來源於本文公開的抗體的晶體。該晶體可具有PZPj1 空間群。在一些情況下，晶體具有介於約40埃至80埃、介於45埃至約75埃或介於約50 埃至約75埃的晶胞參數"a"，介於約40埃至140埃、介於約50埃至約130埃、介於約55埃 至約130埃的晶胞參數"b"以及介於100埃至約350埃、介於120埃至約340埃或介於約 125埃至約330埃的晶胞參數"c"。晶體可包含牛抗體或其部分。晶體可包含基於或來源 於牛抗體的Fab片段。晶體可以是分離的晶體。
[0194] 在一些實施方案中是包含含有SEQIDNO: 24和SEQIDNO: 23的牛抗體Fab片段 的分離的晶體，其中晶體具有P2PA空間群以及a= 71. 4埃、b= 127. 6埃和c= 127.9 埃的晶胞參數。
[0195] 在一些實施方案中是包含含有SEQIDNO: 340和SEQIDNO: 341的牛抗體Fab片 段的分離的晶體，其中晶體具有PZPj1空間群以及a= 54. 6埃、b= 53. 7埃和C= 330. 5 埃的晶胞參數。
[0196] 在利用包含超長CDR3的抗體的任何或全部上文或下文的發明或實施方案中，包 含超長CDR3的任何抗體可以進行使用，例如包括任何含有超長CDR3的上述抗體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0197] 本公開的上述內容以及下列詳細描述，結合附圖閱讀時將更好的被理解。用於說 明本發明的目的，圖中所示的是目前優選的實施方案。然而應當理解：本發明並不限於所示 的確切的安排、實施例和手段。
[0198] 圖IA到圖IC顯示了牛抗體中的新結構域的鑑定。圖IA示出了⑶R3長度在鼠、人 和牛所有組成成分間的比較。在牛重鏈中獨特地發現了 60個胺基酸以上的超長亞群。圖 IB示出了來自文獻的鼠（mu)、人（hu)或牛序列的代表性CDRH3序列以及從我方深度測序 得到的6種牛序列（B-Sl至B-S4和B-Ll以及B-L2)。定義所有抗體可變區的⑶RH3邊界 的構架3的保守半胱氨酸和構架4的色氨酸用灰色著色以供參考。CDRH3的長度在右側顯 示。鼠抗體包括D44. 1、抗-HEL抗體、93F3、醛縮酶以及針對人⑶3的治療性抗體0KT3。這些 抗體因在⑶R3H3中具有游離半胱氨酸而不同尋常。人抗體包括Yvo、冷沉球蛋白、CR6261、 抗A型流感血凝素以及具有最長的人CDRΗ3之一的抗-HIV抗體PG9。牛抗體表現了文獻 中的超長序列和進行比較的短序列。BLV5B8和BLV1H12 (粗體顯示）用於我們的結構測定 中。相對保守TTVHQ和CPDG基序是粗體。圖IC示出：與具有"標準"⑶RΗ3 (右）的93F3 相比較，FabBLVlH12(左）和BLV5B8(中）Fab的晶體結構。一條超長的、兩個β鏈的莖從 各個牛Vh免疫球蛋白結構域中伸出並在異常的三個二硫鍵連接的隆突結構域處終止。
[0199] 圖2Α到圖2C顯示了超長牛抗體的結構多樣性。圖2Α示出：兩個隆突結構的比較 以二硫鍵的模式顯示差異。除隆突和其二硫鍵模式的二維表示外，示出了BLV1H12(左）和 BLV5H8(右）的隆突的近距離視圖。對二硫鍵進行編號並圈出。在下方示出了球形區域的 序列，並且在具有DH2種系基因段的保守半胱氨酸下劃線。在各個序列的上方表明二硫鍵 模式。圖2B示出：BLV1H12和BLV5B8的可變區的疊加在除上部的莖和隆突外的可變區中 顯示結構同源，並明顯趨異化。圖2C示出：BLV1H12(左）和BLV5B8(右）的表面和電荷密 度的表示在球形區域中顯示不同的形狀和電荷。
[0200] 圖3A到圖3C顯示了對超長抗體的形成的遺傳基礎。圖3A示出超長抗體中使用 的種系可變區VhBUL的鑑定。前導序列是淺灰色，編碼序列用上方的胺基酸翻譯來表明，內 含子是斜體以及獨特的TTVHQ延伸是粗體，該獨特的TTVHQ延伸形成莖的上升鏈的一部分。 在重組信號序列七聚物和九聚物下劃線。圖3B示出=VhBUL區在21號染色體上發現。局部 牛細胞中期擴展（左）和放大的第21號染色體（右上）通過具有318H2和14-74H6的BAC 克隆的雙色FISH示出VhBUL區在BTA21q24中的位置。對BTA21的國際命名在底部寫出。 圖3C示出：優選地在超長抗體中使用的描述為VhBUUDH2和VaIx的牛免疫球蛋白基因座 示意圖。V(D)J重組過程裝配基因段以形成功能性超長重和輕鏈基因。（左下）將V-D-J 區定位到BLVlH12Fab結構。VhBUL因編碼⑶RHl和⑶RH2殘基以及TTVHQ基序而獨特， 所述⑶RHl和⑶RH2殘基與莖相互作用，所述TTVHQ基序引發上升β-鏈。同樣，VaIx輕 鏈編碼與莖相互作用的⑶RLl和⑶RL2殘基。箭頭表明潛在的連接多樣性區域。相對較 長的V-D插入物用紫色表明。還不清楚這些序列是否由N-添加、基因轉變或另一種機理產 生。（右下）詳細描述了⑶RHl、H2、L1和L2與莖的相互作用以及上升鏈的YxYxY基序的 位置。
[0201] 圖4A到圖4C描述了牛超長VhCDRH3的深度序列多樣性。圖4A示出在IgM和IgG 的牛超長CDRH3中的半胱氨酸數目分布。圖4B示出超長CDR3的長度分布。要注意的是： 在免疫應答期間選定的任何給定長度的克隆序列可偏離比例。圖4C示出超長牛VhCDRH3 的代表性序列。示出了VhBUL區的末端部分以及在V-D連接、DH2和Jh (頂部）的連接多樣 性。示出BLVH12和BLV5B8的序列以進行比較，隨後示出20個超長⑶RH3序列（底部） 在由DH2保守的半胱氨酸下劃線。定義所有抗體可變區的CDRH3邊界的保守半胱氨酸和 色氨酸用灰色突出顯示以供參考。在CPDG基序下標灰色劃線，編碼YxYxY基序的上升鏈區 標灰色下劃線。
[0202] 圖5A到圖5C示出：半胱氨酸的突變有助於超長⑶RH3多樣性。圖5A示出：超長 CDRH3深層序列的共有區與DH2比對。三次深度測序運行的共有序列（來自兩頭牛）進行 確定並與彼此以及DH2比對。除一些插入物/缺失區外，共有區比對完好。因此，無論一個 Dh基因還是高度相關的基因都產生超長CDRH3抗體的序列多樣性。圖5B示出：DH2基因區 域分析顯示可很容易地突變成半胱氨酸的殘基，包括SH熱點。上邊是核苷酸序列且下邊是 翻譯的胺基酸序列。由用於SH和/或基因轉變的AID識別的RGYW熱點框出。在（B)中位 置 3、15、19、21、25、27、31、33、39、43、45、49、51、57、60、64、73、75、79、81、84、88、90、93、97、 102、106、112、117、121、123、127、129、133、139和145處的核苷酸可在一個突變中變異成編 碼半胱氨酸的密碼子。圖5C示出親和成熟組，顯示向半胱氨酸的突變或由半胱氨酸的的突 變。鑑定幾組克隆相關的序列並針對體細胞高頻突變對其進行分析。三個組作為實例（左 側標有1至3)示出。來自半胱氨酸的序列差異用灰色突出顯示。右側示出各個序列在簇 中的代表次數。
[0203] 圖6A到圖6D示出：具有超長⑶RH3的牛抗體結合抗原。圖6A示出用於鑑定抗 原-特異性、超長CDRH3抗體的免疫實驗方案。分離，通過RTPCR對重鏈可變區mRNA進 行分離、擴增並與變體輕鏈配對以產生在HEK239細胞中生成的IgG的小文庫。圖6示出： 132個超長⑶RH3抗體針對BVDV的ELISA(左圖）和在滴定試驗中B8、B9和H12 "點擊" 的結合活性（右圖）。圖6C示出：B8、H9和H12相較於BLV1H12和DH2種系區域的序列。 右側是鑑定的CDRH3的長度。在由DH2保守的半胱氨酸下劃線。圖6D示出細胞中H12結 合NS2-3。標貼flag的BVDVNS2-3蛋白質構建體轉染至HEK293A細胞並用作為陽性對照 的抗-Flag(左）、H12抗體（中間）和B8 (右）進行著色。未轉染的細胞的結合試驗在底 部示出。
[0204] 圖7A到圖7B描述了在新的minifold中的超長CDRH3多樣化的模式。圖7A示 出：左側圖示具有4個半胱氨酸的DH2隆突的示意圖，右側圖示由SH和基因轉變生成多個 新半胱氨酸模式和新環。圖7B示出產生抗體多樣性的機理。在人類和小鼠（左）中，通過 V⑶J組合和Vh-'配對的組合多樣性產生了多個不同的結合位點，該結合位點在抗原暴露 後由體細胞高頻突變進一步優化。在牛（右）中，嚴格限制結合多樣性；突變成或始自半胱 氨酸的體細胞突變可重塑"球形"區域，在超長⑶RH3中產生大量結構多樣性。這些抗體 可通過SH進一步優化並可與獨特的靶標（諸如孔或通道）結合。
[0205] 圖8A到圖8J描述的方案示出：將牛G-CSF與牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突結構 域連接進而設計本文公開的免疫球蛋白構建體。圖8A示出牛BLV1H12抗體的重鏈區和輕鏈 區的帶狀圖。盒裝區突出顯示包含莖和隆突結構域的超長CDR3的延伸區。圖8B示出：生 長因子（例如，牛G-CSF)的帶狀圖，該生長因子插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆 突結構域的一部分。圖8C示出：毒素（例如，Mokal、VM-24)的帶狀圖，該毒素插入或替換 牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。圖8D示出：受體配體（例如，GLP-1、毒 蜥外泌肽-4)的帶狀圖，該受體配體插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突結構域的 一部分。圖8E示出：激素（例如，紅細胞生成素）的帶狀圖，該激素插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。圖8F示出：動畫描述了牛BLV1H12抗體的重鏈區和 輕鏈區。圖8G示出：生長因子（例如，牛G-CSF)的動畫，該生長因子插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。圖8H示出：毒素（例如，Mokal、VM-24)的動畫，該毒 素插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。圖81示出：受體配體（例 如，GLP-1、毒蜥外泌肽-4)的動畫，該受體配體插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突 結構域的一部分。左側展板示出：受體配體的兩個末端，該受體配體插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。右側展板示出：受體配體的N-端，該受體配體在用 蛋白酶治療後從隆突結構域釋放。圖8J示出激素（例如，紅細胞生成素）的動畫，該激素 插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區的隆突結構域的一部分。生長因子、毒素、受體配體和 激素可通過GGGGS(Ab-肽LI)或GGGSGGGGS和GGGGSGGGS(Ab-肽L2)序列的多肽接頭進行 連接。未通過接頭進行連接的另一構建體（Ab-肽LO)未在本動畫中示出。
[0206] 圖9A到圖9E呈現對於Ab-bGCSF融合蛋白的說明性鼠NFS-60細胞增殖活性。圖 9A到9B分別描述了牛G-CSF和人G-CSF的增殖活性。圖9C描述了無G-CSF時，對於牛 BLV1H12抗體的增值活性的缺乏。圖9D描述了無接頭（Ab-bGCSFL0)時，插入至或替換隆 突結構域一部分的牛G-CSF的增殖活性。圖9E描述了通過GGGGS(Ab-bGCSFLI)序列的多 肽接頭時，插入至或替換隆突結構域一部分的牛G-CSF的增殖活性。
[0207] 圖IOA至圖IOE呈現了Ab-GCSF融合蛋白的人粒細胞先祖細胞增殖活性。圖IOA 至圖IOB分別描述了牛G-CSF和人G-CSF的增殖活性。圖IOC描述了無G-CSF時，對於牛 BLV1H12抗體（Ab)缺乏增殖活性。圖IOD描述了無接頭（Ab-bGCSFL0)時，插入至或替換 隆突結構域一部分的牛G-CSF的增殖活性。圖IOE描述了通過GGGGS(Ab-bGCSFLI)序列 的多肽接頭的所述連接，插入至或替換隆突結構域一部分的牛G-CSF的增殖活性。
[0208] 圖IlA至圖IlB描述了小鼠的Ab-bGCSF融合蛋白的藥代動力學。
[0209] 圖12A至圖12B提供了在小鼠嗜中性粒細胞中Ab-bGCSF融合蛋白的增殖活性，該 小鼠嗜中性粒細胞是血著色的並在注射後第10天計數。
[0210] 圖13A至圖13C顯示在畢赤酵母中Ab-bGCSF融合蛋白的表達和純化。圖13A示 出：對於本文提供的免疫球蛋白構建體的畢赤酵母表達載體的示意圖。圖13B提供了免疫 球蛋白構建體Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSFLl的表達誘導後的Western印跡。圖13C提供了 在0-70μg每IOOmL培養液的產率下，在畢赤酵母中表達的純化的Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSF LI的SDS-PAGE凝膠。
[0211] 圖14A至圖14C示出了在游離式HEK293細胞中用於表達免疫球蛋白構建體的載 體。圖14A提供了在游離式HEK293細胞中用於表達的Ab-bGCSFLO重鏈的載體。圖14B 提供了在游離式HEK293細胞中用於表達的Ab-bGCSFLl重鏈的載體。圖14C提供了在遊 離式HEK293細胞中用於表達的Ab-bGCSF輕鏈的載體。
[0212] 圖15A示出純化的抗體融合的SDS-PAGE凝膠。圖15A示出來自HEK293細胞的純 化的Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSFLl蛋白質的SDS-PAGE凝膠。圖15B提供了包含連接至原 毒素2兩末端的GGGGS接頭的免疫球蛋白構建體Ab-原毒素2的SDSPAGE。
[0213] 圖16A至圖16B提供了Ab-MokalLO(無接頭）和Ab-MokalLl(有接頭）免疫球蛋 白構建體的SDSPAGE和活性。圖16A提供了Ab-MokalLO和Ab-MokalLl免疫球蛋白融合 蛋白的SDSPAGE。圖16B提供了關於T細胞活化的BLVlH12-Mokal融合蛋白抑制活性。
[0214] 圖17提供了在人外周血單核細胞（PBMC)中BLVlH12_Mokal融合蛋白抑制活性。
[0215]圖 18A至圖 18C提供了Ab-VM24L1(GGGGS接頭）和Ab-VM24L2(GGGSGGGGS和 GGGGSGGGS接頭）免疫球蛋白構建體的SDSPAGE和活性。圖18A提供了Ab-VM24L1 和Ab-VM24L2免疫球蛋白融合蛋白的SDSPAGE。圖18B提供了關於T細胞活性的BLV1H12-VM24L1融合蛋白抑制活性。圖18C提供了關於T細胞活性的BLV1H12-VM24L2融 合蛋白抑制活性。
[0216] 圖19提供了Ab-GLP-I和Ab-毒蜥外泌肽-4免疫球蛋白構建體的SDSPAGE。
[0217] 圖20提供了在HEK293細胞表達GLP-I受體中Ab-GLP-I和Ab-毒蜥外泌肽-4 的活性。
[0218] 圖21提供了TFl細胞中的Ab-hEPO融合蛋白的增殖活性。
[0219] 圖22A至圖22C描述了超長⑶R3序列。（頂部）從VHBUL、DH2和JH種系的翻譯。 文獻報導的5個全長超長CDRH3包含4個到8個半胱氨酸並彼此不高度同源；然而當這些 ⑶RH3的第一半胱氨酸在比對前"固定"時，可見用0#保守的一些半胱氨酸殘基。七個序 列（BLV1H12、BLVOT3、BLV8C11和BF4E9)中的4個序列如DH2 -樣在相同的位置包含4個 半胱氨酸，但也具有附加半胱氨酸。81^588與0112種系一樣具有兩個半胱氨酸。與一些半 胱氨酸保留具有的限定的同源提示DH2的突變可產生這些序列。第一組包含鑑定的最長的 CDRH3並顯示克隆相關性。*表明重複出現167次的序列，暗示其是根據功能嚴格選定的。 許多8個半胱氨酸序列根據功能選定因它們重複多次，在寬括號中表明。其他各種長度的 代表性序列在最後一組中表明。在定義CDRH3邊界的構架半胱氨酸和色氨酸殘基下劃雙 下劃線。在表2A-C中列出的BLV1H12至UL-77序列（最左側列）分割成4部分進行描述 以鑑定有某些種系序列衍生的胺基酸殘基片段。從左向右移動，第一部分是由％種系衍生 並在整個公開內容中用X1X2X3X4X5基序代表。第二部分是在整個公開內容中設計為父"殘基 的一系列間隔區的胺基酸殘基。第三部分是由種系DH2區衍生的一系列胺基酸殘基以及第 四部分是由種系JhI區衍生的一系列胺基酸殘基。 具體實施方案
[0220] 本文公開了抗體及其片段。通常，抗體及其片段包含超長⑶R3的至少一部分。超 長CDR3的一部分可來源於或基於超長CDR3序列。超長CDR3的一部分可基於或來源於超長 ⑶R3序列的莖結構域。另外或此外，超長⑶R3的一部分可基於或來源於超長⑶R3序列的 隆突結構域。抗體或其片段可進一步包含一個或多個治療性多肽。治療性多肽可插入至超 長CDR3的一部分。治療性多肽可替代超長CDR3的一部分的胺基酸序列中的一個或多個氨 基酸殘基。治療性多肽可替代超長CDR3的一部分的核酸序列中的一個或多個核苷酸。另 夕卜，治療性多肽可與超長CDR3的一部分偶聯或連接。本文公開的抗體及其片段進一步包含 切割位點。本文公開的抗體及其片段的一部分可基於或來源於產生超長CDR3的不同動物 或種類的抗體序列。例如超長CDR3可基於或來源於牛抗體序列，且抗體序列的附加或其他 部分可基於或來源於非牛抗體序列。本文描述了抗體或其片段的進一步細節。 軺長CDR3蛋白質
