乙醯肝素酶缺陷的非人類哺乳動物的製作方法

2023-06-06 13:23:36

專利名稱：乙醯肝素酶缺陷的非人類哺乳動物的製作方法
技術領域：
本發明與至少擁有一個受幹擾的乙醯肝素酶等位基因片段的細胞和非人類哺乳 動物有關。本發明還與使用乙醯肝素酶(Hpse)缺陷的非人類哺乳動物進行醫療藥品篩選有關。
背景技術：
乙醯肝素酶是一種哺乳動物體內產生的β -糖苷降解酶，專門用於降解肝素和硫 酸乙醯肝素(HS)蛋白多糖，因此與細胞表面和細胞外基質功能有密切聯繫。乙醯肝素酶活 動與腫瘤細胞的轉移有關，因為乙醯肝素酶降解細胞間質(ECM)的HS，從而導致ECM的結構 改變，因而促進腫瘤細胞的轉移。與之類似，乙醯肝素酶活動與血管形成、炎症和自身免疫 有關，參與血管內皮細胞的活動和免疫細胞的激活及運動。現有結果確定，乙醯肝素酶表達 量與腫瘤血管生成和癌症病人的存活率有關。儘管之前有關於多種哺乳動物肝素/HS降解內切酶(endoglycosidase)的報導， 目前研究的結果顯示哺乳動物細胞只表達一個具有活性的乙醯肝素酶(Hulett等，Nat med.，1999，5 :803-809 ；Vlodavsky 等，Nat Med.，1999，5 :793-802)。由於乙醯肝素酶在哺乳動物體內從生理學功能(包括胚胎形成和發育)到多種疾 病(如炎性反應，血管再生和腫瘤轉移)等基礎生物現象中扮演了重要的角色，因此需要一 個動物模型對乙醯肝素酶進行活體研究。美國專利公報US2002/0194625表明轉基因鼠表 達人類乙醯肝素酶用於研究腫瘤發生和病理過程。國際專利公報W02004/006949表明使用 乙醯肝素酶表達轉基因鼠作為模型來測試乙醯肝素酶在毛髮生長中多個方面的角色。由於乙醯肝素酶的重要性和多功能性，缺乏乙醯肝素酶的動物可以作為有價值 的工具來展現乙醯肝素酶所扮演的角色。儘管在這方面的需求得到廣泛認同，並有多次 嘗試建立乙醯肝素酶缺陷的動物，但是到目前為止這種動物還不存在。國際專利公報 W02005/118808表明利用小幹擾RNA(siRNA)技術可以抑制細胞中的乙醯肝素酶活性。然而 很不幸，siRNA技術不適用於創造穩定的無乙醯肝素酶動物或者完全抑制乙醯肝素酶活性 的模型。所以對乙醯肝素酶缺陷的動物仍然有需求。

發明內容
本發明提供一個至少擁有一個受幹擾的乙醯肝素酶等位基因片段的轉基因非人 哺乳動物。在一個實例中，受幹擾的乙醯肝素酶等位基因片段缺乏促進子和外顯子1。更確 切的說，受幹擾的乙醯肝素酶基因可能會缺少HindIII-Xbal片段。此發明包括受到幹擾的 雜合子或純合子哺乳動物。本發明還提供從上述非人類轉基因哺乳動物中得到的細胞。另外，本發明提供了一種製作至少有一個受幹擾乙醯肝素酶等位基因片段的轉基 因非人類哺乳動物的方法，該方法包括在非人類哺乳動物胚胎幹細胞中使用同源組合來敲除乙醯肝素酶基因的步驟；將得到的含有重組細基因的胞植入從動物體內分離的胚泡中； 將胚泡移植到假孕的非人類哺乳動物；移植的胚泡發育成為一個轉基因非人類哺乳動物； 交配產生轉基因非人類哺乳動物以繁殖後代；在後代中檢測到擁有至少一個被幹擾乙醯肝 素酶等位基因片段的非人類哺乳動物。在一個特定的實例中，乙醯肝素酶基因被刪除部分 包括SEQ ID NO 1中的核酸序列。本發明還提供包含一個用於構建乙醯肝素酶核酸序列載體的質粒，在此載體中至 少一部分的乙醯肝素酶外顯子序列被所選定的標記核酸序列所替代。在一個實例中，選定 的標記序列包含一個抗新黴素基因。另外，本發明提供一個篩選藥品的模型，包含用至少擁有一個受到幹擾的乙醯肝 素酶等位基因片段轉基因非人類哺乳動物的步驟；如對上述的哺乳動物誘導疾病；然後在 該動物上篩選藥品；從而通過該動物疾病的發展分析藥物的作用。在一個實例中，給動物接 種腫瘤細胞或刺激造成炎症。上述的分析包括確定是否形成腫瘤轉移或炎症反應程度。在 其它實例中，上述的疾病誘導包括實驗性自身免疫腦脊髓炎。在其他一些實例中，上述的疾 病誘導劑可引起過敏反應。方法包括將結果與在其它非轉基因非人類哺乳動物上實驗的結 果進行比較。


