含有穩定化類維生素a的柔和化妝品組合物的製作方法

2023-06-05 20:12:11 4

專利名稱：含有穩定化類維生素a的柔和化妝品組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種皮膚和毛髮用的化妝品組合物，其釋放類維生素A(retinoid)，具有改進的類維生素A穩定性並對於皮膚來說也是柔和的。
已知類維生素A具有寬泛的皮膚益處例如皮膚增亮、皺紋處理、油的控制。不幸的是，類維生素A不穩定，尤其是在水的存在下。然而，化妝品組合物幾乎總含有大量的水，從而提供美學可接受的表觀和觸覺特性。另一個與使用類維生素A有關的缺點在於其刺激性，尤其是當以相對高濃度塗敷和/或塗敷在敏感皮膚上時。因此，含有改進的穩定性的類維生素A並對於皮膚來說柔和的化妝品組合物是商業上所希望的。
一種水包油乳狀液化妝品組合物含有(a)溶解在流體油中的類維生素A，(b)聚合乳化劑。
除了在操作和對比例中，或者另外清楚地指出，本說明書中表示物質的量或反應條件、物質的物理性質和/或使用的所有數值均理解是用詞「約」修飾。所有的量是以最終組合物的重量計，除非另外說明。
在此所用的術語″皮膚″包括面部、頸部、胸部、背部、臂、手、腿和頭皮上的皮膚。
溶解在流體油中的類維生素A本發明組合物含有類維生素A。適用的類維生素A包括但不限於視黃基酯、視黃醇、視黃醛和視黃酸，優選視黃醇或視黃基酯。術語「視黃醇」包括視黃醇的下列異構體全反式視黃醇、13-順式-視黃醇、11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇；3，4-二脫氫-13-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-11-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-9-順式-視黃醇。優選的異構體是全反式視黃醇、13-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇、9-順式-視黃醇。首選全反式視黃醇，這歸因於其廣泛的商業可得性。
視黃基酯是視黃醇的酯。術語「視黃醇」定義如上。適用於本發明的視黃基酯是視黃醇的C1-C30酯，優選C2-C20酯，並且首選C2、C3和C16酯，因為它們通常更易得到。視黃基酯的實例包括但不限於棕櫚酸視黃基酯、甲酸視黃基酯、乙酸視黃基酯、丙酸視黃基酯、丁酸視黃基酯、戊酸視黃基酯、異戊酸視黃基酯、己酸視黃基酯、庚酸視黃基酯、辛酸視黃基酯、壬酸視黃基酯、癸酸視黃基酯、十一烷酸視黃基酯、十二烷酸視黃基酯、十三烷酸視黃基酯、肉豆蔻酸視黃基酯、十五烷酸視黃基酯、十七烷酸視黃基酯、硬脂酸視黃基酯、異硬脂酸視黃基酯、十九烷酸視黃基酯、花生四烯酸視黃基酯、山嵛酸視黃基酯、亞油酸視黃基酯、油酸視黃基酯。
本發明優選的酯選自棕櫚酸視黃基酯、乙酸視黃基酯和丙酸視黃基酯，因為這些酯商業上可得性最高因而價格低廉。亞油酸視黃基酯和油酸視黃基酯也因其功效而優選。
類維生素A在本發明中的用量至少約0.001％，優選約0.001％-約10％，更優選該用量是約0.01％-約1％，首選約0.01％-約0.5％。
存在於本發明組合物中的類維生素A溶解在流體油中以便改進類維生素A的儲存穩定性。以使類維生素A在25℃下以至少0.1g類維生素A/100g該油的量溶解的方式來選擇適用的流體油。優選類維生素A以至少2g視黃酸/100g的該油的量溶解，首選以2-80g類維生素A/100g該油的量溶解。
作為舉例說明，視黃醇結晶在不同油中的溶解度如下所述油 溶解度，重量％礦物油 34.2Cetiol OE 80棕櫚酸異硬脂基酯 44C12-15烷基苯甲酸酯 85甘油三油酸酯/角鯊烯(6∶1) 56.4環甲基矽酮 2.7聚二甲基矽氧烷 0.49通過下列方法測定類維生素A在油中的溶解度。將以超過在該油中的預定溶解度的已知重量的純類維生素A加入到該油中。向該混合物中加入甲醇以溶解全部類維生素A晶體。使用氮氣噴射以保證全部甲醇從油中蒸發。使類維生素A過夜重結晶。經0.45微米濾器過濾該樣本。通過UV光譜在適當波長(視黃醇是325nm)下測定濾液在異丙醇中的已知稀釋液並且相對於類維生素A在異丙醇中的校準標準測定類維生素A的濃度。
適用的流體油包括但不限於脂肪酸或醇的酯和烴類，優選脂肪酸或醇的單酯，只要它們滿足本文所述的溶解度要求。首選的是，流體油選自棕櫚酸異硬脂基酯、水楊酸三癸酯、C12-15辛酸酯、硬脂酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯和棕櫚酸異丙酯，或者其任意混合物。二辛基醚，例如商品名為Cetiol OE，也被包括為首選的油。
矽油也可以含在所述的組合物中。這些優選選自含約3-約9，優選約4-約5個矽原子的環狀或直鏈聚二甲基聚矽氧烷。其它矽油還可以包括例如聚烷基矽氧烷、聚烷基芳基矽氧烷和聚醚矽氧烷共聚物(例如聚二甲基矽氧烷共聚醇)。在此使用的聚烷基矽氧烷包括，例如在25℃下粘度為約5-約100,000釐沲的聚二甲基矽氧烷，優選在25℃下粘度為約10-約400釐沲的聚二甲基矽氧烷。
所述的油可以單用或者與彼此成為混合物。
所述的油的用量使選定量的類維生素A溶解然而不影響本發明組合物的舒適觸覺特性。
聚合乳化劑本發明組合物使用聚合乳化劑，以提高該組合物中類維生素A的穩定性。聚合乳化劑使水進入到油相中的擴散最小化並由此使類維生素A暴露於水最小化，由此獲得類維生素A的改進了的穩定性。
適用的聚合潤溼劑一般屬於下面兩種(b1)兩性嵌段共聚物；(b2)含有用疏水基團改性的親水性主鏈的聚合物。
所述的嵌段共聚物可以是二嵌段(AB體系結構)或三嵌段(ABA或BAB體系結構)。為了舉例說明，A嵌段是親水性的，例如聚環氧乙烷、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、矽氧烷、瓜耳膠和生物聚合物(阿拉伯膠、蛋白質、明膠)。B嵌段是疏水性的，例如聚環氧丙烷、聚異丁烯和聚苯乙烯。
