微流化水包油乳狀液和疫苗組合物的製作方法

2023-05-27 18:33:06 1

專利名稱:微流化水包油乳狀液和疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明大體上涉及疫苗領域，並特別涉及用於在動物體內提高免疫應答的輔佐製劑。具體而言，本發明涉及亞微型水包油乳狀液作為疫苗佐劑以提高抗原免疫原性的用途。本發明提供了亞微型水包油乳狀液製劑、含有併入這種乳狀液中的抗原的疫苗組合物、以及這種乳狀液和疫苗的製備方法。本發明還提供了包含由適用於疫苗的皂草糖苷和甾醇形成的絡合物的組合物。
背景技術：
細菌、病毒、寄生物和支原體傳染廣泛分布在動物中，例如牛、豬和寵物。由這些傳染劑引起的疾病通常對殺菌劑藥物治療具有抵抗力，由此沒有有效的治療手段。因此，越來越多地使用疫苗學途徑控制動物中的傳染病。整個傳染性病原體可以在化學滅活或適當基因操作之後適用於疫苗製劑。或者，病原體的蛋白質亞單位可以在重組表達系統中表達並提純以用於疫苗製劑。
佐劑通常是指提高對抗原的體液和/或細胞免疫應答的任何材料。傳統的疫苗是由滅活的致病微生物的粗製品構成的，並且與病理微生物的培養物共存的雜質可以充當提高免疫應答的佐劑。然而，當使用病理微生物或純化蛋白質亞單位的均一製品作為疫苗接種的抗原時，這些抗原引發的免疫性差並因此必須添加佐劑之類的某些外源材料。此外，合成和亞單位疫苗的製造昂貴。因此，藉助於佐劑，激發免疫應答需要較少劑量的抗原，由此節省疫苗的製造成本。
佐劑已知以許多不同的方式發揮作用以提高免疫應答。許多佐劑改變了與免疫應答相關的細胞因子網絡。這些免疫調節佐劑即使沒有與抗原結合，也可以發揮它們的效用。一般而言，免疫調節佐劑造成某些細胞因子的總體上調(general up-regulation)和其它細胞因子的伴生下調(concomitant down regulation)，從而產生細胞Th1和/或體液Th2應答。
一些佐劑具有保持抗原構造完整性的能力，由此可以有效地將抗原呈遞給合適的免疫效應細胞。由於輔佐製劑對抗原構造的這種保持性，疫苗具有提高的貯存壽命，例如對免疫刺激複合物表現出的那樣(ISCOMs)。Ozel M.等人；Quarternary Structure of theImmunestimmulating Complex(Iscom)，J.of Ultrastruc.and Molec.Struc.Res.102，240-248(1989)。
一些佐劑具有使抗原作為基地(depot)保存在注射部位的性能。由於這種基地效應，抗原不會通過肝臟清除迅速流失。鋁鹽和油包水乳狀液通過這種基地效應作用較短的時間。例如，可以使用作為油包水乳狀液的弗氏完全佐劑(FCA)獲得長期基地。FCA通常保留在注射部位直至生物降解可以通過抗原呈遞細胞去除抗原。
基於它們的物理性質，佐劑可以分成兩大類，也就是粒狀佐劑和非粒狀佐劑。粒狀佐劑以微粒形式存在。免疫原能夠與微粒結合或並存。鋁鹽、油包水乳狀液、水包油乳狀液、免疫刺激複合物、脂質體以及納米微粒和微粒是粒狀佐劑的例子。非粒狀佐劑通常是免疫調節劑，並且它們通常與粒狀佐劑結合使用。胞壁醯二肽(從分枝桿菌中提取出的肽聚糖的佐劑活性組分)、非離子嵌段共聚物、皂草苷(從皂皮樹的樹皮中提取出的三萜系化合物的複合混合物)、脂質A(含有兩個磷酸根基團和五個或六個通常C12至C16長度的脂肪酸鏈的葡糖胺的二糖)、細胞因子、碳水化合物聚合物、衍生的多糖、和細菌毒素(例如霍亂菌毒素和不耐大腸桿菌的毒素(LT))是非粒狀佐劑的例子。
一些公知的佐劑是非粒狀免疫調節劑和能夠賦予輔佐製劑基地效應的粒狀材料的結合。例如，FCA將結核桿菌組分的免疫調節性能與油乳劑的短期基地效應結合在一起。