本發明將根據實例和附帶的數據進一步的詳述。圖IA顯示設計的乙醯肝素酶基因(Hpse) 5』端的(指定為正常等位基因片段)和 被幹擾的目標片段(指定為K/0等位片段)。同源組合造成第1外顯子和促進子的消失並 被替換為一個neo基因。顯示了在限制I或者ERv處理後的基因片段數量。編號 1 4的片段代表了可用於DNA印跡檢測的探針。Neo的編碼方向有所顯示。圖IB展示了用ERv切割後野生型(wt)、Hpsev_雜合型和Hpse+型的胚胎基因 DNA的DNA印跡分析。如圖IA所示樣品與3號探針進行了雜交。野生型(wt)胚胎只顯示 了正常等位基因片段，雜合子胚胎同時顯示了正常等位基因片段和變異等位基因片段，而 Hpsev-(KO)胚胎只顯示了短的等位基因片段。圖IC展示了乙醯肝素酶mRNA表達的PCR分析。RNA採集於野生型和Hpse-KO鼠 的肺和脾，並使用3對在不同區域用於放大Hpse基因的PCR引物進行了 PCR放大。在從野 生型中提取的樣品中檢測到了 Hpse表達，而在Hpse-KO樣品中沒有。L-19用來做內標。圖ID展示了乙醯肝素酶活性分析實驗。從4個野生型鼠和4個Hpse-KO鼠提取 的血液樣本使用同位素硫(35S)標記的ECM進行了孵化(16h，37°C，pH 6.2)。同位標記的 降解物被釋放到培養基中並6B進行了凝膠過濾分析。只在從野生型鼠提取 的樣品中發現了乙醯肝素酶活性，Hpse-KO鼠中沒有發現乙醯肝素酶活性。圖IE展示了 HS降解分析實驗。從野生型和Hpse-KO鼠摘取的肝、腎和脾組織勻 漿高速離心後，取上清與3H-Eicetyl標記的HS進行了孵育(18h，37°C，pH 5. 8)。反應後的 混合物用Superose-12進行了凝膠層析。A圖顯示空白(第一個峰)和陽性對照樣品(被 重組肝素酶完全降解的樣品；第二個峰)。B，C，D圖顯示Hpse-KO組織提取物(線)孵育 得到與空白對照(A圖顯示)同樣的結果，表示沒有發現乙醯肝素酶活性；野生型提取組織 的孵育顯示明顯的乙醯肝素酶活性(點線)，與重組乙醯肝素酶孵育後的圖形(A圖顯示)一樣。圖2展示了來源於野生型鼠(點線)和Hpse-KO鼠(線)的HS分子結構對比。由 肝臟(圖A和B)和腎臟(圖C和D)提取的用同位素硫(35S)標記的HS鏈進行了 Superose 12凝膠層析分析。圖A和C顯示了硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的分子結構，圖B和D顯示了 HS鏈的分子結構。圖3展示了野生型鼠和Hpse-KO鼠乳腺形態的對比。3個月未受精雌鼠的乳腺組 織切片用蘇木精(hematoxylin)染色。與相同年齡的野生型動物的組織相比較(上圖)， Hpse-KO的乳腺(下圖)顯示豐富的側枝和腺泡結構。圖4A展示了在主動脈環模型中生長因子誘導的血管內皮芽。Hpse-KO和野生型鼠 的主動脈環受到了 FGF-2的誘導後6天生出血管芽。固定後，用0. 02%結晶紫溶液染色並 評估血管出芽量。Hpse-KO主動脈環(下圖)比野生型主動脈環(上圖)的出芽量高。圖4B展示了用Matrigel plug試驗血管再生。Hpse-KO (下圖)和野生型(上圖) 鼠皮下注射了 200μ 1隻含80ng/ml FGF-2 (不含其它生長因子)的Matrigel。7天後，切出 植入的Matrigel並拍照。然後Matrigel勻漿後使用Drabkin試劑對血紅蛋白進行分析。 與野生型鼠對比，Hpse-KO的血管生成反應更明顯(Hpse-KO :55. 57士7. 18mg/dl ；野生型 26 士 4. 8mg/dl ；ρ ( 0. 0002)。圖5Α展示了 MMP表達的實時定量PCR分析結果。從野生型鼠和Hpse-KO鼠的腎 髒、肝臟和乳腺中提取RNA，使用實時定量PCR分析ΜΜΡ-2、ΜΜΡ-9、ΜΜΡ-14和ΜΜΡ-25的表達。 野生型組織中每個MMP的表達程度都定為100% (黑色柱體)，測量得到的Hpse-KO的表達 量表現為與之相比較的百分比(白色柱體)。每個分析都重複進行了 6次，平均值表示為 +/-SD。圖5Β展示了通過蛋白質印跡分析ΜΜΡ-2和β聯蛋白(β-Catenin)表達的結果。 從肝臟、腎臟和乳腺的組織提取的組織勻漿電泳分離後，用ΜΜΡ-2單克隆抗體(mA801B ；上 圖)，β聯蛋白(mAbeiOlM;中圖)，或α微管蛋白(B-5_l_2 ；下圖)做的蛋白質印跡分析結果。圖5C顯示了 β聯蛋白染色。固定並石蠟包埋的腎組織用抗β聯蛋白抗體染色。 與從野生型得到的樣本相比從Hpse-KO得到的腎樣本有更強的染色。圖6展示了乙醯肝素酶轉染的人乳腺癌細胞(MDA-231)中多種MMP的表達。圖6Α 顯示MDA-231細胞分別表模擬轉染的空(質粒)載體、活性乙醯肝素酶(Hpse)或突變的乙 醯肝素酶(mut-Hpse)基因。mRNA表達量由實時定量PCR測出。空(質粒)載體轉染細胞 的mRNA表達量定為100%，Hpse和mut-Hpse轉染細胞的表達量以與空(質粒)載體轉染 細胞的百分比形式表達。圖6B顯示了數種MMP在這三個細胞株中的表達。在活性乙醯肝 素酶轉染的細胞中發現ΜΜΡ-2、MMP-9、MMP-14的表達量減少，而此變化在轉染帶有突變的 乙醯肝素酶的細胞中沒有看到。圖7展示了在脂多糖(LPQ刺激後小鼠腹腔液中細胞分布。成年動物(每5個一 組)在腹腔內注射溶解在100 μ 1 PBS中的10 μ g LPS。16小時後將動物殺死並用IOmlPBS 衝洗腹腔。對腹腔中發現的細胞進行了計數。圖8總結了傷口處的血管再生。野生型、Hpse-KO和Hpa-tg鼠麻醉後，剃毛，並在 背部做了 Icm長、全皮深的切口。切口用氰基丙烯酸鹽膠封閉並在術後第1、3、7天用MRI進行檢查。
