共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體、重組腺病毒及其應用的製作方法
2023-06-16 23:44:31 2
專利名稱：共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體、重組腺病毒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種重組腺病毒，特別是涉及IRES介導的 共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體、重組腺病毒及其應用。
背景技術：
移植是末期組織器官功能衰竭的根治性治療手段。受者對移植物的排斥是移植成 功的主要障礙。近年來，免疫抑制劑的應用推動了器官移植的發展，但是，長期應用 免疫抑制劑所引起的多種毒副作用，不僅嚴重影響了患者的長期生存質量，也極大地 限制了器官移植的開展。誘導供者特異性免疫耐受為最終擺脫非特異免疫抑制劑的毒 副作用提高受者生存質量帶來了希望。隨著基因轉移技術的迅速發展及基因治療理論 和實踐的不斷完善，基因治療逐漸成為在分子水平研究移植免疫耐受的重要手段。
T細胞是移植排斥的主要效應細胞，防止同種異型反應T細胞活化是防止移植排 斥發生的主要途徑。T細胞活化增殖必須同時存在MHC/抗原肽-TCR和協同刺激信號， 阻斷協同刺激信號將導致T細胞無能、凋亡或克隆丟失而引發免疫耐受。B7/CD28途 徑在協同刺激信號通路中的作用最為肯定，幹預該途徑誘導特異性耐受已成為移植免 疫調節的基本思路。作為T細胞表面B7分子的另一個配體，細胞毒性T淋巴細胞相 關抗原4 (CTLA-4)與B7分子的親和力較CD28高數十倍而優先結合B7分子並傳遞負 調控信號，從而阻斷T細胞活化。CTLA4-Ig是CTLA-4胞外段與IgG Fc段的融合蛋白， 與細胞表面的B7分子結合起到封閉作用，通過阻斷B7/CD28協同刺激通路而達到抑 制T細胞活化的目的。
內部核糖體進入位點(internal ibosome entry site, IRES)是小RNA病毒類中5， 端非翻譯區中的一段序列，其二級結構和三級結構構成了蛋白質翻譯過程中核糖體的 登陸平臺，40s核糖體亞單位可以不依賴5'端帽子結構而在內部結合到mRNA上，從 而直接對其後的結構基因進行翻譯。IRES的這一特點可應用於構建同時表達兩個基因 的雙順反子真核表達載體。
腺病毒(Adenovirus, Ad)載體系統具有如下特點a、病毒基因組不整合到宿 主的基因組中，也就不會影響宿主結構基因的正常表達；b、可插入較大的外源基因
片段(8.5kb) ; C、可感染分裂細胞也可感染非分裂細胞，感染譜比較廣；d、瞬時
表達而不是終身表達，另外載體上帶有GFP (綠色螢光蛋白)報告基因，可以通過綠 色螢光蛋白的示蹤很直觀地觀察到外源基因的表達。由於腺病毒載體在哺乳動物及其 多種細胞上進行基因轉移和蛋白表達的高效性，使其在基因治療的研究中受到人們的 青睞，成為當今使用最多的病毒載體之一。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種IRES介導的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病 毒載體。
本發明所提供的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體，是先將CTLA4Ig基 因、IRES基因和CTLA4基因順次插入pAdTrack-CMV穿梭載體中巨細胞病毒(CMV)啟動 子的下遊，得到攜帶CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重組穿梭載體，再將該 重組穿梭載體與病毒骨架載體pAdeasy-1共轉化細菌後得到的攜帶有CTLA4Ig和 CTLA4基因的腺病毒質粒載體。
該腺病毒質粒載體為胞外分泌性表達CTLA4Ig，所述CTLA4Ig基因的5'端還連 接有抑瘤素M信號肽編碼序列。
所述攜帶CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重組穿梭載體與病毒骨架載體 pAdeasy-l共轉化的細菌為A co"' BJ5183，隨後，在該細菌內進行同源重組。
具體來講，所述共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體可簡稱為 pAdeasy-CIC。
本發明的另一個目的是提供一種共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒。 本發明所提供的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒，將上述共表達CTLA4Ig
和CTLA4的重組腺病毒載體轉染包裝細胞一人胚腎293細胞(HEK 293)得到的。
所述共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體可通過脂質體介導法轉染人胚腎
293細胞。
所述共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒感染的哺乳動物細胞也屬於本發明的 保護範圍。
所述哺乳動物細胞可包括幹細胞(如骨髓間充質幹細胞、脂肪幹細胞等)、組織 細胞、樹突細胞和骨髓單個核細胞等。