[0221] 本發明提供了包含超長CDR3序列或其部分的抗體或免疫球蛋白構建體。
[0222] 在一個實施方案中，本發明提供了包含超長⑶R3的抗體。超長⑶R3可以是35個 或更多個胺基酸長度（例如，40個或更多個、45個或更多個、50個或更多個、55個或或更多 個、60個或更多個）。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分、⑶R3的莖結構 域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結構域的一部分可包含來源於超長⑶R3的隆突結 構域的一個或多個保守基序。CDR3的莖結構域的一部分可包含來源於超長CDR3的莖結構 域的一個或多個保守基序。此類抗體可包含在超長CDR3內的至少3個或更多個半胱氨酸 殘基（例如，4個或更多個、6個或更多個、8個或更多個）。抗體可包含一個或多個半胱氨 酸基序。抗體可包含在超長CDR3內的非抗體序列。另外或此外，抗體包含非牛序列。非牛 序列可與超長⑶R3序列連接。抗體可進一步包含接頭。接頭可包含（GGGGS)n胺基酸序列， 其中η= 1至5。另外，接頭包含（GSG)n、GGGSGGGGS或GGGGSGGGS胺基酸序列。抗體可包 含在超長CDR3內的非牛序列。抗體可進一步包含抗體序列，其中該抗體序列不包含超長 CDR3序列。抗體可進一步包含抗體序列，其中抗體肽序列與超長CDR3肽序列的胺基酸序列 同一性是約40 %或更少（例如，約35 %或更少、約30 %或更少、約25 %或更少、約20 %或 更少、約15%或更少、10%或更少、約5%或更少、約3%或更少、約1 %或更少）。抗體可包 含細胞毒性藥劑或治療性多肽。細胞毒性藥劑或治療性多肽可與超長CDR3偶聯。抗體可 與靶標結合。靶標可以是蛋白質靶標。該蛋白質靶標可以是橫跨膜蛋白質靶標。抗體可以 包含BLV1H12和/或BLVCVl抗體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、 BF1H1、BLV5B8和/或F18抗體的至少一部分。抗體可包含人抗體的至少一部分。抗體可 以是嵌合的、重組的、工程化的、合成的、人源化的、全人或人工程化的抗體。抗體可包含來 自兩個或更多個不同抗體的抗體序列。所述兩個或更多個不同抗體可以來自相同的種類。 例如，該種類可以是牛種類、人種類或鼠種類。所述兩種或更多種不同抗體可以來自相同類 型的動物。例如，該兩種或更多種不同抗體可以來自人。另外，兩種或更多種不同抗體是來 自不同物種。例如，該兩種或更多種不同抗體是來自人物種和牛物種。在另一個實例中，該 兩種或更多種不同抗體可以是來自牛物種和非牛物種。在另一個實例中，該兩種或更多種 不同抗體是來自人物種和非人物種。
[0223] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中CDR3是35個或 更多個胺基酸長度並基於或來源於非人類序列。超長CDR3序列可來源於自然產生超長 ⑶R3抗體的任何物種包括反芻動物諸如牛（奶牛）。抗體可包含BLV1H12和/或BLVCVl 抗體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、BF1H1、BLV5B8和/或F18抗 體的至少一部分。另外，超長⑶R3序列可由駱駝或鯊魚⑶R3序列衍生。
[0224] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體，其中CDR3包含非 抗體序列。非抗體序列可來源於任何蛋白質家族包括但不限於：趨化因子、生長因子、肽、細 胞因子、細胞表面蛋白質、血清蛋白質、毒素、細胞外基質蛋白質、凝血因子、分泌的蛋白質 等。非抗體序列可由治療性多肽衍生。非抗體序列可以是人或非人源。非抗體序列可包含 合成序列。非抗體序列可包含非抗體蛋白質諸如肽或結構域的一部分。超長CDR3的非抗 體序列可包含來自其自然序列的突變，包括胺基酸改變（例如，取代）、插入或缺失。可製備 在非抗體序列間的接點處的工程附加胺基酸以促進或增強抗體內非抗體序列的適當摺疊。 ⑶R3可以是35個或更多個胺基酸長度。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部 分XDR3的莖結構域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結構域的一部分可包含來源於超 長⑶R3的隆突結構域的一個或多個保守基序。⑶R3的莖結構域的一部分可包含來源於超 長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。另外或此外，抗體包含至少3個或更多個半胱 氨酸殘基。抗體可包含一個或多個半胱氨酸基序。抗體可包含BLV1H12和/或BLVCVl抗 體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、BF1H1、BLV5B8和/或F18抗體 的至少一部分。
[0225] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3和非牛序列的抗體。超長CDR3 可源自反芻動物。反芻動物可以是牛。非牛序列可以來源於或基於非牛哺乳動物序列。例 如，非牛序列可來源於或基於人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和/或山羊序列。超長CDR3序列可包 含非牛序列。此外，非牛序列與超長CDR3序列連接。非牛序列可來源於或基於抗體序列的 至少一部分。抗體序列可編碼可變區、恆定區或其組合。CDR3可以是35個或更多個胺基酸 長度。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分XDR3的莖結構域的至少一部分 或其組合。CDR3的隆突結構域的一部分可包含來源於超長CDR3的隆突結構域的一個或多 個保守基序。CDR3的莖結構域的一部分可包含來源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個 保守基序。另外或此外，抗體包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基。抗體可包含一個或多 個半胱氨酸基序。
[0226] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中CDR3是35個或 更多個胺基酸長度且包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基，例如包括：4個或更多個、6個或 更多個和8個或更多個。
[0227] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中CDR3是35個或 更多個胺基酸長度且包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基並且其中超長CDR3是多特異性 抗體的組分。多特異性抗體可以是雙特異性或包含更高的化合價。
[0228] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中CDR3是35個或 更多個胺基酸長度且包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基，其中超長CDR3是免疫連接物。
[0229] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中CDR3是35個或 更多個胺基酸長度且包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基，其中包含超長CDR3的抗體與橫 跨膜蛋白質靶標結合。此類橫跨膜靶標可包括但不限於：GPCR、離子通道、轉運體和細胞表 面受體。
[0230] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體，其中包含超長CDR3的 抗體與橫跨膜蛋白質靶標結合。此類橫跨膜靶標可包括但不限於：GPCR、離子通道、轉運體 和細胞表面受體。⑶R3可以是35個或更多個胺基酸長度。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突 結構域的至少一部分XDR3的莖結構域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結構域的至少 一部分可包含來源於超長⑶R3的隆突結構域的一個或多個保守基序。⑶R3的莖結構域的 一部分可包含來源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。此外或另外，抗體包含 至少3個或更多個半胱氨酸殘基。抗體可包含一個或多個半胱氨酸基序。
[0231] 本文提供了免疫球蛋白構建體，其包含含有互補決定區3(⑶R3H)的至少一部分 的哺乳動物免疫球蛋白重鏈以及治療性多肽，其中該治療性多肽插入至或替換⑶R3H的至 少一部分。免疫球蛋白構建體可包含一個或多個接頭。一個或多個接頭可將治療性多肽與 重鏈連接。在一些實施方案中，接頭包含（GGGGS)n胺基酸序列，其中n= 1至5。此外或另 夕卜，接頭包含（GSG)n(SEQIDN0:342)、GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS胺基酸 序列。在一些實施方案中提供了本文所述的免疫球蛋白構建體，其中治療性多肽選自激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細胞因子或其組合。在某些實施方案中，治療性多肽是細胞因 子。在一些實施方案中，治療性多肽是集落刺激因子多肽。在某些實施方案中，集落刺激因 子是巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、粒細胞集 落刺激因子（G-CSF)或其片段或變體。在一個實施方案中，集落刺激因子是哺乳動物G-CSF或其衍生物或變體。在其他實例中，治療性多肽是Mokal、Vm24、人GLP-1、毒蜥外泌肽-4、 人EP0、人FGF21、人GMCSF或人幹擾素-β。本文提供了免疫球蛋白構建體，其包含在互補 決定區3 (CDR3H)中含有隆突結構域的哺乳動物免疫球蛋白重鏈或其片段以及與CDR3H的 所述保守結構域連接的治療性多肽，其中所述哺乳動物免疫球蛋白是牛免疫球蛋白。在一 些實施方案中，牛免疫球蛋白是BLV1H12抗體。在本文所述的免疫球蛋白構建體的一些實 施方案中，隆突結構域的至少一部分被治療性多肽替換。CDR3H的隆突結構域可包含來源於 超長CDR3H的隆突結構域的一個或多個保守基序。免疫球蛋白構建體可進一步包含CDR3H 的莖結構域的至少一部分。⑶R3H的莖結構域的一部分可包含來源於超長⑶R3H的莖結構 域的一個或多個保守基序。
[0232] 本文進一步提供了抗體或其片段，其包含互補決定區3 (⑶R3H)的莖結構域或其 片段以及治療性多肽。在一些情況下，互補決定區3 (CDR3H)是由牛超長CDR3H衍生。治療 性多肽可以是本文公開的任何治療性多肽。例如，治療性多肽是Mokal、Vm24、GLP-1、毒蜥 外泌肽-4、人EP0、人FGF21、人GMCSF或人幹擾素-β。治療性多肽可與莖結構域連接。在 一些情況下，抗體或其片段進一步包含接頭。接頭可將治療性多肽與莖結構域連接。此外 或另外，抗體或其片段進一步包含⑶R3H的隆突結構域的至少一部分。在一些情況下，接頭 將治療性多肽與隆突結構域連接。在一些情況下，隆突結構域與莖結構域連接。⑶R3的隆 突結構域的一部分可包含來源於超長CDR3的隆突結構域的一個或多個保守基序。CDR3的 莖結構域可包含來源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。
[0233] 在一些情況下，本文提供了抗體或其片段。抗體或其片段可包含至少一個免疫球 蛋白結構域或其片段以及治療性多肽或其衍生物或變體。治療性多肽或其衍生物或變體 可與免疫球蛋白結構域連接。在一些情況下，治療性多肽是Mokal、Vm24、GLP-1、毒蜥外泌 肽-4、人EP0、人FGF21、人GMCSF、人幹擾素-β或其衍生物或變體。在一些實施方案中，免 疫球蛋白結構域是免疫球蛋白Α、免疫球蛋白D、免疫球蛋白Ε、免疫球蛋白G或免疫球蛋白 Μ。免疫球蛋白結構域可以是免疫球蛋白重鏈區或其片段。在一些情況下，免疫球蛋白結構 域是來自哺乳動物抗體。此外，免疫球蛋白結構域是來自嵌合的抗體。在一些情況下，免疫 球蛋白結構域是來自工程抗體或組合抗體。在其他情況下，免疫球蛋白結構域是來自人源 化的，人工程化的或全人抗體。在某些實施方案中，哺乳動物抗體是牛抗體。在其他情況下， 哺乳動物抗體是人抗體。在其他情況下，哺乳動物抗體是鼠抗體。在一些情況下，免疫球蛋 白結構域是包含互補決定區3(CDR3H)的隆突結構域的重鏈區或其片段。治療性多肽可以 與隆突結構域連接。此外或另外，免疫球蛋白結構域是包含互補決定區3 (⑶R3H)的莖結構 域的重鏈區或其片段。在一些情況下，治療性多肽與莖結構域連接。在一些情況下，抗體或 其片段進一步包含接頭。接頭可將治療性多肽與免疫球蛋白結構域或其片段連接。CDR3的 隆突結構域可包含來源於超長CDR3的隆突結構域的一個或多個保守基序。CDR3的莖結構 域可包含來源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。
[0234] 本文提供了免疫球蛋白構建體，其包含至少一個免疫球蛋白結構域或其片段以及 與所述免疫球蛋白結構域連接的G-CSF多肽或其衍生物或變體。在一些實施方案中，免疫 球蛋白結構域是免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。 在一些實施方案中，免疫球蛋白結構域是免疫球蛋白重鏈區或其片段。在一個實施方案中， 免疫球蛋白結構域是來自哺乳動物或嵌合的抗體。在其他情況下，免疫球蛋白結構域是來 自人源化的，人工程或全人抗體。在某些實施方案中，哺乳動物抗體是牛抗體。在一些情 況下，哺乳動物抗體是人抗體。在其他情況下，哺乳動物抗體是鼠抗體。在一個實施方案 中，免疫球蛋白結構域是包含互補決定區3(CDR3H)的隆突結構域的重鏈區或其片段。在一 個實施方案中，G-CSF多肽可以與隆突結構域連接。免疫球蛋白結構域是包含互補決定區 3(⑶R3H)的莖結構域的重鏈區或其片段。G-CSF多肽可以與莖結構域連接。⑶R3的隆突結 構域可包含來源於超長CDR3的隆突結構域的一個或多個保守基序。CDR3的莖結構域可包 含來源於超長CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。
[0235]在某些實施方案中提供了免疫球蛋白構建體，其包含至少一個免疫球蛋白結構域 或其片段以及與所述免疫球蛋白結構域連接的G-CSF多肽或其衍生物或變體，其中所述 G-CSF多肽是牛G-CSF多肽或其衍生物或變體。在一些實施方案中，本文提供了包含本文提 供的免疫球蛋白構建體以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一些實施方案中提供了 在有需要的哺乳動物中預防或治療疾病的方法，該方法包含向所述哺乳動物施用藥物組合 物。免疫球蛋白結構域可以是包含互補決定區3 (CDR3H)的隆突結構域的重鏈區或其片段。 G-CSF多肽可以與隆突結構域連接。免疫球蛋白結構域是包含互補決定區3 (⑶R3H)的莖 結構域的重鏈區或其片段。G-CSF多肽可以與莖結構域連接。⑶R3的隆突結構域可包含來 源於超長CDR3的隆突結構域的一個或多個保守基序。CDR3的莖結構域可包含來源於超長 CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。