具體實施例方式本發明的目的是提供用轉基因手段消除或減弱乙醯肝素酶基因的細胞株和動物。 幹擾手段引起乙醯肝素酶基因的部分或全面消除，比如在乙醯肝素酶基因上的關鍵位點 引入突變，導致該基因不能表達或不能生產有活性的功能蛋白。對乙醯肝素酶基因進行幹擾可通過多種方式實現，比如同源組合、突變、cre/lox 技術、反義技術和轉位子反轉錄轉座子技術。用同源組合技術通常的方法是用一個標記基因，如抗生素抗性(新黴素抗性) 基因幹擾一個正常的靶基因。將標記基因整合到目標基因的轉錄單位可起到幹擾靶基 因的表達，同時為篩選有同源組合的細胞提供了手段。其中一個例子為新黴素選擇質粒 (loxP-PGK-gb2-neo-loxP)，可從 Gene Bridges GmbH 獲得。
在一個實例中，同源組合被用於淘汰Hpse基因。為了實現這個目的，設計了 一個 兩端為與Hpse基因同源的DNA序列，中間是新黴素抗性基因的一個線性質粒結構用於感染 非人類哺乳動物胚胎幹細胞。在細胞培養皿中加入抗生素來選擇發生了同源組合的細胞。 然後同源組合的幹細胞被注射到分離出來的胚泡中並植入假孕的非人類哺乳動物中。在同 源組合導致一個Hpse等位片段失活後，兩代或更多選擇性繁殖將提供Hpse基因的兩個等 位基因同時被幹擾的無Hpse非人類哺乳動物。本發明提供轉基因非人類哺乳動物包括嚙齒類動物，如老鼠、天竺鼠和小鼠， 在這些動物上乙醯肝素酶的基因編碼被幹擾。導致上述的動物部分缺乏、選擇性缺乏或完 全缺乏有活性的乙醯肝素酶。鼠的乙醯肝素酶基因有12個外顯子，為了使乙醯肝素酶的基因進入休眠狀態可 將它們刪除。但是，有些外顯子可能不是活性的必要元素，刪除它們只會使乙醯肝素酶部分 失活，這種導致乙醯肝素酶不完整失活的刪除稱為減弱刪除。用一個結構來刪除多於一個 外顯子是提供無Hpse或減弱Hpse動物的一種選擇。該技術的困難在於會增加需要刪除的 序列的長度。在能提供無Hpse或減弱Hpse動物的結構中，首選外顯子2和3的刪除、外顯 子4的刪除、外顯子5到9的刪除、外顯子10的刪除、外顯子11或12的刪除。最佳的結構 為選擇促進因子和外顯子1的刪除。一個特定實例提供了一個轉基因Hpse敲除鼠，該鼠的Hpse基因的外顯子1被完 全刪除且促進因子也被部分刪除。在一個更具體的實例中，Hpse基因缺少HindIII-XbaI限 製片段，該片段擁有的一個核酸序列在SEQ描述為ID NO :1。該鼠乙醯肝素酶有功能缺陷。本發明的實例提供了擁有被幹擾Hpse基因的轉基因鼠和其製備方法。獲得無 Hpse或Hpse減弱鼠的方法與幹擾其體內指定基因的方法相同。簡單的說，從鼠的染色體中 確認乙醯肝素酶的基因編碼特徵。根據基因構架，設計一個結構來刪除基因不需要的部分， 是靠適當的質粒來實現的。在首選的結構中，促進因子的一部分和外顯子1被刪除。在一 個實例中，21Λ 31Λ的上遊序列和41Λ 61Λ的下遊序列被包含在loxp-neo-loxp質粒中 同系整合。大鼠的hpse基因只有5個外顯子，其它推選的結構包括外顯子2的刪除、外顯 子3的刪除、外顯子2和3的刪除、外顯子4或5的刪除。結構可由基因作圖和部分排序來 確認。將該結構注射到一個鼠的ES細胞中，再根據選用的標記來選擇形成的克隆。對克隆進行同源整合檢測，比如DNA印跡分析和/或PCR。有同源整合的ES克隆被注射到分離出 來的鼠胚泡中，然後將胚泡植入假孕的鼠中。最後繁殖的後代用於種系選擇。雜交動物可 使用近親繁殖的方式來獲得純種的後代。在另一個實例中反義技術和轉位子反轉錄轉座子技術，如長散在核元件(LINE) 可用於提供無Hpse的轉基因非人類哺乳動物，特別是鼠類。按照本專利發明的轉基因哺乳動物可與其他轉基因非人類哺乳動物交配繁殖提 供其它轉基因非人類哺乳動物。按照本發明產生的轉基因非人類哺乳動物可用於建立乙醯肝素酶缺乏哺乳動物 細胞系。用於建立這種細胞系的方法是成熟的技巧。首選的細胞系包括胚胎幹細胞和纖維 母細胞系。纖維母細胞系可作為乙醯肝素酶缺陷細胞株使用。Hpse基因目標幹擾的成功可由已知的方法來分析。比如RNA印跡可用於確認乙 醯肝素酶mRNA表達的減量或缺失。其它已知的方法夜可用來確認乙醯肝素酶活性的缺失。