對於疏水改性的聚合物，主要組成或主鏈是疏水性的。沿這個主鏈和/或在末端，接枝有疏水基團(例如鏈烷烴(C12-C30))。這些聚合物由BASF、RohmHaas、BF Goodrich等在聚合乳化劑種類下製造。例如●BASF(Pluracares)●B.F.Goodrich(Pemulens，Carbopol 1382)●RohmHaas(Aculyn 22)●Whitco(Silwet)這些分子主要是親水性的並且可以溶解在極性溶劑(水、甘油)中。然而，該聚合物也含有疏水域，其使該聚合物可溶於非極性或有機相例如油。
所述的聚合乳化劑在本發明組合物中的濃度約0.01％-約10％，優選約0.1％-2％，為了使用量最小而最優選是約0.1％-約0.5％。首選的聚合乳化劑是Pemulen TR1、Pemulen TR2、Aculyn 22和Pluracares，因為這些在化妝品上可接受和有效。
優選地，本發明組合物基本上不含有常規乳化劑例如硬脂醯基乳酸鈉、PEG-100硬脂酸酯和鯨蠟硬脂醚(ceteareth)。一般地，常規乳化劑在本發明組合物中的含量小於2％，優選小於1％，首選小於0.5％。如果確實使用，優選使用非離子乳化劑例如吐溫。
組合物的穩定性本發明組合物使組合物中的類維生素A具有顯著改進的穩定性。具體地，組合物中類維生素A的半衰期在50℃下優選至少是約20天，更優選在50℃下至少約40天，首選在50℃下至少約70天。
類維生素A半衰期的測定″半衰期″定義為在指定溫度下使類維生素A降解至其初始濃度的一半時的時間。
將製劑置於50℃的烘箱內用於加速的穩定性研究。通過下述HPLC法在時間間隔分析類維生素A以評估穩定性。該研究證明，類維生素A的降解作用遵守一級動力學。所以，為了測定反應的半衰期，將剩餘類維生素A濃度的自然對數相對於保存時間繪圖得到斜率為k的直線。斜率k是在時間倒數單位中類維生素A氧化的速率。視黃醇的半衰期是通過比率1n2/k測定。
類維生素AHPLC分析的方法帶有Millennium32軟體和光電二極體陣列檢測器的WatersMillipore系統用於收集HPLC數據。色譜條件如下所述柱Phenonaenex I nertsil 5μ ODS 2 150×4.60mm流速1.0mL/min注射體積30μLUV檢測325nm用光電二極體陣列流動相90/10甲醇/水運轉時間15分鐘溫度4℃保留時間約8.7分鐘為了製備具有最終類維生素A濃度在標準曲線範圍內、小於10ppm的樣本溶液，首先將0.2g霜劑樣本與2.5g水混合且渦旋形成漿液。此後，向該漿液中加入甲醇得到50ml的最終總重量並且再次渦旋。樣本隨後用配有0.45μm濾器的一次性注射器過濾。所有樣本均一式三份製備用於HPLC分析。
保溼劑保溼劑優選含在本發明組合物中給皮膚提供溼潤益處。適用的保溼劑是多元醇並且包括但不限於甘油(即丙三醇)，除甘油以外可以加入其中的保溼劑包括山梨糖醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、乙氧基化葡萄糖和己三醇。保溼劑在本發明組合物中的濃度是至少10％。優選濃度至少2％，一般在約2％-約90％的範圍內。優選約5％-約60％，為了使溼潤益處最佳化首選約10％-約35％。首選的保溼劑是甘油和山梨糖醇-美容上優選、低成本且高效。
彈性體彈性體是一種優選的任選成分含在本發明組合物中。彈性體賦予絲質感。這些材料是高度交聯的矽氧烷聚合物和矽油的混合物。供應商來源包括GE Silicones(Waterford，NY)，Dow Corning(Midland，MI)，和Rhodia Silicones(Cranbury，NJ)。彈性體的含量優選是0％-30％，優選1％-15％，首選1％-10％。首選地，為了有助於分散彈性體並為了皮膚光滑性，彈性體以與附加揮發性矽油(環甲基矽酮類和聚二甲基矽氧烷類)的聯合形式存在。在這種情況中，揮發性矽油的含量是約0％-約25％，優選約1％-約10％。
適當彈性體的實例
類維生素A增效劑本發明的優選組合物含有類維生素A增效劑。
據信，視黃醇酯和視黃醇在皮膚中按照

圖1所示機理酶促轉化為視黃酸。
某些化合物抑制ARAT/LRAT、視黃醛還原酶、CRABPII和視黃酸氧化作用(後者是通過細胞色素P450體系催化的)，而某些其他化合物促進視黃醛脫氫酶。此類化合物總稱為″增效劑″並且在上表中編為B1-B5組。所述的增效劑，單用或彼此合用，通過增加可用於轉化為視黃酸的視黃醇的量和抑制視黃酸的降解來增強類維生素A的作用。增效劑與類維生素A(例如視黃醇、視黃基酯、視黃醛、視黃酸)聯合作用。
本發明組合物優選含有組合物重量約0.0001％-約50％、優選約0.001％-約10％、首選約0.001％-約5％的增效劑或增效劑組合。
本發明組合物中包括的增效劑或其組合選自下列組(a)增效劑，選自B1，B2；B3；B4，B5；
(b)增效劑的二元組合，選自B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5，B3/B4；B3/B5；B4/B5；(c)增效劑的三元組合，選自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5；(d)增效劑的四元組合，選自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)五組增效劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
本發明中含有的作為增效劑的化合物是基於在表A所列的某些濃度下這些化合物通過如部分2.1-2.7中所述的對於特定酶的體外微粒體試驗的能力而選擇的。本發明包括這樣的增效劑，即使沒有在此詳細提及。換言之，如果一種化合物在下述試驗中充分抑制或促進酶，它將與類維生素A聯合作用，模擬視黃酸對角蛋白細胞(皮膚細胞)的作用，並且由此屬於本發明的範圍內。
由於含有類維生素A並且優選含有類維生素A增效劑，本發明組合物有效預防和處理乾燥皮膚、痤瘡、光損傷的皮膚、皺紋的出現、老年斑、老化的皮膚，提高角質層的柔韌性、增量皮膚色澤、控制皮脂分泌並且通常提高皮膚的質量。該組合物可以用於改善皮膚脫屑和表皮分化。
增效劑在本發明產品中的存在顯著改善類維生素A的性能。