本發明公開了一種由IRES介導的CTLA4Ig (分泌型)及CTLA4 (膜結合型)雙基 因共表達的重組腺病毒載體及共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒。所述重組腺病 毒是將本發明攜帶有CTLA4Ig及CTLA4基因的雙順反子腺病毒質粒載體轉染包裝細胞 得到的。該重組腺病毒可高效感染哺乳動物細胞(如幹細胞或組織細胞等)，並在IRES 的介導下同時表達分泌型CTLA4-Ig和膜結合型的CTLA4。實驗證明，受本發明重組腺 病毒體外感染的大鼠骨髓間充質幹細胞，可分別在基因水平和蛋白水平檢測到 CTLA4Ig及CTLA4的共表達，同時，利用CTLA4的免疫抑制作用，可以兩種形式同時 阻斷抗原特異性T細胞活化所需的B7/CD28協同刺激信號，使T細胞活化受阻，從而 使得被感染的細胞具有抑制免疫反應的作用。若將本發明的重組腺病毒應用於器官移 植中(如製成免疫抑制劑，包括實驗製劑和藥物)，可抑制移植排斥反應的發生，誘 導供者特異性免疫耐受，從而減少或最終擺脫非特異免疫抑制劑的應用，為提高受者 生存質量帶來了有利保障。本發明將在醫學領域，尤其是器官移植領域中發揮重要作 用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1A為通過RT-PCR從活化的大鼠脾細胞中獲得CTLA4全長、CTLA4胞外段及
IgGFc段基因片段連接入pT-Easy載體的酶切鑑定結果
圖1B為構建攜帶CTLA4Ig融合基因質粒pIRES2-CTLA4Ig酶切鑑定結果
圖1C為構建重組腺病毒穿梭質粒pAdtrack-CIC的酶切鑑定結果
圖1D為構建重組腺病毒質粒pAdeasy-CIC的酶切鑑定結果
圖2為重組腺病毒質粒pAdeasy-CIC在293A細胞中包裝的顯微鏡觀察結果
圖3A為經純化及傳代培養的大鼠骨髓間充質幹細胞的細胞形態
圖3B為重組腺病毒Ad-CIC感染大鼠骨髓間充質幹細胞感染效率的流式細胞術鑑
定結果
圖3C為重組腺病毒Ad-CIC感染大鼠BM麗SCs後GFP表達的螢光顯微鏡觀察結果
圖3D為轉基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表達的RT-PCR鑑定結果
圖3E為轉基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表達的Western Blotting鑑定結果
圖4為單向混合淋巴細胞反應檢測轉基因B腦MSCs免疫抑制功能的鑑定結果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, DavidW.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。
所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(w/v)百分比濃度或體積/體積(v/v)
百分比濃度。
所用引物、DNA序列合成及DNA序列測定均由上海英駿公司完成。 實施例中描述到的的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以 達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生
物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照 實施例中的提示替換使用；在產業實施中，來源於大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物的 各種細胞均為離體的，並包括從細胞庫中取得、或商業購買獲得，還包括按照已有文 獻的介紹製備獲得，以及經可以商業獲取的多種幹細胞用已知方法誘導而來的。
實施例1、構建分泌性表達CTLA4Ig和膜結合型表達CTLA4的腺病毒質粒載體 pAdeasy—CIC
一、大鼠CTLA4全長、CTLA4胞外段和IgGFc段基因片段的獲得 取雄性Wistar大鼠(購自軍事醫學科學院動物中心)，拉頸處死，在無菌條件 下摘取脾臟，用眼科彎鑷擠壓脾臟組織，過400目篩網收集脾細胞懸液於50mL離心 管中，離心，棄上清，洗滌細胞沉澱，用含10^胎牛血清的RPMI1640 (Sigma公司產 品)培養液(預先加入青-鏈黴素100U/mL)重懸細胞。將分離得到的脾細胞按2X107cm 2的濃度接種於50mL塑料培養瓶內，向其中加入刀豆蛋白A(ConA，購自Sigma公司) 至終濃度為5ug/mL，置於37°C、 5% C02和飽和溼度的孵箱中進行培養，培養72h 後，離心，洗滌細胞。將細胞收集於1.5mL EP管中，加入lmL TRizol試劑(購自 Invitrogen公司)並參照試劑盒說明書提取ConA刺激增值細胞的總RNA，然後以提 取的總RNA為模板，反轉錄其中的mRNA為cDNA， 20y 1反轉錄體系及反應條件為5 X認V反轉錄緩衝液4p1， dNTPs(10mM) 2ul， RNAse抑制劑0.5ul， olig dT ly l，AMV反轉錄酶l，mRNAO. 2y l，DEPC處理水10. 3 y 1， 42。C反應lh。根據GeneBank 公布的大鼠CTLA4 (GenBank號:NP—113862)及IgGFc段(GenBank號:X07189)序
列分別設計併合成引物，引物序列如下
擴增CTLA4全長的引物 pl (上遊引物)5， -CATCCATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3， p2(下遊引物)5， -TAAGCATGCCTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3，； 擴增IgGFc段的引物
p3 (上遊引物)5， -ACTCCGCGGATTGAGCCCAGAAGACCCAA-3，
p4 (下遊引物)5， -ACTGGATCCGTCGACCTATTTACCAGGAGAGCGGGACA-3，；
擴增CTLA4胞外段的引物 p5 (上遊引物)5， -GTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3， p6 (下遊引物)5， -ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3'。