本發明的轉基因非人類哺乳動物可用於多種藥品的測試。測試方法可包括將哺乳 動物暴露給疾病誘發因素後，向該動物注射相應需要測試的藥物。然後就疾病的發展對該 哺乳動物進行分析。在一些實例中，本發明的非人類哺乳動物可用於檢測抗乙醯肝素酶和/或抗癌藥 物。一個典型的分析實驗包括給無Hpse的動物接種如黑色素瘤、上皮癌或肝癌細胞等腫 瘤細胞作為疾病激發物。在接種後這些動物接受需要測試藥品的治療，通常按不同的間隔 時間和量進行腹腔內注射、尾靜脈注射、餵食或鼻吸入。被測試藥物在腫瘤轉移(如肺或 骨)中的作用，經過與感染同樣疾病同樣年齡同樣性別的野生動物進行比較。分析實驗法 可用來確定被測藥物的有效劑量。本發明的轉基因動物，乙醯肝素酶的缺失可用一些MMP，特別是MMP2和MMP14的增 量表達來彌補。因此，一個特定的實例，使用此動物來評估抗MMP物質的藥用潛力。由於MMP在多重硬化症、炎症和神經系統損傷中扮演著重要角色，本發明的一個 實例是關於使用無Hpse的動物來測試多重硬化症治療藥物的效果。為了實現這個目的，一 個已知疾病模型是實驗性自身免疫性腦脊髓炎。針對多重硬化症可將本發明中的轉基因非 人類哺乳動物暴露給Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein(MOG)肽和百日咳毒素(Shao et al.，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004,45 :4060-4065)。通過給藥後對疾病的發展進 行評估，癱瘓數量的降低是藥用潛力的標誌。本發明的轉基因非人類哺乳動物與相應的野生動物相比對炎症促進劑有強烈反 應(圖7)，所以可用於篩選抗炎症藥物。為了這個目的，無Hpse哺乳動物可暴露在下述多 禾中ISSi^帛牛莫M中:Carrageenan Paw Edema (CPE), Adjuvant-Induced Arthritis (ΑΙΑ), Collagen-Induced Arthritis(CIA), Mouse Ear Edema, intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) and Air Pouch。然後對使用的抗炎症藥物進行評估，減弱的炎 症反應是抗炎症潛力的標誌。本專利的轉基因非人類哺乳動物也可用於篩選用於促進傷口癒合的藥物。在一 個實例中，分析實驗法包括麻醉野生型、Hpse-KO和Hpa-tg鼠，剃毛，並在背部做了 Icm長， 全皮厚度的切口。切口用氰基丙烯酸鹽膠閉合併在術後第1、3、7天分別測量傷口上皮邊 緣的方法來檢測傷口的復原情況。另外傷口液體可通過插入適當海綿，比如5立方釐米的polyvinyl海綿，的方法來採集。在插入海綿一定的時間，比如一天，後可將海綿拔出。然後 通過離心過濾的方法收集吸附在海綿中的液體，並對液體炎症因子使用如蛋白質印跡這樣 的方法進行分析。傷口組織也可切片後用於組織染色分析。在實驗分析中測試的傷口治療 藥物可在任意時間直接使用在傷口上或皮下注射。此外，本專利的轉基因非人類哺乳動物顯示出特定蛋白酶貯藏的增加。例如肥大 細胞蛋白酶-5和-6以及carboxylp印tidase A的貯藏。根據蛋白質印跡分析顯示，這些 酶在無Hpse鼠中有所增加。這一結果顯示了乙醯肝素酶在調節肥大細胞功能中的角色，特 別是對過敏反應的調節。因此轉基因非人類哺乳動物可用於篩選用於抗過敏反應的藥，也 可用作慢性過敏模型。用於對過敏藥品的效果經過評估並與感染同樣疾病的同年齡同性別 的野生動物進行比較。轉基因鼠可繁殖並顯示出正常的生命期限，沒有明顯病理變化，僅有一些細小的 改變(乳腺的過渡分枝，較強的血管再生反應)。對大腦、心臟、肝、肺、腎和脾等多個器官的 組織分析沒有顯示任何病理改變。因此，敲除乙醯肝素酶沒有給動物造成傷害反而提供了 一個可以展示乙醯肝素酶在多個生理和病理環境中所扮演角色的平臺，同時可以用來篩選 治療用的藥物。實施例1乙醯肝素酶缺陷小鼠的製作乙醯肝素酶缺陷的小鼠是通過幹擾所選擇的ES細胞中的基因製作的。目標載體 通過刪除部分促進子(起始點上遊大約500bp)和全部第一外顯子(圖1A)，來製作一個功 能缺陷的突變體。被刪除部分的核酸序列展示在圖SEQ ID N0:1，一個長達151Λ的乙醯肝 素酶的基因由一個鼠(U9/SV)基因組的噬菌體基因庫(Stratagene，Cedar Creek, TX)中 分離出來。基因上遊一段2. 