所述的增效劑是通過部分2.1-2.7所述的體外微粒體研究的化合物。適用於本發明的化合物在表A所列的濃度下抑制或促進酶至至少是表A中所列的寬泛百分比。
表A增效劑試驗濃度和抑制/增強百分率ARAT/LRAT試驗(鑑定B1增效劑)
視黃醇脫氫酶試驗(鑑定B2增效劑)
視黃醛還原酶試驗(鑑定B3增效劑)
CRABPII拮抗劑試驗(鑑定B4增效劑)
視黃酸氧化作用試驗(鑑定B5增效劑)
用於測定本發明含有所述化合物的適合性的體外微粒體試驗如下所述
1.材料全反式視黃醇、全反式視黃酸、棕櫚醯CoA、二月桂醯基磷脂醯膽鹼、NAD和NADPH購自Sigma Chemical公司。用於微粒體試驗的類維生素A的儲備液是在HPLC級乙腈中製備。用於HPLC分析的所有類維生素A標準儲備液是在乙醇中製成，在-70℃的N2氣氛下儲存並當不儲存時保持在琥珀色光下的冰上。其它化學品和抑制劑商購自化妝品材料供應商或化學公司例如Aldrich或International Flavors andFragrances。
2.方法2.1 RPE微粒體的分離(改進自J.C.Saari D.L.Bredberg，″視網膜色素上皮中CoA和非CoA依賴的視黃醇酯化作用″，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
50g冷凍的除去視網膜和房水的對切牛眼杯得自W.L.LawsonCo.，Lincoln，NE，U.S.A。將眼睛冷凍過夜並用鑷子揭去有色的虹膜。各眼杯用2×0.5mL冷的緩衝液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗滌，用人造刷子或橡膠澱帚擦洗掉深色細胞。將該細胞懸浮液加入到虹膜並在燒杯中用聚四氟乙烯攪拌棒攪拌數分鐘。該混懸液經粗濾器(Spectra/Por 925μl孔徑聚乙烯篩)過濾除去大顆粒，並且所得深色混懸液用帶有馬達驅動的聚四氟乙烯均化器的Glas-Col均化。將細胞勻漿離心在20,000g(Sorvaal RC-5B型離心機，帶有SS34轉鼓，在2.5×10cm管中，14,000RPM)下離心30分鐘。所得上清液在150,000g(Beckman L80型超速離心機，帶有SW50.1轉鼓，在13×51mm管中，40,000RPM)下進一步離心60分鐘。所得小顆粒用Heat Systems Ultrasonics Inc.的W185D型Sonifier細胞破裂器分散在5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH7緩衝液中，並且所得微粒體分散體等分在小管中並且儲存在-70℃下。微粒體的蛋白濃度是通過BioRad染料結合試驗、利用BSA作為標準來測定。
2.2大鼠肝臟微粒體的分離(R.Martini M.Murray，″在大鼠肝臟微粒體視黃酸4-羥基化作用中的P450 3A酶的參與″，ArchivesBiochem.Biophys.303，57-66(1993))。
將約6g的冷凍大鼠肝臟(由Accurate Chemical and ScientificCorp.提供的Harlan Sprague Dawley大鼠得到)在3體積的0.1M三羥甲基氨基甲烷/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH7.4緩衝液中用Brinkmann Polytron均化。所得的組織混懸液進一步在上述馬達驅動的聚四氟乙烯均化器中均化。所得勻漿依次在10,000g下離心30分鐘，在20,000g下離心30分鐘和在30,000g下離心15分鐘，並且所得上清液在105,000g下超速離心80分鐘。小顆粒在約5mL的上述0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4緩衝液中超聲並在-70℃下保存為等份試樣。蛋白濃度按照上述方法測定。
2.3 ARAT和LRAT活性的試驗(鑑定B1)下列方法是J.C.Saari D.L.Bredberg，″牛視網膜色素上皮微粒體的ARAT LRAT活性″，Methods Enzymol.190，156-163(1990)中所述方法的一個改進。製備下面的緩衝液並儲藏在4℃下0.1M PO4/5mM二硫代蘇糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在試驗當天，每毫升緩衝液加入2mg BSA，得到PO4/DTT/BSA工作緩衝液。1mM視黃醇底物在乙腈中製備並保藏在安瓿瓶中氮氣和-20℃下。製備在工作緩衝液內的4mM棕櫚醯-CoA溶液(等份保藏)和在乙醇中的4mM二月桂醯磷脂醯膽鹼溶液並且儲藏在-20℃下。抑制劑製備成在H2O、乙醇、乙腈或DMSO中的10mM儲備溶液。用含50μg/ml丁基化羥基甲苯(BHT)的純乙醇製備終止液，並且將含有50μg/mL BHT的己烷溶液用於萃取。
向2英錢小玻璃瓶中按照下面順序加入PO4/DTT/BSA緩衝液達到500μL的總體積，5μL醯基供體(4mM棕櫚醯-CoA和/或二月桂醯磷脂醯膽鹼)，5μL抑制劑或溶劑空白(10mM儲備或進一步的稀釋液)，隨後加入約15μg的RPE微粒體蛋白(約15μL的約1mg/mL微粒體蛋白等份)。溫育5分鐘。在37℃下使反應溫度平衡且隨後加入5μl的1mM視黃醇。蓋上瓶子，渦旋5秒且在37℃下溫育30-90分鐘。加入0.5mL乙醇/BHT終止該反應。加入3mL己烷/BHT萃取類維生素A，渦旋該管數秒數次且在低速下離心5分鐘以加快分離各層。除去己烷上層加入到潔淨的瓶中，並且用另一份3mL己烷/BHT按照上述方法再次萃取水層。合併己烷層且通過在37℃氮氣流下在熱鋁塊上乾燥蒸發己烷。乾燥的殘餘物儲藏在-20℃下直至HPLC分析。通過如下積分HPLC信號，分別定量分析棕櫚酸視黃基酯和月桂酸視黃基酯的量，得出ARAT和LRAT活性。
注意溫育溶液含有40μM醯基供體，100/μM或更少的抑制劑，10μM視黃醇，約30μg/mL微粒體蛋白，和約0.1M PO4，pH7/5mM DTT/2mg/mL BSA。加入視黃醇後的所有步驟在黑暗或琥珀光下進行。
2.4視黃醇脫氫酶活性的試驗(鑑定B2)製備下列儲備液50mM KH2PO4，pH7.4緩衝液，無菌過濾。
