β-鏈模擬物及其相關方法
2023-06-17 10:33:41 2
專利名稱:β-鏈模擬物及其相關方法
技術領域:
本發明主要涉及β-鏈模擬物(β-strand mimetic)結構,還涉及其相關的化合物庫、及其用途。
背景技術:
為確定分子作為治療劑的可能活性,對其進行隨機篩選已經存在了多年,並且導致大量重要藥物的發現。儘管分子生物學和計算化學的進展已經導致對被稱為「合理化藥物設計(rational drug design)」的興趣日益增長,這種技術並未證實如最初所預期的那樣快捷或可靠。因此,近幾年來人們的興趣重新轉向隨機藥物篩選。因此,在基於組合化合物庫的發展和在這種庫中篩選生物活性成員的新技術方面,取得了特別的進展。
通常,組合化合物庫僅僅是分子的集合。這種庫隨著庫中的化學物種而變化,並隨著用來產生庫成員以及鑑別哪些成員與所關心的生物靶點相互作用的方法而變化。雖然這一領域尚屬初期,用於生成並篩選庫的方法已經變得相當地多樣和成熟。例如,最近的關於各種組合化合物庫的綜述已經確認了若干這樣的技術(Dolle,J.Com.Chem.,2(3)383-433,2000),包括標記的和未標記的庫成員的使用(Janda,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110779-10785,1994)。
最初,組合化合物庫主要限於肽源或核苷酸源的成員。因此,Houghten等人的技術說明了稱為「雙重定義迭代(dual-definediterative)」法的例子,其通過裂分合成(split synthesis)技術匯集可溶性組合肽庫(Nature(London)35484-86,1991;Biotechniques 13412-421,1992;Bioorg.Med.Chem.Lett.3405-412,1993)。通過這一技術獲得了含有數千萬成員的可溶性肽庫。這種庫已經在例如甲硫氨酸-腦啡肽和亮氨酸-腦啡肽的阿片樣肽的識別中顯示出效果(Dooley和Houghten,Life Sci.52,1509-1517,1993),而N-醯化肽庫已經用於識別acetalins,其是有效的阿片樣物質拮抗劑(Dooley等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010811-10815,1993)。近來,已經構建了全D-胺基酸阿片樣肽庫,並且對其對mu(「μ」)阿片樣物質受體的鎮痛活性進行了篩選(Dooley等,Science 2662019-2022,1994)。
雖然含有肽源和核苷酸源成員的組合庫具有重要價值,該領域中仍然需要含有不同源成員的庫。例如,傳統的肽庫很大程度上僅僅改變胺基酸序列而產生庫成員。雖然確實要承認肽的二級結構對生物活性至關重要,這種肽庫無法賦予其庫成員受限的二級結構。
因此,一些研究人員用二硫橋使肽環化,試圖提供更受限的二級結構(Tumelty等,J.Chem.Soc.1067-68,1994;Eichler等,Peptide Res.7300-306,1994)。然而,這種環化的肽通常仍然非常容易變形,很難進行生物應用,因此僅僅獲得了有限的成功。
最近,發展了非肽化合物,其非常接近地模擬了在生物活性蛋白質或肽中發現的回折的二級結構。例如,Kahn的美國專利第5,440,013號和Kahn公開的PCT申請WO94/03494都公開了結構受限的非肽化合物,其模仿了回折的三維結構。
雖然在結構受限的肽模擬物的合成和識別上已經取得顯著的進展,該領域中仍然需要模擬肽二級結構的小分子。該領域還需要含有這種成員的庫,以及合成和篩選所關注的靶點,特別是生物靶點的庫成員的技術,以識別生物活性庫成員。例如,Kahn的美國專利第5,929,237號及其部分繼續申請美國專利第6,013,458號也公開了模擬生物活性肽和蛋白質中回折區二級結構的結構受限化合物。
本發明也滿足了這些需要,並且通過提供結構受限化合物,模擬生物活性肽和蛋白質的β-鏈結構的二級結構,進一步提供了相關的優勢。
發明內容
簡要的說,本發明涉及模擬生物活性肽和蛋白質β-鏈結構的二級結構的結構受限化合物。本發明還公開了含有這些化合物的庫及其合成與篩選。
本發明的化合物具有以下通式(I)
其中A是-(CH)-、-N-或-CH2-N-,B是-(C=O)-或-(CH2)m-,W是-(C=O)-、-Y(C=O)-、-NH(C=O)-或不存在,X是-NH-、-NH(C=O)-或不存在,Y是氧或硫,Z是氧或氫,L是氫、R5、-C(O)NHR3或其等價物,n=0或1並且m=1或2;R1、R2、R3、R4和R5可以相同或不同,並且獨立地選自氫、胺基酸側鏈部分或其衍生物、分子的剩餘部分、連接基和固體載體,及其立體異構體。
在本發明的一個實施方式中,X不存在,A是-N-,B是-(C=O)-,L是-C(O)NHR3,其它基團如上文結構(I)中所定義,因此,本發明的化合物具有如下結構(I』)
任選地,W不存在且Z是氧。
在本發明的一個實施方式中,X不存在,A是-N-,B是-(CH2)m-,L是-C(O)NHR3,其它基團如上文關於結構(I)的定義,因此,本發明的化合物具有如下結構(I」)
任選地,W不存在且Z是氧。
在本發明的一個實施方式中,X是-NH-,A是-(CH)-,B是-(CH2)m-,L是-C(O)NHR3,其它基團如上文關於結構(I)的定義,因此,本發明的化合物具有如下結構(I』」)
任選地,當Z是氧時,W不存在。
在本發明的一個實施方式中,A是-CH2-N-,B是-(CH2)m-,L是-C(O)NHR3,其它基團如上文關於結構(I)的定義,因此,本發明的化合物具有如下結構(I」」)
任選地,Y是氧,並且/或者W不存在,並且/或者Z是氧。
本發明還涉及含有上文結構(I)、(I』)、(I」)、(I』」)和(I」」)的化合物的庫,以及合成這樣的庫的方法,和對其進行篩選以鑑別生物活性化合物的方法。本發明還公開了含有與藥學可接受的載體或稀釋劑相結合的本發明的化合物的組合物。
參考下面的詳細說明和附圖,本發明的這些方面和其它方面將是顯而易見的。
圖1和圖2說明了製備本發明的庫和本發明的化合物的合成方法學。
圖3說明了製備本發明的庫和本發明的化合物的合成方法學,實施例9對其進行了更詳細的描述。
圖4說明了製備本發明的庫和本發明的化合物的合成方法學,實施例10對其進行了更詳細的描述。
具體實施例方式 本發明公開了模擬生物活性肽和蛋白質β-鏈區域的二級結構的結構受限化合物。這樣的β-鏈模擬物結構在廣泛範圍的領域中具有應用性,包括用作診斷劑和治療劑。本發明還公開了含有本發明的β-鏈模擬物結構的庫,以及對其進行篩選以鑑別生物活性成員的方法。
一方面,本發明涉及β-鏈模擬物結構和含有β-鏈模擬物結構的化合物庫。本發明的β-鏈模擬物結構可用作生物活性劑,包括(但不限於)用作診斷劑、預防劑和/或治療劑。本發明的β-鏈模擬物結構庫可用於這樣的生物活性劑的鑑別。在本發明的實施中,庫可以含有從幾十到幾百乃至幾千(或更多)個單個β-鏈模擬物結構(本文中也稱為「成員」)。
在本發明的一個方面,公開了具有以下結構(I)的β-鏈模擬物結構
其中A是-(CH)-、-N-或-CH2-N-,B是-(C=O)-或-(CH2)m-,W是-(C=O)-、-Y(C=O)-、-NH(C=O)-或不存在,X是-NH-、-NH(C=O)-或不存在,Y是氧或硫,Z是氧或氫(當Z是氫時,C=Z代表CH2),L是氫、R5、-C(O)NHR3或其等價物,n=0或1並且m=1或2;R1、R2、R3、R4、和R5可以相同或不同,並且獨立地選自氫、胺基酸側鏈部分或其衍生物、分子的剩餘部分、連接基和固體載體,以及該結構的立體異構體。
在本發明的一個方面,R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、苄基、取代苄基(其中苄基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、咪唑並C1-4烷基、取代咪唑並C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、滷素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺醯基、或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環己基C0-2烷基。
在一個實施方式中,R1、R2和R3可以相同或不同,並且代表化合物的剩餘部分,R4選自胺基酸側鏈部分或其衍生物。在另一個實施方式中,L代表-C(=O)NHR3,R1、R2和R3可以相同或不同,並且代表化合物的剩餘部分或胺基酸側鏈部分或其衍生物,並且R4是氫 如本文所使用的,術語「胺基酸側鏈部分」代表任何天然蛋白質中所存在的胺基酸側鏈部分,包括(但是不限於)表1中載明的天然胺基酸的側鏈部分。本發明的其它天然胺基酸側鏈部分包括(但是不限於)3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、羥賴氨酸、γ-羧基穀氨酸鹽(酯)、磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸的側鏈部分。此外,在本發明的實際應用中也可以使用糖基化的胺基酸側鏈,包括(但是不限於)糖基化的蘇氨酸、絲氨酸和天門冬醯胺。
表1
除天然胺基酸側鏈部分外,本發明的胺基酸側鏈部分還包括它們的各種衍生物。如本文所使用的,胺基酸側鏈部分的「衍生物」包括天然胺基酸側鏈部分的修飾物和/或變化物。例如,丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的胺基酸側鏈部分通常可以分類為低鏈烷基、芳基或芳基烷基部分。胺基酸側鏈部分的衍生物包括其它直鏈或支鏈的、環狀或非環狀的、取代或未取代的、飽和或非飽和的低鏈烷基、芳基或芳基烷基部分。
如本文所使用的,術語「化合物的剩餘部分」和「分子的剩餘部分」用來指任何共價結合到β-鏈模擬物結構上的分子部分、試劑、化合物、載體、分子、連接基團、胺基酸、肽或蛋白質。優選結合在R1和/或R2和/或R3位置上。該術語還包括胺基酸側鏈部分及其衍生物。
如本文所使用的,「低鏈烷基部分」含有1-12個碳原子,「低鏈芳基部分」含有6-12個碳原子,「低鏈芳基烷基部分」含有7-12個碳原子。因此,在一個實施方式中,胺基酸側鏈衍生物選自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳基烷基,在一個更優選的實施方式中,胺基酸側鏈衍生物選自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳基烷基。
本發明的胺基酸側鏈衍生物進一步包括低鏈烷基、芳基和芳基烷基部分的取代衍生物,其中取代基選自(但是不限於)一個或多個以下的化學部分 -OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和滷素(包括F、Cl、Br和I),其中各個R的存在獨立地選自直鏈或支鏈的、環狀或非環狀的、取代或未取代的、飽和或不飽和的低鏈烷基、芳基和芳基烷基部分。一方面,取代基含有小於18個碳原子。此外,本發明的環狀低鏈烷基、芳基和芳基烷基部分包括萘,以及雜環化合物,例如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、異喹啉和咔唑。胺基酸側鏈衍生物進一步包括低鏈烷基和芳烷基部分的烷基部分的雜烷基衍生物,包括(但不限於)烷基和芳烷基磷酸酯(鹽)和矽烷。
在本發明的一個方面,R1、R2和R3部分選自-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR,其中各個R的存在如上文所定義。