[0236]在一些實施方案中是抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中第一抗體序 列的至少一部分是由超長⑶R3的至少一分部衍生；以及（b)非抗體序列。抗體或其片段 可進一步包含第二抗體序列，其中第二抗體序列的至少一部分是由超長⑶R3的至少一部 分衍生。衍生第一抗體序列和/或第二抗體序列的超長CDR3是來自反芻動物。反芻動物 可以是牛。第一抗體序列的至少一部分和/或第二抗體序列的至少一部分可來源於哺乳動 物。哺乳動物可以是牛。此外，哺乳動物是非牛哺乳動物，諸如人。第一和/或第二抗體序 列可以是3個或更多個胺基酸長度。胺基酸可以是連續胺基酸。此外，胺基酸是非連續氨 基酸。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個或更多個胺基酸長度的牛抗體序列。牛抗 體可以是BLVH12、BLV5B8、BLVCVl、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 抗體。第一和 / 或第二 抗體序列可包含含有3個或更多個胺基酸長度的人抗體序列。來源於超長CDR3的至少一 部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分 可以是20個或更少個氨基端長度。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分 和/或來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可以是3個或更多個氨基端 長度。第一和/或第二抗體序列可包含1個或多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更 多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多 個、15個或更多個、20個或更多個、30個或更多個或40個或更多個來源於超長CDR3的隆突 結構域的胺基酸殘基。一個或多個來源於超長CDR3的隆突結構域的胺基酸殘基可以是絲 氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含1個或多個、2個或更多個、3個 或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或 更多個或10個或更多個來源於超長CDR3的莖結構域的胺基酸殘基。第一和/或第二抗體 序列可包含1個或多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個來源於 超長CDR3的莖結構域的保守基序。一個或多個來源於超長CDR3的莖結構域的保守基序可 包含選自任一SEQIDNOS:157-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來源於超長CDR3的 至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列 的部分可以包含選自任一SEQIDNOS:157-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來源於超 長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可以包含與選自任一SEQIDN0S: 157-224和235-295的序列具有50%或 更高同源的序列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含選自任一 SEQIDN0S: 157-234的序列。來源於超長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包 含與選自任一SEQIDN0S: 157-224的序列具有50%或更高同源的序列。來源於超長⑶R3 的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含與選自任一SEQIDN0S:225-227的序列具有 50%或更高同源的序列。來源於超長⑶R3的至少一部分的第二抗體序列的一部分可包含 選自任一SEQIDNOS:235-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來源於超長CDR3的至少一 部分的第二抗體序列的一部分可包含與選自任一SEQIDN0S:235-295的序列可具有50% 或更高同源的序列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於 超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可來源於相同的超長CDR3序列。來源於超 長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可來源於兩個或更多個不同的超長CDR3序列。第一和/或第二抗體序列 的超長CDR3的一部分可基於或來源於BLV1H12超長CDR3序列。第一和/或第二抗體序列 的超長CDR3的部分可基於或來源於BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18超長 ⑶R3序列。抗體可進一步包含一個或多個接頭序列。
[0237] 本發明還提供了包含重鏈多肽的抗體，其中重鏈多肽包含超長CDR3序列的至少 一部分。重鏈多肽可包含基於或來源於SEQIDN0S:24-44的多肽序列中的任一個的多肽 序列。重鏈多肽可包含由基於或來源於SEQIDN0S:2-22的任何一個DNA序列編碼的多肽 序列。本文還提供了包含重鏈多肽的抗體，其中重鏈多肽包含超長CDR3序列且重鏈多肽序 列基本上類似於由SEQIDNOS:24-44的任何一個提供的這些多肽序列。重鏈多肽序列可 以認為基本上類似於由SEQIDNOS:24-44的任何一個提供的多肽序列，其中重鏈多肽序列 與由SEQIDN0S:24-44的任何一個提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、 99%或更高核酸同一性。抗體可進一步包含輕鏈多肽。輕鏈多肽可包含基於或來源於SEQ IDN0:23的多肽序列的多肽序列。輕鏈多肽可包含由基於或來源於SEQIDNO: 1的DNA序 列的DNA序列編碼的多肽序列。本文還提供了抗體，其進一步包含輕鏈多肽，其中輕鏈多肽 包含超長⑶R3序列且輕鏈多肽序列基本上類似於由SEQIDN0:23提供的這些多肽序列。 輕鏈多肽序列可認為基本上類似於由SEQIDNO: 1提供的多肽序列，其中輕鏈多肽序列與 由SEQIDN0:1的任何一個提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、99%或更 高核酸同一'I"生。抗體在動物中可具有治療活性。抗體在受試者的感染的疾病中具有治療活 性。抗體可包含單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、組合抗體、工程抗體或合成抗體。抗體 可包含哺乳動物抗體。抗體可包含牛抗體。抗體可包含G-CSF多肽或其衍生物或變體。抗 體可包含哺乳動物G-CSF多肽或其衍生物或變體。抗體可包含牛G-CSF或其衍生物或變體。 在一些實施方案中，治療劑的藥物組合物包含本文所述的抗體和藥學上可接受的載體。在 某些實施方案中，抗體被用於以治療有效量的本文所述的抗體或藥物組合治療有需要的受 試者的方法中。在一些實施方案中，核酸分子或其補體編碼本文所述的治療性免疫球蛋白。 遺傳序列
[0238] 本發明提供了編碼包含超長CDR3序列或其部分的抗體的遺傳序列（例如，基因、 核酸、多核苷酸）。本發明提供了編碼包含隆突結構域和/或超長CDR3序列的隆突結構域 的抗體的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸）。在另一個實施方案中，本發明提供了編 碼本文所述的抗體或免疫球蛋白構建體的遺傳序列。
[0239] 本發明還提供了編碼包含超長⑶R3序列或其部分的遺傳序列（例如，基因、核酸、 多核苷酸）。本發明還提供了編碼隆突結構域和/或超長CDR3的隆突結構域的遺傳序列 (例如，基因、核酸、多核苷酸）。
[0240] 在一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列。超長 CDR3可以是35個或更多個胺基酸長度（例如，40個或更多個、45個或更多個、50個或更多 個、55個或更多個、60個或更多個）。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分、 ⑶R3的莖結構域的至少一部分或其組合。此類抗體可在超長⑶R3內包含至少3個或更多 個半胱氨酸殘基（例如，4個或更多個、6個或更多個、8個或更多個）。抗體可包含一個或 多個半胱氨酸基序。抗體可在超長CDR3內包含非抗體序列。此外或另外，抗體包含非牛序 列。抗體可進一步包含抗體序列。抗體可包含細胞毒性劑或治療性多肽。細胞毒性劑或治 療性多肽可以與超長CDR3偶聯。抗體可與靶標結合。靶標可以是蛋白靶標，諸如橫跨膜蛋 白靶標。
[0241] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個或更多個胺基酸長度且來源於或基於非人序列。編碼超長CDR3的遺傳序列 可以由自然產生超長CDR3抗體的任何物種包括反芻動物諸如牛（奶牛）衍生。此外，超長 ⑶R3序列可以來源於駱駝或鯊魚⑶R3序列。
[0242] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3包含非抗體蛋白序列。編碼非抗體蛋白序列的遺傳序列可以來源於任何蛋白質家族包 括但不限於：趨化因子、生長因子、肽、細胞因子、細胞表面蛋白質、血清蛋白質、毒素、細胞 外基質蛋白質、凝血因子、分泌的蛋白質等。非抗體序列可以來源於治療性多肽。非抗體蛋 白質序列可以是人或非人源。非抗體序列可包含合成序列。非抗體序列可包含非抗體蛋白 質（諸如肽或結構域）的一部分。超長CDR3的非抗體蛋白序列可包含來自其自然序列的 突變，包括胺基酸改變（例如，取代）、插入或缺失。可製備在非抗體序列間的接點處的工程 附加胺基酸以促進或增強抗體內非抗體序列的適當摺疊。CDR3可以是35個或更多個氨基 酸長度。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分XDR3的莖結構域的至少一部 分或其組合。此外或另外，抗體包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基。抗體可包含一個或 多個半胱氨酸基序。
[0243] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3和非牛序列的抗體的遺 傳序列。超長CDR3可以源自反芻動物。反芻動物可以是牛。非牛序列可來源於或基於非牛 哺乳動物序列。例如，非牛序列可來源於或基於人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和或山羊序列。非 牛序列可以在超長⑶R3內。此外，非牛序列連接或附加至在超長⑶R3序列。非牛序列可 來源於或基於抗體序列的至少一部分。抗體序列可編碼可變區、恆定區或其組合。CDR3可 以是35個或更多個胺基酸長度。超長⑶R3可包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分XDR3 的莖結構域的至少一部分或其組合。此外或另外，抗體包含至少3個或更多個半胱氨酸殘 基。抗體可包含一個或多個半胱氨酸基序。
[0244] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個或更多個胺基酸長度且包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基，包括例如4個或 更多個、6個或更多個和8個或更多個。
[0245] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個或更多個胺基酸長度並包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基且其中超長CDR3 是多特異性抗體的組分。多特異性抗體可以是雙特異性或包含較高的化合價。
[0246] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個或更多個胺基酸長度並包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基，其中超長CDR3 是免疫連接物的組分。
[0247] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個或更多個胺基酸長度並包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基且其中包含超長 CDR3的抗體與橫跨膜蛋白質靶標結合。此類橫跨膜靶標可包括但不限於：GPCR、離子通道、 轉運體和細胞表面受體。
[0248] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列，其中 包含超長CDR3的抗體與橫跨膜蛋白質靶標結合。此類橫跨膜靶標可包括但不限於：GPCR、 離子通道、轉運體和細胞表面受體。CDR3可以是35個或更多個胺基酸長度。超長CDR3可 包含⑶R3的隆突結構域的至少一部分、⑶R3的莖結構域的至少一部分或其組合。此外或 另外，抗體包含至少3個或更多個半胱氨酸殘基。抗體可包含一個或多個半胱氨酸基序。
[0249] 在另一個實施方案中，本發明提供了編碼抗體或其片段的遺傳序列，其包含：(a) 第一抗體序列，其中第一抗體序列的至少一部分來源於超長CDR3的至少一部分；以及（b) 非抗體序列。抗體或其片段可進一步包含第二抗體序列，其中第二抗體序列的至少一部分 來源於超長CDR3的至少一部分。衍生第一抗體序列和/或第二抗體序列的超長CDR3是來 自反芻動物。反芻動物可以是牛。第一抗體序列的至少一部分和/或第二抗體序列的至少 一部分可來源於哺乳動物。哺乳動物可以是牛。此外，哺乳動物是非牛哺乳動物，諸如人。 第一和/或第二抗體序列可以是3個或更多個胺基酸長度。胺基酸可以是連續胺基酸。此 夕卜，胺基酸是非連續胺基酸。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個或更多個胺基酸長度 的牛抗體序列。牛抗體可以是BLVH12、BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 抗 體。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個 或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、15個或更多個、20個 或更多個、30個或更多個、40個或更多個、50個或更多個、60個或更多個或70個或更多個 胺基酸長度的人抗體序列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或 來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可以是20個或更少個胺基酸長度。 來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少一 分部的第二抗體序列的部分可以是3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多 個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、15個或更多個或20個或更 多個酸長度。第一和/或第二抗體序列可包含1個或多個、2個或更多個、3個或更多個、4 個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個 或更多個、15個或更多個、20個或更多個、30個或更多個或40個或更多個來源於超長CDR3的隆突結構域的胺基酸殘基。一個或多個來源於超長CDR3的隆突結構域的胺基酸殘基可 以是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含1個或多個、2個或更多 個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、 9個或更多個或10個或更多個來源於超長CDR3的莖結構域的胺基酸殘基。第一和/或第 二看題序列可包含1個或多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個 來源於超長CDR3的莖結構域的保守基序。一個或多個來源於超長CDR3的莖結構域的保守 基序可包含選自SEQ ID N0S:157-307和SEQ ID NOS:333-336中任一個的序列。來源於超 長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可包含選自SEQ ID N0S:157-307和SEQ ID NOS:333-336的任一的序列。 來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少一分 部的第二抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID NOS: 157-224和235-295的任一的序列具 有50%或更高同源的序列。來源於超長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含 選自SEQ ID NOS:157-234的任一的序列。來源於超長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列 的部分可包含與選自SEQ ID N0S:157-224的任一的序列具有50%或更高同源的序列。來 源於超長⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID N0S:225-227的 任一的序列具有50%或更高同源的序列。來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列 的部分可包含選自SEQ ID N0S:235-307和SEQ ID N0S:333-336的任一的序列。來源於超 長⑶R3的至少一部分的第二抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID N0S:235-295的任一的 序列具有50%或更高同源的序列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分 和/或來源於超長CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可來源於相同的超長CDR3序 列。來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來源於超長CDR3的至少 一分部的第二抗體序列的部分可來源於兩個或更多個不同的超長CDR3序列。第一和/或 第二抗體序列的超長CDR3的一部分可基於或來源於BLV1H12超長CDR3序列。第一和/或 第二抗體序列的超長CDR3的部分可基於或來源於BLV5B8、BLVCV1、BLV?3、BLV8C11、BF1H1 或F18超長⑶R3序列。抗體可進一步包含一個或多個接頭序列。