10mM在DMSO中的全反式視黃醇(Sigma R7632)。
200mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(NADP)(Sigma N0505)在無菌水中。
40mM試驗化合物在適當溶液(水，緩衝液，乙醇，氨仿或DMSO)中。
大鼠肝臟微粒體在50mM KH2PO4，pH7.4緩衝液(4μg/μl)中的1∶10稀釋液。
在帶有螺旋蓋的2英錢小玻璃瓶中按照次序加入緩衝液，達到400μl的終體積，25μl稀釋微粒體(最終＝100μg)-用煮沸的微粒體作為對照並且用正常微粒體用於試驗樣本。
4μl的200mM NADP(最終＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(最終＝100μM)8μl的10mM視黃醇(最終＝200μM)小瓶在37℃的振搖水浴中溫育45分鐘。向各瓶中加入500μl冰冷乙醇終止該反應。用冰冷己烷(2.7ml/次萃取)萃取類維生素A2次。在第一次萃取過程中向各瓶中加入乙酸視黃基酯(5μl的900μM儲備液)作為檢測各樣本中萃取效率的手段。將樣本渦旋10秒，之後在1000rpm、5℃下在Beckman GS-6R離心機中輕微離心5分鐘。每次萃取之後將含類維生素A的己烷上層與水層分離置於潔淨的2英錢小瓶中。在氮氣的細流下蒸發己烷。乾燥的殘餘物保藏在-20℃下直至HPLC分析。
2.5視黃醛還原酶活性的試驗(鑑定B3)用下列替代品按照上述方法製備所有儲備液10mM全反式視黃醛(Sigma R2500)在DMSO中-代替視黃醇。
200mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原形式，四鈉鹽(NADPH)(SigmaN7505)在無菌水中-代替NADP。
在帶有螺旋蓋的2英錢小玻璃瓶中，按照順序加入下列緩衝液，達到400μl的終體積。
25μl稀釋微粒體(最終＝100μg)-用煮沸的微粒體作為對照並且用正常微粒體用於試驗樣本。
4μl的200mM NADPH(最終＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(最終＝100μM)3μl的10mM視黃醛(最終＝75μM)遵照如上述相同的溫育和萃取方法。
2.6 CRABPII拮抗劑(鑑定B4)2.6.1.CRABPII的合成a.表達體系將基因CRABPII克隆於pET 29a-c(+)質粒(Novagen)。克隆的基因是在強噬菌體T7轉錄和翻譯信號的控制下。T7聚合酶的來源是由宿主細胞大腸桿菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。後者在lacUV5的控制下，在IPTG存在的誘導下，具有T7聚合酶的染色體副本。
所述的質粒按照製造商方案(Novagen)通過轉化作用轉移到大腸桿菌BLR(DE3)pLysS細胞中。
b.引入將轉化細胞的過夜培養物以1∶100稀釋到含50μg/mL卡那黴素和25μg/mL氯黴素的2×YT中。在37℃下振搖時細胞生長，直至在600nm下的OD達到0.6-0.8。隨後加IPTG至1mM的終濃度並且該培養物繼續培養2小時。通過在5000g下室溫離心10分鐘收穫細胞。小顆粒儲藏在-20℃下。
2.6.2.純化按照Norris和Li，1997所述方法進行純化。
a.細胞溶解使冷凍的小顆粒在室溫下融化並再懸浮在1-2個小顆粒體積的新制細胞溶解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8，10％(w/v)葡萄糖，1mMEDTA，0.05％(w/v)疊氮化鈉，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯基甲基磺醯氟，2.5mM苄脒，6yg/mL DNase)中。溶胞產物在室溫下溫育30分鐘。通過超聲(10,000psi下六個30秒脈衝交替以在冰上的5個30秒延遲)進行進一步溶胞。通過在15000rpm和4℃下離心1小時除去溶胞產物的不溶性部分並將上清液保藏在-20℃下。
b.在Sephacryl S300上的凝膠過濾室溫下將步驟a.的上清液加載到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱上。洗脫緩衝液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％疊氮化鈉(緩衝液A)。流速是2mL/分鐘。收集的2-mL餾份在280nm下檢測其紫外吸光度。呈現峰的餾份通過SDS-page測試出CRABPII的存在。
c.陰離子交換色譜2mL的含CRABPII的凝膠過濾餾份加載在季胺陰離子交換柱FPLC(快速蛋白液體色譜)型monoQ(Pharmacia)上。CRABPII用由100％緩衝液A-30％緩衝液B的梯度緩衝液(100％緩衝液B＝緩衝液A+250mM NaCl)在室溫下20分鐘內洗脫。每分鐘收集1mL餾分。再次通過SDS page檢測CRABPII的存在。將CRABPII儲藏在4℃下，之後用帶有小瓶平臺附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High VacuumInternational)冷凍乾燥。將乾燥的樣本保存在室溫下直至其用於結合試驗。
d.CRABPII存在的檢測CRABPII的表達和純化利用變性SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析在7-15％聚丙烯醯胺凝膠(Biorad)上驗證。將10μL樣本與10μL的2×加載緩衝液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合併且通過加熱(80℃下2分鐘)變性。樣本加載在凝膠上，該凝膠浸漬在1×Tris-甘氨酸緩衝液(Biorad)中，並且室溫下施加恆定電流(25mA)1小時。用考馬斯藍染色之後，根據用基準點(Benchmark)預染色蛋白梯(Gibco BRL)測定的分子量鑑定蛋白。