以合成的cDNA為模板，分別在上述三對引物的引導下進行PCR擴增，20ulPCR 反應體系為IOXPCR緩衝液2p1， dNTPs(2.5mM) 1.6nl，上、下遊引物各0.5iU， 模板4ul，rTaq酶0. 2ul，重蒸水11. 2 u 1。反應條件均為先94°C 40s， 51°C 40s， 72°C 40s，共30個循環；最後一個循環結束後延伸7min。 PCR反應結束後，對PCR 擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果擴增獲得了 CTLA4全長、CTLA4胞外 段和IgGFc段的特異性片段，大小分別為692bp、 378bp、 716bp。切膠回收PCR擴增 產物，將三個回收片段分別連入pGEM-T-Easy載體(購自Promega公司)中，然後將 連接產物分別轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，經過100 u g/mL氨苄青黴素抗性篩選 及"藍白篩選"，挑取陽性克隆，搖菌，提質粒，用對攜帶有不同目的片段 的重組質粒進行單酶切鑑定，結果如圖1A所示(泳道1: DL2000 marker,泳道2:CTLA4 全長，泳道3: IgGFc段，泳道4:CTLA4胞外段)，攜帶有CTLA4全長的重組質粒(命 名為pT-Easy-CTLA4)可獲得692bp的酶切片段，攜帶有CTLA4胞外段的重組質粒(命 名為pT-Easy-CTLA4胞外段)可獲得378bp的酶切片段，攜帶有IgGFc段的重組質粒 (命名為pT-Easy-IgGFc)可獲得716bp的酶切片段，與預期結果一致。再對三種質 粒進行序列測定，結果與GeneBank公布的大鼠CTLA4全長、CTLA4胞外區和IgGFc段 的基因序列完全一致，表明獲得了序列正確的大鼠CTLA4全長、CTLA4胞外段和IgGFc 段基因片段。
二、 5'端連接有抑瘤素M信號肽編碼序列的CTLA4Ig融合基因的獲得 根據GeneBank公布的去除信號肽的大鼠CTLA4胞外區編碼序列及抑瘤素M信號 肽編碼序列(GenBank號:NM—020530)設計引物，引物序列如下 p6: 5， -ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3，； p8: 5， -CTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3，； p9: 5， -CAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGC-3，； pl0: 5' -TCAGAATTCAGATCTATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTC-3，。 經過三次PCR擴增，引物分別為p8+p6， p9+p6和pl0+p6，第一次PCR反應以步驟 一獲得的CTLA4胞外區片段為模板，以後每一次PCR模板為前一次PCR擴增產物，50 iil PCR反應體系為10XPyrobest Buffer緩衝液5iil， dNTPs(2. 5mM) 4ul，上、 下遊引物各1.5yl，模板6ul，屍jroZ;eW DNA聚合酶0.25ul，重蒸水31.75"1。 PCR反應條件均為先94°C 40s， 53°C 40s， 72°C 40s，共30個循環；最後一個循 環結束後延伸7min。反應結束後，對最終PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 可見453bp的特異性條帶出現，與預期結果一致。切膠回收該目的片段，並在末端加 A尾，10y 1反應體系及反應條件為IOXPCR緩衝液lwl，凝膠回收產物7u 1， dATP (2raM) lul， rr邵酶lnl，在72。C條件下反應30分鐘。然後，將加尾產物連接於 pGEM-T-Easy載體中，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，經過100ug/mL 氨苄青黴素抗性篩選及"藍白篩選"，挑取陽性克隆，搖菌，提質粒，進行序列測定，
測定結果證實在CTLA4胞外段上遊(5'端)成功引入抑瘤素M信號肽序列，將該融 合基因命名為M信號肽-CTLA4胞外段，將攜帶有該融合基因的克隆載體命名為pT-M 信號肽-CTLA4胞外段。
取質粒pT-M信號肽-CTLA4胞外段及pIRES2-EGFP (購自美國BD公司，先用fcof I酶切，凝膠電泳回收兩種質粒的Acot I酶切產物，再用5"3c II酶切該酶切產物， 20ii 1酶切體系及反應條件分別為(1)10XH Buffer2u 1， fco/ I liil，質粒5ul， 重蒸水12yl， 37。C酶切2h; (2)10XT Buffer2 u 1， 0. l%BSA2ul，II lul， 質粒5ixl，重蒸水10ul， 37"酶切2h。再凝膠電泳回收兩種質粒的II酶切產 物。應用快速連接試劑盒(購自TaKaRa公司)對電泳回收的酶切片段進行連接反應， 即將M信號肽-CTLA4胞外段片段連接入載體pIRES2-EGFP中，將該重組載體命名為 pIRES2-CTLA4胞外段，12 u 1連接體系及連接條件為質粒酶切片段3ul，插入片段 3wl， Solution I 6 ii 1，混勻後在16T:水浴中反應30分鐘。反應結束後，將連接產 物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，經過25 u g/mL卡那黴素抗性篩選，挑取陽性克隆， 搖菌，提質粒，用iboWI及II進行雙酶切鑑定，結果經酶切獲得了 453bp和5. 