5kb長的序列作為同源克隆的短臂，放入含有新黴素抗性基因 (neo)白勺pNT_Lox2質f立(由Dr. Peter Carmeliet,Department of Molecular and Cellular Medicine, Catholic University, Leuven, Belgium 提供)。外顯子 1 下遊的一段 4. 8kb 的 序列作為內源性基因的同源長臂。目標載體的總長約為14.5-1Λ。目標載體由限制酶Not I線性化並被電轉到由Uppsala Transgenic facility提 供的胚胎幹細胞(EQ中。也可選擇其它ES細胞。顯現新黴素抗性基因的ES克隆通過在 培養液中加G418(350yg/ml，Invitrogen，Carlsbad, CA)的方法來篩選，並使用DNA印跡 法來分析目標基因DNA的同源重組。簡單來說從ES細胞中提取的染色體DNA由EcoR V或 Seal切割。產生的片段用0. 8%的瓊脂糖凝膠分離後轉到尼龍膜上，然後與32P標記的探針 進行雜交(見圖1A)。篩選出400個具有抗新黴素抗性的ES克隆，其中只有兩個克隆有Hpse基因中 的同源重組，而且沒有在其它位點上發現有整合。這兩個有同源重組的克隆被注入到由 C57BL/6受精鼠分離出來的胚胞中，然後移植到假孕的小鼠中。產生的雄性嵌合鼠與雌性 C57BL/6鼠進行了雜交，其中一個克隆表現出有性繁殖能力。此雜交小鼠後代近親交配得到 Hpse缺失的純合子鼠。對這種混合基因背景(U9/SvJ/Sv/C57BL/6)的小鼠進行了表型的 研究。全部動物實驗按照瑞典和以色列國家動物實驗協會的規定進行。鼠的後代用基因印跡法進行了分析(圖1B)，結果顯示沒有早死現象。為了驗證 Hpse基因已被完全乾擾，使用實時PCR按照具體的參數對來自野生型和Hpse-KO鼠的組織中提取的乙醯肝素酶mRNA進行了檢查。從脾和肺組織中用TRIzoI分理出RNA並用分光光 度法定量(約IOOmg)。用500ng的RNA和寡核苷酸引物反轉錄後的到的cDNA用於PCR進 行了放大。檢測乙醯肝素酶表達的PCR條件是，94°C變性2分鐘，然後是25個循環，包括變 性94°C 15秒，58°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘。擴增產物(10 μ 1)用1. 5%瓊脂糖凝膠 電泳分離，溴化乙錠染色(Hy Labs, Rehovot, Isreal)。PCR中使用的引物在表1中進行了 總結。設計用來檢測乙醯肝素酶基因的引物包括5_』端，中部，和3_』端區域。如圖IC所 示，只在來自野生型鼠的樣本中發現了乙醯肝素酶mRNA。
表1 用於檢測Hpse mRNA的引物放大的基因/區域序列5』 -3，SEQ ID NO mHpse 5'順向5 『 -CGACCGACGACGTGGTAGAC-3『2mHpse 5'反向5' -GCAACAGCTCCTGGAAGGG-3『3mHpse Middle順向5' -TTTCTGAGCTCTGATGCGCTG-3'4mHpse Middle反向5' -TGGGCCTTTCACTCTTGACAG-3'5mHpse 3'順向5 『 -ACTTGAAGGTACCGCCTCCG-3『6MHpse 3，反向5 『 -GAAGCTCTGGAACTCGGCAA-3『7L-19順向5 『 -ATGCCAACTCTCGTCAACAG-3『8L-19反向5 『 -GCGCTTTCGTGCTTCCTT-39確認乙醯肝素酶活性已被消除。用放射性同位素硫(35S)標記的ECM(圖1D)或者 放射性同位素硫(35S)標記的可溶性硫酸肝素作為底物(圖1E)對來自野生型鼠和Hpse-KO 鼠的4份血清樣本和3份組織樣本(肝、腎和脾)進行了乙醯肝素酶活性的分析。血清樣 本用緩衝液(20mM phosphate-citrate, pH 6.2，含有 ImM dithiothreitol, lmMCaC12, and 50mM NaCl)按1 : 1進行稀釋，然後與35S-標記的ECM進行孵育(16h，37°C )。收集培養 後，離心(20，000秘，41，11^11)，並用瓊脂糖凝膠(^-68柱進行凝膠過濾分析。收集的洗脫 液(每管O.aiil)，用beta閃爍計數器進行分析，檢測有mS-標記的HS降解片段。未降解 的HS蛋白多糖(HSPGs)從瓊脂糖凝膠6B柱的死體積區洗脫出來(peak I，Kav < 0. 2)， 而HS降解片段從柱的Vt中洗脫出(peak II,0. 5 < kav < 0. 8)。此分析方法使用的ECM 表層皿的準備方式如下牛角膜內皮細胞培養液中加入放射性同位素硫(Na2[35S]04) (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)，在細胞培養的第一天和第五天分別加入兩次 (25 μ β Ci/ml)。