在另一個實施方式中,除了可以是胺基酸側鏈部分或其衍生物(或者在R1、R2和R3的情況下是化合物的剩餘部分),R1、R2和R3可以是促進化合物與另一部分或化合物連接的連接基團。例如,本發明的化合物可以連接到一種或多種用於診斷或篩選檢驗的公知化合物上,例如生物素。而且,R1、R2和R3可以是將化合物連接到固體載體(例如用於固相肽合成中的載體)的連接基團,或者另外任選地,本身可以是載體。在這一實施方式中,優選在R1、R2或R3位置上,更優選在R3位置上,連接到另一部分或化合物,或者連接到固體載體上。
在X不存在,A是N,B是-(C=O)-並且L是-C(O)NHR3的實施方式中,本發明的β-鏈化合物具有以下結構(I』)
其中R1、R2、R3、R4、W、Y、Z和n如上文所定義。在優選的實施方式中,R2和R3代表化合物的剩餘部分,R1和R4選自胺基酸側鏈部分。
在X不存在,A是N,B是-(CH2)m-並且L是-C(O)NHR3的實施方式中,本發明的β-鏈模擬物結構包括以下結構(I」)
其中R1、R2、R3、R4、W、Y、Z、m和n如上文所定義。在優選的實施方式中,R2和R3代表化合物的剩餘部分,R1和R4選自胺基酸側鏈部分。
在一個更具體的實施方式中,其中X是-NH-、A是-(CH)-,B是-(CH2)m-並且L是-C(O)NHR3,β-鏈模擬物結構具有以下結構(I』」)
其中R1、R2、R3、R4、W、Y、Z、m和n如上文所定義。
在一個更具體的實施方式中,A是-CH2-NH-、B是-(CH2)m-並且L是-C(O)NHR3,本發明的化合物具有以下結構(I」」)
任選地,其中R1、R2、R3、R4、W、X、Y、Z、m和n如上文所定義,W不存在,Z是氧,Y是氧。
可以通過使用適當的起始組成分子(下文中稱為「組成片段」)來製備本發明的β-鏈模擬物結構。簡言之,在具有結構(I』)的β-鏈模擬物結構的合成中,將第一和第二組成片段偶聯,以形成結合的第一-第二中間體,如果必要的話,將第三和/或第四組成片段偶聯,以形成結合的第三-第四中間體(或者,如果有市售的話,可以使用單獨的第三中間體),然將結合的第一-第二中間體與第三-第四中間體(或第三中間體)偶聯,以提供第一-第二-第三-第四中間體(或者第一-第二-第三中間體),將該中間體環化,生成本發明的β-鏈模擬物結構。另外可選地,可以通過將單獨的組成片段逐步地在溶液中的連續偶聯,或者通過固相肽合成中常用的固相合成來製備結構(I』)的β-鏈模擬物結構。
在本發明的上下文中,「第一組成片段」具有如下結構1
其中R2、A和B如上文所定義,R是適用於肽合成的保護基。適當的R基團包括烷基,在優選的實施方式中,R是甲基。這樣的第一組成片段可以通過將CH(OR)2-(CH2)m-CHO與H2N-R2結合的還原性氨基化,或者通過CH(OR)2-(CH2)m-Br的取代反應而容易地合成。
本發明的「第二組成片段」具有如下結構2
其中L和R4如上文所定義,P是適用於肽合成的氨基保護基,X代表活化的羧酸基團的離去基團。優選的保護基包括叔丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、BOC、FMOC和Alloc(烯丙氧基羰基)。當L是-C(O)NHR3時,-NHR3可以是羰基保護基。N-保護的胺基酸是市售的,例如可從多種來源得到FMOC胺基酸。通過N-保護的胺基酸羧酸基團的活化,可以容易地進行這些N-保護的胺基酸到本發明第二組成片段的轉化。合適的活化的羧酸基團包括其中X是氯或溴之類的滷素的醯基滷、其中X是乙醯基之類的醯基的酸酐、例如N-羥基琥珀醯亞胺酯和五氟苯基酯的活性酯、以及其它的活性中間體,例如使用二環己基碳二亞胺(DCC)之類的碳二亞胺在偶聯反應中形成的活性中間體。
在胺基酸的疊氮衍生物充當第二組成片段的情況下,這樣的化合物可以通過Zaloom等人所公開的反應(J.Org.Chem.465173-76,1981),由相應的胺基酸製備。
本發明的「第三組成片段」具有以下結構3 R1-NH2或R3-NH2 其中R1和R3如上文所定義。合適的第三組成片段可以是多種來源的市售產品,或者可以通過合成一級胺常用的標準有機合成技術方便地製備。
更具體地,通過使第一組成片段與第二組成片段反應,生成結合的第一-第二中間體,然後使結合的第一-第二中間體與第三組成片段或者與第三和第四組成片段連續反應,提供結合的第一-第二-第三-第四中間體,然後使該中間體環化以生成β-鏈模擬物結構,合成結構(I』)的本發明的β-鏈模擬物結構。
可以通過如下技術來完成具有結構I』的β-鏈模擬物結構的一般合成。使用例如光氣的偶聯試劑將第一組成片段1與第二組成片段2偶聯,N-脫保護之後,結合的第一-第二中間體1-2描述如下
其中,A、B、L、R、R2、R4、P、X和n如上文所定義。X2C(=S)是一個偶聯試劑的例子,還可以採用其它類型的偶聯試劑。實施例中描述了本發明代表性的組成片段的合成。可以通過與以上公開的組合式組分合成相類似的技術,來製備結構(I」)到(I』」)的β-鏈模擬物化合物,但是對組成片段進行適當的修飾。
本發明的另一方面,公開了含有本發明的β-鏈模擬物結構的庫。一旦匯集完成,可以對本發明的庫進行篩選,以鑑別具有生物活性的單個成員。舉例來說,這種對於庫生物活性成員的篩選可以涉及評價庫成員的結合活性,或者評價庫成員在功能分析中的效果。通常通過使庫成員(或者庫成員的亞型)與例如抗體、酶、受體或細胞系的所關注的靶點相接觸而完成篩選。能夠與所關注的靶點相互作用的庫成員在本文中稱為「生物活性庫成員」或者「生物活性模擬物」。例如,生物活性模擬物可以是能夠結合到抗體或者受體上的庫成員,能夠抑制酶的庫成員,或者是能夠引起或者對抗例如與細胞系有關的功能反應的庫成員。換句話說,對本發明的庫的篩選確定了哪些庫成員能夠與一種或多種所關注的特定生物靶點相互作用。當相互作用確實發生時,則可以從庫成員中鑑別出相互作用的生物活性模擬物(或多個生物活性模擬物)。從庫中鑑別單個(或有限數量)的生物活性模擬物,產生了本身具有生物活性的β-鏈模擬物結構,因此可以用作診斷劑、預防劑或治療劑,還可以進一步用於極大地發展這些領域中先導化合物的鑑別。
可以使用已知的肽合成技術,結合本發明的第一、第二、第三,以及任選的第四組成片段,完成本發明的庫的肽模擬物的合成。更具體地說,可以在結構受限化合物的N-端和/或C-端上添加任意的胺基酸序列。因此,可以通過已知技術在固相載體上(例如PAM樹脂)合成模擬物(參見,例如,John M.Stewart和Janis D.Young,Solid PhasePeptide Synthesis,1984,Pierce Chemical Comp.,Rockford,III.),或者通過醇連接(alcohol attachment)在甲矽烷基連接的樹脂上合成模擬物(參見Randolph等,J.Am Chem.Soc.1175712-14,1995)。
此外,可以組合使用溶液和固相合成技術來合成本發明的肽模擬物。例如,可以採用固體載體合成線性肽序列,直至將結構受限的β-鏈加入到該序列中。然後可以將先前通過溶液合成技術合成的合適的結構受限β-鏈模擬物結構作為下一個「胺基酸」加入到固相合成中(即,可以使用既具有N-末端又具有C-末端的結構受限的β-鏈模擬物作為加入到線性肽中的下一個胺基酸)。通過將結構受限的β-鏈模擬物結構結合到序列當中,然後可以加入另外的胺基酸,以完成結合到固體載體上的肽。另外可選地,可以在固體載體上合成N-端和C-端保護的線性肽序列,將其從載體上脫除,然後在溶液中使用公知的溶液偶聯技術偶聯到結構受限的β-鏈模擬物結構上。
在本發明的另一方面,公開了構建庫的方法。傳統的組合化學技術(參見,例如,Gallop等人,J.Med.Chem.371233-1251,1994)允許通過試劑在基本分子框架的順序組合而迅速製備大量化合物。組合技術已經用於構建由天然胺基酸衍生的肽庫。例如,取20種適當保護並且不同的胺基酸的20種混合物,並且將每一種均與20種胺基酸之一進行偶聯,創建了400(即,202)種二肽的庫。將該程序重複7次,結果製成了由大約260億(即,208)種八肽組成的肽庫。
在本發明的另一方面,公開了對庫進行生物活性篩選以及分離生物活性庫成員的方法。可以通過多種技術和方法對本發明的庫進行生物活性篩選。通常,可以通過(1)使庫與受體之類的所關注生物靶點接觸,使得庫的模擬物與靶點之間發生結合,和(2)通過適當的檢驗來檢測結合作用,例如通過Lam等人(Nature 35482-84,1991)或Griminski等人(Biothechnology 121008-1011,1994)所公開的量熱檢驗(在此引入二者以供參考),來進行篩選檢測。在優選的實施方式中,庫成員處於溶液中,靶點固定在固相上。另外可選地,可以將庫固定在固相上,並且可以通過使其與溶液中的靶點接觸來進行探測。
可以使用圖1所示的製備β-鏈模擬物庫的通用方案來完成本發明庫的肽模擬物的合成。使用具有96孔板的FlexChem反應堆艙(Reactor Block)來進行本發明二環模板庫的所選肽模擬物的合成。在以上方案中,「Pol」代表2-氯三苯甲基氯樹脂(Novabiochem),以下提供了詳細的過程。
步驟1將2-氯三苯甲基氯樹脂(1mmol/g)以及Fmoc-R1-胺基酸(1.5當量)和DIEA(2當量)的DCE溶液置於96孔Robinson艙(FlexChem)中。將反應混合物在室溫下振蕩12小時。用DMF、MeOH和DCM洗滌樹脂。
步驟2向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,並用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌產物混合物。向樹脂中加入4-R2-氨基-2-Fmoc-氨基丁酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟3向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,並用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌產物混合物。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5,5-二甲氧基-戊酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟4向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,並用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌產物混合物。向樹脂中加入市售的R3-酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟5將樹脂在室溫下用甲酸(每孔1.2mL)處理18小時。之後,過濾除去樹脂,在減壓下使用SpeedVac(Servant)濃縮濾液,得到油狀產品。將這些產品用50%的水/乙腈稀釋,然後在冷凍後進行凍幹。
表2顯示了可以根據本發明製備的β-鏈模擬物庫,實施例9中給出了其代表性的製備過程。表2的化合物說明了本發明的一個方面,即如下的化合物,其中A是-(CH)-,B是-(CH2)m-且m=1,W是-(C=O)-,X是-NH(C=O)-,Y是氧,Z是氫,使得C=Z代表CH2,L是-C(=O)NHR3,n=0,R4是氫,R1、R2和R3可以相同或不同,並且獨立地選自胺基酸側鏈部分或其衍生物、分子的剩餘部分、連接基團和固相載體,及該化合物的立體異構體。在本發明這一方面的各實施方式中,R1、R2和R3獨立地選自相對低分子量的分子部分,即分子量在15(甲基)到1,000g/mol之間的有機基團;並且/或者R1、R2和R3中的至少一個代表胺基酸側鏈或其衍生物。例如,在表2的化合物中,R3代表天冬氨酸衍生物。一方面,本發明的化合物分子量在大約440至750g/mol的範圍之內,其中表2的化合物提供了大量這樣的化合物的實例。
表2 B-鏈模擬物庫
可以使用圖2所示的β-鏈模擬物庫的通用方案來進行本發明庫的肽模擬物的合成。使用具有96孔板的FlexChem反應堆艙來完成本發明二環模板庫的所選肽模擬物的合成。在以上方案中,「Pol」代表2-氯三苯甲基氯樹脂(Novabiochem),以下提供了詳細的過程。
