一種植物啟動子及其應用的製作方法
2023-06-06 10:14:41 1
專利名稱：一種植物啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物啟動子及其應用。
背景技術：
啟動子是基因表達所必需的，決定了外源基因表達的空間、時間和表達的強度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。最常用的啟動子是35s基因啟動子，該啟動子能夠在植物組織中高水平表達，因此35s啟動子已經被引入許多轉基因植物中。35s啟動子來源於CaMV，該病毒能夠侵染多種十字花科植物，在其複製周期中經歷DNA和RNA階段，與人類免疫缺陷病毒(HIV)和B型肝炎病毒以及反轉錄轉座子的繁殖過程相似。與B型肝炎病毒不同的是，CaMV DNA並不整合到宿主基因組上。35s啟動子是CaMV DNA上控制基因組的RNA形式(即35S RNA)合成的區域。
由於35s啟動子在植物基因工程中被廣泛應用，在談論轉基因植物的安全性時，人們自然要關心該啟動子是否存在著潛在風險。有關35s啟動子的潛在風險問題最初是源於Kohli等(Kohli，etal.，Plant J.1999，17(6)591-601)的文章。Kohli等使用霰彈法進行水稻的遺傳轉化，他們的重組DNA分子包括分別由35s啟動子控制的3個基因。對轉基因植物進行分析後發現，在水稻基因組中存在著多拷貝的緊密相連的外源DNA，在精確定位這些DNA之間的毗連區後，發現確實存在著DNA重組位點。其中，11個重組位點中有4個是35s啟動子內的同一位點，該位點是一個長19bp、包括TATA box在內的迴文序列。他們認為這一位點就是35S啟動子中的重組熱點(hot-spot)。Cummins等根據這一工作推論這一熱點會使轉基因不穩定，從而導致35s啟動子較大的移動性，插入到植物基因組的不同位置。在此假說的基礎上，Cummins等進一步列出了一系列35s啟動子的潛在風險(1)如果35s啟動子插入到原來整合到植物基因組中的隱性病毒基因組旁，可能會重新活化病毒；(2)與此相似，如果該啟動子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上遊，可能會增強該毒素的合成；(3)當轉基因植物被動物或人類食用時，35S啟動子可能會通過基因的水平轉移插入到某一致癌基因上遊、活化並且導致癌症的發生。上述任何一種情況使人們有足夠的理由關心35s啟動子的安全性。
轉基因植物的生物安全性問題是當前轉基因技術發展的難題。實現外源基因在轉基因植物中的定向、安全、高效表達是解決轉基因植物安全性問題的關鍵之一。解決這個問題的一個重要途徑是克隆到調控外源基因在特定器官或特定發育時期表達的啟動子，構建高效表達遺傳轉化載體，實現可控的遺傳轉化。1，5一二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)是植物光合作用中重要的質體蛋白；由核基因編碼的小亞基的基因rbcS具有葉片組織特異性和光誘導特性，葉片組織特異性為實現轉基因的定向表達創造了條件，光誘導特性為轉基因的定時表達帶來了希望。利用rbcS啟動子在轉基因植物中調控外源蛋白基因使其在葉片中高效表達，而在種子中不表達將是解決轉基因安全性的重要技術策略。從而希望能夠解決外源毒蛋白對人類健康帶來的潛在風險，促進轉基因植物實現產業化。另外，外源基因表達量不足往往是得不到理想的轉基因植物的重要原因。由於啟動子在決定基因表達方面起關鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動子和通過改造增強其活性是增強外源基因表達首先要考慮的問題。
發明創造內容本發明的目的是提供一種具有葉片組織特異性、表達強度高的植物啟動子。
本發明所提供的植物啟動子名稱為rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由655個鹼基組成。
含有rbcSc啟動子的表達載體和細胞系也屬於本發明的保護範圍，利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體，如植物表達載體pB2(圖譜如圖1B所示)。
本發明的rbcSc啟動子的轉錄活性是35S啟動子的1.3倍；而且是由rbcS基因啟動子進行結構上的改造而得到，除了具有較強的表達活性外，還具有葉片組織特異性和光誘導特性，rbcS啟動子可在轉基因植物中調控外源蛋白基因使其在葉片中高效表達，而在種子中不表達，保證種子等目標器官中不含有外源基因表達的蛋白質等，解決種子等目標器官中含有外源蛋白(如Bt毒蛋白)等生物安全性問題。本發明的rbcSc啟動子可代替35S啟動子作為植物轉基因的工具啟動子，廣泛用於培育具有較高生物安全性的單子葉和雙子葉轉基因植物。