油乳劑很早以前就用作疫苗佐劑。Le Moignic和Pinoy在1916年發現，滅活鼠傷寒沙門氏菌在礦物油中的懸浮液提高了免疫應答。隨後在1925年，Ramon描述了作為增強對白喉類毒素的抗毒響應的物質之一的澱粉油。然而，油乳劑直至1937年才開始普及，當時Freund公布了他的現在被稱作弗氏完全佐劑(FCA)的輔佐製劑。FCA是由與滅活分枝桿菌和失水山梨醇酯A(Arlacel A)混合的礦物(石蠟)油構成的油包水乳狀液。Arlacel A主要是單油酸二縮甘露醇酯，並用作乳化劑。儘管FCA能夠優異地誘發抗體反應，但其造成嚴重的疼痛、膿腫形成、發燒和肉芽腫性炎症。為了避免這些不合意的副反應，開發出不完全的弗氏佐劑(IFA)。IFA在組成上與FCA類似，只是不存在分枝桿菌組分。IFA通過基地配方在注射部位發揮作用，並在抗體生成細胞的刺激下減緩抗原釋放。
另一種改進FCA的途徑是基於下述概念一用生物相容油代替礦物油將有助於在注射部位消除與FCA相關的反應。乳狀液也被認為應該是水包油型，而非油包水型，因為後者在注射部位產生長期基地。Hilleman等人描述了油基佐劑「Adjuvant65」，其是由86％花生油、10％作為乳化劑的Arlacel A和4％作為穩定劑的單硬脂酸鋁構成。Hilleman，1966，Prog.Med.Virol.8131-182；Hilleman和Beale，1983，在NewApproaches to Vaccine Development中(Eds.Bell，R.and Torrigiani，G.)，Schwabe，Basel。在人體中，Adjuvant 65是安全和有效的，但是與IFA相比表現出較低的輔助性。然而，由於使用純化或合成乳化劑代替Arlacel A時許多疫苗對人類的反應原性和輔助性的降低，停止了Adjuvant65的使用。美國專利5,718,904和5,690,942提出，水包油乳狀液中的礦物油可以被替換成可代謝油以改進安全性。
除了輔助性和安全性，乳狀液的物理外觀也是重要的商業考慮因素。物理外觀取決於乳狀液穩定性。乳狀液分層、沉積和聚集是乳狀液不穩定的指徵。當乳狀液的油相和水相具有不同的比重時，發生乳狀液分層。當乳狀液的初始液滴尺寸很大且乳狀液滴沒有任何布朗運動時，也會發生乳狀液分層。當液滴尺寸很大時，存在界面破壞的趨勢且液滴聚結成大粒子。乳狀液的穩定性由許多因素決定，例如所用乳化劑的性質和量、乳狀液中的液滴尺寸、和油相與水相之間的密度差。
乳化劑通過降低界面自由能和對液滴聚結產生物理或靜電阻礙，促進分散的液滴的穩定性。已經使用非離子型和離子型洗滌劑作為乳化劑。非離子型乳化劑在界面上取向並產生相對鬆散(bulky)的結構，從而導致分散的液滴的空間空缺(steric avoidance)。陰離子或陽離子乳化劑通過吸引抗衡離子引發電雙層的形成；這種雙層推斥力使液滴在互相接近時互相推斥。
除了使用乳化劑，也可以通過用機械裝置降低乳狀液的液滴尺寸來實現乳狀液穩定性。通常，使用推進式混合器、渦輪轉子、膠體磨、均化器和超聲波儀製造乳狀液。微流化是提高乳狀液中液滴尺寸均一性的另一種方式。微流化可以產生優異的物理穩定的乳狀液，其具有亞微範圍的一致粒度。除了提高乳狀液的穩定性，微流化方法能夠實現終端過濾，這是優選的確保最終產物無菌性的方式。此外，亞微型油粒子可以從注射部位進入淋巴，然後進入排洩鏈的淋巴結、血液和脾。這降低了在注射部位形成油狀基地的可能性，其可能產生局部炎症和明顯的注射部位反應。
微流化器現已市售。當兩種流化流在互作用室中高速互相作用時，在微流化器中形成乳狀液。微流化器是空氣或氮氣驅動的，並可以在超過20,000psi的內壓下運行。美國專利4,908,154提出使用微流化器以獲得基本不含任何乳化劑的乳狀液。