7到10天後在細胞培養皿中加入含有0. 5% Triton X-100的PBS和20mM NH4OH,將細胞單層溶解後，暴露ECM。然後使用PBS清洗四次，除去細胞殘渣，而ECM沒有受 到影響並堅固的附著在培養皿上。組織樣本的分析用了四個月的野生型鼠和Hpse-KO鼠。動物殺死後，收集的器官立即置於 2ml PBS，pH7. 4，含有 1 % Triton X-100 和蛋白酶抑制(Sigma-Aldrich， St. Louis,MO)的緩衝液中勻漿。均漿被放在冰上30分鐘，然後4°C，15，OOOrpm離心20min。 然後收集的上清用HiTrap肝素-瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare Bioscience)純化。在 使用IOml的PBS清洗後，用含有IM NaCl的PBS洗脫結合的蛋白質。蛋白質的總量由 Bradford方法測定。來源於洗脫物的50μ g蛋白質樣本與5000cpm[3H]-acetyl標記的 HS，在 20mM phosphate-citrate, ImM DTT，ImM CaCl2, and 50mM NaCl, pH 5· 8 緩衝液中孵 育(37°C，過夜)。得到的最終產品使用瓊脂糖凝膠12層析柱進行了分析(GE Healthcare Biosciences)0不論在任何實驗分析系統中，沒有在一個來自Hpse-KO鼠的樣本中檢測到乙醯肝 素酶活性，而來自野生型鼠的樣本顯現出了正常程度的乙醯肝素酶活性(圖ID和E)。特 別是在血清樣本中，通常由於血小板和白細胞的激活而釋放出大量的乙醯肝素酶。如圖ID 所示，來自野生型鼠的血液樣本洗脫液第20-40管中含有大量的低分子物質，說明有高活 性乙醯肝素酶反應(圖1D，Peak II)。Peak II中洗脫的標記物為HS的降解物，這些片 段比HSPk的完整HS鏈小5 6倍，而且不會被乙醯肝素酶進一步消化。相對而言，來自 Hpse-KO鼠的血液樣品沒有展示肝素酶活性，因為缺少HS降解產物(Peak II)，而只是在洗 脫液第5-10管中檢測到高分子量的標記物質，即完整的HSPGs，由細胞外基質中蛋白酶降 解基質而產生。同樣，來源於野生型鼠和Hpse-KO鼠器官組織樣本的測試結果與血液樣本 測試得到的結果相同。實施例2乙醯肝素酶缺陷鼠的表型分析純合子突變的動物沒有顯示明顯的異常表型，有正常生育能力和正常的生命周 期。為了檢驗是否有年齡相關的表型，6，12和18個月的鼠被殺死，其器官在96%乙醇、冰醋酸和3%水的溶液中固定。石蠟包埋的組織切片，由Hematoxlin&eosin染色。對來自 Hpse-KO鼠各個器官切片的組織學檢查沒有發現任何重大的異常。為了研究乳腺形態，來自三個月大的未交配過的雌性純合子Hpse-KO鼠或野生型 鼠的整個乳腺在Tellys固定液(100111170% EtOH, 5ml福馬林，5ml冰醋酸)中固定，組織 切片用Hematoxlin&eosin染色後，用自來水清洗(1個小時)，脫水並保存在水楊酸甲酯中。 未交配過的Hpse-KO鼠的乳腺顯示出異常豐富的分支管道和早熟的腺泡結構，即一般在懷 孕的鼠中才會發生的情況(圖3，下圖)；而未交配過的野生型鼠乳腺則沒有這種不正常的 發育。以前，在未交配過的超標達人肝素酶(hpa-tg鼠)轉基因母鼠觀察到過此現象，但是 與hpa-tg鼠不同，Hpse-KO鼠和野生型鼠的主要管道的寬度沒有區別。為了檢驗乙醯肝素酶缺失和HS結構改變帶來的後果，從15隻野生型鼠和15隻 Hpse-KO鼠中提取了血液樣本(72小時禁食前後)。樣本被用於分析蛋白質總量和肌酸酶 的含量、以及穀草轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)的活性。血液樣本 用Kodak950檢測。使用自動的Kodak250系統檢測尿液樣本(25 μ 1)中的蛋白質量和肌酸 酶含量。結果顯示在野生型鼠和Hpse-KO鼠之間沒有重大區別。另外血小板中乙醯肝素酶 含量較高，血液樣本進行了凝血性能檢測(APTT)。同樣野生型鼠和Hpse-KO鼠之間沒有重 大區別。以前報導稱在肝臟的發育和再生過程中乙醯肝素酶活性比健康肝臟更明顯。另外，本專利發明者最近的研究工作發現乙醯肝素酶有促進肝再生的作用(未發表的結果)。 因此，設想的是Hpse-KO小鼠肝臟在部分切除後，可能表現出響應較慢的再生率。野生型鼠 和Hpse-KO鼠G個動物每組)接受了部分肝切除。每隻鼠都用MRI檢查，以評估體內肝臟 大小。