步驟1將2-氯三苯甲基氯樹脂(1mmol/g)以及Fmoc-R1-β-胺基酸(1.5當量)和DIEA(2當量)的DCE溶液置於96孔Robinson艙(FlexChem)中。將反應混合物在室溫下振蕩12小時。用DMF、MeOH和DCM洗滌樹脂。
步驟2向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入4-R2-氨基-2-Fmoc-氨基丁酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟3向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,並用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌產物混合物。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5,5-二甲氧基-戊酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟4向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%的哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入市售的R3-酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
步驟5將樹脂在室溫下用甲酸(每孔1.2mL)處理18小時。之後,過濾除去樹脂,在減壓下使用SpeedVac(Servant)濃縮濾液,得到油狀產品。將這些產品用50%的水/乙腈稀釋,然後在冷凍後進行凍幹。
表3顯示了可以根據本發明製備的β-鏈模擬物庫,實施例10中給出了其代表性的製備過程。表3的化合物說明了本發明的一個方面,即如下的化合物,其中A是-(CH)-,B是-(CH2)m-且m=1,W不存在,即Rb與雜環的N之間是直接的鍵,X是-NH(C=O)-,Y是氧,Z是氫,使得C=Z代表CH2,L是-C(=O)NHR3,n=0,R4是氫,R1、R2和R3可以相同或不同,並且獨立地選自胺基酸側鏈部分或其衍生物、分子的剩餘部分、連接基團和固相載體,及該化合物的立體異構體。本發明這一方面的各實施方式中,R1、R2和R3獨立地選自相對低分子量的分子部分,即分子量在15(甲基)到1,000g/mol之間的有機基團;並且/或者R1、R2和R3中的至少一個代表胺基酸側鏈或其衍生物。例如,在表3的化合物中,R3代表戊二酸衍生物。一方面,本發明的化合物分子量在大約450至800g/mol的範圍之內,其中表3的化合物提供了大量這樣的化合物的實例。
表3 B-鏈模擬物庫
本發明的β-鏈模擬物結構可以用作生物活性試劑,如診斷劑、預防劑和治療劑。優選地,將化合物配製為藥物可接受的形式,然後對有用本發明的β-鏈模擬物結構治療需求的患者給藥。
因此,本發明提供了含有結構(I」)到(I』」)的化合物的藥物組合物。對於含有該化合物的藥物組合物的製備,本領域的技術人員可以使用相關領域已知的公知常識和技術。通常已知的多種載體和其它添加劑可用於製備本發明的組合物。本發明的藥物組合物可以以對於需要治療的疾病狀況來說標準的方式給藥,例如通過口服、直腸或腸胃外給藥。
為了這些目的,可以將本發明的化合物通過本領域公知的方法配製為諸如片劑、膠囊、水性或油性溶液或懸浮液、(脂類)乳液、可分散的粉末、栓劑、油膏、乳膏、滴劑和無菌可注射水性或油性溶液或懸浮液的形式。
本發明的合適的藥物組合物是一種適於口服給藥的單位劑量形式的組合物,例如含有大約1mg至大約1g本發明的化合物的片劑或膠囊。
另一方面,本發明的藥物組合物是一種適於靜脈注射、皮下注射或者肌肉注射的組合物。舉例來說,患者可以接受大約1μg/kg至大約1g/kg本發明化合物的靜脈、皮下或肌肉劑量。可以通過彈丸式注射(bolus injection)的方式給予靜脈、皮下和肌肉劑量。另外可選地,可以通過一段時間的連續輸液來給予靜脈劑量。
另外可選地,患者接受大約等於日胃腸外劑量的日口服劑量,每天用該化合物給藥1至4次。
下表說明了代表性的含有用於人類治療或預防的化合物或其藥物可接受鹽的藥物劑量形式 含有通式(I)化合物的藥物組合物可以用於多種生物上所需的效果,包括抑制溫血動物中的蛋白酶,調節溫血動物中與細胞信號轉導因子有關的肽,和用於抑制溫血動物中的激酶。通過包括對有需要的動物施用有效量的結構式(I)的化合物的方法可以達到這些效果。
而且,如下文中所詳細討論的,本發明的β-鏈模擬物結構還可以有效地用於在溫血動物中抑制肽的MHC-I和/或MHC-II出現於T細胞受體中;在溫血動物中抑制肽結合到SH2結構域上;在溫血動物中抑制肽結合到SH3結構域上;在溫血動物中抑制肽結合到PTB結構域上;調節溫血動物中的G蛋白耦合受體(GPCR)和離子通道;和調節溫血動物中的細胞因子。
激酶抑制(包括SH2和SH3結構域抑制) 一方面,本發明提供了在溫血動物中抑制激酶的方法。該方法包括對動物施用一定量的本發明的化合物,其中該用量對於抑制激酶是有效的。激酶(也稱為蛋白激酶)是一類催化反應並由此使生物分子(典型地為另一種酶)發生磷酸化的酶。人們認為哺乳動物基因組中編碼了多達1000種激酶(Hunter,Cell 50823-829,1987)。大量的激酶允許快速信號放大和多個調控點。
磷酸化是信號轉導過程中非常常見的共價修飾,並導致發生磷酸化的那些蛋白質的活性發生改變。激酶因而是信號途徑中的關鍵組分。激酶通常編組入數個模塊功能區或「結構域」中(Cohen,G.B.等人,Cell 80237-248,1995)。一種稱為「SH3」的結構域,是結合到富含脯氨酸的肽,尤其是延伸鏈上的55-70個胺基酸的區域。另外一種稱為「SH2」的結構域,是長度大約100個胺基酸的磷酸酪氨酸結合區域。人們認為這兩種結構域與蛋白底物的識別和結合有關。這些以及其它的結構域,包括豆蔻醯化和棕櫚醯化位點的結構域,負責組裝起將催化結構域引導到正確靶點的多蛋白複合體(Mayer等人,Mol.Cell.Biol.12609-618,1992;和Mayer和Baltimore,Mol.Cell.Biol.142883-2894,1994)。儘管已知SH2和SH3結構域存在於某些激酶中,這些結構域還存在於其它蛋白質中。本發明的化合物可以用於抑制激酶或其它蛋白質中SH2-或SH3-介導的結合。
身體在大量不同的、但是經常相互關聯的分子內信號轉導機制中運用激酶。例如,生長因子、轉導因子、荷爾蒙、細胞周期調控蛋白和許多其它類型的細胞調節物,在它們的信號級聯(signaling cascade)中利用酪氨酸激酶(參見,例如,Bolen等人,FASEB J.63403-3409,1992;和Ullrich和Schlessinger,Cell 61203-212,1990)。絲氨酸/蘇氨酸激酶彌補了大多數激酶家族中的剩餘物。
在體內和體外測定酶的作用並理解其功能的一種重要的方法,是使用特定的酶抑制劑。如果發現一種或多種化合物可以抑制酶,該抑制劑可以用來調節酶的活性,並可以觀察到降低的效果。這樣的方法有助於解釋多種中間代謝的途徑,而且對於了解酶動力學和確定催化機制也是十分重要的。本發明提供了這樣的化合物。
許多免疫應答的調控是通過經由含有SH2結構域的酪氨酸激酶傳遞信號的受體介導的。通過抗原特異性T-細胞受體(TCR)的T-細胞激活啟動了信號轉導級聯繫統,其導致了淋巴因子分泌和細胞增生。TCR激活後最早期的生物化學反應之一是酪氨酸激酶活性的增加。特別地,T-細胞激活和增生是通過含有SH2結構域的p56lck和p59fyn酪氨酸激酶以及ZAP-70和Syk(Weiss和Litman,Cell 76263-274,1994)的T-細胞受體介導的激活來控制的。其它的證據表明,幾種src-族激酶(lck、blk、fyn)參與了從B-細胞抗原受體引導的信號轉導途徑,因此可以用來結合來從幾種獨立的受體結構收到的刺激。因此,阻斷這些SH2結構域激酶與它們的同源受體之間相互作用的抑制劑,能夠在自身免疫疾病、移植排異反應中用作免疫抑制劑,或者用作抗炎劑,以及在淋巴細胞性白血病的情況下用作抗癌藥物。
另外,已知含有SH2結構域的非跨膜PTP酶,將它們命名為SH-PTP1和SH-PTP2(Neel,Cell Biology 4419-432,1993),SH-PTP1等同於PTP1C、HCP或SHP,SH-PTP2也稱為PTP1D或PTP2C。SH-PTP1在全部譜系和全部分化階段的造血細胞中得以高水平表達。由於確認SH-PTP1基因負責motheaten(me)小鼠表型,這便提供了預測阻斷與其細胞底物相互作用的抑制劑效果的基礎。因此,可以預期SH-PTP1的抑制導致損傷的對促有絲分裂刺激的T-細胞反應、降低的NK細胞功能,以及如上文所述的具有潛在治療應用的B-細胞前體的缺失。
本發明的化合物結合在STAT6的SH2結構域上的能力,或結合在蛋白酪氨酸磷酸酶SH-PTP1的SH2結構域上的能力,可以用Payne等人,P.N.A.S.USA 904902-4906,1993中公開的程序證明。可以通過Songyang等人,Cell 72767-778,1993的程序對SH2結合模擬物庫進行篩選。另外參見Songyang等人,Current Biology 4973-982,1994的程序,以測試化合物充當蛋白激酶的底物或抑制劑的能力。
因此,一方面,本發明提供在溫血動物中抑制磷酸酶的方法,該方法包括用一定量的本發明的化合物為動物給藥,其中該用量對於抑制磷酸酶是有效的。
在II型(非胰島素依賴型)糖尿病中,酪氨酸磷酸酶(PTP-1b)抗衡了激活的胰島素受體激酶的作用,可能代表了重要的藥物靶點。體外實驗顯示,注射PTP酶阻斷了內源蛋白質上酪氨醯殘基的胰島素刺激的磷酸化。因此,本發明的化合物可以用於在糖尿病中調節胰島素的作用。
另一方面,本發明提供了抑制第一蛋白質中的磷酸酪氨酸殘基與第二蛋白質的SH2結構域結合的方法。該方法包括使一定量的本發明的化合物與含有第一和第二蛋白質的組合物接觸。該用量對於減輕第一與第二蛋白質之間通過第二蛋白質的SH2結構域和第一蛋白質的磷酸酪氨酸殘基的結合是有效的。
蛋白酶抑制 另一方面,本發明提供了在溫血動物中抑制蛋白酶的方法。該方法包括用一定量本文所述的本發明的化合物為動物給藥。該用量對於抑制動物中的蛋白酶是有效的。在不同的實施方式中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶;蛋白酶是選自凝血酶、X因子、IX因子、VII因子、XI因子、尿激酶、HCV蛋白酶、胃促胰酶胰蛋白酶和激肽釋放酶的絲氨酸蛋白酶;蛋白酶是凝血酶;蛋白酶是VII因子;蛋白酶選自天冬氨酸、半胱氨酸和金屬蛋白酶。
關於蛋白酶抑制,組織蛋白酶B是通常與酶原加工和蛋白質轉換有關的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。活性水平升高涉及到腫瘤轉移(SloaneB.F.等人,Cancer Metastasis Rev.9333-352,1990)、類風溼性關節炎(Werb,Z.Textbook of Rheumatology,Keller,W.N.;Harris,W.D.;Ruddy,S.;Sledge,C.S.,Eds.,1989,W.B.Saunder Co.,Philadelphia,Pa.,pp.300-321)和肌營養不良(Katunuma和Kominami,Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.1081-20,1987)。
鈣激活中性蛋白酶是胞質或膜結合Ca++-激活的蛋白酶,其響應細胞內鈣水平變化而造成細胞骨架蛋白的降解。它們有助於關節炎和肌營養不良中的組織降解(參見Wang和Yuen Trends Pharmacol.Sci.15412-419,1994)。
