重組仙臺病毒載體的純化方法
2023-06-17 01:34:06 3
專利名稱：重組仙臺病毒載體的純化方法
技術領域：
本發明屬生物醫藥技術領域，涉及重組病毒載體的純化方法，更具體是應用於重
組仙臺病毒純化。
背景技術：
基因治療是當今最具發展前景和發展最快的前沿生物技術之一。研究結果表明很 多疾病都是由於直接或間接原因基因自身出現異常及功能障礙導致的。隨著人類基因組的 解析，有關疾病與基因關係的信息越來越多。基因治療就是把與疾病有關的基因製成藥劑 導入患者體內，達到治療疾病的目的。這是一種尖端信息快速轉為實用化的最新醫療技術。
—般的基因治療載體，進入到細胞核內作為DNA來表達目的基因所編碼的蛋白。 在細胞核內有整合到靶細胞的染色體上，或者與染色體DNA發生基因重組的危險。有報告 表明，雖然發生頻率極低，但逆轉錄病毒載體有誘發白血病的可能。另外，已知腺相關病毒 載體在被整合的染色體附近，可引起局部的不可逆性的染色體結構變化。因此，在使用這些 載體時必須慎重考慮利弊問題。仙臺病毒載體是細胞質型RNA載體，對各種動物細胞有較 高的感染效率；它本身不進入細胞核內，在細胞質中進行基因表達，在理論上不存在改變細 胞核內染色體的危險性，與其他載體相比具有更高的安全性。從根本上解決以往載體存在 的生物安全隱患的不足之處。 在臨床前研究中，重組仙臺病毒載體在重度下肢缺血基因治療製劑、阿耳茨海默 病(早老性痴呆症)疫苗、愛滋病疫苗都表現出了極好的治療效果。由於仙臺病毒載體的 基因表達水平很高，可望獲得以往載體所不能實現的更好的治療效果。此外，該載體即使是 較少劑量也可發揮相應的治療效果，相比其他載體需要幾十分鐘以上的細胞接觸才能獲得 較滿意的基因導入效果，重組仙臺病毒載體僅在幾分鐘之內便可完成，在臨床上可以減輕
患者及醫生的負擔，是一種非常快捷實用的載體。因此仙臺病毒載體有比較廣闊的應用前
旦 豕。 重組病毒在對於所有應用之前，都要在宿主細胞中增殖之後從宿主細胞中進行純 化這一過程。 一般的方法包括細胞培養、感染宿主細胞、收穫裂解宿主細胞、濃縮粗製裂解 物、核酶消化處理、以及進一步層析純化。大多數改良的方法都集中在選用不同性質的層析 介質和超速離心。本發明是利用了仙臺病毒蛋白的特點創造性的提出了新的純化途徑，其 過程是將收集的病毒初始液與來源於動物的紅細胞在低溫下混合一定的時間，然後在低溫 條件下低速離心，收集沉澱；沉澱再用洗液洗滌，洗滌後的沉澱在37t:溫浴一定的時間，然 後在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。收集的病毒純品也可以選用相應的 層析介質做進一步的精純化。 為更好的說明本發明的內容，對仙臺病毒的結構做簡單的介紹。
仙臺病毒(Sendai virus, SeV)屬於副粘病毒科副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬病 毒，為單股負鏈RNA病毒。RNA分子量4. 76X 106D，病毒粒子多是呈圓形，直徑130 250nm。 病毒內部由直徑約18nm的螺旋狀對稱結構的核蛋白組成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射狀排列的纖突，纖突長8 15nm，寬2 4nm。 仙臺病毒的基因結構特點野生型SeV為嗜肺的單股負鏈RNA病毒，基因組 全長15384個核苷酸，編碼核蛋(皿cleoprotein， NP)、磷蛋白(phosphoprotein， P)、 基質蛋白(matrix protein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素神經氨酸酶 (hemagglutinin—neuraminidase, HN)禾口大分子蛋白(large protein, L) 6禾中結構蛋白禾口 C、 V、W等一些非結構蛋白。基因排列次序為3 '-leader-NP-P/C-M-F-HN-L-leader-5'。其中HN、 F蛋白為跨膜糖蛋白，位於 病毒表面，形成剌突，又稱為剌突蛋白(spiker protein). M蛋白排列在包膜內表面.NP 蛋白與病毒基因組RNA結合，形成螺旋狀的核衣殼，再結合P蛋白、L蛋白形成核蛋白 (ribo皿cleo-protein， RNP)複合體，構成病毒的核心結構.P/C基因區還包含一個病毒特 有的非結構蛋白C的編碼區，除非結構蛋白C外，每個基因上、下遊各有一個非編碼序列R1、 R2，對基因表達有特殊的調控功能。SeV RNA3 '端和5'端各有1個51nt和54nt的前導 (leader)序列，它們與病毒在宿主內複製及致病有關.