出人意料，兩組動物在肝臟切除手術後的8天中沒有觀察到有任何重大不同。實施例3乙醯肝素酶缺陷鼠硫酸乙醯肝素結構的生化分析降解硫酸肝素是乙醯肝素酶的一個主要功能，因此對從被選擇的內臟中分離出來 的HS進行了分析。野生型和Hpse-KO鼠腹腔內注射了 0. 5mCi Na235SO4 (specif ic activity 1，500Ci/mmol ；Perkin Elmer, ffaltham, MA)，動物容許自由接觸食物和水45分鐘。然後動 物被頸椎脫位法殺死並解剖。選擇的器官組織在50mM Tris-HCLpH 7.4,1% (v/v)Triton X-100，4M urea，0. 25M NaCl含有蛋白酶抑制(Sigma-Aldrich)的緩衝液中勻漿，然後在 4°C孵育過夜。離心後，取上清加載於DEAE-kphacel層析柱，在50mM Tris-HCl, pH 7.4， 0.3M NaCl中進行分離。上樣後，柱子用緩衝液多次清洗，然後使用同樣的緩衝液加1. 5M NaCl 脫洗。洗脫液用 chondroitinase ABC (Seikagaku, Tokyo, Japan)禾口 benzonase (Merck, San Diego, CA)消化，然後進行脫鹽，凍幹。再次使用DEAE-kphacel來除掉降解的硫酸軟 骨素和寡核苷酸。經過1. 5M NaCl洗脫的HSPG被用於進一步的分析。為了分析HS的分子結構，在瓊脂糖凝膠12柱上進行了 HSPk和HS的凝膠層析， 用 50mM Tris-HCl, pH 7. 4，IM NaCl,0. 1% Triton X-100 進行了脫洗。為了分析 HS 的微 細結構，HS樣本用亞硝酸在pHl. 5處理後，得到不同大小的寡糖片段，然後用NaB『H]4進行 還原反應。還原後的產品用生物膠P-10柱(Bio-Rad，Hercules, CA) (1x200cm)進行了分 離，用0.5M NaCl洗脫。一部分的亞硝酸降解產品用葡聚糖凝膠G-15柱進一步分離，並收 集雙糖部分。由降解N-sulfated域而產生的3H or mS標記的雙糖脫鹽，濃縮後在HPLC系 統上用陰離子交換柱Partisil-IOSAX上進行了進一步分析。如預料的，Hpse-KO組織的HS鏈的分子量比野生型組織的HS高(圖2)。另夕卜， Hpse-KO組織中分離出來的HS自由鏈的洗脫峰更窄和更勻稱，意味著比野生型組織的HS有 較高的均一性。在來自野生型和Hpse-KO組織的HS樣品沒有磺基化程度的不同。實施例4乙醯肝素酶缺陷鼠中血管內皮細胞出芽的分析實驗證明乙醯肝素酶在細胞轉移和血管新生中起重要作用。所以，對乙醯肝素酶 基因敲除對內皮細胞遷移和萌芽生長的影響進行了評價。首先，應用體外主動脈環法。簡單 講，8隻野生型和8隻Hpse-KO鼠被殺死。主動脈被洗淨後切1_2毫米厚的環。兩個環嵌入 不含生長因子的三維Matrigel (BD Biosciences, San Jose，CA)，並在含有FGF-2 (50ng/ml， 0.5ml)的生物-MPM 中(Biological industries, Beithaemek, Israel)培養。這樣的培養 在(37°0，8%0)2，潮溼的空氣)維持了 6天，培養液和FGF-2每2天更換一次。培養過程中 每天都評估了血管出芽，為期6天，然後用4%的福馬林將組織固定M小時，並用0. 02% 的水晶紫在乙醇中染色(Sigma-Aldrich)，用Nikon EclipseTS 100相差顯微鏡拍照。如所 期望的，FGF-2缺失的情況下，野生型或Hpse-KO環中只有少量出芽或沒有出芽。用FGF-2 刺激後野生型和Hpse-KO環中出現了內皮發芽(圖4B)。與野生型環相比，Hpse-KO環展現 的管形成更加明顯(圖4B，上、下圖)，提示Hpse-KO對FGF-2的反應較高。
為了驗證以上體外結果，我們進行了體內血管生成分析試驗。在此模型中，小鼠皮 下注射200 μ 1不含生長因子的Matrigel。然後加入或不加入FGF-2 (80ng/ml)。7天後，切 出此Matrigel，拍照，在低滲裂解液中(250 μ 1 0. 1 % Bri j-35/plug)和用5000xg離心5 分鐘。上清液用測量德拉布坎的試劑分析血紅蛋白含量，以評估新血管生成。相對野生型 鼠而言，含有FGF-2的Matrigel在Hpse-KO鼠內引起了劇烈的血管生成反應，證實了體外 的結果。血紅蛋白測定結果顯示，在Hpse-KO鼠的Matrigel中血紅蛋白是野生型鼠的2倍 (55. 57 士 7. 18mg/dl vs. 26 士 4. 8mg/dl ；ρ ( 0. 0002)。