白細胞介素轉化酶(ICE)將pro-IL-1β切割為一種關鍵的炎症介體IL-1β,因此ICE的抑制證明可以用於關節炎的治療(參見,例如,Miller B.E.等人,J.Immunol.1541331-1338,1995)。ICE或類ICE蛋白酶還可以在細胞凋亡(程序性細胞死亡)中起作用,因此在癌症、AIDS、阿爾茨海默病、和其它與細胞凋亡失調有關的疾病中發揮作用(參見Barr和Tomei,Biotechnol.12487-493,1994)。
HIV蛋白酶在AIDS病毒HIV的生命周期中發揮關鍵作用。在病毒成熟的最終步驟中,它將多蛋白前體切割為病毒體核的功能性酶和結構蛋白。HIV蛋白酶抑制劑很快確認為一種極好的AIDS治療靶點(參見Huff,J.R.,J.Med.Chem.342305-2314),而且已經證明可用於其治療,最近利託那韋(ritonavir)、Crixivan和沙奎那維(saquinavir)獲得FDA的核准則證實了這一點。
C肝病毒(HCV)是當今世界非甲型和非B型肝炎的主要原因。估計感染了多達5千萬人。當前,沒有滿意的治療可停止這一使人衰弱的疾病的發展。在該病毒的生命周期期間,產生了大約3000個胺基酸的多蛋白,其被病毒的蛋白酶和宿主蛋白酶剪切,產生成熟的病毒基因產物。位於HCV NS3蛋白內的絲氨酸蛋白酶在四個特定位點上斷裂,產生被認為是對於病毒複製至關重要的非結構性蛋白。因此,HCV蛋白酶抑制劑是引人注目的藥物設計靶點,可能具有重大的治療效益(Neddermann等人,Bio.Chem.378469-476,1997)。
血管緊張素轉化酶(ACE)是腎素-血管緊張素系統的一部分,它在血壓的調節中起到中心作用。ACE將血管緊張素I切割為八肽血管緊張素II,其由於血管收縮活性是一種有效的加壓劑。已經證明ACE的抑制在治療上可用於高血壓的治療(William,G.H.,N.Engl.J.Med.3191517-1525,1989) 膠原酶切割細胞外基質(如結締組織、皮膚、血管)的主要成分膠原蛋白。膠原酶活性升高促使關節炎(Krane等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.580340-354,1990)、腫瘤轉移(Flug和Kopf-Maier,Acta Anat.Basel 15269-84,1995)、和其它與結締組織降解有關的疾病。
類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶形成高度選擇性的一大類與止血/凝固(Davie和Fujikawa,Ann.Rev.799-829,1975)和補體激活(Muller-Eberhard,Ann.Rev.Biochem.44697-724,1975)有關的酶。對這些蛋白酶進行測序,已經顯示了同源類胰蛋白酶核的存在,其具有修飾特異性的胺基酸插入,並通常造成與其它大分子組分的相互作用(Magnusson等人,Miami Winter Symposia 11203-239,1976)。
凝血酶是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶,它的作用在於在從血纖蛋白原產生血纖蛋白的過程中,和在血小板受體的激活過程中,提供有限的蛋白水解,因此在血栓形成和止血中起到至關重要的作用(Mann,K.G.,Trends Biochem.Sci.12229-233,1987)。通過選擇性切割血纖蛋白原中一百八十一個Arg-或Lys-Xaa序列中的僅僅兩個Arg-Gly鍵,凝血酶在清除血纖蛋白原的血纖維蛋白肽A和B中表現出顯著的特異性(Blomback,Blood Clotting Enzymology,Seeger,W.H.(ed.),Academic Press,New York,1967,pp.143-215)。
許多重要的疾病狀態與異常止血有關,包括急性冠狀綜合症。阿司匹林和肝素廣泛用於治療患者的急性冠狀綜合症。但是,這些藥劑具有一些內在的局限性。例如,並發動脈粥樣硬化斑塊破裂的血栓形成,傾向於是一個凝血酶介導的、依賴血小板的過程,其相對地對於阿司匹林和肝素的抑制有抵抗力(Fuster等人,N.Engl.J.Med.326242-50,1992)。
凝血酶抑制劑防止在體內血管損傷位點形成血栓。而且,由於凝血酶還是有效的生長因子,其啟動冠狀動脈機械損傷位點上的平滑肌細胞增生,抑制劑阻斷這一增生性平滑肌細胞反應,並減少再狹窄。凝血酶抑制劑還可以降低血管壁細胞中的炎症反應(Harker等人,Am.J.Cardiol.75122-16B,1995)。
而且,至少兩種明確定義的轉錄因子,核因子(NF)κB和活化蛋白(AP)-1是由細胞內的還原-氧化(氧化還原)狀態調節的。氧化還原狀態對基因表達的調節帶來了有希望的治療結論。例如,氧化還原調節的轉錄因子NF-κB和AP-1的結合位點位於許多種與疾病發病機理直接相關的基因的啟動區,例如AIDS、癌症、動脈粥樣硬化和糖尿病併發症(Sen和Packer,FASEB Journal 10709-720,1996)。更具體地說,例如NF-κB和AP-1的轉錄因子在DNA共有區位點上的結合是由氧化-抗氧化動態平衡,尤其是硫醇-二硫化物平衡驅動的。
在NF-κB的情況下,在NF-κB功能的調節中發揮著至關重要的作用的生理學上相關的硫醇,是還原的硫氧還蛋白或還原的類硫氧還蛋白的蛋白質。硫氧還蛋白是具有抗氧化功能的重要的蛋白氧化還原酶。已經發現硫氧還蛋白增量調節(upregulate)激活的NF-κB的DNA結合,並因此增加基因的表達(Schenk等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911672-1676,1994)。硫氧還蛋白涉及到還原活化的胞質NF-κB(尤其是cys-62的還原),因此其有助於核易位和DNA結合(Hayashi等人,J.Biol.Chem.26811380-11388,1993)。
已經發現Fos和Jun在AP-1複合物中的DNA結合活性是由氧化還原狀態調節的(Abate等人,Science 2491157-1162,1990)。每一蛋白在它的DNA結合結構域中含有單一的保守半胱氨酸(兩側為賴氨酸和精氨酸)。該硫醇似乎並不是二硫鍵的一部分,可以以它的氧化形式作為次磺酸或亞磺酸存在。Ref-1是一種還具有內切核酸酶DNA修復活性的雙功能核內蛋白,它通過這一調節半胱氨酸的還原來刺激AP-1DNA結合。其中將關鍵的半胱氨酸用絲氨酸取代的Fos突變體,引起了AP-1DNA結合活性3倍的增加,而且不再受氧化還原控制(Okuno等人,Oncogene 8695-701,1993)。因此,由於轉錄因子fos家族中至少四個成員、jun家族中3個成員和ATF/CREB家族中至少4個成員均含有這一保守半胱氨酸,轉錄因子的氧化還原控制似乎是普遍的。
如上文所提及,例如NF-κB和AP-1的轉錄因子的調節具有重要的治療結論。例如,AP-1是腫瘤產生的重要介體(Yoshioka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924972-4976,1995)。因此,阻抑AP-1轉錄活性的化合物在癌症的治療中具有應用性。而且,由於它在調節對炎性細胞因子和內毒素的響應中的直接作用,NF-κB的活化在例如類風溼性關節炎的慢性疾病和例如敗血性休克的急性病症的發展中發揮了重要的作用。人們認為例如系統性紅斑狼瘡(SLE)和阿爾茨海默病的自身免疫疾病也與NF-κB的激活有關。類似地,NF-κB在HIV基因表達的激活中發揮著重要作用。其它認為與NF-κB有關的病症包括流感、動脈粥樣硬化、腫瘤發生和共濟失調性毛細血管擴張症(AT)。
氧化還原酶抑制 關於轉錄因子的調節,本發明的化合物調節轉錄因子,該轉錄因子結合DNA的能力由半胱氨酸殘基通過細胞氧化還原酶的還原來控制。在一個實施方式中,轉錄因子是NF-κB。在這一實施方式中,本發明的化合物具有免疫和/或炎症反應介體的活性,或者用於控制細胞的生長。在另一實施方式中,轉錄因子是AP-1,細胞氧化還原酶是Ref-1。在這一實施方式中,本發明的化合物具有抗炎劑和/或抗癌劑的活性。在另外又一實施方式中,轉錄因子選自Myb和糖皮質素受體。其它可以在本發明的背景下受調節的轉錄因子還包括NF-κB族轉錄因子,例如Rel-A、c-Rel、Rel-B、p50和p52;AP-1族轉錄因子,例如Fos、FosB、Fra-1、Fra-2、Jun、JunB和JunD;ATF;CREB;STAT-1、-2、-3、-4、-5和-6;NFAT-1、-2和-4;MAF;甲狀腺因子;IRF;Oct-1和-2;NF-Y;Egr-1;和USF-43。
因此,本發明一方面提供了在溫血動物中抑制氧化還原酶的方法,其包括用一定量的本發明的化合物為動物給藥,其中該用量對於抑制氧化還原酶是有效的。氧化還原酶活性的抑制可以用作調節轉錄的方法。
CAAX抑制 另一方面,本發明提供了在溫血動物體內CAAX抑制的方法。該方法包括用一定量本文所述的本發明的化合物為動物給藥。該用量對於在動物體內提供CAAX抑制是有效的。
Ras是一種ras致癌基因的蛋白產物,它是與調節細胞分裂和生長的信號轉導有關的膜結合蛋白。Ras基因的突變是最常見的與人類癌症有關的基因異常之一(Barbacid,M.Annu Rev Biochem 56779-827,1987)。這些突變導致始終「開啟」的生長信號,產生癌細胞。為了定位在細胞膜上,Ras需要在它的C-端CAAX序列通過法尼基轉移酶(FT酶)發生半胱氨酸的異戊二烯化,其中,在CAAX序列中,「a」定義為具有疏水側鏈的胺基酸,「X」是另一胺基酸。這一翻譯後修飾對它的活性是至關重要的。已經顯示具有序列CaaX的FT酶的肽基抑制劑阻斷或減緩了腫瘤在細胞培養和整個動物中的生長(Kohl等人,Science2601934-1937,1993;Buss和Marsters,Chemistry and Biology 2787-791,1995)。
篩選抑制CAAX活性的化合物活性的方法在本領域是公知的。參見,例如美國專利第6,391,574號,其描述了鑑別抑制細胞中CAAX蛋白AAX三肽的蛋白水解去除的化合物的方法。又參見美國專利第5,990,277號,其公開了幾種合適的檢驗,以及參考文獻(Gibbs等人,Cell 77175,1994;Gibbs,Cell 651,1991;Maltese,FASEB J.43319,1990;Moores等人,J.Biol.Chem.26614603,1991;Goldstein等人,J.Biol.Chem.26615575,1991;歐洲專利0 461 869A2;Casey,J.LipidRes.331731-1740,1992;Cox等人,Curr.Opin.Cell.Biol.41008-1016,1992;Garcia等人,J.Biol.Chem.26818415-18418,1993;Vogt等人,J.Biol.Chem.270660-664,1995;Kohl等人,Science,2601934-1937,1993;Garcia等人,J.Biol.Chem.,26818415-18418,1993;和Vogt等人,J.Biol.Chem.270660-664,1995)。
MHC分子 另一方面,本發明提供了抑制抗原肽在第一類或第二類MHC分子上結合的方法。該方法包括使根據本發明的化合物與包含抗原肽和第一類或第二類MHC分子的組合物相接觸。以對於降低兩個物種之間結合親和性有效的用量將化合物與抗原/分子相接觸。
免疫系統的一個重要方面是T細胞反應。這一反應需要T細胞識別稱為人類白細胞抗原(「HLA」)的細胞表面分子複合體或者主要組織相容性複合體(「MHC」)和肽,並與之發生相互作用(參見,例如,Male等人,Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company,1987)。通過被抗原遞呈細胞(APC)攝食,抗原至少部分地轉移了免疫反應,APC在它的表面上含有在主要組織相容性複合體(MHC)中的基因編碼的第二類糖蛋白。然後,抗原在表面結合MHC糖蛋白的情況下,並通過抗原特異性T細胞受體與抗原-MHC複合體之間的相互作用,呈遞至特異的輔助性T細胞(T helper cell),刺激輔助性T細胞以介導抗原特異性免疫反應,包括細胞毒素T細胞功能的導入、B細胞功能的導入和若干輔助和助長這一反應的因子的分泌。在本發明的一個方面,MHC分子是HLA-A2.1、HLA-A1或HLA-A3.1,或者任何其它存在於黑素瘤患者中的HLA等位基因。