用蛋白質印跡法確定CRABPII的存在。在SDS-PAGE上分離的蛋白質用Biorad盒轉移到Immobilon-P轉移膜(Millipore)上。轉移發生在1×Tris-甘氨酸緩衝液(Biorad)+10％甲醇中。施加3小時電流(60mA)使蛋白遷移通過該膜。此後，該膜用在1×TBS中的5％幹乳室溫下封阻1小時，並在同樣的緩衝液中4℃下過夜探測CRABPII(小鼠反克隆5-CRA-B3的1/1000稀釋液)的初級抗體。次日，該膜用PBS(3×5分鐘)洗滌且隨後用次級抗體，過氧化物酶偶聯的抗小鼠抗體(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀釋液在室溫下溫育1小時。該膜用1×PBS(3×5分鐘)洗滌並且用ECL檢測試劑盒按照製造商說明(Amersham)來測定蛋白質。
純化CRABPII的濃度用BSA試劑盒(Pierce)測定。
2.6.3.放射性結合試驗220pmol的CRABPII在20mM Tris-HCl緩衝液pH 7.4中與15pmol的放射性全反式視黃酸(NEN)以70μl的總體積溫育。對於競爭性試驗，向混合物中過量加入另一種配體(6670∶1,670∶1或70∶1)。該反應在室溫下避光進行1小時。為了從結合的全反式視黃酸中分離出未結合的全反式視黃酸，使用6kD截止的微量色譜柱(Biorad)。用Microplex歧管按照製造商的說明(Pharmacia)棄去貯存緩衝液。將樣本加載在柱上並且在重力下在30分鐘內進行分離。濾液中出現與CRABPII結合的視黃酸(″RA″)，而柱中保留了游離的RA。通過閃爍計數器測定濾液的放射性。
2.7 NADPH依賴性視黃酸氧化作用的試驗(鑑定B5)下列方法是R.Martini M.Murray，″大鼠肝臟微粒體視黃酸4-羥基化作用中P450 3A酶的參與″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)所述方法的一個改進。製備下列試驗緩衝液並儲存在4℃下0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在試驗的當天，在緩衝液中製備60mM NADPH溶液。按照上述方法製備抑制劑儲備液、酸化的乙醇/BHT終止液，和己烷/BHT。1mM視黃酸工作溶液是通過用乙醇稀釋15mM儲備液(在DMSO中)來製成的。
向2英錢小瓶中依次加入下列試驗緩衝液得到500μL的終體積，20μL 60mM NADPH，5μL抑制劑或溶劑空白，隨後加入約2mg的大鼠肝臟微粒體蛋白。在37℃下溫育5分鐘，隨後加入5μL的1mM視黃酸工作溶液。
在37℃下繼續溫育60分鐘-瓶子不加蓋，因為該氧化過程除NADPH以外還需要分子O2。按照上述方法用酸化的乙醇/BHT終止並用己烷/BHT萃取。按照下述方法通過積分HPLC信號定量分析快速洗脫的極性視黃酸代謝產物(推測是4-氧代視黃酸)。
注意加入視黃酸之後的所有步驟是在避光或在琥珀色光線下進行。最終的培育溶液含有2.4mM NADPH，100μM或更少的抑制劑，10μM視黃酸，約4mg/mL大鼠肝臟微粒體蛋白和約0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2。
單個類維生素A的HPLC分析通過HPLC定量的類維生素A的樣本是通過將各瓶中的殘餘物用100μL的甲醇溶解來製成。將該溶液轉移到150μL玻璃錐形管內，該玻璃錐形管置於1mL套瓶中，蓋緊並且置於Waters 715自動取樣器中。立刻注射60μL的等份試樣並分析類維生素A的含量。
該色譜儀由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光電二極體陣列檢測儀和Waters 474掃描螢光檢測器組成。類維生素A分析採用兩種HPLC方案。對於ARAT和LRAT試驗，視黃醇和視黃醇酯的分離是採用Waters 3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters SentryNovapak C18保護柱使用調至流速為1mL/分鐘的80∶20(v/v)甲醇/THF等度流動相洗脫10分鐘而進行的。在325nm下測定洗脫液的吸光度並在325ex/480em下測定螢光。較短的Waters 3.9×150mm C18Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保護柱用於分離用於視黃醇和視黃酸氧化試驗的視黃酸和醇，試驗採用A.B.Barua，″水溶性化合物Gluconomides的分析″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)所述梯度體系的一個改進方法。該體系由68∶32(v/v)甲醇/含10mM乙酸銨的水至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分鐘線性梯度組成，並有5分鐘以1mL/分鐘的流速的保持。在300nm-400nm監測柱洗脫液。
這些方案的選擇是基於各試驗清晰拆分有關的視黃酸、醇、醛、和/或酯的能力和分離的相對速度。單個類維生素A的HPLC鑑定是基於未知峰的保留時間與已知確定類維生素A標準物的峰的保留時間的精確匹配以及未知峰相對於已知確定類維生素A的UV光譜分析(300-400nm)。
適用於本發明的增效劑包括但不限於下表B1-B5所列的增效劑。