3kb 的DNA片段，與預期結果相符。先後用I和II分別酶切上述重組質粒 pIRES2-CTLA4胞外段及pT-Easy-IgGFc質粒，20 u 1酶切體系及反應條件分別為(1) 10XK Buffer 2 u 1， 5a/z^Ilul，質粒10ul，重蒸水7ul，混勻後，37。C酶切2h; (2)10XT Buffer 2 ii 1， 0. l%BSA2yl， Ssc IIlul，質粒10iU，重蒸水5ul， 混勻後，37"C酶切2h。反應結束後，對兩種質粒的雙酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電 泳，回收5. 3kb的pIRES2-CTLA4胞外段酶切片段及716bp的pT-Easy-IgGFc酶切片 段，用快速連接試劑盒對兩酶切片段進行連接反應，即將IgGFc片段插入質粒 pIRES2-CTLA4胞外段的下遊，得到含有CTLA4Ig融合基因(5'端連接有抑瘤素M信 號肽序列)的重組載體，命名為pIRES2-CTLA4Ig，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感 受態細胞，經過25wg/mL卡那黴素抗性篩選，挑取陽性克隆，搖菌，提質粒，用fco/ I和I進行雙酶切鑑定，鑑定結果如圖1B所示(泳道1為DL2000 marker,泳 道2、 3、 4為pIRES2-CTLA4Ig酶切片段)，經酶切得到了大小約1170bp的特異性條 帶，與預期結果相符。將該重組質粒-2(TC保存備用。
三、構建腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4(pAdTrack-CIC) 用I和《§7 II分別雙酶切腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV (購自美國 stratagene公司)和質粒pIRES2-CTLA4Ig， 20 n 1酶切體系及反應條件為10XH Buffer 2nl，質粒10yl，I lul，II lul，重蒸水6iU，混勻，37。C水 浴反應2h。反應結束後，對兩種雙酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別回收 線性化的pAdTrack-CMV穿梭質粒和CTLA4Ig融合基因片段(5，端連接有抑瘤素M信 號肽序列)，應用快速連接試劑盒將CTLA4Ig融合基因片段連入線性化的穿梭質粒 pAdTrack-CMV中，連接體系及反應條件為pAdTrack-CMV質粒1， CTLA4Ig片段6 ul， Solution I 10nl，在16。C水浴中反應30分鐘。反應結束後，取2 u 1連接產 物常規轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經過25ug /mL卡那黴素抗性篩選，挑取陽 性克隆，搖菌，提質粒，用I和II進行雙酶切鑑定，結果經酶切得到了大 小約1170bp的特異性條帶，與預期結果相符。將該攜帶有CTLA4Ig融合基因片段(5' 端連接有抑瘤素M信號肽序列)的重組質粒命名為pAdTrack-CTLA4Ig。 -2CTC保存質 粒備用。
挑取前述"藍白篩選"平板上的藍色克隆，此為自身環化的pGEM-T-Easy載體， 搖菌，提取質粒。用5o力I和I雙酶切步驟一獲得的CTLA4全長基因片段，20 u L酶切體系及反應條件為10XK Buffer 2 y 1，質粒10ul， 0. 1 %BSA 2 u 1， &力I lnl， 7Kco I lul，重蒸水5wl，混勻，37"水浴反應2h。然後，應用快速連接試 劑盒通過這兩個位點將CTLA4全長基因片段連接入自身環化的pGEM-T-Easy載體中， 得到攜帶CTLA4全長基因片段的正向重組質粒，命名為pT-CTLA4。再用^co/ I和
I雙酶切pT-CTLA4和pIRES2-EGFP，酶切體系同上。酶切後，對兩種酶切產物進 行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收585bp的IRES2片段與692bp的PT-CTLA4雙酶切 產物，再將兩者連接，10ul連接體系及連接條件為pT-CTLA4雙酶切產物lyl， IRES2 3ul， T4DNA連接酶lul， 2X連接buffer 5 n 1，混勻後，4。C連接過夜(12-24 小時)。反應結束後，將連接產物常規轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經過100iig /mL氨苄青黴素素抗性篩選，挑取陽性克隆，搖菌，提質粒，用fa^I和AfcoI進行 雙酶切鑑定，結果經酶切得到了大小約1276bp的特異性條帶，與預期結果相符。將 該攜帶有IRES2基因和CTLA4全長基因片段(命名為IRES2-CTLA4)的重組質粒命名 為pT-IRES2-CTLA4。 -20。C保存質粒備用。
用I和J力o I分別對重組質粒pT-IRES2-CTLA4和pAdTrack-CTLA4Ig進行雙 酶切，20ti 1酶切體系及反應條件為10XH Buffer 2 u 1，質粒10pl， 5^〗11ul， J力o I lul，重蒸水6ul，混勻，在37。C水浴中反應2h。反應結束後，對兩種雙酶 切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別回收1.0kb的線性化重組穿梭質粒 pAdTrack-CTLA4Ig和1276bp的IRES2-CTLA4片段，然後以3:1的摩爾比將 IRES2-CTLA4片段連接入線性化的質粒pAdTrack-CTLA4Ig中，10 y 1連接體系及連接 條件為pAdTrack-CTLA4Ig lul， IRES2-CTLA4片段3iU， T4 DNA連接酶lul， 2 X連接buffer 5 ul，混勻後，4'C連接過夜。