本發明的化合物與MHC I分子結合的能力基本上可以如Elliot等人,Nature 351402-406,1991中所述來證明。類似地,本發明的化合物與MHC II分子結合的能力可以通過Kwok等人,J.Immunol.1552468-2467,1995中的方法證明。
具有14-3-3結構域的蛋白 另一方面,本發明提供了抑制第一個肽與含有14-3-3結構域的第二個肽結合的方法,其中第一個肽具有與第二個肽的14-3-3結構域的結合親和性。該方法包括使本發明的化合物與含有(第一個)肽的組合物相接觸,該肽具有與第二個肽的14-3-3結構域的結合親和性。
文獻中已經描述了具有14-3-3結構域的蛋白及其結合配偶體。這些肽可以用於本發明的方法。參見,例如Dai和Murakami,J Neurochem2003 Jan.84(1)23-24;Lim等人,J Biol Chem 2002 Oct.25,277(43)40997-1008;Parvaresch等人,FEBS Lett 2002 Dec.18,532(3)357-62;Eilers等人,Mol Cell Biol 2002Dec.,22(24)8514-26;Liu等人,CancerRes 2002 Nov.15,62(22)6475-80;Truong等人,Proteins 2002 Nov.15,49(3)321-5;Birkenfeld等人,Biochem J 2003 Jan.1,369(Pt 1)45-54;Espejo等人,Biochem J 2002 Nov.1,367(Pt 3)697-702;和Benzing等人,J Biol Chem 2002 Sep.6,277(36)32954-62。
在本發明方法的實際應用中,用治療有效量的本發明的化合物為對其有需要的溫血動物給藥。例如,可以用本發明的化合物為已經診斷為下列病症或者有其發展風險的溫血動物給藥,所述的病症選自任何一種或多種克朗氏病(Chrohn’s disease)、哮喘、類風溼性關節炎、局部缺血、再灌注損傷、移植物抗宿主疾病(GVHD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、阿爾茨海默病、同種異體移植排斥和成人T細胞白血病。
結節性硬化複合症 患有結節性硬化複合症(TSC)的患者通常在腦、心臟、腎臟和其它組織中發展了多發性病灶損傷(參見,例如,Gomez,M.R.Brain Dev.17(suppl)55-57,1995)。哺乳動物細胞的研究已經顯示TSC1(其表達錯構瘤蛋白)和TSC2(其表達抗結核菌素)的過量表達負向調節細胞增生並誘導G1/S抑制(arrest)(參見,例如,Miloloza,A.等人,Hum.Mol.Genet.91721-1727,2000)。其它研究顯示,錯構瘤蛋白和抗結合菌素在β-聯蛋白降解複合體水平上發揮功能,更具體地說,這些蛋白通過參與β-聯蛋白降解複合體來負向調節β-聯蛋白的穩定性和活性(參見,例如,Mak,B.C.等人,J.Biol.Chem.278(8)5947-5951,2003)。β-聯蛋白是一種95-kDa的蛋白質,它通過其與膜結合的鈣黏著蛋白家族成員的關聯參與細胞黏著,並作為Wnt/Wingless途徑的關鍵成分參與細胞增生和分化(參見,例如,Daniels,D.L.等人,Trends Biochem.Sci.26672-678,2001)。已經顯示這一途徑的破壞在人類和齧齒動物中是致癌的。本發明提供了調控β-聯蛋白活性的化合物,尤其是調節它與其它蛋白質的相互作用的化合物,因此可以用於TSC的治療。
為了進行說明而並非進行限定,提供了以下的實施例。
實施例 在製備實施例和實施例中使用了以下縮寫 BMS;硼二甲基硫醚 CbzOSu苄氧羰基N-羥基琥珀醯亞胺 DIC1,3-二異丙基碳二亞胺 DIEAN,N-二異丙基乙基胺 DIPEAN,N-二異丙基乙基胺 DMAPN,N-二甲基氨基吡啶 DMF二甲基甲醯胺 DMSO二甲亞碸 EA乙酸乙酯 EDC1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 EDCl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 FmocOsu9-芴氧羰基N-羥基琥珀醯亞胺 HATU[2-(1H-9-氮雜苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽 Hex.己烷 HOBTN-羥基苯並三唑 MC二氯甲烷 MeOH甲醇 -OBn-O-苄基 PPTS對甲苯磺酸吡啶鎓 PyBOP苯並三唑-1-基-氧代-三-吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸鹽 p-TsOH對甲苯磺酸 THF四氫呋喃 TLC薄層色譜 製備實施例1 (1)萘-2-羧酸醯胺的製備
向2-萘甲酸(25g,0.145mol)的MC(200ml)溶液中加入草醯氯(38ml,0.4356mol)和催化量的DMF,並在室溫下攪拌2小時。溶劑蒸發後,將粗的醯氯用MC(200ml)稀釋,在冰浴溫度下向其中滴加氫氧化銨的水溶液(160ml)。攪拌1小時後,通過抽濾收集沉澱的產物,在己烷中研製並乾燥,得到題述的化合物,其不經進一步提純在下一步中使用。
(2)萘-2-基-甲基胺的製備
在0℃下向上一步(1)中得到的粗醯胺的THF(100ml)溶液中,緩慢加入BMS(27.5ml,0.2904mol)。將生成的反應混合物加熱到60℃,加熱3小時,用5%HCl在0℃下淬滅,用EA萃取,並用5%HCl洗滌。合併水層,並將其用1N NaOH鹼化,再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到白色固體狀的題述化合物(13g)。
TLC體系1MC/MeOH=90∶10v/vRf=0.23 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm4.07(s,2H),7.48(m,3H),7.79(m,4H) 製備實施例2 (1)1H-吲哚-2-羧酸醯胺的製備
向吲哚-2-羧酸(1g,6.21mmol)的MC(30ml)溶液中加入草醯氯(1.64ml,18.62mmol)和催化量的DMF,並在室溫下攪拌2小時。溶劑蒸發後,將粗的醯氯用MC(20ml)稀釋,在冰浴溫度下向其中逐滴加入氫氧化銨的水溶液(7ml)。攪拌1小時後,通過抽濾收集沉澱的產物,在己烷中研製並乾燥,得到題述的化合物,其不經進一步提純在下一步中使用。
(2)(1H-吲哚-2-基)-甲基胺的製備
在0℃下向上一步(1)中得到的粗醯胺的THF(30ml)溶液中,緩慢加入BMS(1.18ml,12.42mmol)。將生成的反應混合物加熱到60℃,加熱3小時,用5%HCl在0℃下淬滅,用EA萃取,並用5%HCl洗滌。合併水層,並將其用1N NaOH鹼化,再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到黃色油狀的題述化合物(0.28g)。
TLC體系1MC/MeOH=90∶10v/vRf=0.15 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm3.98(s,2H),7.08(m,3H),7.26(m,1H),7.58(d,1H),9.10(br s,1H) 製備實施例3 (1)2-苄氧羰基氨基-4-氧代-丁酸苄酯的製備
在0℃下向Z-Asp-OBn(10g,0.028mol)的MC(200ml)溶液中加入草醯氯(2.93ml,0.0336mol)和催化量的DMF,並在室溫下攪拌2小時。溶劑蒸發後,將粗的醯氯溶解在苯(400ml)中,在0℃下緩慢加入三丁基氫化錫(15.1ml,0.056mol)和催化量的Pd(0),在室溫下攪拌過夜。溶劑蒸發後,加入醚(100ml)/10%KF水溶液(100ml),並在室溫下攪拌2小時,然後過濾,得到兩相溶液。分離有機層並將其濃縮,得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到淡黃色油狀的題述化合物Z-Asp-OBn醛(6g)。
Rf己烷/EA(2/1)中0.29 (2)2-苄氧羰基氨基-4,4-二甲氧基-丁酸苄酯的製備
向上一步(1)中得到的Z-Asp-OBn醛(6g,17.58mmol)的甲醇(100ml)溶液中加入催化量的p-TsOH,在室溫下攪拌5小時。反應完成後,將溶劑蒸發得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到淡黃色油狀的題述化合物Z-Asp-OBn乙縮醛(5g)。
RfHex./EA(2/1)中0.32 (3)2-苄氧羰基氨基-4,4-二甲氧基-丁酸的製備
將上一步(2)中得到的Z-Asp-OBn乙縮醛(0.5g,1.29mmol)溶解在THF(20ml)/NaOH(0.11g,2.1mmol)的水溶液(20ml)中,在室溫下攪拌30分鐘。起始原料完全消失後,蒸發濃縮反應混合物,然後用水/EA稀釋。分離水層,並在0℃下將其用1N HCl非常小心地酸化至pH 4-5,再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到淡黃色油狀的題述化合物Z-Asp-OBn乙縮醛(0.27g)。
TLC體系1己烷/EA=20∶10v/vRf=0.10 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm2.20(s,2H),3.35(d,6H),4.52(m,2H),5.19(t,2H),5.80(d,1H),7.37(br s,5H) (4)2-氨基-4,4-二甲氧基-丁酸的製備
在裝有氫氣球的反應容器中,加入上一步(3)中得到的Z-Asp-OBn乙縮醛(2.22g,5.73mmol)的乙酸(20ml)溶液和皮爾曼(Pearlman’s)催化劑,並在室溫下攪拌過夜。將生成的反應混合物過濾、濃縮並凍幹,得到粗產品,其不經進一步提純在下一步中使用。
(5)2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4,4-二甲氧基-丁酸的製備
向上一步(4)中得到的粗Asp-OH乙縮醛的THF(100ml)/水(100ml)溶液中,加入FmocOsu(2.13g,6.3mmol)/碳酸氫鈉(1.93g,22.92mmol),在室溫下攪拌過夜。將生成的反應混合物濃縮,並用水/EA稀釋。分離水相層,並在0℃下將其用1N HCl非常小心地酸化至pH 4-5,再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到泡沫固體狀的題述化合物(1.5g)。
RfHex./EA(2/1)中0.15 製備實施例4 (1)2-苄氧羰基氨基-戊酸的製備
向L-穀氨酸(20g,136mmol)的水/THF(1/1,400ml)溶液中加入碳酸氫鈉(45.7g,544mmol),在冰浴中冷卻至0℃。向反應混合物中加入CbzOSu(37.3g,150mmol),並在室溫下攪拌過夜。反應完成後,將生成的反應混合物用EA萃取。分離水層,將其在0℃下用濃HCl酸化至pH 2,並再次用EA萃取(4次)。濃縮有機層,得到粗產品,將其用柱層析提純,得到無色油狀的題述化合物(16g)。
RfMC/MeOH(9/1)中0.2 (2)4-(2-羧基-乙基)-5-氧代-噁唑烷-3-羧酸苄酯的製備
