一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備及冰鮮保藏的方法
2023-05-27 14:12:56
專利名稱：一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備及冰鮮保藏的方法
技術領域：
本發明涉及一種冰點活性蛋白酶的製備方法及其應用。
背景技術：
金槍魚作為一種深海魚類，素來以營養價值高、純天然、無汙染而享譽國際市場， 並有"海洋黃金"之稱，肉富含優質蛋白、高肌內脂肪和高維生素A、 D，其胺基酸組成與人體 必需的胺基酸組成相似，因此利用率很高。長期以來，金槍魚一直以凍品的形式出口，隨著 國外消費者對肉製品的需求越來越高，以冰鮮品形式出口的肉質食品比例越來越大(羅殷 等，200S)。所謂冰鮮品，是指海產品金槍魚殺後，儘快加工，經過預冷、分割、包裝後，迅速冷 卻至肉中心溫度_2 Ot:然後裝入保溫容器的一種肉質食品的保鮮產品(趙燕寧，1998)。 冰鮮品與凍品相比，更好的保持了海產品原有的色澤和香味，免去了凍品解凍過程，減少了 肉類的營養成分的損失。在海產品的冰鮮品基礎上，如何增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的 質量，是需要解決的關鍵問題。由於冰點活性蛋白酶在(TC及以下的溫度下具有催化效率高 的特點，因此在肉食品和水產品加工等低溫環境工業具有廣泛應用前景。但現有方法製備 得到的用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的極端耐受性差，極大的限制了其在金槍魚 類冰鮮品的應用。
發明內容
本發明是為了解決現有方法製備得到的用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶 的極端耐受性差的問題，而提供了一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備及冰 鮮保藏的方法。 本發明用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法按照以下步驟進行
—、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種於優化培養基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉速為180 220r/min的條件下振蕩培養93 100h得到培養液，其中優化培養基 按照重量份數比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH 值為7. 5 ; 二、培養液在10000r/min條件下離心10min，然後將上清液和硫酸銨按照2. 5 3.5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在O 0. 5。C條件下靜置7. 5 8. 5h，然後在12000r/min 條件下離心30min，棄去上清液，將離心後的沉澱和50mmol/L、 pH為7. 5的Tris-HCl緩衝 液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4t:條件下透析7. 5 8. 5h，然後在fC條件下經 超濾膜濃縮後即得到用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本發明冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將金 槍魚清洗乾淨，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本發明的冰點活性蛋白酶，冰點 活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然後按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內，密封，快速冷卻，放 入-2 (TC冷庫，即實現了對金槍魚的冰鮮保藏。 本發明製作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26°C，在0 l(TC條件能 保持30%以上的相對活力，在NaCl濃度為0 2mol/L的條件下酶的活力保持不變，本發明 的冰點活性蛋白酶極端耐受性好，使用本發明冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的金槍魚有明顯 嫩化現象，本發明冰點活性蛋白酶明顯的抑制了金槍魚的TvB脬值、pH值和菌落總數的上 升速度，達到保鮮的目的，使用本發明冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚，與新鮮的金 槍魚肉相比較，穀氨酸和組氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉類的風味，增鮮作用明顯， 使用本發明冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚的保鮮期達到50天以上，保鮮期長，由 此可知，使用本發明的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚能更好的保持原有的色澤和 香味，免去了凍品解凍過程，減少了肉類的營養成分的損失，在保鮮的基礎上，又能增加冰 鮮品的風味，提高冰鮮品的質量。
圖1為用具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚 冰鮮品中揮發性鹽基氮含量變化圖； 圖2為用具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚 冰鮮品中揮發性鹽基氮含量變化圖； 圖3為用具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚 冰鮮品中pH變化圖； 圖4為具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚冰 鮮品中pH變化圖； 圖5用具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚冰 鮮品中總菌數量圖； 圖6為具體實施方式