反應結束後，將連接產物常規轉化大腸 桿菌DH5a感受態細胞，經過25yg /mL卡那黴素抗性篩選，挑取陽性克隆，接種於 5mLLB液體培養基(含25ug/mL卡那黴素)中在37'C下搖菌過夜，提質粒，用JMt 和《 7 II進行雙酶切鑑定，結果如圖1C所示(泳道1為DL15000 DNA marker,泳道 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8為重組質粒酶切片段)，經酶切得到了大小約2483bp的特異性 條帶，與預期結果相符。將該攜帶有目的基因片段的腺病毒穿梭質粒命名為 pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4 (簡稱pAdTrack-CIC) 。 -2(TC保存質粒備用。
四、細菌內同源重組獲得腺病毒質粒pAdeasy-CIC
用冰WB液(10%超純甘油+ 90%無菌水)製備大腸桿菌BJ5183感受態細菌，40 ul/EP管分裝，-7(TC保存備用。用限制性內切酶屍歷el (購自Biolab公司)切重組 穿梭質粒pAdTrack-CIC，使其線性化，反應體系及反應條件為穿梭質粒1 u g， 1 %BSA 0. 2yl， 10XNEB Buffer 4 2yl，lyl，添加雙蒸水至20iil，在37°C 下孵育2h。反應結束後，用70%乙醇沉澱線性化質粒，室溫乾燥15min後，溶於5 u 1 ddH20中。再將線性化的穿梭質粒pAdTrack-CIC與100ng超螺旋腺病毒骨架質粒 pAdEasy-1 (購自美國stratagene公司)用電穿孔法共轉化至40 u 1大腸桿菌BJ5183 感受態細胞中進行同源重組，電轉化條件為2500V， 200Q， 25uF。然後，將菌液 從電轉杯中移入EP管中，添加900 y 1 LB液體培養基，在37。C下溫和振搖(150 r/min) 培養45min。分別取100ul、 200yl、 300 u 1菌液塗布於含25 y g/mL卡那黴素抗性 的LB平板上，在該受體菌中pAdTrack-CIC與pAdEasy-1的同源序列之間同源重組， 重組後的質粒由原來的pAdEasy-1氨苄青黴素抗性變為卡那黴素抗性，因此只有重組 體或pAdtrack-CMV才具有卡那黴素抗性。將抗性平板置於37。C下孵育16-20h。選取 在卡那黴素抗性平板上長出的8個小克隆，分別接種於5mL含25 u g/mL卡那黴素的 LB培養液中，在37'C下搖菌過夜。培養結束後，提取質粒，通過0.7%瓊脂糖凝膠電 泳進行初步鑑定，結果重組質粒均大於40kb，與預期結果相符。根據電泳結果，選取 重組質粒，用限制性內切酶屍scl (購自Biolab公司)進行單酶切，酶切反應體系及 反應條件為重組質粒lug， l%BSA0.2ul， 10XNEB Buffer 1 2ul，屍acl lul， 添加雙蒸水至20ul，在37'C下孵育2h。反應結束後，對酶切產物進行0.7%瓊脂糖 凝膠電泳鑑定，結果如1D所示(泳道1為DL15000 DNA marker,泳道2、 3、 4、 5為 酶切片段)，經酶切可以產生4.5kb小片段及38.6kb的大片段，檢測結果證明成功 構建了攜帶有CTLA4Ig融合基因(5'端連接有抑瘤素M信號肽序列)、IRES2基因和 CTLA4全長基因片段(命名為CTLA4Ig-IRES2-CTLA4)的重組腺病毒質粒，命名為 pAdeasy-CIC。將經鑑定的陽性重組子二次轉化至大腸桿菌DH 5 ct感受態細胞，提取 重組腺病毒質粒pAdeasy-CIC，用屍sc I酶切5 y g重組腺病毒質粒使其線性化，酶切
條件為在37。C下孵育2h。向其中加入等體積酚/氯仿，混勻，4°C、 12000rpm離心 2min。將上清轉移至另一 EP管中，加2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，室溫放置2min， 然後4。C， 12000rpm離心5min。去除上清，再向沉澱中加入70%乙醇，混勻，4°C、 12000mm離心5min。去除上清，室溫乾燥沉澱15rain。最後，向沉澱中加入50ul無 菌TE緩衝液溶解質粒，貯存於-20C備用。
實施例2、脂質體介導重組腺病毒質粒pAdeasy-CIC轉染人胚腎293A細胞進行病毒包裝及擴增與滴度測定
一、 脂質體介導重組腺病毒質粒pAdeasy-CIC轉染人胚腎293A細胞進行病毒包裝
在準備轉染前l天，用60mm平皿中接種7.5X105人胚腎293A細胞(購自南京凱 基生物有限公司))，置於37。C、 C02培養箱中培養。轉染前3-4h進行換液，以保證 細胞呈指數生長(加5mL培養基)；準備轉染用實施例1獲得的線性化質粒pAdeasy-CIC 和脂質體Lipof ectamine 2000 (購自Invitrogen公司)(1)用500 " 1無血清DMEM 培養液(購自Sigma公司)稀釋15-20 u g線性化pAdeasy-CIC質粒DNA; (2)用500 u 1 無血清DMEM稀釋20 u 1脂質體Lipof ectamine 2000，輕輕混勻，不超過5min; (3) 將(1)和(2)混勻(輕彈)作用20min (不超過30min)。將線性化pAdeasy-CIC 質粒麗A與脂質體混合物加入培養皿中，輕輕混勻後，置於37、 5%〔02培養箱中孵 育10-12h。棄掉培養基，洗1-2次，改用含5X胎牛血清的DMEM培養基5mL，在相同 條件下繼續培養48h後，換新培養基匿EM (含5%胎牛血清)，用螢光顯微鏡觀察重 組腺病毒(命名為Ad-CIC)的產生，腺病毒的產生可通過其表達的GFP進行監測。在 脂質體介導轉染7-10天後，可以清楚地看到細胞病變效應(cytopathic effect, CPE) 的發生，即細胞開始聚集並且從平皿上脫落，當所有細胞都出現該現象就認為完全發 生了 CPE。完全的CPE發生在轉染後10-14天出現，結果如圖2所示(A為光鏡下結 果，B為螢光顯微鏡下結果)。在完全CPE後收集細胞，於-70C和37。C之間反覆凍 融3-4次，然後4。C、 5000rpm離心10min，去除細胞碎片，將包裝好的腺病毒毒液進 行分裝，100ul/管，凍存於-70C備用。