SeV編碼蛋白的結構與功能 HN蛋白HN蛋白為同源四聚體的II型跨膜糖蛋白，其基因在進化中高度保守，編碼 區有1728bp，可編碼575個胺基酸殘基，其中1 35aa殘基位於包膜內，36 60aa為疏水 胺基酸組成的跨膜區，61 575aa殘基位於包膜外.HN蛋白有4個潛在的N-糖基化位點，分 別位於N77、N499禾P N511 ，成熟的HN蛋白只有N77、N499和N511被糖基化。N499禾P N511糖 基化對於細胞內轉運和促進融合至關重要。254 259aa殘基組成的六肽鏈N-R-K-S-C-S, 是神經氨酸酶的唾液酸結合位點，與病毒吸附穿入有關。 目前已知HN有3種功能1)吸附宿主細胞表面受體。病毒藉助HN與細胞表面含 唾液酸的受體結合，使病毒吸附於宿主細胞表面。2)具有神經氨酸酶活性，可裂解宿主細胞 膜寡糖鏈末端唾液酸，促進子代病毒顆粒從感染的細胞表面釋放.3)與F蛋白協同作用促 進細胞融合.HN的這3種功能相對獨立，定位於HN蛋白的不同區域，如C端的444個氨基 酸殘基主要負責受體識別和神經氨酸酶活性，而與F蛋白相互作用促進細胞融合的功能與 和跨膜區比鄰的膜外區82個胺基酸殘基有密切關係。 研究表明HN膜內區可與其他病毒蛋白特異性的相互作用，在子代病毒組裝中起 重要作用.進一步比較各株SeV及I型人副流感病毒HN膜內區胺基酸序列，發現短肽 S-Y-W-S-T高度保守，暗示它有重要的生物學作用。 F蛋白病毒包膜與細胞膜融合是包膜病毒穿入宿主細胞的主要方式。SeV F蛋白 具有膜融合活性，與病毒致病性有關。 M蛋白M蛋白是非糖基化的內膜蛋白，位於病毒包膜內表面，1173個核苷酸編碼
348個胺基酸。M蛋白富含鹼性胺基酸。即使病毒包膜被去汙劑破壞的情況下，也能維持緊
湊的病毒結構。M蛋白含有5個半胱氨酸殘基，分別位於83、 106、 158、251 、295位，即使在副
粘病毒亞科這些半胱氨酸殘基也是很保守的，說明它們有重要的生物學功能。 P/C蛋白P/C基因編碼區1821-3550bp。根據目前文獻報導，由於RNA轉錄後加工
和多個0RF的重疊，P/C基因共可編碼8種蛋白C'、C、Y1、Y2、P、V、W和X蛋白。8種蛋白
中最大的是P蛋白，共568個胺基酸。P、 V和W蛋白N端317個胺基酸相同。L蛋白L基因編碼序列為8556 15242nt。編碼2228個胺基酸，分子質量單位為
4245kd左右，是SeV編碼的最大蛋白。只有L蛋白與P蛋白形成複合物，才具有RNA多聚酶 的活性，在病毒RNA複製、轉錄、mRNA5 '帽結構甲基化等發揮作用。 NP蛋白NP基因編碼區1575bp，編碼524個胺基酸。NP蛋白自身相互作用，同時包 裹病毒RNA形成左手螺旋的核衣殼。 基於以上SeV編碼蛋白的功能，特別是仙臺病毒外膜表面存在的HN蛋白可與紅細 胞表面唾液酸殘基結合，同時兼具唾液酸酶活性，可裂解細胞表面糖蛋白上的唾液酸殘基， 但在低溫下HN主要表現出的是唾液酸的結合活性，仙臺病毒可以與紅細胞結合；在適當的 升高溫度的條件下表現的是神經氨酸酶活性，仙臺病毒可以與紅細胞分開。利用該特點我 們創造性的提出 一種純化仙臺病毒的方法。