十製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚冰 鮮品中總菌數量圖。
具體實施例方式
本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一 本實施方式用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法 按照以下步驟進行 —、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種於優化培養基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉速為180 220r/min的條件下振蕩培養93 100h得到培養液，其中優化培養基 按照重量份數比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH 值為7. 5 ; 二、培養液在10000r/min條件下離心10min，然後將上清液和質量濃度為65% 75%的硫酸銨按照2. 5 3. 5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在0 0. 5"條件下靜置7. 5 8. 5h，然後在12000r/min條件下離心30min，棄去上清液，將離心後的沉澱和50mmol/L、 pH 為7. 5的Tris-HCl緩衝液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4。C條件下透析7. 5
8. 5h，然後在4t:條件下經超濾膜濃縮後即得到用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本實施方式步驟三中陳海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代謝產物等。 本實施方式步驟二中超濾膜的分子量為50Kda。 用實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行 將金槍魚清洗乾淨，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本實施方式的冰點活性蛋白 酶，冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰 和0. 02 0. 04g的NaCl，然後按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內，密封，快速冷卻，放入 (TC -2t:冷庫，即實現了對金槍魚進行冰鮮保藏。 本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26t:，在0 l(TC條 件能保持30%以上的相對活力，在NaCl濃度為0 2mol/L的條件下酶的活力保持不變，本 實施方式的冰點活性蛋白酶耐受性好，使用本實施方式冰點活性蛋白酶對冰鮮保藏後的金 槍魚有明顯嫩化現象，本實施方式冰點活性蛋白酶明顯的抑制了金槍魚的TvB脬值、pH值 和菌落總數的上升速度，達到保鮮的目的，使用本實施方式冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏 的金槍魚，與新鮮的金槍魚肉相比較，穀氨酸和組氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉類 的風味，增鮮作用明顯，使用本實施方式冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚的保鮮期 達到50天以上，保鮮期長。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中優化培養基 按照重量份數比由5份的酪蛋白、3. 75份的檸檬酸鈉、0. 2份的吐溫-80、 1份的酵母提取 物、10份的NaCl和1000份的陳海水組成。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一至二不同的是步驟一中在溫度 為『C、轉速為200r/min的條件下振蕩培養96h得到培養液。其它步驟及參數與具體實施 方式一至二相同。 具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三不同的是步驟二中上清液 和硫酸銨按照3 : 7的重量比混合。其它步驟及參數與具體實施方式
一至三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四不同的是步驟二中在0°C 條件下靜置8h。其它步驟及參數與具體實施方式
一至四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五不同的是步驟二中透析 8h。其它步驟及參數與具體實施方式
一至五相同。
具體實施方式
七本實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照 以下操作進行將金槍魚清洗乾淨，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本發明的冰 點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入 0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然後按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內，密封， 快速冷卻，放入_2 ot:冷庫，即實現了對金槍魚的冰鮮保藏。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
七不同的是冰點活性蛋白酶的加入 量為215U/g魚肉。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