圖1A為植物表達載體pB9物理圖譜圖1B為植物表達載體pB2物理圖譜圖1C為植物表達載體pB8物理圖譜圖2為TaKaRa Mutan BEST Kit原理示意3為幾種啟動子的轉錄活性比較示意4為不同載體在苜蓿植株中的瞬時表達檢測結果照片圖5為不同載體在水稻愈傷組織中的瞬時表達檢測結果照片圖6為不同載體在玉米愈傷組織中的瞬時表達檢測結果照片圖7為不同載體在小麥愈傷組織中的瞬時表達檢測結果照片具體實施方式
實施例1、rbcSZm1啟動子的克隆根據報導序列(GeneBankS42508)設計引物，且5』端加上HindIII酶切位點，3』端加上XbaI酶切位點，由生工生物技術公司合成引物，序列如下引物0AAAAAG CTTGAT ATT AGT TCA GCC CAA；引物1TTTTCT AGACGA CGA GGC CAT CAT CAC。以玉米基因組DNA為模板，按常規方法進行PCR擴增獲得654bp的目的片段，電泳回收純化，連接到pGEM-T載體上，篩選鑑定後進行測序，序列如序列表中SEQ ID №2所示，表明在rbcS基因啟動子的-118處鹼基T突變成C。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSZm1，然後電泳回收純化。同時，也將pBI121質粒(GENBANKAF485783)用XbaI+HindIII雙酶切，37℃，充分酶切直至過夜，之後1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化。酶切體系總共20ulXbaI，2ul；HindIII，2ul；10×buffer，2ul；BSA，2ul；載體DNA；12ul。然後將二者的回收產物用T4DNA連接酶連接，連接體系共10ulT4DNA連接酶，1ul；10×連接buffer，1ul；pBI121，4ul；目的片段，4ul。然後按CaCl2法轉化DH5α，進行卡那抗生素篩選，提取重組陽性質粒，以提取的重組陽性質粒為模板按常規方法進行PCR擴增鑑定，引物序列(0和1)如上，結果表明重組質粒結構正確，得到植物表達載體pB9(圖1A)。
實施例2、rbcSc啟動子的克隆利用Megaprimer PCR的方法，以rbcSZm1作為模板，以引物1GAT ATT AGT TCAGCC CAA和引物2(突變)5』-CCGGGCGCGGCCACG-3』為引物。第一輪擴出了241bp大小的目的片段，回收此片段作為下一輪擴增中的megaprimer。以5』-CGCGCGCGCGCGTG-3』為另一端引物，進行第二輪擴增。經過第二輪擴增，擴增出654bp大小的目的片段，回收純化，連接到T載體上，篩選出陽性克隆，鑑定後送申友生物技術公司測序。測序結果顯示在rbcS基因啟動子的GC富含區-118定點將T突變成C，其它的鹼基序列與rbcSZm1基因啟動子完全一致，命名為rbcSc，其序列如序列表中SEQ ID №1所示。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSc，然後電泳回收純化。同時，也將pBI121質粒用XbaI+HindIII雙酶切之後電泳回收純化，然後將二者的回收產物用T4DNA連接酶連接，轉化到DH5α，卡那抗生素篩選，提取陽性質粒，用XbaI和HindIII雙酶切重組質粒，結果表明重組質粒結構正確，得到植物表達載體pB2(圖1B)，具體步驟參照實例1。
Megaprimer PCR的具體步驟如下第一步反應體系為10×pfu Buffer 5uldNTP 4ul引物1 2ul引物2(突變)2ul模板 1-10ngpfu(5U/ul) 0.5ul滅菌蒸餾水 直到50ul反應程序為 25個循環反應結束之後，1.0％瓊脂糖電泳，回收純化241bp片段為megaprimer。
第二步在PCR小管中加入質粒 1uldNTP 1ul10×buffer5ulTaq plus酶2.5Umegaprimer2ul引物1 8ul突變 16ul補水至48ul進行如下反應 5個循環結束後，72℃取出加入2ul另一端引物，繼續進行如下反應 30個循環反應結束之後，1.0％瓊脂糖電泳，回收純化654bp片段。然後把回收的片段連接到T載體上，測序。
實施例3、rbcSo啟動子的克隆利用插入突變在rbcSZm1基因啟動子的-31位置、TATA框上遊插入八核苷酸序列(八聚體ATTTGCAT)。根據寶生物公司TaKaRa Mutan BEST Kit突變試劑盒(原理如圖2)的說明合成引物插入序列引物5』端ATT TGCATC ATG GAC ATG GCT CTAT；插入序列引物3』端TCG CTG GAT CCG CGT CCG CC；以rbcSZm1基因啟動子為模板，按常規方法進行PCR擴增產物回收純化，連接到T載體上，篩選出陽性克隆，鑑定後送申友生物技術公司測序，結果發現八核苷酸序列插入到了啟動子當中，且位於TATA框上遊14bp處。命名為rbcSo，其序列如序列表中SEQ ID №3所示，自5』端155位-162位鹼基為插入的八核苷酸序列ATGCAAAT。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSo，然後電泳回收純化。同時，也將pBI121質粒用XbaI+HindIII雙酶切之後電泳回收純化，然後將二者的回收產物用T4DNA連接酶連接，轉化到DH5α，卡那抗生素篩選，提取陽性質粒，用XbaI和HindIII雙酶切重組質粒，結果表明重組質粒結構正確，得到植物表達載體pB8(圖1C)，具體步驟參照實例1。