實施例5乙醯肝素酶缺陷鼠補償性反應的分析Hpse-KO鼠乳腺腺體的異常形態和異常的新生血管形成能力引發了對這些表型 背後機制的調查。其中一個問題是其它ECM降解酶對缺乏乙醯肝素酶是否起了補償作用。 Hpa2，一個與乙醯肝素酶基因有顯著同源性(大約38% )但是無乙醯肝素酶活性的蛋白質 是調查的第一個對象。對Hpa2的分析在野生型和Hpse-KO鼠間沒有發現任何的不同。另 外在Hpse-KO鼠中發現的未經降解的HS也不支持有另外的類乙醯肝素酶。考慮到蛋白酶，尤其是基質金屬蛋白酶(MMP)，在調節細胞外基質的功能和結構 中發揮重要作用。因此，對幾種選擇的基質金屬蛋白酶的表達由實時PCR進行了研究。對 從HPSE-KO和野生型鼠腎臟，肝臟和乳腺提取的RNA，使用相應的MMP-2，-3，-9，-14，-25 特異性引物進行了分析(表幻。實時量化PCR是由自動轉子基因系統RG-3000A (Corbett research, Sydney, Australia)來完成的。PCR反應體系(20 μ 1)由 10 μ 1 QPCR SYBR green mix(ABgene,Epsom,UK),5y 1稀釋後的cDNA和0. 3μΜ引物組成(每個樣品做了 6個重複 管)。PCR的條件如下，初始變性步驟為95°C 15分鐘。然後是40個循環，每個循環包括 94°C 15秒，57°C雜交30秒並在72°C延伸30秒。肌動蛋白被用來作為內參標準。圖2 用來發現MMP表現的引子
權利要求
1.一種轉基因非人類哺乳動物，所述轉基因非人類哺乳動物具有至少一個缺損的乙醯 肝素酶等位基因。
2.如權利要求1所述的轉基因非人類動物，其中，所述缺損的乙醯肝素酶等位基因缺 乏啟動子和外顯子1。
3.如權利要求2所述的轉基因非人類動物，其中，所述缺損的乙醯肝素酶基因缺乏 HindIII-XbaI 片段。
4.如權利要求1 3中任一項所述的轉基因非人類動物，所述動物就乙醯肝素酶基因 的缺損而言是純合性的。
5.一種分離細胞，所述分離細胞源自權利要求1 4中任一項所述的轉基因非人類哺 乳動物。
6.一種權利要求1所述的轉基因非人類哺乳動物的製備方法，所述方法包括a)通過在非人類哺乳動物胚胎幹細胞中的同源重組來刪除部分乙醯肝素酶基因；b)將步驟a)中得到的細胞植入分離的胚泡；c)將所述胚泡移植至假孕的非人類哺乳動物內；d)讓所述移植胚泡發育成轉基因非人類哺乳動物；e)將所述轉基因非人類動物育種以產生後代；和f)對所述後代進行篩選以鑑定出具有至少一個缺損的乙醯肝素酶等位基因的轉基因 非人類哺乳動物。
7.如權利要求6所述的方法，其中，在a)中刪除的所述部分包含SEQID N0:1所示的 核苷酸序列。
8.一種用於製備權利要求1所述的轉基因非人類哺乳動物的載體，所述載體包含編碼 乙醯肝素酶敲除構建體的核酸序列，其中所述乙醯肝素酶編碼序列的一個外顯子的至少一 部分被選擇性標記物序列所替代。
9.如權利要求8所述的載體，其中，所述選擇性標記物序列包含新黴素抗性基因。
10.一種治療性藥物候選物的篩選方法，所述方法包括a)提供權利要求1所述的轉基因非人類哺乳動物；b)使所述哺乳動物接觸疾病刺激物；c)對所述哺乳動物施用所述藥物候選物；和d)對所述動物由所述疾病刺激物誘導的疾病的發展進行分析。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物包含接種的腫瘤細胞，且所述步 驟d)包括確定任何腫瘤轉移的形成。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物是炎症刺激物，且所述步驟d)包 括確定任何炎症響應的水平。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物誘導實驗性自身免疫性腦脊髓炎。
14.如權利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物誘導過敏反應。
15.如權利要求10 14中任一項所述的方法，所述方法還包括將所獲得的結果與在野 生型非人類哺乳動物中獲得的相應結果進行比較。
全文摘要
本發明涉及到細胞和至少有一個受到幹擾的乙醯肝素酶基因的轉基因非人類哺乳動物。本發明還涉及到利用非人類的乙醯肝素酶缺失哺乳動物和細胞篩選藥物和篩選方法。
文檔編號C12N15/85GK102056479SQ200980121892
公開日2011年5月11日 申請日期2009年4月9日 優先權日2008年4月11日
發明者烏爾夫·林達爾, 伊斯拉埃爾·弗洛達夫斯基, 埃亞·茲切拉, 李晉萍 申請人:烏普薩拉多糖研究股份公司