二、 重組腺病毒的擴增
將293A細胞接種於60隱平皿中，單層培養36h達90%融合時(約5-10X 107 平皿)，吸去單層細胞培養基，小心加入50wl步驟一獲得的重組腺病毒Ad-CIC毒 液，並添加無血清DMEM培養液，使之剛好覆蓋到有細胞的平皿。小心晃勻，在37。C、 5XC02培養箱中培養20min後，再將培養液晃勻；培養2h後，小心加入5mL新配製的含5X胎牛血清的DMEM培養基；培養3-4天，用螢光顯微鏡觀察GFP表達情況及細胞 的CPE現象。待細胞完全CPE後，收集細胞懸液，反覆凍融3次，將重組腺病毒Ad-CIC 從胞體上釋放出來，4°C、 5000rpm低速離心10min，去除細胞碎片。為得到滴度更高 的病毒，如此反覆"感染-收集-凍融"3次。將最終獲得的腺病毒毒液分裝後-7(TC凍 存。
三、重組腺病毒Ad-CIC的滴度測定(TCID50法)
收集293A細胞，用含2X胎牛血清的高糖DMEM培養液稀釋細胞，使其濃度為1 X10VraL。取兩個96孔板，每孔分別加入100iil細胞懸液(1X10V孔)，置37。C、 5% c02培養箱中培養24h。取Ad-CIC毒液100ul稀釋於990yl的培養液(2X胎牛 血清的高糖DMEM)中(102倍稀釋)，混勻後，取200iil稀釋於1.8mL培養液中(10:i 倍稀釋)，如此進行系列稀釋，直至1(T倍稀釋。向96孔板每排前10個孔加入100 u 1 稀釋好的病毒液，A排-G排孔的病毒稀釋度依次為103， 104， 105-10"倍。每排孔的病 毒稀釋倍數相同。向各排孔加毒液時，要從高稀釋倍數開始，餘孔加100ul培養液 作陰性對照。將2個96孔板置37。C、 5%〔02培養箱中培養10天。IO天后，在顯微鏡 下計數每排發生cpe孔數的比例，帶入公式t二i。' )TCID50/mL (T滴度，D=Log 稀釋倍數，S二陽性比例的總和)，將TCID50/mL轉化為PFU/mL的公式為TCID50/mL 二lX10"PFU/niL。最後測得收穫的重組腺病毒Ad-CIC的滴度為6. lX107PFU/mL。
實施例3、檢測重組腺病毒Ad-CIC體外轉染目的細胞的轉染效率、表達情況 以大鼠骨髓間充質幹細胞(BMDMSCs)為例，檢測本發明重組腺病毒Ad-CIC體外 感染目的細胞(哺乳動物細胞)的感染效率、目的基因的表達鑑定，具體檢測方法如
下
一、大鼠骨髓間充質幹細胞(BMDMSCs)的分離
取雄性LEWIS大鼠(購自北京維通利華實驗動物中心)，拉頸處死後浸入75%酒 精10分鐘。用無菌剪刀等手術器械分離大鼠股骨，用注射器吸取低糖DMEM培養液(購 自Sigma公司)反覆衝洗骨髓腔至顏色發白(約3-4次)。用400目篩網過濾衝洗液， 離心，棄上清，收集細胞。將骨髓細胞沉澱用PBS重懸，然後將其輕輕疊加到密度為 1.083g/mL的大鼠淋巴細胞分離液(購自TBD公司)上，1800rpra離心30分鐘(室溫 下)，小心吸取界面間的乳白色單個核細胞層，加入含10X胎牛血清的DMEM培養液 (預先加入青-鏈黴素100U/mL)中充分混勻，離心，棄上清，洗滌細胞沉澱。將分離 的細胞按2 X 107cm2的濃度接種於裝有低糖謹EM完全培養液的50mL塑料培養瓶中， 置於37。C、 5% C02和飽和溼度的孵箱中培養48h後更換新鮮培養液，棄掉未貼壁細
胞，以後每隔2-3天換液一次。待細胞長到80%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化
細胞進行傳代培養，方法為用細巴斯德吸管將消化細胞吹打成單細胞懸液後，以1 X105/mL的濃度接種於新的低糖DMEM培養液中，每隔2-3天換液一次，細胞傳代， 細胞形態如圖3A所示，表明得到了經純化的BMDMSCs，備用。
二、重組腺病毒Ad-CIC體外感染BMDMSCs及感染效率的流式細胞術檢測
1、 M0I值(Multiplicity of Infection)測定
向六孔板的各孔中分別種入2X10S個293A細胞，常規培養24h後，分別用0、 2、 5、 10、 25、 50 ul Ad-CIC重組腺病毒毒液感染細胞，繼續培養72h。在顯微鏡下觀 察，發現加入50til病毒液的孔發生完全CPE，根據以下公式計算MOI值
PFU/ml x V(加入病毒體積) 6.1 x l07PFU/ml x0.05 ml (加入病毒體積)
接種細胞數 2x 105
根據AdEasy Vector Systerm操作說明書提示，此病毒液的體積相當於M0I = 10-20，所以計算結果與粗略估計的病毒滴度相當。
2、重組腺病毒Ad-CIC體外感染BMDMSCs的感染效率測定
將擴增至第3代的大鼠BMDMSCs按2 X 105/瓶接種於4個T 25-cm2的塑料培養瓶 中，常規培養24h後，向各瓶依次加入MOI值為0、 50、 100、 150的病毒量的重組腺 病毒Ad-CIC毒液感染細胞，置37'C、 5XC02培養箱中培養48h。培養結束後，用0. 25 %胰酶消化各瓶細胞，離心，洗滌，重懸於500ul的PBS緩衝液中，用流式細胞儀 檢測各管細胞的GFP的表達率。結果如圖3B所示，M0I值為150時，感染效率可達到 98. 67%。
三、重組腺病毒Ad-CIC在BMDMSCs中的表達鑑定
1、 GFP表達鑑定
用0. 25%胰酶消化第3代大鼠BMDMSCs，按2X 105/瓶接種於4個T-25cii^的塑料 培養瓶中，培養24h後，按MOI二150的病毒量用Ad-CIC感染細胞，分別培養1、 3、 7、 14天後在螢光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，結果如圖3C所示，感染24h即有 GFP表達，在第3天時表達量最強，以後逐漸開始減弱，在第14天時仍有表達。