將上一步(1)中得到的N-Cbz-L-穀氨酸(4g,14.22mmol)、多聚甲醛(5g)、催化量的pTsOH、分子篩(5g)和甲苯(100ml)置於迪安-斯達克(Dean-Stark)裝置中,並回流直至起始原料消失。將生成的反應混合物冷卻至室溫,過濾並濃縮,得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到無色油狀的題述化合物(2g)。
Rf純EA中0.45 (3)5-氧代-5-(3-氧代-丙基)-噁唑烷-3-羧酸苄酯的製備
在0℃下向上一步(2)中得到的二保護的穀氨酸(2g,6.82mmol)的MC(200ml)溶液中加入草醯氯(0.7ml,7.5mmol)和催化量的DMF,並在室溫下攪拌2小時。溶劑蒸發後,將生成的粗醯氯溶解在THF(400ml)中,在0℃下向其中緩慢加入三丁基氫化錫(3.86ml,14.34mmol)和催化量的Pd(0),並在室溫下攪拌過夜。溶劑蒸發後,加入醚(100ml)/10%KF水溶液(100ml),在室溫下攪拌2小時,然後過濾,得到兩相溶液。分離有機層並將其濃縮,得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到無色油狀的題述化合物(0.7g)。
Rf己烷/EA(4/1)中0.23 (4)4-(3,3-二甲氧基-丙基)5-氧代-噁唑烷-3-羧酸苄酯的製備
向上一步(3)中得到的二保護醛(0.7g,2.53mmol)的MeOH(30ml)溶液中加入催化量的pTsOH,在室溫下攪拌7小時。反應完成後,通過蒸發溶劑來濃縮反應混合物,得到粗產品,將其通過柱層析提純,得到無色油狀的題述化合物(0.5g)。
Rf己烷/EA(4/1)中0.33 (5)2-苄氧羰基氨基-5,5-二甲氧基-戊酸的製備
將上一步(4)中得到的二保護乙縮醛(0.456g,1.411mmol)溶解在MeOH(20ml)/1N NaOH(10ml)中,在室溫下攪拌過夜。起始原料完全消失後,通過蒸發溶劑濃縮反應混合物,並將其用水/EA稀釋。分離水層,並在0℃下將其用1N HCl非常小心地酸化至pH 4-5,再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到無色油狀的題述化合物(0.35g)。
RfHex./EA(1/1)中0.1 (6)2-氨基-5,5-二甲氧基-戊酸的製備
在裝有氫氣球的反應容器中,加入上一步(5)中得到的Cbz-乙縮醛(0.35g,1.13mmol)的MeOH(10ml)溶液和催化量的10%Pd/C,在室溫下攪拌過夜。將生成的反應混合物過濾並濃縮,得到無色油狀的粗產品(0.2g),其不經進一步提純在下一步中使用。
RfHex./EA(1/1)中0.01 (7)2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5,5-二甲氧基-戊酸的製備
向上一步(6)中得到的粗Glu-OH乙縮醛的THF(10ml)/水(10ml)溶液中,加入FmocOsu(0.42g,1.24mmol)/碳酸氫鈉(0.5g,5.9mmol),並在室溫下攪拌過夜。溶劑蒸發後,將生成的反應混合物用水/EA稀釋。分離水層,並在0℃下將其用1N HCl非常小心地酸化至pH 4-5,並再次用EA萃取。合併有機層並將其濃縮,得到無色油狀的題述化合物(0.19g)。
TLC體系1純EARf=0.25 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm1.75(br m,4H),3.28(d,6H),3.43(q,1H),4.20(t,1H),4.38(m,3H),5.62(d,1H),7.31(m,4H),7.65(d,2H),7.75(d,2H) 製備實施例5 (1)2-叔丁氧羰基氨基-4-甲氧基羰基-氨基-丁酸的製備
向Boc-Dab-OH(3g,13.75mmol)的水(50mL)溶液中緩慢加入NaOH(2.75g,68.75mmol,5當量)直至pH>11,向其中加入甲苯(50mL)中的氯代甲酸甲酯(2.6g,27.5mmol,2當量)。將生成的反應混合物攪拌2小時。為了進行TLC檢驗,取出少量水相併用1NHCl酸化。通過TLC確認反應完成之後,分離有機相,並將水相用10%HCl溶液酸化,用EA萃取(5mL×2)。合併有機相,將其用無水Na2SO4乾燥並真空濃縮,得到無色油狀的粗產品(3.277g,11.86mmol,86%)。
TLC體系EARf=0.2 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm1.30~1.50(bs,9H),2.00~2.30(m,2H),3.10~3.30(m,2H),3.70(bs,3H),4.35(m,1H),5.40(m,1H),5.65(bs,1H)。
(2)(1-苄基氨基甲醯基-3-甲氧基羰基氨基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯的製備
在5℃下向上一步(1)中得到的2-叔丁氧羰基氨基-4-甲氧基羰基氨基-丁酸(1.1g,3.98mmol)的DMF(20mL)溶液中加入EDCI(763mg,3.98mmol,1當量)、HOBT(538mg,3.98mmol,1當量)和DIEA(1.4mL,7.96mmol,2當量),並攪拌1天。通過TLC檢驗確認反應完成後,在5℃下將反應溶液用10%HCl酸化(直至pH~4),並用EA(20mL)萃取。合併有機相,將其用飽和NaHCO3和鹽水洗滌,用無水Na2SO4乾燥並真空濃縮,得到殘餘物,加入EA和正己烷使其固化,並通過柱層析提純,得到白色固體狀的題述化合物(620mg,1.7mmol,43%)。
Rf=0.7(EA) 1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm1.45(bs,9H),1.75~2.10(m,2H),3.05(m,1H),3.45(m,1H),3.65(s,3H),4.25(m,H),4.45(d,2H,J=5.7Hz),5.45(m,1H),7.05(m,1H),7.20~7.45(m,5H)。
(3)(3-氨基-3-苄基羰基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯鹽酸鹽的製備
向上一步(2)中得到的(1-苄基氨基甲醯基-3-甲氧基羰基氨基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(1g,2.7mmol)的1,4-二噁烷(10mL)溶液中加入1,4-二噁烷(6.8mL,27mmol)中的4N HCl,並攪拌2小時。通過TLC檢驗確認反應完成後,將反應溶液濃縮並真空乾燥,得到白色固體狀的題述化合物。
實施例1 1-苄基-7-甲基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-A]嘧啶-2-酮 (A)N-苄基-3-[3-(2-[1,3]二氧戊環-2-基-乙基)-3甲基-硫脲基]-丙醯胺的製備
在0℃下將β-丙氨酸苄基醯氨基鹽酸鹽(1.0當量)和N-甲基嗎啉(2.2當量)的二氯甲烷懸浮液用硫光氣(1.2當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌2小時。將澄清的溶液用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。
將該產物溶解在二氯甲烷中,並在0℃下用2-(N-甲基-2-氨基乙基)-1,3-二氧戊環(0.9當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌4小時。將反應物用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯/己烷=5/2)提純該粗產品,得到純的產品。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm2.02(m,2H),2.60(m,2H),3.18(s,3H),3.82(m,2H),3.88(m,2H),4.03(m,4H),4.44(m,2H),4.91(m,1H),6.84(br.s,1H),7.25-7.38(m,5H); MS(m/z,ESI),352(MH+) (B)1-苄基-7-甲基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮的製備
將上一步(A)中得到的醯胺在60℃下用甲酸處理4天。減壓下將甲酸蒸發後,通過製備TLC(矽膠,乙酸乙酯/甲醇=5/1)提純殘餘物,得到純的題述產物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm2.05(m,1H),2.36(m,1H),2.64(d,1H),2.96(m,1H),3.30(m,3H),3.44(s,3H),4.42(d,1H),4.86(br.s,1H),5.08(d,1H),5.49(m,1H),7.25-7.38(m,5H); MS(m/z,ESI),290(MH+),311(M+Na) 實施例2 1,7-二苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-A]嘧啶-2-酮 (A)N-苄基-3-[3-苄基-(3,3-二乙氧基-丙基)-硫脲基]-丙醯胺的製備
在0℃下將β-丙氨酸苄基醯氨基鹽酸鹽(1.0當量)和N-甲基嗎啉(2.2當量)的二氯甲烷懸浮液用硫光氣(1.2當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌2小時。將澄清的溶液用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。將該產物溶解在二氯甲烷中,並在0℃下用2-(N-苄基-1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷(0.9當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌6小時。將生成的反應混合物用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯/己烷=2/1)提純該粗產品,得到純的題述產品。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.22(t,6H),1.95(m,2H),2.60(m,2H),3.46(m,2H),3.60(br.t,2H),3.63(m,2H),3.97(m,2H),4.38(m,2H),4.52(m,1H),5.07(br.s,2H),6.16(br.s,1H),6.98(br.s,1H),7.25-7.38(m,10H); MS(m/z,ESI),458(MH+) (B)1,7-二苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮的製備
將上一步(A)中得到的醯胺在60℃下用甲酸處理4天。減壓下將甲酸蒸發後,通過製備TLC(矽膠,乙酸乙酯/甲醇=5/1)提純殘餘物,得到純的產品。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm1.94(m,1H),2.24(m,1H),2.62(m,1H),3.01(m,1H),3.18(m,1H),3.43(m,1H),3.62(m,1H),4.39(d,1H),4.51(m,1H),4.91(m,1H),5.02(d,1H),5.26(d,1H),5.53(m,1H),7.25-7.40(m,10H); MS(m/z,APCI),366(MH+) 實施例3 1,7-二苄基-六氫-嘧啶並[1,6-A]嘧啶-2,6-二酮 (A)N-苄基-3-[3-苄基-(3,3-二乙氧基-丙基)-硫脲基]-丙醯胺的製備