七或八不同的是向每克的魚片中加入2g的碎冰和5g的NaCl。其它步驟及參數與具體實施方式
七或八相同。
具體實施方式
十本實施方式用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法
按照以下步驟進行 —、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種於優化培養基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉速為180 220r/min的條件下振蕩培養93 100h得到培養液，其中優化培養基 按照重量份數比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH值 為7.5 ; 二、培養液在10000r/min條件下離心10min，然後將上清液和硫酸銨按照3 : 7的 重量比混合，在0 0. 5t:條件下靜置7. 5 8. 5h，然後在12000r/min條件下離心30min， 棄去上清液，將離心後的沉澱和50mmol/L、pH為7. 5的Tris HC1緩衝液按照1 : 1的重量 比混合，在4t:條件下透析7. 5 8. 5h，然後在4t:條件下經超濾膜濃縮後即得到用於金槍 魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本實施方式步驟三中陳海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代謝產物等。 本實施方式步驟二中超濾膜的分子量為50Kda。 用實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將 大目金槍魚或黃鰭金槍魚清洗乾淨，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本實施方式的 冰點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉，同時向每克的魚片中0. 2g的碎 冰和0. 03g的質量濃度為4%的NaCl，然後按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內，密封，快 速冷卻，放入(TC -21:冷庫，即實現了對金槍魚的冰鮮保藏(得到了金槍魚冰鮮品)。
本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26t:，在0 l(TC條 件能保持30%以上的相對活力，O 2麗aCl濃度下酶的活力保持不變，本實施方式的冰點 活性蛋白酶耐受性好，使用本實施方式冰點活性蛋白酶的金槍魚冰鮮品有明顯嫩化現象。
圖1為用本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚冰鮮 品中揮發性鹽基氮含量變化圖，圖1中^""^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶製作金槍 魚冰鮮品醫表示未經任何處理的金槍魚；圖2為用本實施方式製作得到的冰點活 性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚冰鮮品中揮發性鹽基氮含量變化圖，圖2中^ ^^表 示用實施方式冰點活性蛋白酶製作金槍魚冰鮮品，醫表示未經任何處理的金槍魚； 圖3為用本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚冰鮮品中pH變 化圖，圖3中^ ^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶製作金槍魚冰鮮品，醫表示 未經任何處理的金槍魚；圖4為用本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃 鰭金槍魚冰鮮品中pH變化圖，圖4中^""^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶製作金槍 魚冰鮮品，醫表示未經任何處理的金槍魚；圖5為用本實施方式製作得到的冰點活 性蛋白酶冰鮮保藏後的大目金槍魚冰鮮品中總菌數量圖，圖5中》 ^ 表示用實施方式 冰點活性蛋白酶製作金槍魚冰鮮品，墨表示未經任何處理的金槍魚；圖6為用本實 施方式製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚冰鮮品中總菌數量圖，圖6中 ""^^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶製作金槍魚冰鮮品，墨表示未經任何處 理的金槍魚
6
從圖1 6中可以看出，大目金槍魚和黃鰭金槍魚在冰點性蛋白酶處理後，能夠較 明顯的抑制TvB脬值、pH值和菌落總數的上升速度，使用本實施方式製作得到的冰點活性 蛋白酶實現了金槍魚保鮮的目的。 冰點活性蛋白酶對大目金槍魚和黃鰭金槍魚酶解影響如表1所示。 表l
大目金槍魚黃鰭金槍魚胺基酸冰點活性蛋白酶對照冰點活性蛋白酶對照
(%)(。/。)(%)(%)
穀氨酸(Glu)1. 250. 621. 040. 57
甘氨酸(Gly)0. 230. 180. 340. 13
丙氨酸(Ala)0. 400. 260. 280. 24
天冬氨酸(Asp)0. 240. 150. 230. 14
蘇氨酸(Thr)0. 160. 100. 140. 09
絲氨酸(Ser)0. 160. 100. 160. 12
纈氨酸(Val)0. 350. 270. 270. 24
蛋氨酸(Met)0. 520. 370. 480. 33
異亮氨酸(Ile)0. 640. 450. 510. 28
亮氨酸(Leu)0. 380. 250. 420. 27
酪氨酸(Tyr)0. 290. 190. 280. 19
苯丙氨酸(Phe)0. 260. 170. 260. 16
賴氨酸(Lys)0. 310. 200. 370. 21
組氨酸(His)2. 851. 702. 431. 54
精氨酸(Arg)0. 160. 110. 150. 13
脯氨酸(Pro)0. 140. 090. 170. 09