2、 RT-PCR鑑定基因水平CTLA4Ig及CTLA4的共表達
按M0I 二 150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠B腦MSCs ，常規培養3天，用TRIZ0L 試劑並參照試劑盒說明書提取被感染細胞的總RNA，然後以提取的總RNA為模板，反 轉錄其中的mRNA為c麗A， 20ul反轉錄體系為5XAMV反轉錄緩衝液4ul，
dNTPs(10mM) 2p1， RNAse抑制劑lwl， AMV反轉錄酶0. 5ul， raRNA 2ul，重蒸水 11.5ul。然後以合成的cDNA為模板，分別在CTLA4Ig引物P1 (上遊引物)5，-ATGGGGGTACTGCTCACACA-3，及P2 (下遊引物)5， -CTATTTACCAGGAGAGCGGGA-3，和 CTLA4全長引物P1 (上遊引物)5， -CATAGATCTATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3，及P2 (下 遊引物)5， -TAACTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3'的引導下進行PCR擴增， 20u 1 PCR反應體系為10XPCR緩衝液2yl， dNTPs(2. 5mM) 1.6ul，正、反向引 物各lul，模板ltil， r乃。酶0.2ia，重蒸水13.2ul。同時，以大鼠"-actin 基因為參照，用於擴增大鼠"-actin基因的引物序列為P3'(上遊引物)5' -AGAAAATCTGGCACCACACC-3，和P4，(下遊引物)5， -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3，。 PCR反應結束後，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3D所 示(泳道l、 7為DL15000 DNA marker,泳道2為Ad-CTLA4全長感染BMDMSCs，泳道 3為Ad-CIC感染BMDMSCs，泳道4為Ad-CTLA4Ig感染BMDMSCs， Ad-GFP感染BMDMSCs， 泳道5為BM腿SCs)，可見大小約為U70bp的特異性條帶出現，表明目的基因CTLA4Ig (1170bp)和CTLA4全長(692bp)在經Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs的mRNA水平上 均獲得表達，且前者的表達量明顯髙於後者。
3、 Western blotting鑑定蛋白水平CTLA4Ig及CTLA4的共表達 按M0I二150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠BMDMSCs，常規培養3天後，取 107個被重組腺病毒Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs,並以AchGFP (用上述相同方法獲得 的不含外源基因CTLA4Ig-IRES-CTLA4基因，僅含有GFP基因的重組腺病毒)、 Ad-CTLA4Ig (用上述相同方法獲得的不含外源基因IRES-CTLA4，僅含有GFP基因和 CTLA4Ig基因的重組腺病毒)、Ad-CTLA4(用上述相同方法獲得的不含外源基因CTLA4Ig 基因和IRES基因，僅含有GFP基因和CTLA4全長基因的重組腺病毒)感染的大鼠 BMDMSCs作對照，分別加入200 n 1 RAPA細胞裂解液(50mM Tris， 150mM NaCl， 5mM EDTA， 1%NP40， 0.5%脫氧膽酸鈉，0. 1%SDS， lmMPMSF， 10u g/mL aprotinin， lmMNaV04) 在4。C下裂解過夜，然後12000rpm離心30分鐘，吸取上清，用BCA法測定蛋白濃度 為4900ix g/mL。然後，取等量的經不同重組腺病毒感染的細胞裂解液進行不連續SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，再用半乾式轉印的方法將蛋白質轉移至PVDF膜 上，接著用5%脫脂奶粉封閉2小時， 一抗均為兔來源抗CTLA4抗體(購於santacruz 公司)，4'C孵育過夜(12-24小時)，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然後加入辣 根過氧化物酶偶連的抗兔二抗(購於中杉金橋生物技術有限公司)，室溫孵育l小時 後，用TBST洗膜4次。最後，用ECL化學發光檢測試劑盒(購自Santa Cruz公司) 於暗室自顯影。檢測結果如圖3E所示，發現被本發明重組腺病毒Ad-CIC感染的大鼠
BMDMSCs中同時表達有CTLA4Ig和CTLA4全長蛋白，而對照組未出現CTLA4Ig和CTLA4 全長蛋白共表達，與預期結果相符，從而在蛋白水平上證明CTLA4Ig和CTLA4全長在 經Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs中獲得表達。
實施例4、檢測被重組腺病毒Ad-CIC體外轉染的目的細胞的免疫抑制功能(混合 淋巴細胞反應，mixed lyphocyte response, MLR)
以大鼠骨髓間充質幹細胞(BMDMSCs)為例，檢測本發明重組腺病毒Ad-CIC體外 感染目的細胞(哺乳動物細胞)後，目的細胞的免疫抑制功能。