實施例4、rbcSc、rbcSo啟動子的瞬時表達的檢測本實施例所用主要溶液的成分(1)W5清洗液(pH5.8高壓滅菌)NaCl154mmoll/lCaCl2125mmol/lKCl 5mmol/l葡萄糖 5mmol/l(2)酶溶液纖維素酶R-101.2％離析酶R-10 0.4％用K3AS培養基配製，攪拌30-60分鐘溶解之後，3000g，離心5分鐘，過濾滅菌，現用現配。
(3)GUS酶提取緩衝液Na3PO4(pH7.0)50mmol/lEDTA10mmol/lNaCl100mmol/lSodium Lauroy Sarcosine 0.1％
Triton X-1000.1％β-巰基乙醇 10mol/lPMSF2mmol/lBSA 0.01％(4)MaMg溶液MgCl215mmol/lMES 5mmol/l甘露醇 0.5mmol/lpH5.8，高壓滅菌。
(5)終止緩衝液Na2CO30.2mol/l(6)MUG溶液用GUS酶提取緩衝液配製成2mmol/l。
(7)4-MU溶液用終止緩衝液配成100umol/l，再稀釋成工作濃度。
rbcSc、rbcSo啟動子的瞬時表達的檢測的具體步驟如下1、原生質體的製備(1)採集生長6周的無菌菸草植株上中等大小的葉片。
(2)用8個培養皿，每個培養皿中含有10ml用K3AS調製的酶解液，放4片葉片。
(3)將葉片疊成兩層，垂直於中肋切成2mm寬的小條。
(4)用封口膜將培養皿密封，26℃保溫16小時。
(5)檢查酶解進行的程度，輕輕的攪動，使已分離的細胞釋放進酶解液，如果需要，繼續將葉片酶解1-3小時。
(6)為了促進原生質體的釋放，可用大口徑移液管緩慢的將酶解液上下吹吸2-3次。
(7)用100目和200目不鏽鋼篩的濾器過濾酶解混合液。
(8)將濾得的原生質體置於5ml離心管中，2000rpm離心20分鐘，使原生質體漂浮上層。
(9)用大口徑移液管將上層原生質體以最小體積轉移到新的5ml離心管中。
(10)用4倍體積的W5溶液稀釋原生質體懸浮液，溫和混勻，以2000rpm，5分鐘離心沉澱原生質體。
(11)用W5溶液洗滌並以2000rpm，5分鐘離心沉澱原生質體。
2、聚乙二醇介導的轉化(1)將菸草原生質體懸浮於5ml MaMg溶液中，用血紅細胞計數器測定原生質體的濃度，使每個轉化樣品大約有1×106-2×106個細胞。
(2)2000rpm，5分鐘離心沉澱原生質體，除去上清，再將沉澱懸浮於0.5ml的MaMg溶液中。
(3)對原生質體在45℃水浴中進行熱激處理5分鐘，取出樣品後室溫放置10分鐘。
(4)向樣品中加入用於轉化的DNA，通常每個樣品(約106個原生質體)大約加10ugDNA。DNA用TE溶解，體積小於30ul。
(5)緩慢加入0.5ml PEG1450，溫和混勻，以誘導細胞攝取DNA。
(6)室溫下轉化25分鐘。
(7)用5ml W5溶液稀釋樣品，溫和攪勻後，用2000rpm離心5分鐘沉澱原生質體。
(8)按大約每毫升105個原生質體的密度將原生質體再懸浮於K3AM培養液中。
(9)在26℃，將5ml離心管中的原生質體遮光培養20小時，進行瞬時表達。
(10)首先用W5溶液將原生質體稀釋3倍，然後2000rpm，7分鐘離心收集原生質體。
(11)將沉澱再懸浮於500ul的GUS酶提取緩衝液中並轉移到1.5ml的離心管中。交替地將樣品在液氮和37℃水浴中進行3次各3分鐘左右的反覆凍融後，4℃條件下8000rpm離心5分鐘沉澱細胞碎片，再分析上清液中酶活性。提取液可在-80℃條件下保存若干星期而不會喪失活性。
(12)用微量Bradford法測定上清部分的蛋白質濃度。在測定蛋白質濃度時，加入到染色試劑中的上清液需20ul。
3、GUS的螢光測定(1)對各樣品進行測定時，預先準備200ul，2mmol/l的MUG溶液於微量離心管中，在37℃下水浴5分鐘。加入200ul細胞提取液，攪動均勻後，再進行水浴。
(2)15分鐘後，從每支待測管中取出200ul轉移到預先加有1.8ml終止緩衝液的試管中，搖動均勻。
(3)用螢光計在激發光波長為362nm，發射波長為450nm下所產生的MU濃度作定量分析。用終止緩衝液將MU貯液稀釋來配成濃度範圍在0-10umpl/l的一系列MU標準液，通過測定它們的螢光強度作出一條標準曲線。
(4)根據各稀釋樣品的螢光強度可計算出初始反應中未稀釋產物的濃度。對每一個樣品，空白對照(未用DNA做電擊轉化的樣品)值被扣除。