實施例l雞紅細胞液的製備 1).採雞血用注射器吸取阿氏液約lml，取3日齡 10日齡SPF雞(最少兩隻)， 從胸骨尖下方約1. 3cm處將注射器針頭剌入心臟。吸取心血約2ml 4ml 。與阿氏液輕輕 混合，放入裝有10ml阿氏液的離心管中， 2)洗滌雞紅胞將離心管中的血液經1500r/min 1800r/min離心8min，棄上清 液，沉澱 物加入阿氏液，輕輕混合後，再經1500r/min 1800r/min離心8min，用吸管移去 上清液及沉澱紅細胞上層的白細胞薄膜，再重複以上過程後，加入阿氏液20ml，輕輕混合成 紅細胞懸液，4度保存5天備用。 3)雞紅細胞懸液取阿氏液保存不超過5天的紅細胞液，在錐形刻度離心管中離 心1500r/Min-1500r/min離心8min，棄去上清液，加人PBS，用吸管反覆吹吸使PBS與紅細 胞均勻混合，製成紅細胞液。
實施例2重組病毒的純化 1)病毒初始液與實施例1製備的紅細胞液在低溫(優先4°C 8°C )下混合一定 的時間，優先選擇0. 5小時 2小時； 2)然後在低溫(優先4°C 8°C )條件下低速(優先選擇1000rpm/m 4000rpm/ m)離心，收集沉澱； 3)沉澱再用洗液(PBS，含一定濃度的BSA)洗滌；
4)洗滌後的沉澱在32°C 38t:溫浴5分鐘 30分鐘； 5)然後在室溫條件下低速(優先選擇1000rpm/m 3000rpm/m)離心，收集上清液
即為病毒純品。純化的病毒電鏡照片，見附圖1。 實施例3.重組病毒的純度鑑定(SDS-PAGE電泳) 方法參考分子克隆3，採用10% SDS-PAGE法進行，加樣量為4. 0 X 108CIU， SDS-PAGE電泳，凝膠用考馬斯亮藍染色，脫色，照相，與仙臺病毒對照品梯度SDS-PAGE圖譜 比較，判斷是否含仙臺病毒的7條特徵帶。見附圖2。
實施例4 SDS-PAGE電泳純度檢查 採用10%梯度SDS-PAGE法進行，加樣量為4. OX 108CIU，電泳，凝膠用考馬斯亮藍 染色，脫色後用掃描儀掃描，用圖片分析軟體alpha-Image對電泳條帶進行分析，計算仙臺 病毒特徵帶蛋白總量佔總蛋白量的百分比。參考附圖3
實施例5 病毒滴度測定
1.將病毒從-80 °C冰箱中取出，立即放於37 °C水浴鍋中搖5秒鐘，待融化後取出，
放於4t:冰箱中待用。 2.取U型底96孔板放在生物安全櫃中，向各孔加入PBS，50u1/孔，共16個孔。
3.取病毒50ul加在第一孔，用加樣器反覆混勻10次，取50ul加到下一孔中，如此 依次稀釋到第15 L在第15孔中取出50ul棄掉；第16孔設為陰性對照，只加50ul PBS。
4.向各孔中加入新鮮配製的雞紅細胞，8Xl(fcells/ml，50ul/孔。順序為先加陰 性孔(第16孔)，再依從稀到濃的順序加入雞紅細胞，蓋上蓋子，輕輕拍打板子側面，使之混 勻。 5. 4"放置1小時，觀察結果，照相，記錄。 6結果判定血球完全凝集者判為陽性，凝集終點為最後一個完全凝集的孔(示例