在0℃下將β-丙氨酸苄基醯氨基鹽酸鹽(1.0當量)和N-甲基嗎啉(3.2當量)的二氯甲烷懸浮液用硫光氣(0.7當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌2小時。將澄清的溶液用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。將該產物溶解在二氯甲烷中,並在0℃下用2-(N-苄基-1-氨基3,3-二乙氧基丙烷(0.9當量)處理10分鐘。使得反應混合物升溫至室溫,並繼續攪拌4小時。將生成的反應混合物用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、蒸餾水、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯/己烷=2/1)提純該粗產品,得到純的題述產品。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.23(t,6H),1.87(m,2H),2.55(m,2H),3.24(m,2H),3.49(m,2H),3.59(m,2H),3.65(m,2H),4.45-4.58(m,5H),5.62(br.s,1H),6.57(br.s,1H),7.25-7.48(m,10H); MS(m/z,ESI),442(MH+) (B)1,7-二苄基-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2,6-二酮的製備
將上一步(A)中得到的醯胺在60℃下用甲酸處理4天。減壓下將甲酸蒸發後,通過製備TLC(矽膠,乙酸乙酯)提純殘餘物,得到題述的化合物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.89(m,1H),2.19(m,1H),2.58(m,1H),2.75(m,1H),3.02(m,3H),4.42(d,J=12.4Hz,1H),4.55(d,J=2.4Hz,2H),4.65(m,1H),4.78(m,1H),4.98(d,J=12.4Hz,1H),7.25-7.38(m,10H); MS(m/z,ESI),350(MH+) 實施例4 1,7-二苄基-6-氧代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮 (A)(3-溴-1-甲氧基丙烷-1-氧代)-連接的ArgoGel樹脂的製備
將乾燥ArgoGel樹脂和對甲苯磺酸吡啶鎓(pyridiniumpara-toluensulphonate)(240mg,0.96mmol)的1,2-二氯乙烷(15mL)懸浮液加熱至回流,同時連續去除溶劑和痕量的水。除去大約5mL的餾分後,加入3-溴-1,1-二甲氧基丙烷(700mg,3.84mmol)的1,2-二氯乙烷(5mL)溶液,混合物保持回流4小時,連續去除EtOH/EDC,之後用DMF和二噁烷洗滌樹脂,然後凍幹得到要求的產品。
(B)(3-苄基氨基-1-甲氧基丙烷-1-氧代)-連接的ArgoGel樹脂的製備
將苄基胺(520mg,4.85mmol)的DMSO(4mL)溶液加入到溴乙縮醛樹脂(1g,0.48mmol)中,將懸浮液在60℃下振蕩15小時。將生成的樹脂過濾,並用DMSO、MeOH和MC洗滌,真空乾燥過夜。通過氯醌測試檢測二級胺。
(C)β-丙氨酸苄基胺脲的製備
在室溫下向β-丙氨酸苄基醯胺HCl鹽(80mg,0.36mmol)的N-甲基嗎啉(120μl)和MC(2mL)溶液中加入三光氣(0.72mmol)。10分鐘後,將生成的異氰酸酯溶液加入到上一步(2)中得到的二級胺樹脂(100mg,0.048mmol)的懸浮液中,並在室溫下持續振蕩3小時。用DMF、MeOH和MC洗滌樹脂,並通過氯醌測試檢測反應的完成。
(D)1,7-二苄基-6-氧代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮的製備
將步驟(C)中含硫脲基團的樹脂用甲酸處理,並持續振蕩15分鐘。濾去樹脂,將濾液濃縮並通過層析法(矽膠)提純,得到題述的化合物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm1.94(m,1H),2.24(m,1H),2.62(m,1H),3.01(m,1H),3.18(m,1H),3.43(m,1H),3.62(m,1H),4.39(d,1H),4.51(m,1H),4.91(m,1H),5.02(d,1H),5.26(d,1H),5.53(m,1H),7.25-7.40(m,10H); MS(m/z,APCI),366(MH+) 實施例5 1,7-二苄基-2-氧代-6-硫代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-4-羧酸苄酯 (A)2-異硫氰酸根合-琥珀酸1-苄酯4-(9H-芴-9-基甲基)酯的製備
向2-叔丁氧羰基氨基-琥珀酸1-苄酯(1g,3.09mmol)的MC溶液中加入DIC(532μl,1.1當量)、DMAP(188mg,0.5當量)和芴基甲醇(635mg,1.05當量)。反應完成後,將生成的反應混合物用1N鹽酸和飽和NaHCO3溶液洗滌,並通過柱層析(矽膠)提純,得到芴基甲酯(400mg)。
將該酯稀釋於二噁烷(10ml)中,並加入二噁烷的4NHCl溶液,並持續攪拌2小時,以除去Boc保護基。反應完成後,將溶液蒸乾。將胺的HCl鹽用MC和N-甲基嗎啉稀釋,在大約0℃下加入硫光氣(1.2當量)。反應完成後,將混合物用10%KHSO4溶液、蒸餾水、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物。通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯/己烷=1/1)提純該粗產品,得到純的題述產品。
(B)天冬氨酸苄基,芴基酯硫脲
將上一步(A)中得到的異氰酸酯(0.5mmol)的MC溶液與N-甲基嗎啉,加入到如實施例4步驟(B)中所得到的二級胺樹脂(200mg,0.04mmol)的懸浮液中,並在室溫下持續振蕩3小時。將生成的樹脂用DMF、MeOH和MC洗滌,並通過氯醌測試檢測反應的完成。
(C)天冬氨酸硫脲苄基醯胺
將上一步(B)中得到的樹脂在DMF(4mL)中溶脹30分鐘,並加入25%的哌啶溶液,以切斷芴基甲基保護。將生成的樹脂用DMF、MeOH和MC洗滌。將樹脂在減壓下乾燥,並再次溶脹,向其中加入DIC(8μL,0.05mmol)、HOBt(8mg,0.05mmol)和DIEA(18μL,0.1mmol),以對酸進行活化。振蕩30分鐘後,加入苄基胺並持續振蕩過夜,得到所需的苄基醯胺樹脂。
(D)1,7-二苄基-2-氧代-6-硫代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-4-羧酸苄酯的製備
將上一步(C)中得到的樹脂在MC(4mL)中溶脹,向其中加入PPTS(10mg),並在60℃下加熱4小時,得到題述的化合物。MS(m/z,ESI),500(MH+)。
實施例6 7-苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-1-羧酸苄酯 (A){3-[3-苄基-3-(3,3-二乙氧基-丙基)-硫脲基]-丙基}-氨基甲酸苄酯的製備
在0℃下將Cbz-二氨基丙烷HCl鹽(1.0當量)和N-甲基嗎啉(2.2當量)的MC懸浮液用硫光氣(1.2當量)處理10分鐘。使得生成的溶液升溫至室溫,並繼續攪拌2小時。將生成的澄清溶液用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4、水、和飽和NaCl洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物,將其溶解在MC中,並在0℃下用N-苄基-1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷(0.9當量)處理10分鐘,然後使其升溫至室溫並繼續攪拌6小時。將生成的反應混合物用乙酸乙酯稀釋,並用10%KHSO4溶液、水、飽和NaHCO3、水、和飽和NaCl洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物,隨後使其通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯/己烷,2/1)提純,得到題述的化合物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.17(t,6H),1.5(bs,2H),1.75(t,2H),1.92(m,2H),3.20(q,2H),3.45(m,2H),3.60(m,4H),3.75(q,2H),4.51(t,1H),5.06(s,4H),6.75(br.s,1H),7.25-7.38(m,10H); MS(m/z,ESI),442(M-OEt+)。
(B)7-苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-1-羧酸苄酯的製備
向上一步(A)中得到的醯胺的MC溶液中加入PPTS,並在70℃下攪拌過夜。將生成的反應混合物在減壓下濃縮,得到殘餘物,將其通過製備TLC(純乙酸乙酯)提純,得到題述的化合物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.89(m,2H),1.95(m,1H),2.63(m,1H),2.80(m,1H),3.10(m,1H),3.45(m,1H),3.89(m,1H),4.01(m,1H),4.39(d,1H),4.51(m,1H),4.92(m,2H),5.10(m,2H),7.16-7.4(m,10H); MS(m/z,ESI),396(MH+) 實施例7 8-乙醯基-6-氧代-六氫-吡嗪並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苄酯 (A)[乙醯基-(2,2-二甲氧基-乙基)-氨基]-乙酸的製備
在室溫下向苄基甘氨酸HCl鹽(1當量)的MeOH溶液中加入二甲氧基乙醛(1.05當量),然後加入NaCNBH3(1.2當量),攪拌5小時。將生成的反應混合物在減壓下濃縮,得到油狀殘餘物,將其溶解在MC中,並用飽和NaHCO3溶液、水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物,將其溶解在MC中,並在0℃下用三乙胺(3當量)和乙醯氯(1.1當量)處理。
反應完成後,將生成的反應混合物用飽和NaHCO3溶液、水、和飽和NaCl溶液洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物,將其通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯)提純,得到純的產品。將該產品用10%Pd/C和含H2的氣球氫化,得到題述的化合物,其不經進一步提純用於下一步中。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm2.09(s,1H),2.20(s,2H),3.40(d,6H),3.48(d,2H),4.16(s,2H),4.44(m,1H) (B)(3-{2-[乙醯基-(2,2-二甲氧基-乙基)-氨基]-乙醯基氨基}-丙基)-氨基甲酸苄酯的製備