本實施例用菸草原生質體瞬時表達系統，通過PEG介導的轉化方法，把載體pB2、pB8、pB9和pBI121分別導入到菸草原生質體中，24小時之後，破碎細胞，離心取上清液，用MUG作為底物測GUS酶的活性。分解生成的4-MU在激發波長362nm，產生發射波長450nm的螢光，由螢光分光光度計可測得相對螢光數值，利用公式相對螢光強度×1.5×10-3umol/l÷蛋白質濃度(mg/ml)計算GUS活性。結果如圖3所示，表明rbcSc啟動子的轉錄活性是rbcSZm1的3.5倍，是35S啟動子的1.3倍；rbcSo啟動子的轉錄活性是rbcSZm1的1.6倍，是35S啟動子的0.6倍。
實施例5、rbcSc啟動子在玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、小麥愈傷組織、苜蓿植株中的活性將植物表達載體pB2、pBI121和pB9用農桿菌轉化的方法在玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、小麥愈傷組織、苜蓿植株上進行轉化，以檢測啟動子rbcSc在不同物種中的活性。
農桿菌介導的瞬時表達檢測具體步驟如下1、農桿菌感受態的製備及轉化(1)挑取LBA4404單菌落於3mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養過夜。
(2)取過夜培養菌液500ul，接種於50mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養至OD600＝0.5。
(3)5000rpm離心5分鐘。
(4)加10ml 0.15M NaCl懸浮農桿菌細胞，5000rpm離心5分鐘。
(5)1ml預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24小時內使用或分裝成200ul，液氮中速凍1分鐘，-70℃保存。
(6)取200ul感受態細胞，加入1ug構建好的質粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37℃，5分鐘。
(7)加入1mlYEB，28℃慢速培養4小時。
(8)1000rpm離心30秒，棄上清，加入0.1mlYEB培養基重新懸浮細胞，塗布於含有100ug/ml卡那和100ug/ml Sm的YEB平板上，28℃培養48小時。
2、轉化、染色及檢測挑取步驟(8)中的單菌落於卡那和Sm抗生素的YEB液體培養基中28℃振蕩培養24小時，取50ul菌液加入到3ml新鮮培養基，振蕩培養，10小時。轉化時取1ml菌液，加入9ml培養基稀釋。將植物組織材料浸入提前準備好的農桿菌菌液中5分鐘後取出，用無菌濾紙將愈傷上面的菌液吸乾，然後放在MS分化培養基(MS+2mg/lBA+0.2mg/l IAA)上，培養三天後放入GUS染色緩衝液(50mmol/l磷酸鈉(pH7.0)；1mmol/l EDTA；1mmol/l鐵氰化鉀；1mmol/l亞鐵氰化鉀；0.5mg/ml X-gluc(X-gluc溶液；10mg X-gluc溶於1ml N-N-二甲基甲醯胺中)；0.05％ Triton-100)中，37℃染色過夜，觀察並照相。結果如圖4、圖5、圖6和圖7所示，表明rbcSc啟動子在苜蓿、水稻、玉米、小麥中均具有轉錄活性。圖4、圖5、圖6和圖7中，左側部分為pB9，中間部分為pB2，右側部分為pBI121。
序列表16032101211655212DNA213人工序列220
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1.一種植物啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的植物啟動子，其特徵在於它的編碼序列是序列表中的SEQ ID №1。
3.含有權利要求1所述啟動子的細胞系。
4.含有權利要求1所述啟動子的表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於所述表達載體為植物表達載體pB2。
6.權利要求1所述啟動子在培育轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物啟動子及其應用，本發明所提供的植物啟動子rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。rbcSc啟動子可代替35S啟動子作為植物轉基因的工具啟動子，可廣泛用於培育具有較高生物安全性的單子葉和雙子葉轉基因植物。
文檔編號C12N5/10GK1603409SQ03134800
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月30日 優先權日2003年9月30日
發明者王濤, 劉禮兵, 袁媛 申請人:中國農業大學