中第11個孔)，病毒滴度按以下公式計算 病毒滴度=凝集終點孔的病毒稀釋度 病毒粒子密度=8X107XA A為病毒滴度 示例中的病毒樣品滴度為1 : 2， 048 病毒粒子密度為8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。 實施例6 —種重組仙臺病毒純化系統，或者一種重組仙臺病毒純化試劑盒，其組 成包括來源於動物的紅細胞、含BSA的細胞洗液。
附圖1本發明方法純化的病毒電鏡照片。 附圖2本發明方法純化的病毒SDS-PAGE電泳圖譜，判斷是否含仙臺病毒的7條特 徵帶。左邊為低分子量Marker,中間為本發明方法純化的樣品，右邊為次高分子量Marker。
1 :L，2 :P，3 :HN，4 :NP，5 :P'，6 :&，7 :M 附圖3本發明方法純化的病毒SDS-PAGE電泳圖譜純度鑑定，對7條特徵帶的含量 用分析軟體alpha-Imag做出分析。L， P， HN， NP， P， Fn M比例依次為4. 7 % ， 6. 6 % ， 22. 0 % ， 34. 0%，6. 3%，4. 4%，22. 1%。 附圖4 :血球完全凝集者判為陽性，凝集終點為最後一個完全凝集的孔(示例中第
11個孔)，病毒滴度按以下公式計算 病毒滴度=凝集終點孔的病毒稀釋度 病毒粒子密度=8X107XA A為病毒滴度 示例中的病毒樣品滴度為1 : 2， 048 病毒粒子密度為8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。
權利要求
一種重組仙臺病毒的純化方法，其特徵是過程包括以下步驟(1)收集來源於動物的紅細胞；(2)病毒初始液與紅細胞在低溫下混合一定的時間；(3)然後在低溫條件下低速離心，收集沉澱；(4)沉澱再用洗液洗滌；(5)洗滌後的沉澱在37℃溫浴一定的時間；(6)然後在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。
2. 根據權利要求l，所述的動物紅細胞優先來源於雞紅細胞。
3 根據權利要求l，所述的病毒初始液與紅細胞混合的條件為2°C 8°C。
4. 根據權利要求l，所述的病毒初始液與紅細胞混合的時間為0. 5 2小時。
5. 根據權利要求l，所述的病毒初始液與紅細胞低溫低速離心條件為2000rpm/m，時間 為10 30分鐘。
6. 根據權利要求l，所述上清液洗液優先為含BSA的PBS。
7. 根據權利要求l，所述病毒純品可以用層析法進一步純化。
8. —種重組仙臺病毒純化系統，其組成包括來源於動物的紅細胞、洗液。
全文摘要
本發明提供了一種重組仙臺病毒的純化方法，其過程是將收集的病毒初始液與來源於動物的紅細胞在低溫下混合一定的時間，然後在低溫條件下低速離心，收集沉澱；沉澱再用洗液洗滌，洗滌後的沉澱在37℃溫浴一定的時間，然後在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。
文檔編號C12N7/02GK101735990SQ200810225790
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月13日 優先權日2008年11月13日
發明者許允立 申請人:本元正陽基因技術有限公司