游離胺基酸總量9. 575. 227. 534. 73 注"冰點活性蛋白酶"表示用本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後 的黃鰭金槍魚冰鮮品，"對照"表示未經任何處理的金槍魚。 從表1中的數據看出，本實施方式製作得到冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金 槍魚冰鮮品中釋放出了更多的游離胺基酸，穀氨酸和組氨酸含量顯著增加，增加肉類的風 味，起到增鮮作用，經本實施方式製作得到冰點活性蛋白酶冰鮮保藏後的黃鰭金槍魚冰鮮 品保鮮期為50天，保鮮期長。 使用本實施方式製作得到的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚更好的保持 原有的色澤和香味，免去了凍品解凍過程，減少了肉類的營養成分的損失，在保鮮的基礎 上，又能增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的質量
權利要求
一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法，其特徵在於用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法按照以下步驟進行一、南極海冰細菌Colwellia sp.NJ341接種於優化培養基上，在溫度為7.5～8.5℃、轉速為180～220r/min的條件下振蕩培養93～100h得到培養液，其中優化培養基按照重量份數比由4.8～5.2份的酪蛋白、3.6～3.9份的檸檬酸鈉、0.15～0.25份的吐溫-80、0.8～1.2份的酵母提取物、8～12份的NaCl和950～1050份的陳海水組成，pH值為7.5；二、培養液在10000r/min條件下離心10min，然後將上清液和硫酸銨按照2.5～3.5∶6.5～7.5的重量比混合，在0～0.5℃條件下靜置7.5～8.5h，然後在12000r/min條件下離心30min，棄去上清液，將離心後的沉澱和50mmol/L、pH為7.5的Tris-HC1緩衝液按照1∶0.8～1.2的重量比混合，在4℃條件下透析7.5～8.5h，然後在4℃條件下經超濾膜濃縮後即得到用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。
2. 根據權利要求1所述的一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法，其 特徵在於步驟一中優化培養基按照重量份數比由5份的酪蛋白、3. 75份的檸檬酸鈉、0. 2份 的吐溫80、 1份的酵母提取物、10份的NaCl和1000份的陳海水組成。
3. 根據權利要求1或2所述的一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方 法，其特徵在於步驟一中在溫度為『C、轉速為200r/min的條件下振蕩培養96h得到培養 液。
4. 根據權利要求3所述的一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法，其 特徵在於步驟二中上清液和硫酸銨按照3:7的重量比混合。
5. 根據權利要求1、2或4所述的一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方 法，其特徵在於步驟二中在ot:條件下靜置8h。
6. 根據權利要求1所述的一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備方法，其 特徵在於步驟二中透析8h。
7. 冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特徵在於冰點活性蛋白酶對金槍 魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將金槍魚清洗乾淨，切成3cm 4cm厚的魚片， 向魚片中加入本發明的冰點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉， 同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然後按層魚層冰的形 式放入塑料薄膜袋內，密封，快速冷卻，放入_2 ot:冷庫，即實現了對金槍魚的冰鮮保藏。
8 根據權利要求7所述的冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特徵在於 冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉。
9. 根據權利要求7或8所述的冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特徵 在於向每克的魚片中加入2g的碎冰和0. 03g的NaCl。
全文摘要
一種用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的製備及冰鮮保藏的方法，它涉及一種冰點活性蛋白酶的方法及其應用。本發明解決了現有方法製備得到的用於金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的極端耐受性差的問題。方法一、南極海冰細菌Colwellia sp.NJ341接種於優化培養基上進行培養得到培養液；二、培養液經離心、透析、超濾膜濃縮得到冰點活性蛋白酶；冰鮮保藏的方法向魚片中加入冰點活性蛋白酶，同時加入碎冰和NaCl，密封，冷卻。本發明方法得到的冰點活性蛋白酶極端耐受性好，使用本發明的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚能更好的保持原有的色澤和香味，在保鮮的基礎上，又能增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的質量。
文檔編號A23B4/09GK101724616SQ20101030028
公開日2010年6月9日 申請日期2010年1月14日 優先權日2010年1月14日
發明者侯豔華, 李寧, 林學政, 沈繼紅, 王全富, 閆培生 申請人:哈爾濱工業大學