ARAT/LRAT抑制劑(B1)種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)類胡蘿蔔素藏花酸 3.75E-05 15％ 34％ 015％脂肪酸醯胺 乙醯基鞘氨醇6.78E-06 19％+/-1262％+/-1110％+/-1050％+/-18其它表面活性劑脂肪酸醯胺 C13β-羥基酸/醯胺 17％28％ 25％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 蓖麻油MEA 3.25E-05其它表面活性劑脂肪酸醯胺 椰油醯胺丙基甜菜鹼 25％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 椰油羥乙基咪唑啉2.84E-0768％ 68％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 椰油醯胺-MEA(或椰油基 11％13％ 34％其它表面活性劑一乙醇醯胺)脂肪酸醯胺 甘油-PCA-油酸酯 41％+/-6 58％+/-2其它表面活性劑種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸醯胺 己醯胺 20％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 己醯基鞘氨醇9.99E-0528％+/-4 37％+/-9其它表面活性劑脂肪酸醯胺 羥乙基-2-羥基-C12醯胺 3.29E-0535％ 35％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 羥乙基-2-羥基-C16醯胺 25％ 30％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 月桂醯基肌氨酸 20％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 利多卡因12％ 0其它表面活性劑脂肪酸醯胺 亞油醯胺-DEA(或亞油醯 59％ 12％+/-1343％+/-3 11％+/-9 51％+/-15其它表面活性劑二乙醇醯胺)
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸醯胺 亞油醯胺-MEA(或亞 1.61E-05 14％ 35％ 20％+/-8 35％其它表面活性劑油醯一乙醇醯胺)脂肪酸醯胺 亞油醯胺丙基二甲基 69％+/-18 75％+/-4其它表面活性劑胺脂肪酸醯胺 亞油甲氨64％+/-1543％+/221其它表面活性劑脂肪酸醯胺 肉豆蔻醯肌氨酸 41％+/-1411％+/-11其它表面活性劑脂肪酸醯胺 油醯甜菜鹼 2.80E-0547％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 棕櫚醯胺-MEA 6％ 23％ 12％ 33％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 硬脂基羥基醯胺 10％ 10％其它表面活性劑脂肪酸醯胺 Utrecht-1 21％ 43％ 54％ 51％ 48％+/-6其它表面活性劑種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸醯胺 Utrecht-2 3.47E-06 42％ 83％+/-9 51％ 92％+/-3其它表面活性劑黃烷類柑桔黃素33％ 14％香料 烯丙基α-紫羅蘭酮 16％+/-1422％+/-2317％+/-1036％/-7香料 α-二氫大馬酮 3.35E-04 67％+/-2783％+/-1287％+/-6 98％+/-1香料 α＝紫羅蘭酮9.27E-0445％+/-27 49％+/-30香料 α-甲基紫羅蘭酮 67％ 77％香料 α-松油醇 26％ 25％香料 β-二氫大馬酮 45％ 84％ 52％ 92％香料 Brahmanol 70％ 75％香料 大馬酮 23％ 70％ 29％ 79％香料 δ-二氫大馬酮 58％ 87％ 64％ 95％
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)香料 二氫α-紫羅蘭 13％ 18％香料 乙基Saffranate 51％ 49％香料 葑醇12％ 4％香料 γ-甲基紫羅蘭酮 21％ 38％香料 異丁基紫羅蘭酮 8％ 45％香料 異環香葉醇 18％ 16％香料 異二氫大馬酮80％ 92％香料 Lyral 1.27E-0476％ 71％香料 檀香23％ 12％香料 檀香醇 15％ 43％香料 Timberol34％ 33％香料 吐納麝香(Tonalid) 50％ 33％香料 特拉賽麝香 41％ 21％(Traseolid)其他 椰油三甲基銨-C1 27％其他 烏索酸(Urosolic 1.46E-0621％ 28％acid)非環狀香料檸檬醛 20％非環狀香料香茅醇 30％ 0非環狀香料法呢醇 9.35E-05 23％+/-1853％+/-1810％+/-7 53％+/-19非環狀香料香葉醇 7.83E-03 13％ 32％非環狀香料香葉草基香葉醇 38％+/-1281％+/-6 16％+/-9 77％+/-13非環狀香料裡那醇(Linatool)28％ 0
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)非環狀香料壬二烯醛20％(Nonadieneal)非環狀香料假紫羅蘭酮 12％ 37％磷脂 二辛基磷脂醯乙醇胺 23％ 50％+/-2 017％+/-17脲二甲基咪唑烷酮 22％脲咪唑烷基脲 35％
視黃醇脫氫酶激活劑(B2)種類 化合物 ％增高視黃醇脫氫酶磷脂 磷脂醯膽鹼 增高21％磷脂 鞘磷脂 增高26％視黃醛還原酶抑制劑(B3)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制視黃醛還原酶醛香草醛 9.70E-03 6％脂肪酸花生酸 20％脂肪酸花生酸 49％脂肪酸亞油酸 1.63E-04 62％+/-2脂肪酸亞麻酸 1.34E-04 54％+/-16脂肪酸肉豆蔻酸1.72E-05 26％其他 安吖啶 6.26E-06 22％+/-8其他 卡貝索酮3.61E-07 26％+/-2其他 甘草次酸8.64E-06 38％+/-1磷脂 磷脂醯乙醇胺 37％CRABPII拮抗劑(B4)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制CRABPII脂肪酸反油酸 6.50E-05 ＞50％脂肪酸十六碳二酸 1.30E-04 ＞50％脂肪酸12-羥基硬脂酸 2.91E-05 ＞50％脂肪酸異硬脂酸6.88E-05 ＞50％脂肪酸亞麻籽油 ＞50％