[0250] 本發明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸），諸如 由包含超長⑶R3序列（包括例如，由SEQIDN0S:2-22的任一提供的⑶R3序列）的抗體的 遺傳序列。本發明還提供了基本上與由SEQIDN0S:2-22的任一提供的這些CDR3序列相類 似的超長⑶R3核酸序列。⑶R3序列可認為基本上類似於由SEQIDNOS:2-22的任一提供的 CDR3序列，其中CDR3序列與由SEQIDN0S:2-22的任一提供的CDR3序列具有80%、85%、 90%、95%、99%或更高核酸序列同一性，或者在嚴格雜交的條件下與SEQIDN0S:2-22的 任一序列雜交。
[0251] 本發明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸），諸如 編碼包含重鏈多肽的抗體的遺傳序列，其中重鏈多肽包含超長CDR3序列的至少一部分。重 鏈多肽可包含SEQIDN0S:24-44的任一的多肽序列。重鏈多肽可包含由SEQIDN0S:2-22 的任一的DNA編碼的多肽序列。本發明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核 苷酸、寡核苷酸），諸如編碼包含重鏈多肽的抗體的遺傳序列，其中重鏈多肽包含超長⑶R3 序列且重鏈多肽序列基本上類似於由SEQIDN0S:24-44的任一提供的這些多肽序列。重 鏈多肽序列可認為基本上類似於由SEQIDNOS:24-44的任一提供的多肽序列，其中重鏈多 肽序列與由SEQIDNOS: 24-44的任一提供的核苷酸序列具有60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 99%或更高核酸同一性，或者在嚴格雜交條件下與SEQIDN0S:24-44的任一序列雜交。分 離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸）諸如編碼抗體的遺傳序列可進一 步包含輕鏈多肽。輕鏈多肽可包含SEQIDN0:23的多肽序列。輕鏈多肽可包含由SEQID N0:1的DNA編碼的多肽序列。本發明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷 酸、寡核苷酸）諸如編碼抗體的遺傳序列，該分離的遺傳序列進一步包含輕鏈多肽，其中輕 鏈多肽包含超長CDR3序列且輕鏈多肽序列基本上類似於由SEQIDNO: 23提供的這些多肽 序列。輕鏈多肽序列可認為基本上類似於由SEQIDNO: 1提供的多肽序列，其中輕鏈多肽 序列與由SEQIDN0:1的任一提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、99%或 更高核酸同一性，或者在嚴格雜交條件下與SEQIDNOS:1雜交。 文庫和陣列
[0252]本發明提供了包含超長⑶R3序列的抗體的組群、文庫和陣列。在一些實施方案 中，組群、文庫和陣列的成員可顯示序列多樣性。
[0253]在一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其中 文庫或陣列的至少兩個成員在超長CDR3序列的至少一個半胱氨酸的位置上不同。結構多 樣性可通過在超長CDR3序列中不同數量的半胱氨酸（例如，至少3個或更多個半胱氨酸殘 基諸如4個或更多個、6個或更多個和8個或更多個）和/或通過不同二硫鍵形成和此後的 不同環結構得到加強。
[0254]在另一個實施方案中，本發明了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其中文 庫或陣列的至少兩個成員在位於超長⑶R3的半胱氨酸間的至少一個胺基酸上不同。就這 點而言，文庫或陣列的成員可包括在CDR3的相同位置上的半胱氨酸，導致類似的整體結構 摺疊，但具有通過不同胺基酸側鏈引起的細微差異。此類文庫或陣列可有助於親和力成熟。
[0255]在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其 中超長CDR3序列的至少兩個在長度上不同（例如，35個或更多個胺基酸長度諸如40個或 更多個、45個或更多個、50個或更多個、55個或更多個和60個或更多個）。胺基酸和半胱 氨酸含量可以或不可以在文庫或陣列間進行改變。超長CDR3序列的不同長度可提供獨特 的結合位點，包括例如，由於空間差異、由於改變的長度。
[0256]在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3的抗體的文庫或陣列，其中文 庫的至少另個成員在構建包含超長CDR3的抗體中使用的人構架上不同。
[0257]在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其 中文庫或陣列的至少兩個成員在具有包含超長CDR3的一部分的非抗體蛋白質序列上不 同。此類文庫或陣列可包括多種非抗體蛋白質序列，包括趨化因子、生長因子、肽、細胞因 子、細胞表面蛋白質、血清蛋白質、毒素、細胞外基質蛋白質、凝血因子、分泌的蛋白質、病毒 或細菌蛋白質等。非抗體蛋白質序列可以是人或非人源的並可包含非抗體蛋白質的一部分 諸如肽或結構域。超長CDR3的非抗體蛋白質序列可包含來自其自然序列的突變，包括氨基 酸改變（例如，取代）、插入或缺失。可製備在非抗體序列間的接點處的工程附加胺基酸以 促進或增強抗體內非抗體序列的適當摺疊。
[0258]在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其 中文庫或陣列的至少兩個成員在具有非牛序列上不同。非牛序列可來源於或基於非牛哺乳 動物序列。例如，非牛序列可來源於或基於人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和/或山羊序列。非牛 序列可以在超長⑶R3內。此外，非牛序列連接或附加至超長⑶R3序列。非牛序列可來源 於或基於抗體序列的至少一部分。抗體序列可編碼可變區、恆定區或其組合。
[0259] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其 中文庫或陣列的至少兩個成員在具有與超長CDR3偶聯的細胞毒性劑或治療性多肽上不 同。細胞毒性劑或治療性多肽可包括但不限於：化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如， 細菌、真菌、植物或動物源的酶促活性毒素或其片段）或放射性同位素（例如，放射性連接 物）。細胞毒性劑或治療性多肽可由非抗體序列進行編碼。
[0260] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含超長CDR3序列的抗體的文庫或陣列，其 中文庫或陣列的至少兩個成員在於靶標結合上不同。靶標可以是蛋白質靶標。該蛋白質靶 標可以是橫跨膜蛋白質靶標。此類橫跨膜靶標可包括但不限於：GPCR、離子通道、轉運體和 細胞表面受體。
[0261] 本發明的文庫或陣列可以是本領域中已知的多種形式。文庫或陣列可以是可尋址 的文庫或可尋址的陣列。文庫或陣列可以是展示的形式，例如抗體序列可以在噬菌體、核糖 體、mRNA、酵母或哺乳動物細胞上展示。 細胞
[0262] 本發明提供了包含編碼抗體的遺傳序列的細胞，該抗體含有超長CDR3序列或其 部分。本發明提供了包含編碼抗體的遺傳序列的細胞，該抗體含有超長序列CDR3的隆突結 構域的至少一部分或莖結構域的至少一部。
[0263] 本發明提供了包含編碼超長CDR3或其部分的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷 酸）的細胞。本發明還提供了包含編碼隆突結構域或超長CDR3的隆突結構域的遺傳序列 (例如，基因、核酸、多核苷酸）的細胞。
[0264] 在一個實施方案中，本發明提供了表達含有超長CDR3的抗體的細胞。細胞可以是 原核的或真核的，且包含超長CDR3的抗體可在細胞表面上表達或分泌到培養基中。當抗體 在細胞表面展示時，該抗體優選包含用於插入到質粒膜上的基序，諸如在C-端上的跨膜結 構域或脂質附著位點。對於細菌細胞，包含超長CDR3的抗體可分泌到周質中。細胞是真核 細胞時，其可被編碼包含超長CDR3的抗體的遺傳序列瞬時轉染。此外，通過本領域中技術 人員已知的方法由編碼包含超長CDR3的抗體的轉染或轉導遺傳序列來創建穩定細胞系或 穩定池。細胞可通過螢光激活細胞分選（FACS)或通過選擇編碼藥物抗性的基因進行選定。 有助於產生包含超長CDR3序列的抗體的細胞包括原核細胞（如大腸桿菌）、真核細胞（如 釀酒酵母和畢赤酵母）、昆蟲細胞（例如，Sf9、Hi5)、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、猴細胞（如 C0S-1)或人細胞（如HEK-293、HeLa、SP-1)。 文庫方法
[0265] 本發明提供了用於對包含含有超長CDR3序列的抗體的文庫進行創建的方法。用 於創建空間尋址文庫的方法在WO2010/054007中進行了描述。創建酵母、噬菌體、大腸杆 菌或哺乳動物細胞的文庫的方法在本領域中是眾所周知的。
[0266] 本發明還提供了對包含超長CDR3序列的抗體的文庫進行篩選的方法。 定義
[0267] 在描述實例性實施方案的上下文（特別是以下權利要求的上下文中）中使用的術 語"一個"、"一種"、"該"和類似指示物應被解釋為既包括複數又包括單數，除非本文另有說 明或上下文明顯矛盾。本文中數值範圍的列舉僅意在作為單獨提及落在範圍內的每個單獨 的值的速寫方法。除非另有說明，每個單獨的值猶如其在本文中單獨列舉一樣併入本說明 書。本文所述的全部方法在任何合適的順序下都可完成，除非本文另有說明或上下文明顯 矛盾。本文提供的任何實例或示例性語言（例如，"諸如"）僅意在更好地說明示例性實施 方案並不對示例性實施方案構成限制的示例性實施例中，除非另有要求。在說明書中沒有 語言應被解釋為意指任何未要求保護的對示例性實施方案的實施至關重要的因素。
[0268] 本文可互換使用的"超長⑶R3"或"超長⑶R3序列"包含並非來源於人抗體序列 的CDR3或CDR3序列。超長CDR3可以是35個胺基酸長度或更長，例如，40個胺基酸長度或 更長、45個胺基酸長度或更長、50個胺基酸長度或更長、55個胺基酸長度或更長或60個氨 基酸長度或更長。超長CDR3的長度可包含非抗體序列。超長CDR3可包含隆突結構域的至 少一部分或隆突結構域。超長CDR3可包含非抗體序列，包括例如細胞因子、趨化因子、生長 因子或激素序列。優選地，超長⑶R3是重鏈⑶R3(⑶R-H3或⑶RH3)。優選地，超長⑶R3 是基於或來源於反芻動物（例如牛）序列的序列。超長CDR3可包含至少3個或更多個半 胱氨酸殘基，例如，4個或更多個半胱氨酸殘基、6個或更多個半胱氨酸殘基、8個或更多個 半胱氨酸殘基。超長CDR3可包含一個或多個半胱氨酸基序。超長CDR3可包含胺基酸序 列；該胺基酸序列來源於或基於SEQIDN0S:23-44,或編碼來源於或基於SEQIDN0S:2-22 的DNA序列。包含超長CDR3的可變區可包含胺基酸序列；該胺基酸序列來源於或基於SEQ IDN0S:23-44,或編碼來源於或基於SEQIDN0S:2-22的DNA序列。此類序列可來源於或 基於牛種系VH基因序列。超長CDR3可包含基於非人D或來源於H基因序列的序列（參 見，例如，Koti等人，（2010)M〇1.Immunol. 47:2119-2128)。超長CDR3可包含基於來源於 JH序列或的序列（參見，例如：Hosseini等人，（2004)Int.Immunol. 16:843-852)。在一 個實施方案中，超長CDR3可包含基於來源於非人VH序列或的序列和/或基於來源於非人 DH序列或的序列和/或基於或來源於JH序列的序列，以及任選地包含2至6個或更多個 胺基酸的附加序列，例如，在VH衍生的序列和DH衍生的序列間。在其他實施方案中，超長 ⑶R3可包含與來源於或基於SEQIDN0S:23-44的序列具有約50%或更高同源的序列。例 如，超長CDR3可包含與來源於或基於SEQIDN0S:23-44的序列具有約60%、70%、80%、 85%、90%、95%、97%或更高同源的序列。在另一個實施方案中，超長^1?3可包含序列， 該序列與來源於或基於SEQIDN0S:23-44的序列的5個或更多個胺基酸進行比對。例如， 超長⑶R3可包含序列，該序列與將來源於或基於SEQIDNOS:23-44的序列的5個、10個、 15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個或更多個胺基酸進行比對。 在另一個實施方案中，超長CDR3可包含序列，該序列含有來源於或基於SEQIDN0S:23-44 的序列的5個或更多個連續胺基酸。例如，超長CDR3可包含序列，該序列含有來源於或基 於SEQIDN0S:23-44的序列的5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50 個、55個、60個或更多個連續胺基酸。在另一個實施方案中，超長⑶R3可包含與來源於或 基於SEQIDN0S:2-22的DNA序列具有約50%或更高同源的序列。例如，超長⑶R3可包含 與來源於或基於SEQIDN0S:2-22 的DNA序列具有約 60%、70%、80%、85%、90%、95%、 97%或更高同源的序列。在另一個實施方案中，超長CDR3可包序列，該序列與來源於或基 於SEQIDN0S:2-22的DNA序列的5個或更多個核酸進行比對。例如，超長⑶R3可包序列， 該序列與來源於或基於SEQIDNOS: 2-22的DNA序列的5個、10個、15個、20個、25個、30 個、35 個、40 個、45 個、50 個、55 個、60 個、80 個、100 個、120 個、140 個、150 個、175 個、200 個、225個、250個、275個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個或更多個核 酸進行比對。在另一個實施方案中，超長CDR3可包含序列，該序列含有來源於或基於SEQ IDNOS: 2-22的DNA序列的5個或更多個連續核酸。例如，超長⑶R3可包含序列，該序列含 有來源於或基於SEQIDNOS:2-22的DNA序列的5個、10個、15個、20個、25個、30個、35 個、40 個、45 個、50 個、55 個、60 個、80 個、100 個、120 個、140 個、150 個、175 個、200 個、225 個、250個、275個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個或更多個連續氨基 酸。在另一個實施方案中，超長CDR3可包含與來源於或基於隆突結構域序列的序列具有約 50%或更高同源的序列。例如，超長CDR3可包含與來源於或基於隆突結構域序列的序列具 有約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或更高同源的序列。在另一個實施方案中，超 長CDR3可包含序列，該序列與基於或來源於隆突結構域序列的序列的5個或更多個胺基酸 進行比對。例如，超長CDR3可包含序列，該序列與基於或來源於隆突結構域序列的序列的 5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個或更多個胺基酸 進行比對。在另一個實施方案中，超長CDR3可包含序列，該序列含有基於或來源於隆突結 構域序列的序列的5個或更多個連續胺基酸。例如，超長CDR3可包含序列，該序列含有基 於或來源於隆突結構域序列的序列的5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45 個、50個、55個、60個或更多個連續胺基酸。在另一個實施方案中，超長⑶R3可包含與來源 於或基於隆突結構域序列的序列具有約50%或更高同源的序列。例如，超長CDR3可包含 與來源於或基於隆突結構域序列的序列具有約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或 更高同源的序列。在另一個實施方案中，超長CDR3可包含序列，該序列與基於或來源於隆 突結構域序列的序列的5個或更多個胺基酸進行比對。例如，超長CDR3可包含序列，該序 列與基於或來源於隆突結構域序列的序列的5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40 個、45個、50個、55個、60個或更多個胺基酸進行比對。在另一個實施方案中，超長CDR3可 包含序列，該序列含有基於或來源於莖結構域序列的序列的5個或更多個連續胺基酸。例 如，超長⑶R3可包含序列，該序列含有基於或來源於莖結構域序列的序列的5個、10個、15 個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個或更多個連續胺基酸。本文公 開的抗體可包含來源於或基於本文公開的任何超長CDR3序列的超長CDR3的至少一部分。 可修飾或改變超長CDR3或其部分的序列以含有一個或多個基於非牛抗體的核苷酸和/或 胺基酸。超長CDR3或其部分的序列的修飾和/或改變可提高表達的抗體的一個或多個特 性。例如，修飾和/或改變可提高抗體的表達、摺疊、半衰期、活性和/或溶解度。