按M0I = 150的病毒量用Ad-CIC感染感染擴增至第3代的大鼠腿DMSCs 24h後， 依次用0. 25%胰酶和0. 02%EDTA消化受感染的服頭SCs，離心，洗滌，加入絲裂黴 素C (終濃度為25ug/raL)，再將感染細胞置於37。C， 5XC0j瞎箱中孵育30min。然 後，洗滌細胞3次，用含10X胎牛血清的低糖DMEM培養液重懸細胞，按1X107孔、 1X107孔、1X107孔的密度接種到96孔板中，在相同條件下繼續培養過夜。同時以 同樣密度接種的重組腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs作為對照。
拉頸處死LEWIS大鼠(購自北京維通利華實驗動物中心)及DA大鼠(購自哈爾濱 醫科大學實驗動物中心)各1隻，無菌剖取其脾臟分離脾細胞。向DA大鼠脾細胞重懸 液中加入絲裂黴素C (終濃度為25ug/mL)，置37。C、 5%0)2孵箱中孵育30min，洗 滌3次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞濃度為1 X 107mL，用作MLR 的刺激細胞。將LEWIS大鼠脾細胞作為反應細胞，同樣用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液調整細胞濃度為1Xl07mL。吸去上述預先接種有轉基因大鼠BMDMSCs的96孔 板中的培養液，然後向每孔中分別加入100n 1的反應細胞和刺激細胞懸液建立混合 淋巴細胞培養體系，混勻後將96孔板置於37。C， 5XC02孵箱中培養56h，加3H標記 的脫氧胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR，中國科學院原子能研究所)，標記16h，用細胞收 集器收集細胞於濾紙上，烤乾後，加入閃爍液，用液體閃爍計數儀(Beckman公司) 檢測cpm值，並進行比較分析。結果如圖4所示(Control為陰性對照)，被腺病毒 Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs具有抑制培養體系中反應細胞增值的作用，且其抑制作用 強於被腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs,證明本發明共表達CTLA4Ig及CTLA4 的腺病毒Ad-CIC可以更高效地阻斷T細胞的活化，具有較強的免疫抑制功能，說明 可用於製備免疫抑制劑，包括實驗製劑和藥物。
權利要求
1、共表達CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表達載體，是先將CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因順次插入pAdTrack-CMV穿梭載體中巨細胞病毒啟動子的下遊，得到攜帶CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重組穿梭載體，再將該重組穿梭載體與病毒骨架載體pAdeasy-1共轉化細菌後得到的攜帶有CTLA4Ig和CTLA4基因的腺病毒質粒載體。
2、 根據權利要求1所述的腺病毒表達載體，其特徵在於所述CTLA4Ig基因的5' 端還連接有抑瘤素M信號肽編碼序列。
3、 根據權利要求1或2所述的腺病毒表達載體，其特徵在於所述攜帶CTLA4Ig 基因、IRES基因和CTLA4基因的重組穿梭載體與病毒骨架載體pAdeasy-1共轉化的細 菌為AcW/ BJ5183，隨後，在該細菌內進行同源重組。
4、 根據權利要求3所述的腺病毒表達載體，其特徵在於所述共表達CTLA4Ig 和CTLA4的腺病毒表達載體命名為pAdeasy-CIC。
5、 共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒，是將權利要求1-4任一項所述共表 達CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表達載體轉染人胚腎293細胞得到的。
6、 受權利要求5所述的重組腺病毒感染的哺乳動物細胞。
7、 根據權利要求6所述的哺乳動物細胞，其特徵在於所述哺乳動物細胞包括 幹細胞、組織細胞、樹突細胞和骨髓單個核細胞。
8、 根據權利要求7所述的哺乳動物細胞，其特徵在於所述幹細胞為骨髓間充 質幹細胞或脂肪幹細胞。
9、 權利要求5所述的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒在製備免疫抑制劑 中的應用。
10、 根據權利要求9所述應用，所述免疫抑制劑為實驗製劑或免疫藥物。
全文摘要
本發明公開了IRES介導的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體及重組腺病毒。是先將CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因順次插入pAdTrack-CMV穿梭載體中巨細胞病毒啟動子的下遊，得到攜帶CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重組穿梭載體，再將該重組穿梭載體與病毒骨架載體pAdeasy-1進行同源重組後得到的共表達CTLA4Ig和CTLA4的重組腺病毒載體；將該重組腺病毒表達載體轉染包裝細胞—人胚腎293細胞得到重組腺病毒，重組腺病毒體外感染哺乳動物細胞可使目的細胞具有免疫抑制作用。本發明將在醫學領域，尤其是器官移植領域中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N7/01GK101343640SQ20081005675
公開日2009年1月14日 申請日期2008年1月24日 優先權日2008年1月24日
發明者王韞芳, 管利東, 羅海英, 翟樹森, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所