視黃酸氧化抑制劑(B5)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制 ％抑制視黃酸 視黃酸(10μM)(100μM)咪唑 聯苯苄唑 89％ 100％咪唑 氯咪巴唑4.47E-06 80％ 92％咪唑 克黴唑76％ 85％咪唑 益康唑88％ 100％咪唑 酮康唑 1.85E-07 84％ 84％咪唑 咪康唑 2.78E-07 74％ 86％脂肪酸醯胺月桂基羥乙基咪唑啉 4.67E-07其它表面活性劑脂肪酸醯胺油基羥乙基咪唑啉3.02E-05 54％ 80％其它表面活性劑黃烷類 槲皮酮 6.29E-05 40％ 74％香豆素 香豆素喹啉 (7H-苯並咪唑[2，1-a]8.59E-07苯並[de]-異喹啉-7-酮喹啉 羥基喹啉(2-羥喹啉) 3.64E-04喹啉 美替拉酮(2-甲基-1，2-47％二-3-吡啶基-1-丙烷在下述轉穀氨醯胺酶試驗中優選的增效劑或其組合在10mM的濃度時至少抑制50％的轉穀氨醯胺酶(此後稱為″Tgase″)。
TGase試驗
轉穀氨醯胺酶試驗轉穀氨醯胺酶試驗和角化細胞分化在表皮的末期分化過程中，在細胞四周的內表面上形成一個15nm厚的蛋白層，稱作角化膜(CE)。該CE由許多不同的蛋白組成，這些蛋白在至少兩種表皮中表達的不同轉穀氨醯胺酶(TGases)的作用下、通過形成Nε-(γ-穀氨醯基)賴氨酸異二肽鍵交聯在一起。Tgase I大量表達在表皮的分化層中，尤其是顆粒層中，但在未分化的基底表皮中不存在。因此TGase I是表皮角質細胞分化的有效標記並且TGase I水平高表示分化狀態較高。基於ELISA的TGase I試驗，使用TGase I抗體，用於評估在下列實施例中的培養角質細胞的分化狀況。
將角質細胞(按照上述方法培養)以4,000-5,000細胞/孔的密度鋪板在96孔平板中200μl培養基內。培養2-3天後，或者直至細胞的約50％融合後，將該培養基更換為含有試驗化合物的培養基(每個試驗五份)。令細胞繼續培養96小時，此後抽出培養基並將平板保存在-70℃下。從冷凍器取出平板，並且細胞用200μl的1×PBS洗滌兩次。細胞在室溫下(R/T)與TBS/5％BSA(洗滌緩衝液，牛血清白蛋白)溫育。此後加入TGase初級抗體50μl用洗滌緩衝液1∶2000稀釋的單克隆抗Tgase I Ab B.C.。該初級抗體在37℃下溫育2小時且隨後用洗滌緩衝液漂洗6次。此後細胞與50μl用洗滌緩衝液1∶4,000稀釋的二級抗體(Fab片段，得自Amersham的過氧化物酶偶聯的抗小鼠IgG)在37℃下溫育2小時，隨後用洗滌緩衝液漂洗3次。用洗滌緩衝液漂洗之後，該細胞用PBS漂洗3次。為了顯色，在R/T和避光(在鋁箔下)下，細胞與100μl底物溶液(4mg鄰苯二胺和3.3μl 30％H2O2在10ml 0.1M檸檬酸緩衝液pH 5.0中)溫育整5分鐘。通過加入50μl的4N H2SO4終止該反應。在96孔平板UV分光光度計中在492nm下讀取樣本的吸光度。在5份重複試樣中，4份用兩種抗體處理，第5份用作Tgase背景對照。測定TGase水平且表示為對照百分比。
測定出轉穀氨醯胺酶且在表B1-B5中以下列之一表示(i)％(增效劑+視黃醇抑制/對照抑制)-％(ROH抑制/對照抑制)，其測定出增效劑+視黃醇引起的TGase抑制作用比視黃醇單用的加和效果，或(ii)IC50值，當多個增效劑濃度的抑制作用被測試時-它提供增效劑濃度，該濃度與10-7M的恆定視黃醇濃度一起，抑制50％的TGase。
增效劑的最佳組B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
其它任選的成分結晶脂肪酸結晶脂肪酸是任選的成分。優選地，該脂肪酸含有12-22個碳原子，因為此類酸便宜且是美學上最可接受的。首選的脂肪酸是硬脂酸。此處所用的術語″酸″不排除脂肪酸的鹽的存在，這取決於最終組合物的pH。例如，可以存在鈉、鉀或銨鹽。鹽量包括在脂肪酸的量內。本發明組合物優選含有至少0％的脂肪酸，首選0.1％-18％。
本發明組合物首選進一步含有選自抗氧化劑、還原劑、螯合劑及其混合物的成分來提高類維生素A的穩定性。這些組分提供附加水平的對類維生素A氧化作用的防護效果。本發明製劑的抗氧化劑、還原劑和螯合劑的常用實例可以參見CTFA International CosmeticIngredient Dictionary第4版，The Cosmetic，Toiletry，andFragrance Association，Inc.，Washington，D.C.，1991。
優選的還原劑是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代亞硫酸鈉或其它硫醇，例如硫代甘油、硫脲、巰基乙酸、半胱氨酸等。優選的抗氧化劑是rac-6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸(trolox)、沒食子酸丙酯、三羥基苯甲酸正丙酯、叔丁基對苯二酚和丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、生育酚乙酸酯、棕櫚酸抗壞血酸酯、氫醌、二丁基氫醌等。
螯合劑的適當實例包括，但不限於，EDTA，檸檬酸，酒石酸，有機氨基膦酸類和有機膦酸組分，包括某些Monsanto製造的市售DequestTM類化合物。優選1-羥基乙烯，(1.1-二膦酸)。
有機氨基膦酸是含有至少一個膦酸基團和至少一個氨基的有機化合物。在此所用的適當有機氨基膦酸組分包括氨基亞烷基多(亞烷基膦酸)和次氮基三亞甲基膦酸。此類有機氨基膦酸組分的實例包括某些Monsanto製造的市售DequestTM類化合物。
優選氨基三(亞甲基膦酸)(Dequest 2006)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)和1，6-己二胺四(亞甲基膦酸)。
在此所用的其它適當附加重金屬離子多價螯合劑包括次氮基三乙酸和多氨基羧酸類，例如亞乙基二氨基四乙酸或亞乙基三胺五乙酸。
在此使用的其它適當附加重金屬離子多價螯合劑是亞氨基二乙酸衍生物，例如2-羥乙基二乙酸或甘油基亞氨基二乙酸。