[0269] "分離的"生物分子，諸如本文公開的各種多肽、多核苷酸和抗體，是指已經從其自 然環境的至少一種組分中鑑定和分離和/或回收的生物分子。
[0270] "拮抗劑"是指部分或完全阻斷、抑制或中和多肽的活性（例如，生物活性）的任何 分子。另外，"拮抗劑"還涵蓋完全或部分抑制編碼多肽的mRNA的轉錄或翻譯的分子。合適 的拮抗劑分子包括：例如拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或胺基酸序列變體、肽、 反義寡核苷酸、小的有機分子以及編碼多肽拮抗劑或拮抗劑抗體的核酸。涉及到"一種"拮 抗劑涵蓋一種拮抗劑或兩種或更多種不同拮抗劑的組合。
[0271] "激動劑"是指部分或完全模擬多肽的生物活性的任何分子。另外，"激動劑"還涵 蓋促進編碼多肽的mRNA的轉錄或翻譯的分子。合適的激動劑分子包括：例如激動劑抗體或 抗體片段、天然多肽、天然多肽的片段或胺基酸序列變體、肽、反義寡核苷酸、小的有機分子 以及編碼多肽激動劑或抗體的核酸。涉及到"一種"激動劑涵蓋一種激動劑或兩種或多種 不同激動劑的組合。
[0272] "分離的"抗體是指已經從其自然環境的組分中鑑定和分離和/或回收的抗體。其 自然環境的汙染組分是可幹擾抗體的診斷或治療用途的物質，並可包括酶、激素以及其他 蛋白質或非蛋白質溶質。在優選實施方案中，抗體將被純化（1)至大於抗體重量的95% (例 如，通過Lowry法的測定），並優選至多於99% (按重量計）；（2)至足以獲得N末端或內部 胺基酸序列的至少15個殘基的程度（通過使用轉杯式測序儀）；或（3)在還原或非還原條 件下經SDS-PAGE達到同質性（例如，使用Coomassie?藍或優選銀著色）。由於將不存在 抗體自然環境的至少一個組分，因此分離的抗體包括在組合細胞內的原位抗體。同樣的，分 離的抗體包括在重組細胞周圍的介質中的抗體。可經至少一個純化步驟製備分離的抗體。
[0273] "分離的"核酸分子是指核酸分子，該核酸分子從在抗體核酸的自然來源中通常與 其相關聯的至少一個汙染核酸分子中鑑定和分離。分離的核酸分子不同於其在自然界中發 現的形式或構建。分離的核酸分子因此從在自然細胞中存在的核酸分子中區分開來。然 而，分尚的核酸分子包括在表達抗體的細胞中含有的核酸分子，其中例如，核酸分子是在染 色體位置中不同於天然細胞的核酸分子。
[0274] 如在Kabat中編號的可變域殘基或如在Kabat中編號的胺基酸位置及其變體是 指在Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 5 版，Public HealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1991)中用於編譯抗體 的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用該編號系統，對應於缺乏或插入至可變域的 FR或CDR，實際的線性胺基酸序列包含更少或附加的胺基酸。例如，重鏈可變域可含有在H2 的第52個殘基之後的胺基酸插入物（例如，根據Kabat的52a殘基）以及在重鏈FR第82 個殘基之後的插入殘基（例如，根據Kabat的82a、82b和82c殘基）。經抗體序列的同源性 區域與"標準的"Kabat編號的序列的比對，針對給定抗體來確定殘基的Kabat編號。
[0275] "基本上類似"或"基本上相同"是指兩個數值之間（通常，與本文公開的抗體相關 的一個和與參考/對比抗體相關的另一個）具有足夠高相似性以至於一個本領域中的技術 人員可認為兩個值間的差異在由所述值測量的生物學特性背景內是幾乎沒有或沒有生物 學或統計學顯著性。在所述兩個值間的差異作為參考/對比抗體的數值的函數，是優選少 於約50 %，優選少於約40 %，優選少於約30 %，優選少於約20 %，優選少於約10 %。
[0276] "結合親和力"通常是指在分子（例如抗體）的一個結合位點和其結合配偶體（例 如抗原）之間的總非共價相互作用的強度。除非另有說明，"結合親和力"是指反應在結合 對（例如，抗體和抗原）成員間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y的 親和力通常由解離常數來表示。親和力可通過本領域的常規方法包括本文所述的方法來進 行測量。低親和力抗體通常與抗原結合緩慢並且傾向於容易解離，反之高親和力抗體通常 與抗原結合迅速並且傾向於保持更長時間的結合。在領域中已知多種測量親和力的方法， 任何測量方法都可用於本發明的目的。
[0277] "on-rate"或"關聯的比率"或"關聯率"或"Km"可由表面等離子體共振技術諸如 Biacore(例如，BiacoreA100,Biacore?-2000,Biacore?-3000,Biacore，Inc.，Piscatawa y，N.J.)羧甲基葡聚糖生物傳感器晶片並按照供應商的說明書來確定。
[0278] "載體"是指核酸分子，該核酸分子能夠轉運另一個與其結合的核酸分子。一種類 型的載體是"質粒"，該質粒是指可與附加DNA片段結合的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的 載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加DNA片段可與病毒基因組連 接。某些載體能夠在引入載體的宿主細胞中自主複製（例如，具有複製的細菌源的細菌載 體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如非附加型哺乳動物載體）經引入至宿主細胞 而被整合到宿主細胞基因組，從而與宿主基因組一起被複製。此外，某些載體能夠指導與載 體連接的基因的表達。此類載體在本文稱為"重組表達載體"（或簡稱"重組載體")。通常， 在重組DNA技術中使用的表達載體通常是質粒的形式。由於質粒是載體的一種常用形式， 因此"質粒"和"載體"有時可以互換使用。
[0279] "基因"是指包含對多肽、前驅體或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)的產生是必需的 編碼序列的核酸（例如，DNA)序列。只要能夠保留全長或片段的期望活性或功能特性（例 如，酶促活性，配體結合，信號轉導，免疫原性等），多肽可由全長編碼序列或編碼序列的任 何部分進行編碼。該術語還涵蓋結構基因的編碼區以及位於與兩個5'和3'末端上的編碼 區毗鄰且在任一末端上與編碼區具有約1個或多個Kb距離的序列，以至於基因對應於全長 mRNA的長度。位於編碼區的5'並存在於mRNA中的序列被稱為5'非翻譯序列。位於編碼 區的3'或下遊並存在於mRNA中的序列被稱為3'非翻譯序列。術語"基因"涵蓋cDNA和 基因的基因組形式。基因的基因組形式或克隆含有由非編碼序列中斷的編碼區，該非編碼 序列被稱為"內含子"或"間插區域"或"間插序列"。內含子是轉錄到核RNA(hnRNA)的基 因片段；內含子可含有調節元件諸如：增強子。內含子從核或初級轉錄體中移除或剪接掉； 內含子因此在信使RNA(mRNA)轉錄中缺失。翻譯過程中mRNA的功能是指定新生多肽的氨 基酸的序列或次序。除含有內含子外，基因的基因組形式還可包括位於在RNA轉錄體中存 在的序列的兩個5'和3'末端上的序列。這些序列被稱為"側翼"序列或區域（這些側翼 序列位於在mRNA轉錄體中存在的非翻譯序列的5'或3'）。5'側翼區域可含有控制和影響 基因轉錄的調節序列，諸如啟動子和增強子。3'側翼區域可含有指導轉錄終止，轉錄後切割 和多聚腺苷酸化的序列。
[0280] 如本文中可互換使用的"多核苷酸"或"核酸"是指任何長度的核苷酸聚合物並包 含DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基和/或其 類似物，或通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應可摻入到聚合物的任何基底。多核苷酸 包括修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸和其類似物。如果存在的話，核苷酸結構的修飾可 以在聚合物的組裝之後或之前賦予。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在合 成後進一步修飾，諸如通過與標記偶聯。其他類型的修飾包括，例如"帽";一個或多個天然 存在的核苷酸用類似物取代；核苷酸間修飾例如使用不帶電荷的鍵合（例如甲基磷酸酯、 磷酸三脂、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）和使用帶電荷的鍵合（例如硫代磷酸鹽、二硫代磷 酸鹽等）的修飾；含懸掛物部分例如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨 酸等）的修飾；使用插層劑（例如吖啶、補骨脂素等）的修飾；含螯合劑（例如金屬、放射性 金屬、硼、氧化金屬等）的修飾；含烷化劑的修飾、使用修飾的鍵合（例如α異頭核酸）；以 及多核苷酸的未修飾的形式。另外，通常存在於糖中的任何羥基基團可以例如被磷酸酯基 團、磷酸鹽基團替換，被標準保護基團保護或被活化以製備與附加核苷酸的附加鍵合，或者 可以與固態或半固態支撐物偶聯。5'和3'末端的OH可以磷酸化或被胺或從1個至20個 碳原子的有機加帽基團部分取代。其他氫氧根也可衍生成標準保護基團。多核苷酸還可包 括本領域已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，例如包括：2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基、2' -氟 代-或2' -疊氮基-核糖，碳環糖類似物，α-異頭糖，差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來 蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環類似物以及基本的核糖類似物諸如甲基核苷。一個 或多個磷酸二酯鍵合可被備選的連接基團替換。這些備選的連接基團包括但不限於：實施 方案，其中磷酸酯被P(〇)S(〃硫代〃）、P(S)S(〃二硫代〃）、〃 (0)NR2 (〃醯胺化〃）、P(0)R、P(0) OR'、C0或CH2 (〃縮醛形式〃）替換，其中各個R或R'獨立地是H或任選的含有醚（-0-)、鍵 合、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基（araldyl)的取代或未取代的烷基（1-20個C)。並 非所有的多核苷酸的鍵合需要是相同的。前述描述適用於本文中涉及到的所有多核苷酸， 包括RNA和DNA。
[0281] "寡核苷酸"是指短的，通常是單鏈，通常是一般但不一定具有小於約200個核苷酸 長度的合成多核苷酸。術語"寡核苷酸"和"多核苷酸"並不相互排斥。上文對多核苷酸的 描述同樣和完全適用於寡核苷酸。
[0282] "嚴格雜交條件"是指在該條件下，探針通常在核酸的複雜混合物中將與其 靶亞序列雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴格條件是依賴序列的並在不同的情況 下是不同的。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的大量的指導可見於 Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-Hybridizationwith NucleicProbes,''Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyof nucleicacidassays" (1993)。通常，嚴格條件選定為比在給定離子強度pH值下的特異性 序列的熱熔點（Tm)低約5°C-KTC。Tm是溫度（在確定的離子強度、pH和核濃度下），在 該溫度下，50%與靶標互補的探針與靶序列平衡雜交（因為靶序列過量存在時，在Tm時，在 平衡下，50%探針被使用）。嚴格條件還可通過加入去穩定劑諸如甲醯胺來實現。對選擇性 或特異性雜交，正信號是至少兩次背景雜交，優選10次背景雜交。實例性嚴格雜交條件可 以是如下：50%甲醯胺，5xSSC和1%SDS，在42°C下培養或5xSSC、l%SDS，在65°C下培養， 並在65 °C下用0. 2xSSC和0. 1 %SDS進行洗滌。
[0283] "重組體"當參照細胞、核酸、蛋白質、抗體或載體使用時，表明該細胞、核酸、蛋白 質或載體已經通過異源核酸或蛋白質的引入、天然核酸或蛋白質的改變進行了修飾，或表 明該細胞由被如此修飾的細胞衍生。例如，重組細胞表達在細胞的天然（非組合）形式中 未發現的基因或表達過表達或以其他方式異常表達的天然基因，例如作為非天然發生片段 或剪接變體。本文通過術語"組合核酸"意指：一般而言，通過一般不會在自然中發現的核 酸例如使用聚合酶和內切酶在體外最初形成的核酸。以這種方式，完成不同序列的可操作 的鍵合。因此，線性形式的分離核酸或通過連接一般不會連接的DNA分子在體外形成表達 載體，出於本公開的目的而都被認為是重組體。應當理解：一旦形成重組核酸並引入至宿主 細胞或有機體，重組核酸將複製非重組核酸，例如使用所述宿主細胞的體內細胞機器而非 體外操作；然而，此類核酸一旦重組產生，儘管隨後複製非重組，出於本公開的目的而都被 認為是重組體。同樣，"重組蛋白質"是使用重組技術例如通過本文所述的重組核酸的表達 製備的蛋白質。
[0284] 關於肽或多肽序列的"百分比（％ )胺基酸序列同一性"是指在如果需要的以達 到最大百分比序列同一性的比對序列和引入缺口並且任何保守取代不認為是序列同一性 的一部分後，在與特異性肽或多肽序列的胺基酸殘基相同的候選序列中的胺基酸殘基百分 t匕。為測定百分比胺基酸序列同一性的比對可以以本領域技術範圍內的各種方式例如使用 公眾可獲得的計算機軟體諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MegAlign(DNASTAR)軟體來完成。 本領域的技術人員可確定用於測量比對的適當的參數，包括在對照序列的全長上達到最大 對比所需的任何算法。
[0285] 可互換使用的"多肽"、"肽"、"蛋白質"和"蛋白質片段"是指胺基酸殘基的聚合物。 該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人 工化學模擬物，該術語還適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。
[0286] "胺基酸"是指天然存在的和合成的胺基酸以及功能與天然發生的胺基酸相類似 的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然發生的胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸以及後來 被修飾的這些胺基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基穀氨酸和〇-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是 指具有相同的基本化學結構的天然存在的胺基酸的化合物，例如，結合到氫、羧基、氨基和R 基的α碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞碸、蛋氨酸甲基鋶。此類類似物可具有修飾 的R基（例如正亮氨酸）或修飾的肽骨架，但保持天然發生的胺基酸的相同的基本化學結 構。胺基酸模擬物是指具有的結構與胺基酸的一般化學結構不同但功能與天然存在的氨基 酸相類似的化學化合物。