向上一步(A)中得到的酸(1當量)的MC溶液中加入HATU(1當量)、DIPEA(3當量)和Cbz-二氨基丙烷HCl鹽(1.0當量),並在室溫下攪拌3小時。將反應混合物在減壓下濃縮,得到油狀殘餘物,將其通過製備TLC提純,得到題述的化合物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.60(m,2H),2.01(s,1H),2.20(s,2H),3.20(d,2H),3.24(m,2H),3.40(d,6H),3.50(d,2H),4.06(s,2H),4.44(m,1H),5.08(s,2H),5.18(d,1H),6.91(br d,1H),7.16(br s,5H); MS(m/z,ESI),396(MH+) (C)8-乙醯基-6-氧代-六氫-吡嗪並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苄酯的製備
於室溫下在上一步(B)中得到的Cbz保護的醯胺前體的MC溶液中,加入PPTS(1當量),並加熱至70℃,加熱5小時。濃縮生成的反應混合物,得到殘餘物,其表徵如下。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.90(m,2H),2.10(s,1H),2.30(s,2H),2.61(m,1H),2.82(m,1H),3.15(m,1H),3.50(m,1H),3.9(m,1H),4.0(m,1H),4.2(m,1H),4.3(s,1H),4.47(m,1H),5.08-5.18(m,2H),5.28(br s,1H),7.16(br s,5H); MS(m/z,ESI),332(MH+) 實施例8 7-苄氧基氨基-4-苄基氨基甲醯基-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯 (A)[1-(1-苄基氨基甲醯基-3-甲氧基羰基氨基-丙基氨基甲醯基)-3,3-二甲氧基-丙基]-氨基甲酸苄酯的製備
向製備實施例3(3)中得到的Cbz保護的胺基酸乙縮醛(100mg,1.3當量)的MC溶液中,加入PyBOP(酸的1當量)、DIPEA(酸的6當量)和HOBt(1.3當量),並攪拌30分鐘。向反應混合物中加入氨基苄基醯胺HCl鹽(71mg,0.27mmol),攪拌7小時。將生成的反應混合物用飽和NaHCO3、水、和飽和NaCl洗滌。將有機層用MgSO4乾燥並濃縮,得到油狀殘餘物,將其通過柱層析(矽膠,乙酸乙酯)提純,得到題述的化合物(50mg,產率35%)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm2.1(t,2H),3.05(m,1H),3.50(ss,6H),3.45(m,1H),3.75(s,3H),4.25(q,1H),4.41(m,2H),4.55(m,1H),5.0(q,2H),5.3(m,1H),5.95(m,1H),7.2-7.4(m,10H) (B)4-苄基氨基甲醯基-7-苄氧基氨基甲醯基-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯的製備
將上一步(A)中得到的乙縮醛醯胺環化前體(5mg,0.009mmol)溶解在甲酸(1mL)中,攪拌過夜。將生成的反應混合物濃縮至乾燥,其不經進一步提純用於下一步中。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm2.25(m,2H),2.61(t,2H),3.24(m,1H),3.50(s.3H),3.55(m,1H),3.95(m,1H),4.45(m,2H),4.65(d,1H),4.8(m,2H),5.3(m,1H),5.7(d,1H),7.15-7.4(m,10H),7.85(m,1H) (C)7-苄氧基氨基-4-苄基氨基甲醯基-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯的製備
在室溫下將上一步(B)中得到的Cbz雙環化合物的MeOH溶液和Pd/C(1mg)置於裝有氫氣球的反應容器中,攪拌2小時。反應完成後,將反應混合物用硅藻土過濾器過濾除去Pd/C,並在減壓下蒸發溶劑。將生成的油狀殘餘物溶解在MC中,向其中加入苯甲酸(1.1當量)的MC溶液和PyBOP(1.1當量)、HOBt(1.1當量)和DIPEA(3當量),攪拌30分鐘。向生成的活化酸的溶液中加入胺溶液,持續攪拌3小時。將生成的反應混合物在減壓下濃縮,得到油狀殘餘物,將其通過製備TLC提純,得到題述的化合物。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm2.25(m,2H),2.65(m,2H),3.27(m,1H),3.70(s,3H),3.6(m,1H),4.10(m,1H),4.54(m,2H),4.8(t,1H),5.45(m,1H),7.15-7.42(m,10H),7.9(d,1H),8.31(t,1H) 實施例9 7-苄氧基氨基-4-(1-羧基-乙基氨基甲醯基)-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯 圖3顯示了用於說明實施例9的方法學的合成方案。
將2-氯三苯甲基氯樹脂(200mg,1mmol/g)和Fmoc-丙氨酸(1.5當量,市售)和DIEA(2當量)的DCE(2mL)溶液置於具螺帽的小瓶中。將反應混合物在室溫下振蕩12小時。通過過濾收集樹脂,並將其用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌,得到第一組成片段。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-甲氧基羰基氨基-丁酸(1.5當量,第二組成片段)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,並用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌產物混合物。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5,5-二甲氧基-戊酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入市售的苯甲酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
將樹脂在室溫下用甲酸(每孔1.2mL)處理18小時。之後,過濾除去樹脂,將濾液在減壓下濃縮,得到油狀產品。1H-NMR(300MHz,MeOH-d4)δ1.40(d,3H),1.90(m,1H),2.20(m,1H),2.30~2.25(m,2H),3.15(m,1H),3.20(m,1H),3.45(s,3H),3.40~3.60(m,1H),4.20~4.40(m,2H),4.70(t,1H),5.40(t,1H),7.25~7.45(m,3H),7.75(d,2H); MS(m/z,ESI)433(MH+),455(MNa+) 實施例10 7-苄氧基氨基-4-(2-羧基-丙基氨基甲醯基)-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯 圖4顯示了用於說明實施例10的方法學的合成方案。
將2-氯三苯甲基氯樹脂(200mg,1mmol/g)和Fmoc-β-丙氨酸(1.5當量)和DIEA(2當量)的DCE(2mL)溶液置於具螺帽的小瓶中。在室溫下將反應混合物振蕩12小時。通過過濾收集樹脂,並將其用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌,得到第一組成片段。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-甲氧基羰基氨基-丁酸(1.5當量,第二組成片段)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5,5-二甲氧基-戊酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
向反應前用DMF溶脹的樹脂中加入在DMF中的25%哌啶。之後,將反應混合物在室溫下振蕩30分鐘。重複該脫保護步驟,然後將產物混合物用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌。向樹脂中加入市售的苯甲酸(1.5當量)、DIC(1.5當量)和HOBT(1.5當量)的NMP溶液。將反應混合物在室溫下振蕩12小時後,用DMF、MeOH,然後用DCM洗滌樹脂。
將樹脂在室溫下用甲酸(每孔1.2mL)處理18小時。過濾除去樹脂後,將濾液在減壓下濃縮,得到油狀產品。1H-NMR(300MHz,MeOH-d4)δ1.40(d,3H),1.90(m,1H),2.20(m,1H),2.30~2.50(m,2H),3.15(m,2H),3.35(s,3H),3.40~3.60(m,3H),4.20~4.40(m,2H),4.70(t,1H),5.40(t,1H),7.25~7.45(m,3H),7.75(d,2H)。
MS(m/z,ESI)447(MH+),469(MNa+) 本文列出了各種詳細描述某些過程、化合物和/或組合物的參考文獻,並在此引入其全部內容作為參考。
應當意識到,儘管為說明的目的在此描述了本發明特定的實施方式,但是在不脫離本發明精神和範圍的情況下可以進行各種修改。因此,本發明除了受所附權利要求書限制外,不受其它限制。
權利要求
1.一種選自以下的化合物
1-苄基-7-甲基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮;
1,7-二苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮;
1,7-二苄基-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2,6-二酮;
1,7-二苄基-6-氧代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-2-酮;
1,7-二苄基-2-氧代-6-硫代-八氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-4-羧酸苄酯;
7-苄基-6-硫代-六氫-嘧啶並[1,6-a]嘧啶-1-羧酸苄酯;
8-乙醯基-6-氧代-六氫-吡嗪並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苄酯;
7-苄氧基氨基-4-苄基氨基甲醯基-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯;
7-苄氧基氨基-4-(1-羧基-乙基氨基甲醯基)-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯;和
7-苄氧基氨基-4-(2-羧基-丙基氨基甲醯基)-6-氧代-六氫-吡咯並[1,2-a]嘧啶-1-羧酸甲酯。
2.一種藥物組合物,其包括根據權利要求1所述的化合物和藥學可接受的載體。
3.根據權利要求1所述的化合物在製備鑑別生物活性化合物的藥物中的應用。
4.根據權利要求1所述的化合物在製備在溫血動物中抑制激酶的藥物中的應用。
5.根據權利要求1所述的化合物在製備在溫血動物中抑制CAAX的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了模擬生物活性肽和蛋白質的β-鏈區域二級結構的結構受限化合物。這樣的β-鏈模擬物結構在廣泛的領域範圍內具有應用性,包括用作診斷劑和治療劑。本文還公開了含有本發明的β-鏈模擬物結構的庫,以及對其進行篩選以鑑別生物活性成員的方法。
文檔編號A61P25/02GK101805340SQ201010126139
公開日2010年8月18日 申請日期2003年5月30日 優先權日2003年5月30日
發明者M·卡恩, E·馬薩卡特斯, 文聖煥, 鄭宰旭 申請人:(株)中外製藥