抗氧化劑在本發明組合物中的含量是0.01-10％，優選0.1-5％，首選0.2-4％。還原劑在本發明組合物中的含量是0.01-10％，優選0.1-5％，首選0.2-4％。螯合劑在本發明組合物中的含量是0.01-1％，優選0.05-0.5％，首選0.05-0.3％。
尤其優選的組合物含有0.1％亞硫酸氫鹽、0.7％Dequest 2006和0.2％BHT。
不同類型的活性成分可以存在於本發明的化妝品組合物中。活性劑定義為除潤膚劑和僅僅改善組合物的物理特性的組分之外的皮膚或毛髮有益劑。雖然不限於這種類型，但一般實例包括防曬劑、皮膚增亮劑、曬褐劑。
防曬劑包括阻斷紫外線常用的物質。舉例化合物是PABA、肉桂酸和水楊酸的衍生物。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮(也稱作羥苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮分別在商標Parsol MCX和Benzophenone-3下出售。
防曬劑在乳液中的精確用量可以根據對太陽UV輻射的所需保護程度而變。
另一優選的任選成分選自必需脂肪酸(EFA)，即那些所有細胞的質膜形成所必需的脂肪酸，在角質細胞中EFA缺少使細胞過度增殖。EFA的補充糾正這種現象。EFA也促進表皮的脂質生物合成並為表皮的屏障形成提供脂質。必需脂肪酸優選選自亞油酸、γ-亞麻酸、高-γ-亞麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、己酸及其混合物。
其它任選成分可以包括著色劑、遮光劑和顏料(例如二氧化鈦、二氧化矽)和香精。這些物質的含量可以在組合物的0.001％-20％重量的範圍內任意變化。
化妝上可接受的賦形劑本發明的組合物還可以含有化妝上可接受的賦形劑充當組合物中活性成分的稀釋劑、分散劑或載體，使它們在組合物塗敷在皮膚或毛髮上時易於分布。
除水之外的賦形劑可以包括液體或固體軟化劑、溶劑、保溼劑、增稠劑和粉末。特別優選的非水載體是聚二甲基矽氧烷和/或聚二甲基苯基矽氧烷。本發明的聚矽氧烷可以是粘度在25℃下為約10-0,000,000釐沲的那些。尤其理想的是低粘度和高粘度聚矽氧烷的混合物。這些聚矽氧烷購自General Electric公司，商標為Vicasil、SE和SF以及Dow Corning公司的200和550系列。本發明組合物可以使用的聚矽氧烷的量是在組合物重量的5-95％、優選25-90％的範圍內。
組合物的應用本發明的組合物主要用來作為一種局部塗敷在人體皮膚或毛髮上的產物，尤其是作為調理和平滑皮膚的試劑，並且預防或減少皺紋皮膚或老化皮膚或乾燥毛髮的出現。
在使用中，從適當容器或塗敷器取少量的組合物，例如1-5ml，塗敷在皮膚或毛髮的暴露區域，並且如果必要，隨後用手或手指或適當裝置鋪展和/或擦抹到皮膚或毛髮內。
產品形式和包裝所述的組合物可以包裝在與其粘度和用戶使用目的匹配的適當容器內。例如，組合物可以簡單貯藏在非變形瓶或擠壓容器中，如管或有蓋子的廣口瓶中。
本發明也提供一種含有上述定義的化妝可接受組合物的密封容器。
下列具體實施例進一步舉例說明本發明，但本發明不局限與此。
實施例1.所有製備在室溫(20-25℃)下用高架攪拌器(1000-2000rpm)進行。
2.在1000-1500rpm下混合含水組分(水，甘油，Pemulen，和防腐劑)在一起，直至Pemulen完全溶劑化。
3.在獨立容器中，在1000rpm下混合各種油(矽油和/或其它任選的油)和彈性體。
4.將BHT和視黃醇加入到步驟3的油混合物中；在1000rpm下混合5-10分鐘。
5.將步驟2中的水相加入到步驟4的油相中，在1000-1500rpm下混合5-10分鐘。
6.最後加入TEA，在1500-2000rpm下混合直至充分混合，5-10分鐘。
注意抗氧化劑例如Dequest 2066，亞硫酸氫鈉，和Na2CO3加入到步驟2的水相中。將Transcutol加入到步驟3的油相中。
B.視黃醇穩定性將原型儲存在50℃的安瓿玻璃罐中。從同一罐中在時間為0、1、2、3、4、6、8和12周時取出等分試樣用於視黃醇穩定性測定。視黃醇穩定性用HPLC測定；各樣本一式三份進行分析。
樣本原型的視黃醇穩定性數據如下面3個表所示。表1詳列矽油中含有視黃醇的製劑。表2詳列Cetiol油中含視黃醇的製劑。表3詳列在其它油中含有視黃醇的製劑。
表1
表2
表3
雖然本發明在此描述了一些具體方式，並且參考其某些優選實施方式，所屬領域普通技術人員應當理解，可以對上述方式進行許多變化、改進和替代，並且這些屬於本發明請求保護的範圍內。所有這些改進和變化屬於本發明的描述和請求保護的範圍內，並且本發明僅僅由下面權利要求書的範圍來限定，並且該權利要求書應當在合理程度上儘可能廣義地理解。
權利要求
1.一種水包油乳狀液化妝品組合物，含有(a)溶解在流體油中的類維生素A，(b)聚合乳化劑。
2.權利要求1的組合物，其中該組合物還含有約1％-約90％的多元醇保溼劑；
3.權利要求1的組合物，其中該組合物還含有約0％-約30％的彈性體。
4.權利要求1的組合物，其中該組合物還含有揮發性矽油。
5.權利要求1的組合物，其中該組合物還含有結晶脂肪酸。
6.權利要求1的組合物，其中類維生素A的含量至少是該組合物重量的約0.001％。
7.權利要求1的組合物，其中所述的類維生素A選自視黃酸、視黃醇、視黃基酯、和視黃醛。
8.權利要求1的組合物，其中所述的類維生素A在25℃時以每約100g的油至少約0.1g的類維生素A的量溶解在所述流體油中。
9.權利要求1的組合物，其中組合物中類維生素A的半衰期在50℃時至少為約20天。
10.權利要求1的組合物，還含有類維生素A增效劑。
全文摘要
本發明涉及一種含有類維生素A且具有改進的穩定性和柔和性的化妝品組合物。尤其優選的組合物還含有類維生素A增效劑和多元醇保溼劑。
文檔編號A61K8/06GK1538833SQ01819307
公開日2004年10月20日 申請日期2001年11月19日 優先權日2000年11月22日
發明者P·錢達, P 錢達, Q·T·－T·法姆, -T 法姆, 林得愉, 帳, 周豔, R·維爾馬, A·利普斯 申請人:荷蘭聯合利華有限公司