[0287] "保守修飾的變體"適用於胺基酸和胺基酸序列。"胺基酸變體"是指胺基酸序列。 對於特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸 或其中所述核酸不編碼胺基酸序列，還指基本相同或相關聯的（例如天然連續的）序列。由 於遺傳密碼的簡併性，大量功能相同的核酸編碼大多數蛋白質。例如，密碼子GCA，GCC，GCG 和GCU全部編碼胺基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定丙氨酸的每個位置，該密碼子可改變 成另一個所述相應密碼子而不用改變編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異"，該"沉 默變異"是一種保守修飾的變異。編碼多肽的本文所述的每個核酸序列還描述了核酸的沉 默變異。一個技術人員將認識到：在某些情況下，核酸中的各個密碼子（除通常是蛋氨酸的 唯一密碼子的AUG和通常是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外）可進行修飾以產生功能相同 的分子。同樣，編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在相對於表達產物但不相對於實際探針序 列的所述序列。至於胺基酸序列，一個技術人員將認識到：核酸、肽、多肽或蛋白質序列的 取代、缺失或添加是"保守修飾的變體"包括其中改變導致用化學上相似的胺基酸取代氨基 酸，該核酸、肽、多肽或蛋白質序列改變、添加或刪除編碼序列的一個胺基酸或小百分比的 胺基酸。提供功能相似的氨基端的保守取代表在本領域中是眾所周知的。此類保守修飾的 變體是除本文所述的多態變體、種間同系物和等位基因之外但並不將其排出。通常保守取 代包括：1)丙氨酸（A)、甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸（D)、穀氨酸（E) ;3)天冬醯胺（N)、穀氨醯 胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、蛋氨酸（M)、繳氨酸（V); 6)苯基丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)、蘇氨酸⑴以及8)半胱氨酸 (C)、蛋氨酸（M)(參見，例如，Creighton,Proteins(1984))。
[0288] "抗體" (Abs)和"免疫球蛋白"（Igs)是具有類似結構特性的糖蛋白質。然而抗體 對特定的抗原可顯示結合特異性，免疫球蛋白可包括抗體和通常缺乏抗原特異性的其他抗 體樣分子。後一種多肽，例如，由淋巴系統以低水平生成和由骨髓瘤以升高的水平生成。
[0289] "抗體"、"免疫球蛋白"和"免疫球蛋白構建體"在廣義上可互換使用且包括單克 隆抗體（例如，全長或完整的單克隆抗體）、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體（雙特異 性抗體，只要它們展現出期望的生物學活性）並還可包括某些抗體片段（如本文中更詳細 地描述）。術語"抗體"可指全長抗體或其一部分。抗體可指包含至少一個抗體序列的肽。 抗體序列可包含5個或更多個胺基酸的抗體序列。例如抗體序列可包含6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸的抗體序列。5個或更多個胺基酸可以是抗 體序列的連續胺基酸。或者，5個或多個胺基酸是抗體序列的非連續胺基酸。例如，5個或 更多個胺基酸可包含在抗體序列內的保守基序。例如，5個或更多個胺基酸可包含在超長 CDR3序列內的保守基序。抗體可以是人的、人源化的，全人的和/或親和力成熟的。抗體可 以是嵌合抗體。抗體可以是重組的、工程化的或合成的抗體。抗體可以是牛、牛工程化的、 全牛和/或親和力成熟的。牛工程化的抗體可包含由牛抗體序列衍生的一個或多個核苷酸 或肽。全牛抗體可包含用基於牛抗體序列的一個或多個核苷酸或肽替換非牛抗體序列的一 個或多個核苷酸或肽。抗體可指無論自然的或部分或完全合成的（諸如重組產生的）免疫 球蛋白和免疫球蛋白部分，所述免疫球蛋白或免疫球蛋白部分包括足以形成抗原結合位點 的免疫球蛋白分子可變區的至少一部分。因此，抗體或其部分包含與免疫球蛋白抗原結合 位點同源或基本同源的具有結合結構域的任何蛋白質。例如，抗體可指包含兩條重鏈（其 可表示為H和H'）和兩條輕鏈（其可表示為L和L'）的抗體，其中各個重鏈可以是足以形 成抗原結合位點的全長免疫球蛋白重鏈或其部分（例如，重鏈包括但不限於：VH鏈、VH-CHl 鏈和VH-CH1-CH2-CH3鏈）並且各個輕鏈可以是足以形成抗原結合位點的全長輕鏈或其部 分（例如，輕鏈包括但不限於：VL鏈和VL-CL鏈）。各個重鏈（H和H'）與一條輕鏈（分別 是L和L'）成對。通常，抗體最低限度地包括可變重鏈（VH)和/或可變輕鏈（VL)的全部 或至少一部分。抗體還可包括恆定區的全部或至少一部分。例如，全長抗體是具有兩條全 長重鏈（例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和兩條全長輕鏈（VL-CL)以及鉸 鏈區的抗體，諸如由抗體分泌B細胞產生的抗體和合成產生的具有相同結構域的抗體。此 外，"抗體"是指包含能夠非共價、可逆並以特定方式與相應的抗原結合的免疫球蛋白片段 的免疫球蛋白家族或多肽的一部分。實例性抗體結構單元包括四聚物。各個四聚物包含兩 個相同的多肽鏈對，具有一條"輕鏈"（約25kD)和一條"重鏈"（約50-70kD)的各個對通 過二硫鍵連接。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恆定區基因以及大 量免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為依次分別定義免疫球蛋 白種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的γ、μ、α、δ或ε。各個鏈的N-端定義約100至110 或更多個主要負責抗原識別的胺基酸的可變區。術語"可變輕鏈（VL) "和"可變重鏈（VH) " 分別是指輕鏈和重鏈的這些區域。在一些情況下，本文提供的抗體包含來自禽類抗體、爬蟲 類抗體、兩棲類抗體、昆蟲抗體或其嵌合組合物的至少一個免疫球蛋白結構域。抗體可包含 來自嵌合結構域的至少一個免疫球蛋白結構域。嵌合抗體可由倆個或多個不同種類衍生 (例如，鼠和人，牛和人）。抗體可包含來自工程化的、重組或合成抗體的至少一個免疫球蛋 白結構域。在一些情況下，使用實驗室製備或從細胞提取的抗體基因創建工程化的、重組或 合成抗體。抗體基因源自一種或多種哺乳動物。例如，抗體基因源自人類。抗體基因源自 牛。此外或另外，本文公開的抗體包含來自人源化的、人工程化的或全人抗體的至少一個免 疫球蛋白結構域。抗體可包含來自兩種或更多種不同抗體的抗體序列。兩種或更多種不同 抗體可以來自相同種類。例如，該種類可以是牛種類、人種類或鼠種類。兩種或更多種不同 抗體可以來自相同類型的動物。例如，兩種或更多種不同抗體可以來自牛。兩種或更多種 不同抗體可以來自人。此外，兩種或更多種不同抗體是來自不同種類。例如，兩種或更多種 不同抗體是來自人種類和牛種類。在另一個實例中，兩種或更多種不同抗體是來自牛種類 和非牛種類。在另一個實例中，兩種或更多種不同抗體是來自人種類和非人種類。兩種或 更多種不同抗體可以來自不同動物。例如，兩種不同動物是人和母牛。不同動物可以來自 相同種類。例如，不同動物是人和母牛。不同動物可以是來自相同種類，例如不同動物可以 是母牛和水牛。
[0290]"可變"是指可變域的某些部分（亦被稱為可變區）在抗體的序列間差異廣泛並 用於各個特定抗體與其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性不是均勻分布於整個抗體 的可變域。可變性主要集中在三個區域，該三個區域被稱為：兩個都在輕鏈的互補決定區 (CDR)或高變區（HVR)以及重鏈可變域。CDR包括這些指定為如本文所示的在可變區序列 內的Kabat、Chothia和頂GT。可變域的更高度保守部分被稱為構架（FR)。天然重鏈和輕 鏈的可變區各自包含大多採取β-片層構型並由三個形成環的CDR連接的四個FR區，該環 連接β-片層結構並在一些情況形成β-片層結構的一部分。在各個鏈中的⑶R通過FR 區域緊密保持在一起，並與來自其他鏈的CDR-起促成抗體的抗原-結合位點的形成（參 見:Kabat等人，SeauencesofProteinsofTmmunologicalInterest,第五版，National InstituteofHealth,Bethesda,Md. (1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但現 實多種效應子功能，諸如抗體參與到抗體-依賴性細胞的細胞毒性。
[0291] 抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的被稱為"Fab"片段的抗原-結合片段，各 自具有一個抗原-結合位點和殘餘"Fc"片段，"Fab"片段的名稱反映了其易於結晶的能力。 胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原-結合位點的F(ab)2片段並仍能夠交聯抗原。
[0292]"Fv"是指包含抗原-識別和抗原結合位點的抗體。在雙鏈Fv種類中，該區域包含 一條重鏈和一條輕鏈可變域的非共價結合的二聚體。在單鏈Fv(scFv)種類中，一條重鏈和 一條輕鏈可變域可由柔性肽接頭共價地連接，進而輕鏈和重鏈可以"二聚的"結構連接，該 "二聚的"結構的結構類似於輕鏈和重鏈在雙鏈Fv(scFv)種類中。正是在這種構型中，各個 可變域的3個⑶R相互作用以將抗原-結合位點限定在VH-VL二聚體的表面上。6個⑶R 共同賦予抗體的抗原-結合特異性。然而，即使一個可變域（或只含有三個抗原特異性的 Fv的一半）也具有識別和結合抗原的能力，雖然比完整結合位點更低的親和力。
[0293]Fab片段還含有輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域（CHl)。Fab'片段因在包含抗 體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸的重鏈CHl結構域的羰基末端處添加幾個殘基而與Fab片 段不同。Fab' -SH本文指定為Fab'，其中恆定域的半胱氨酸殘基具有游離地硫醇基。F(ab'）2 抗體片段最初是作為Fab'片段對產生，該Fab'片段在其之間具有鉸鏈半胱氨酸。還已知 抗體片段的其他化學偶聯。
[0294] 基於脊椎動物種類恆定域的胺基酸序列，將來自任何脊椎動物種類的抗體（免疫 球蛋白）的"輕鏈"分配到兩個明顯不同類型的被稱為kappa(K)和IambdaU)的其中之 〇
[0295] 基於它們的重鏈恆定域的胺基酸序列，將免疫球蛋白分配成不同的類別。存在五 個重要類別的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM以及可進一步分為亞類（同種型）的 一些免疫球蛋白，例如IgGpIgG2、IgG3、IgG4、IgAJPIgA2。對應於免疫球蛋白的不同種類 的重鏈恆定域分別被稱為a、S、ε、Y和μ。免疫球蛋白不同類別的亞基結構和三維構 型是眾所周知的。
[0296] "抗體片段"包含完整抗體的僅僅一部分，其中該部分優選保留在完整抗體存在 時通常與該部分相關聯的至少一個、優選大部分或全部功能。抗體片段的實例包括：Fab、 Fab'、F(ab'）2、單鏈Fvs(scFv)、Fv、dsFv、雙抗體（例如（dsFv)2)、Fd和Fd' 片段、Fab 片段、Fd片段、scFv片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微抗體、柔性微抗體、雙特異性片段和 由抗體片段形成的多特異性抗體（參見，例如MethodsinMolecularBiology,第207 卷：RecombinantAntibodiesforCancerTherapyMethodsandProtocols(2003);第一 章；第3-25頁，Kipriyanov)。其他已知的片段包括但不限於：scFab片段（Hust等人，BMC Biotechnology(2007)，7:14)。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點 以及因此保留結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含Fc區域的抗體 片段，保留在完整抗體存在時通常與該Fc區域相關聯的至少一個生物學功能，諸如FcRn結 合、抗體半衰期調控、ADCC功能和互補結合。在一個實施方案中，抗體片段是具有體內半衰 期基本類似於完整抗體的單價抗體。例如，此類抗體片段可包含與Fc序列連接的能夠賦予 片段體外穩定性的抗原結合臂。再例如，抗體片段或抗體部分是指全長抗體的任何部分，該 部分小於全長但包含足以形成抗原結合位點的抗體可變區的至少一部分（例如，一個或多 個CDR)並因此保留全長抗體、抗體片段、包括由全長抗體酶處理產生的抗體衍生物以及合 成例如重組產生的衍生物的結合特異性和/或活性。
[0297] "dsFv"是指具有工程化分子間二硫鍵並穩定VH-VL對的Fv。
[0298] "Fd片段"是指包含可變區（VH)和抗體重鏈的一個恆定區結構域（CHl)的抗體片 段。
[0299] "Fab片段"是指含有由全長免疫球蛋白在木瓜蛋白酶下的消化產生的全長抗體的 一部分的抗體片段或具有合成例如重組產生的相同結構的片段。Fab片段包含輕鏈（含有 VL和CL部分）以及含有重鏈可變域（VH)和重鏈的一個恆定區域結構域部分（CHl)的另一 條鏈；Fab片段可重組產生。
[0300] "F(ab'）2片段"是指由免疫球蛋白在胃蛋白酶pH4.0-4.5下的消化產生的抗體 片段或合成例如重組產生的具有相同結構的抗體。F(ab'）2片段包含兩個Fab片段但其中 各個重鏈部分包含幾個附加胺基酸，包括形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，該二硫鍵連接兩個 片段；F(ab'）2片段可重組產生。
[0301] "Fab'片段"是指包含F(ab'）2片段的一半（一條重鏈和一條輕鏈）的片段。
[0302] "Fd'片段"是指包含F(ab'）2片段的一條重鏈部分的抗體的片段。
[0303] "Fv'片段"是指僅僅包含抗體分子的VH和VL結構域的片段。
[0304] "scFv片段"是指包含可變輕鏈（VL)和可變重鏈（VH)的抗體片段，該可變輕鏈 (VL)和可變重鏈（VH)由多肽接頭以任何順序共價連接。接頭具有長度以便於橋接兩個可 變域而無本質幹擾。示例性接頭是具有整個分散以增加溶解度的一些Glu或Lys殘基的 (Gly-Ser)η殘基。
[0305] 雙特異抗體是二聚的scFv;雙特異抗體通常具有比acFv短的肽接頭，並且雙特異 抗體優選成為二聚體。
[0306] "HsFv"是指抗體片段，其中通常存在於Fab片段中的恆定域已經被異源二聚捲曲 螺旋結構域取代（參見，例如Arndt等人，（2001)JMolBiol. 7:312:221-228)。
[0307] "高變區"、"HVR"或"HV"、以及"互補決定區"或"⑶R"，可指抗體可變域的區域， 該抗體可變域是序列高變的和/或形成限定的環。通常，抗體包含6個高變或CDR區域、 3個VH(H1，H2,H3)和3個VL(L1，L2,L3)。許多高變區域或⑶R劃定都在使用中並涵蓋 於本文。Kabat互補決定區（Kabat⑶R)是基於序列可變性並且是最常使用的（Kabat 等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 5 版PublicHealth Service，NationalInstitutesofHealth，Bethesda,Md. (1991))。Chothia改為是指結構 環的位置（Chothia和Lesk,J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))。AbM高變區代表在Kabat ⑶R和Chothia結構環（Chothia"⑶R"）間的折中並被牛津分子AbM抗體建模軟體採用。 "接觸"高變區域是基於可獲得複合物晶體結構的分析。來自各個這些高變區域的殘基記錄 如下。（另請參見，例如，圖1和12. 3ICI抗體的粗體、斜體文本是Kabat⑶R且加下劃線的 文本是ChothiaCDR)

【權利要求】
1. 一種抗體或其結合片段的文庫，其中該抗體或其結合片段包含超長CDR3。
2. -種編碼抗體或其結合片段的多核苷酸的文庫，其中該編碼的抗體或其結合片段包 含超長CDR3。
3. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3的長度為35個胺基酸或更長、 長度為40個胺基酸或更長、長度為45個胺基酸或更長、長度為50個胺基酸或更長、長度為 55個胺基酸或更長或者長度為60個胺基酸或更長。
4. 如權利要求3所述的文庫，其中所述超長CDR3的長度為35個胺基酸或更長。
5. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3包含3個或更多個半胱氨酸殘 基、4個或更多個半胱氨酸殘基、5或更多個半胱氨酸殘基、6個或更多個半胱氨酸殘基、7個 或更多個半胱氨酸殘基、8個或更多個半胱氨酸殘基、9個或更多個半胱氨酸殘基、10個或 更多個半胱氨酸殘基、11個或更多個半胱氨酸殘基或12個或更多個半胱氨酸殘基。
6. 如權利要求5所述的文庫，其中所述超長CDR3包含3個或更多個半胱氨酸殘基。
7. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述抗體或其結合片段包含半胱氨酸基序。
8. 如權利要求7所述的文庫，其中所述半胱氨酸基序是SEQ ID NOS:45-99中的任一個 或 SEQ ID N0S: 100-56 中的任一個。
9. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3包含非人DH或其衍生物。
10. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含JH序列或其衍生物。
11. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3包含：(a)非人VH序列或其衍 生物；(b)非人DH序列或其衍生物；和/或（c) JH序列或其衍生物。
12. 如權利要求11所述的文庫，其中所述超長CDR3包含額外的胺基酸序列，該額外的 胺基酸序列包含位於VH序列與DH序列之間的2-6個或更多個胺基酸殘基。
13. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3包含非牛序列。
14. 如權利要求13所述的文庫，其中所述非牛序列為非抗體或人序列。
15. 如權利要求13所述的文庫，其中所述非牛序列代替了所述超長CDR3的至少一部 分。
16. 如權利要求12-14中任一項所述的文庫，其中所述非牛序列是激素、淋巴因子、白 介素、趨化因子、細胞因子、毒素或它們的組合。
17. 如權利要求16所述的文庫，其中所述非牛序列是細胞因子。
18. 如權利要求17所述的文庫，其中所述細胞因子是粒細胞集落刺激因子（G-CSF)。
19. 如權利要求13所述的文庫，其中所述超長CDR3包含額外的序列，該額外的序列是 接頭。
20. 如權利要求19所述的文庫，其中所述接頭連接至所述非抗體序列的C-末端，N-末 端，或同時連接至C-末端和N-末端。
21. 如權利要求19所述的文庫，其中所述接頭是（GGGGS) n(SEQ ID NO:339)，其中η為 1至5的整數。
22. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含X 1X2X3X4X5基序，其中X 1S 蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)，其中X2為絲氨酸（S)、蘇氨 酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天冬醯胺（N)，其中X 3為纈氨 酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4為組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸 (R) 、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5為穀氨醯胺（Q)。
23. 如權利要求21的所述的文庫，其中所述X1X2X3X4X 5基序選自SEQ ID N0S:159-191。
24. 如權利要求22所述的文庫，其中所述超長CDR3還包含（X aXb) z基序，其中X a為任 意胺基酸殘基，Xb為選自下組的芳族胺基酸：酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組氨 酸⑶，並且其中z為1-4。
25. 如權利要求24所述的文庫，其中所述（X aXb) z基序為YXYXYX。
26. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3包含X 1X2X3X4X5X n(XaXb)z基序， 其中X1為蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)，其中X 2為絲氨酸 (S) 、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天冬醯胺（N)，其中X3 為纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4為組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、 精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5為穀氨醯胺（Q)，其中XaS 任意胺基酸殘基，Xb為選自下組的芳族胺基酸：酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組 氨酸（H)，其中η為27-54,並且其中z為1-4。
27. 如權利要求26所述的文庫，其中所述X 1X2X3X4X5基序是TTVHQ(SEQ ID NO. 159)或 TSVHQ (SEQ ID NO. 160)，並且其中所述（XaXb)z基序是 YXYXYX。
28. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含TSVHQETKKYQ(SEQ ID NO. 157), VHQETKKYQ(SEQ ID NO: 158), CTTVHQXn (SEQ ID NO. 223)m CTSVHQXn (SEQ ID NO. 224)，其中 n 為 1-8, TTVHQ(SEQ ID NO. 159)、TSVHQ(SEQ ID NO. 160)、VHQ、KKQ、VYQ、 YTYNYEW(SEQ ID NO: 235)，或它們的組合。
29. 如權利要求I或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含CX 1X2X3X4Q,其中X1為T、S、 A或G，其中X2為T、S、A、P或I，其中X 3為V或K，並且其中X 4為H、K或Y。
30. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含CX 1X2VHQ,其中X1為T、S、 A或G，並且其中X2為T、S、A、P或I。
31. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含CX 1X2VX3Q,其中X1為T、S、 A或G，其中X2為T、S、A、P或I，並且其中X 3為H、Y或K。
32. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含CX 1X2KKQ,其中X1為T、S、 A或G，並且其中X2為T、S、A、P或I。
33. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含YX 1YX2,其中X2為E或D。
34. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含YX 1YX2Y15
35. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含Y (E/D)X，其中X為H、W、 N、F、I 或 Y。
36. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含XY(E/D)，其中X為T、S、N 或I。
37. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長⑶R3包含Y (E/D) X 1XnW，其中X1為H、 W、N、F、I或Y，並且其中η為1-4。
38. 如權利要求1或2的文庫，其中所述抗體或其結合片段是嵌合的、人工程化的或人 源化的。
39. 如權利要求1或2所述的文庫，其中所述超長CDR3是反芻動物的CDR3。
40. 如權利要求39所述的文庫，其中所述反芻動物是牛。
41. 一種載體的文庫，其包含如權利要求2-40中任一項所述的多核苷酸文庫。
42. -種宿主細胞的文庫，其包含如權利要求41所述的載體文庫。
43. 如權利要求42所述的文庫，其中所述細胞是細菌、昆蟲、病毒或噬菌體。
44. 如權利要求42所述的文庫，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
45. 如權利要求42所述的文庫，其中所述抗體或其結合片段被展示在細胞表面上。
46. 如權利要求42所述的文庫，其中所述抗體或其結合片段是從細胞分泌的。
47. 如權利要求42所述的文庫，其中所述抗體或其結合片段以空間尋址的格式存在。
48. -種重組抗體或其片段，其中所述重組抗體或其片段的至少一部分基於或來源於 超長⑶R3的至少一部分。
49. 一種抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中該第一抗體序列的至少一部 分來源於超長CDR3的至少一部分；(b)非抗體序列；和（c)任選的第二抗體序列，其中該第 二抗體序列的至少一部分來源於超長⑶R3的至少一部分。
50. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、人工程化抗體或人源 化抗體。
51. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是牛抗體、牛源化抗體、牛工程化抗 體或全牛抗體。
52. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體包含Fab、scFv、dsFv、雙抗體、 (dsFv) 2、微抗體、柔性微抗體或雙特異性片段。
53. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是分離的抗體。
54. 如權利要求48所述的抗體，其進一步包含非抗體序列。
55. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來源於哺乳動物。
56. 如權利要求55所述的抗體，其中所述哺乳動物是牛、人或非牛哺乳動物。
57. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來源於非牛動物。
58. 如權利要求57所述的抗體，其中所述非牛動物是蠍子、蜥蜴或蝸牛。
59. 如權利要求58所述的抗體，其中所述蜥蜴是鈍尾毒蜥。
60. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來源於生長因子、細胞因子、 激素或毒素。
61. 如權利要求60所述的抗體，其中所述生長因子是GSCF、GMCSF或FGF21。
62. 如權利要求61所述的抗體，其中所述GCSF是牛GCSF或人GCSF。
63. 如權利要求60所述的抗體，其中所述細胞因子是β-幹擾素。
64. 如權利要求60所述的抗體，其中所述激素是毒蜥外泌肽-4、GLP-1、促生長素抑制 素或促紅細胞生成素。
65. 如權利要求60所述的抗體，其中所述毒素是Mokal、VM-24、氯毒素、齊考諾肽或原 毒素2。
66. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是合成序列。
67. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是細胞因子序列、淋巴因子 序列、趨化因子序列、生長因子序列、激素序列或毒素序列。
68. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是IL-8序列、IL-21序列 中、SDF-I ( α )序列、促生長素抑制素序列、氯毒素序列、原毒素2序列或齊考諾肽序列。
69. 如權利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列選自SEQ ID NOS: 317-332。
70. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述超長CDR3基於或來源於牛超長CDR3。
71. 如權利要求48所述的抗體，其中所述抗體的至少一部分來自哺乳動物。
72. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一抗體序列的至少一部分和/或所述第二 抗體序列的至少一部分來自哺乳動物。
73. 如權利要求71-72中任一項所述的抗體，其中所述哺乳動物是牛、人或非牛哺乳動 物。
74. 如權利要求48所述的抗體，其中所述抗體在長度上為3個或更多個胺基酸。
75. 如權利要求48所述的抗體，其中所述基於或來源於超長CDR3的至少一部分的抗體 的部分在長度上為20個或更少的胺基酸。
76. 如權利要求48所述的抗體，其中所述基於或來源於超長CDR3的至少一部分的抗體 的部分在長度上為3個或更多個胺基酸。
77. 如權利要求48所述的抗體，其中所述抗體包含基於或來源於超長CDR3的莖結構 域、超長CDR3的隆突結構域或其組合的一個或多個胺基酸殘基。
78. 如權利要求48所述的抗體，其中該抗體包含來源於超長⑶R3的莖結構域的一個或 多個保守基序。
79. 如權利要求54所述的抗體，其中所述非抗體序列代替了所述超長CDR3的至少一部 分。
80. 如權利要求48或49所述的抗體，其中所述超長CDR3的部分包含超長CDR3的莖結 構域的至少一部分、超長CDR3的隆突結構域的至少一部分或其組合。
81. 如權利要求48所述的抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID N0S: 157-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個的序列。
82. 如權利要求48所述的抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID N0S:157-224和 235-295中任一個的序列50 %或更高同源的序列。
83. 如權利要求48所述的抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID N0S: 157-234的第一序列 和選自 SEQ ID NOS :235-307 和 SEQ ID NOS :333-336 的第二序列。
84. 如權利要求48所述的抗體，其中所述重組抗體或其片段的一部分基於或來源於單 個超長⑶R3序列的至少一部分。
85. 如權利要求48所述的抗體，其中所述重組抗體或其片段的一部分基於或來源於兩 種或更多種不同的超長CDR3序列的至少一部分。
86. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長CDR3的一部分基於或來源於BLV1H12超 長Q)R3序列。
87. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長CDR3的一部分基於或來源於與BLV1H12 超長⑶R3序列50 %或更高同源的序列。
88. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長⑶R3的一部分基於或來源於BLV5B8、 BLVCVl、BLVOT3、BLV8C1 UBFlHl 或 F18 超長 CDR3 序列。
89. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長CDR3的一部分基於或來源於與BLV5B8、 81^(^1、81^^)3、81^8(：11、8?1!11或？18超長〇)1?3序列50%或更高同源的序列。
90. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和第二抗體序列的長度為3個或更多個 胺基酸。
91. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序 列的一部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分在長度上為20 個或更少的胺基酸。
92. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分在長度上為 3個或更多的胺基酸。
93. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列包含基於或來源於 超長CDR3的莖結構域、超長CDR3的隆突結構域或其組合的一個或多個胺基酸殘基。
94. 如權利要求77或93所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的隆突結構域的一個 或多個胺基酸殘基是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。
95. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列包含來源於超長 CDR3的莖結構域的一個或多個保守基序。
96. 如權利要求78或95所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的莖結構域的一個或 多個保守基序包含選自SEQ ID NOS:157-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個的序列。
97. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分包含選自SEQ ID NOS:157-307 和 SEQ ID NOS:333-336 中的任一個的序列。
98. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分包含與選自 SEQ ID N0S: 157-224和235-295中的任一個的序列50%或更高同源的序列。
99. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體序 列的一部分包含選自SEQ ID NOS:157-234中的任一個的序列。
100. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分包含與選自SEQ ID N0S: 157-224中的任一個的序列50%或更高同源的序列。
101. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體 序列的一部分包含選自SEQ ID NOS:235-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個的序列。
102. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體 序列的一部分包含與選自SEQ ID N0S:235-295中的任一個的序列50%或更高同源的序列。
103. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和所述來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分來源於相同 的超長⑶R3序列。
104. 如權利要求49所述的抗體，其中所述來源於超長CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和所述來源於超長CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分來源於兩種 或更多種不同的超長CDR3序列。
105. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長CDR3的部 分基於或來源於BLV1H12超長CDR3序列。
106. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長CDR3的部 分基於或來源於與BLV1H12超長⑶R3序列50%或更高同源的序列。
107. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長CDR3的部 分基於或來源於 BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl 或 F18 超長 CDR3 序列。
108. 如權利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長CDR3的部 分基於或來源於與81^588、81^(^1、81^^)3、81^8(：11、8?1!11或？18超長〇)1?3序列50%或 更高同源的序列。
109. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3基於或來源於長度為 35個或更多個胺基酸的超長CDR3。
110. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3基於或來源於包含3 個或更多個半胱氨酸殘基的超長CDR3。
111. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3基於或來源於包含一 個或多個半胱氨酸基序的超長CDR3。
112. 如權利要求111所述的抗體，其中所述一個或多個半胱氨酸基序選自SEQ ID NOS:45-99。
113. 如權利要求112所述的抗體，其中所述一個或多個半胱氨酸基序選自SEQ ID N0S:100-156。
114. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體基於或來源於長度為35個 或更多個胺基酸的超長CDR3。
115. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體基於或來源於包含3個或 更多個半胱氨酸殘基的超長CDR3。
116. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體基於或來源於包含一個或 多個半胱氨酸基序的超長CDR3。
117. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含長度為35個或更多個 胺基酸的超長CDR3。
118. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體含有包含3個或更多個半 胱氨酸殘基的超長CDR3。
119. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述抗體含有包含一個或多個半胱 氨酸基序的超長CDR3。
120. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長⑶R3是重鏈⑶R3。
121. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3包含來源於或基於非 人DH序列的胺基酸序列。
122. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3包含來源於或基於 JH序列的胺基酸序列。
123. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長⑶R3包含： a. 來源於或基於非人VH序列的胺基酸序列； b. 來源於或基於非人DH序列的胺基酸序列；和/或 c. 來源於或基於JH序列的胺基酸序列。
124. 如權利要求48-49中任一項所述的抗體，其中所述超長CDR3包含額外的胺基酸序 列，該額外的胺基酸序列包含位於VH衍生的胺基酸序列與DH衍生的胺基酸序列之間的至 少約兩個胺基酸殘基。
125. 如權利要求48所述的抗體，其中所述抗體或其結合片段包含選自SEQ ID NOS :24-44的序列，該抗體或其結合片段由SEQ ID NOS :2-22的DNA編碼。
126. 如權利要求48所述的抗體，其中所述抗體或其結合片段包含選自SEQ ID NO:23 的序列，該抗體或其結合片段由SEQ ID NO: 1的DNA編碼。
127. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長⑶R3包含選自SEQ ID NOS :24-44的序 列。
128. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長⑶R3包含選自SEQ ID NO:23的序列。
129. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長CDR3是由來源於或基於SEQ ID NOS :2-22的DNA序列所編碼的。
130. 如權利要求48所述的抗體，其中所述超長⑶R3是由來源於或基於SEQ ID NO: 1 的DNA序列所編碼的。
131. 如權利要求48、49或54所述的抗體，其進一步包含第一接頭序列。
132. 如權利要求131所述的抗體，其進一步包含第二接頭序列。
133. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和第二接頭序列包含相同的序列。
134. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和第二接頭序列包含不同的序列。
135. 如權利要求131-132中任一項所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將 所述非抗體序列連接到基於或來源於超長CDR3的部分的部分上。
136. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將所述非抗體序 列連接到所述第一抗體序列上。
137. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將所述非抗體序 列連接到所述第二抗體序列上。
138. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含序列GGGGS。
139. 如權利要求132的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含（a)序列（GGGGS) n且其中 η = 1 至 5 ; (b)序列 GGGSGGGGS ; (c)序列 GGGGSGGGS ;或（d) (a) - (c)的組合。
140. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列為相同的長度。
141. 如權利要求132的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列為不同的長度。
142. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列的長度為3個或 更多個胺基酸。
143. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個或多個 甘氨酸殘基。
144. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含2個或更多 個連續甘氨酸殘基。
145. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個或多個 絲氨酸殘基。
146. 如權利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個或多個 極性胺基酸殘基。
147. 如權利要求146所述的抗體，其中所述1個或多個極性胺基酸殘基選自絲氨酸、蘇 氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺。
148. 如權利要求146所述的抗體，其中所述極性胺基酸殘基包含不帶電荷的側鏈。
149. 如權利要求48所述的抗體，其進一步包含一個或多個切割位點。
150. 如權利要求149所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點包括蛋白酶的識別位 點。
151. 如權利要求149所述的抗體，其中所述蛋白酶為因子Xa。
152. 如權利要求149所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點包括IEGR的胺基酸序 列。
153. 如權利要求149所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點位於所述第一抗體序 列與所述非抗體序列之間。
154. 如權利要求149所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點位於所述第二抗體序 列與所述非抗體序列之間。
155. 如權利要求49所述的抗體，其進一步包含一個或多個切割位點和一個或多個接 頭。
156. 如權利要求155所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點位於所述一個或多個 接頭與所述非抗體序列之間。
157. 如權利要求155所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點位於所述第一抗體序 列與所述一個或多個接頭之間。
158. 如權利要求155所述的抗體，其中所述一個或多個切割位點位於所述第二抗體序 列與所述一個或多個接頭之間。
159. -種抗體或其結合片段的文庫，其中該抗體或其結合片段包含超長CDR3。
160. -種抗體或其結合片段的文庫，其中該抗體或其結合片段包含如權利要求 48-158中任一項所述的抗體或結合片段。
161. -種核酸文庫，其包含多個包含編碼抗體或其結合片段的序列的多核苷酸，其中 該抗體或其結合片段包含超長CDR3。
162. -種核酸文庫，其包含多個包含編碼抗體或其結合片段的序列的多核苷酸，其中 該抗體或其結合片段包含如權利要求48-158中任一項所述的抗體或結合片段。
163. -種多核苷酸，其包含編碼可變區的核酸序列，其中該可變區包含超長⑶R3。
164. -種包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼可變區的核酸序列，其中該 可變區包含超長⑶R3。
165. -種包含多核苷酸的宿主細胞，其中該多核苷酸包含編碼可變區的核酸序列，其 中該可變區包含超長⑶R3。
166. -種多核苷酸，其包含編碼如權利要求48-158中任一項所述的抗體或其結合片 段的核酸序列。
167. -種包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼如權利要求 [00144] -[00173]中任一項所述的抗體或其結合片段的核酸序列。
168. -種包含多核苷酸的宿主細胞，其中該多核苷酸包含編碼如權利要求48-158中 任一項所述的抗體或其結合片段的核酸序列。
169. -種產生包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段的方法，其包括在其中所 述多核苷酸序列得到表達並且所述包含超長CDR3或其片段的抗體或其結合片段得以產生 的條件下培養權利要求168的宿主細胞。
170. 如權利要求169所述的方法，其進一步包括從宿主細胞培養物中回收所述包含超 長CDR3或其片段的抗體或其結合片段。
171. -種藥物組合物，其包含如權利要求48-158中任一項所述的抗體或其片段。
172. -種藥物組合物，其包含（a)包含基於或來源於超長⑶R3的至少一部分的序列的 抗體或其片段；和（b)藥學上可接受的賦形劑。
173. 如權利要求172或173所述的藥物組合物，其進一步包含治療劑。
174. 如權利要求172或173的藥物組合物，其中所述治療劑是抗體、小分子、有機化合 物、肽、蛋白質。
175. -種治療有需要的受試者的疾病或病症的方法，其包括向哺乳動物施用治療有效 量的如權利要求48-158中任一項所述的抗體。
176. 如權利要求175所述的方法，其中所述抗體包含超長CDR3序列和非抗體序列。
177. 如權利要求176所述的方法，其中所述非抗體序列選自Mokal、Vm24、GLP-l、毒蜥 外泌肽-4、β -幹擾素、人EPO、人FGF21、人GMCSF、人幹擾素-β、牛GCSF、人GCSF、IL8、齊 考諾肽、促生長素抑制素、氯毒素 、SDFl ( α )、IL21、原毒素2以及它們的衍生物或變體。
178. 如權利要求175所述的方法，其中所述疾病或病症選自：自身免疫性疾病、異種免 疫性疾病或病症、炎性疾病、病原性感染、血栓栓塞性病症、呼吸系統疾病或病症、代謝病、 中樞神經系統（CNS)病症、骨病、癌症、血液病症、肥胖症、糖尿病、骨質疏鬆症、貧血或疼 痛。
179. 如權利要求175所述的方法，其中所述疾病或病症將受益於離子通道的調節。
180. 如權利要求179所述的方法，其中所述離子通道選自鉀離子通道、鈉離子通道或 酸敏感離子通道。
181. 如權利要求175所述的方法，其中所述離子通道選自KvL 3離子通道、NavL 7離 子通道和酸敏感離子通道（ASIC)。
182. 如權利要求175所述的方法，其中所述疾病或病症將受益於受體的調節。
183. 如權利要求182所述的方法，其中所述受體選自GLPIR、GCGR、EPO受體、FGFR、 FGF21R、CSFR、GMCSFR、IL8R、IL21R 和 GCSFR。
184. 如權利要求175所述的方法，其中所述疾病或病症是乳腺炎。
185. 如權利要求175所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
186. 如權利要求185所述的方法，其中所述哺乳動物是牛或人。
187. -種分離的晶體，其含有包含SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 23的牛抗體Fab片段， 其中該晶體具有空間群a = 71. 4埃、b = 127. 6埃且c = 127. 9埃的晶胞尺寸。
188. -種分離的晶體，其含有包含SEQ ID NO: 340和SEQ ID NO: 341的牛抗體Fab片 段，其中該晶體具有空間群a = 54. 6埃、b = 53. 7埃且c = 330. 5埃的晶胞尺 寸。
【文檔編號】C07K16/18GK104520321SQ201380013323
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年1月9日 優先權日:2012年1月9日
【發明者】奧馬爾·A·巴茲甘, 茅洪源, 沃恩·斯密德, 達米安·愛可爾特, P·舒爾茨, 峰·王, 伊恩·威爾森, 勇·張 申請人:斯克利普斯研究所, 奧馬爾·A·巴茲甘, 茅洪源