在文獻中已經描述了許多亞微型水包油輔佐製劑。美國專利5,376,369提出被稱作Syntax Adjuvant Formulation(SAF)的亞微型水包油乳狀液輔佐製劑。SAF包含作為油組分的角鯊烯或角鯊烷、乳狀液形成量的Pluronic L121(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段共聚物和免疫增強量的胞壁醯二肽。角鯊烯是在許多組織中，尤其是在鯊魚和其它魚類肝臟中發現的線型烴前體。角鯊烷通過角鯊烯的氫化製備，並且是完全飽和的。角鯊烯和角鯊烷均可以進行新陳代謝並具有毒物學研究的良好記錄。角鯊烯或角鯊烷乳狀液已經以輕微的副作用和合意的效力用在人類癌症疫苗中。參看，例如，Anthony C.Allison，1999，Squaleneand Squalane emulsions as adjuvants，Methods1987-93。
美國專利6,299,884和國際專利公開WO90/14837提出，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物對於亞微型水包油乳狀液的形成不是必須的。此外，這些參考文獻提出無毒可代謝油的使用，並明確排除礦物油和有毒石油餾分油在它們的乳狀液製劑中的應用。
美國專利5,961,970提出用作疫苗佐劑的又一亞微型水包油乳狀液。在該專利所述的乳狀液中，疏水組分選自中鏈甘油三酯油、植物油和它們的混合物。該乳狀液中包含的表面活性劑可以是天然的生物相容性表面活性劑，例如磷脂(例如卵磷脂)或藥學可接受的非天然表面活性劑(例如TWEEN-80)。該專利還提出在形成乳狀液時，在乳狀液中加入抗原，而非在已經獨立地和外源性地形成乳狀液之後將抗原與乳狀液混合。
美國專利5,084,269提出，包含與礦物油結合的卵磷脂的輔佐製劑導致宿主動物體內刺激的降低並同時引發提高的全身免疫。來自美國專利5,084,269的輔佐製劑商業上用於商品名為AMPHIGEN的獸用疫苗。AMPHIGEN製劑是由被卵磷脂包圍的微胞-油滴構成的。這些微胞與傳統的油基佐劑相比，能夠與更完整的細胞抗原連接。此外，AMPHIGEN基疫苗製劑與包含油佐劑(通常包含10％至20％油)的其它疫苗製劑相比，包含低油含量的2.5至5％礦物油。其低油含量使這種佐劑基疫苗製劑對注射部位的組織較不刺激，從而產生較少損傷並在屠宰時需要較少修整。此外，油滴周圍的卵磷脂塗層進一步降低了注射部位反應，從而產生既安全又有效的疫苗。
使用AMPHIGEN製劑作為許多獸用疫苗中的佐劑，並需要在短和長儲存期內以及在重構時保持疫苗產品的物理外觀。此外，就在注射之前，將凍幹抗原與預製輔佐製劑混合。這種實踐並不總是確保抗原在水包油乳狀液中的均勻分布，並且乳狀液的外觀可能不合意。此外，在靜置時，均勻乳狀液可能表現出相分離。因此，需要在長貯存壽命中不會表現出相分離的穩定的輔佐製劑。防止相分離的一種方式是降低乳狀液的液滴尺寸並提高粒子均一性。儘管文獻中已經提出了可代謝油基乳狀液製劑的微流化方法，但還沒有進行AMPHIGEN製劑之類的水包油乳狀液的微流化。
在本發明中，使用微流化使卵磷脂包圍的礦物油液滴的尺寸達到亞微尺寸。意外地，本發明人已經發現，用由卵磷脂和油的混合物構成的水包油乳狀液輔佐的疫苗製劑的微流化，不僅改進了製劑的物理外觀，還提高了製劑的免疫效果。微流化製劑還以改進的安全性為特徵。

發明內容本發明人已經意外地發現，可以通過微流化改進不可代謝油基水包油乳狀液的佐劑活性和安全性。即使抗原在微流化之前固有地併入乳狀液中，併入微流化乳狀液中的抗原也是穩定的。
因此，在一個實施方式中，本發明提供了可用作疫苗佐劑的亞微型水包油乳狀液製劑。本發明的亞微型水包油乳狀液是由不可代謝的油、至少一種表面活性劑和水性組分構成的，其中該油以亞微米範圍的平均油滴尺寸分散在水性組分中。優選的不可代謝油是輕質礦物油。優選的表面活性劑包括卵磷脂、TWEEN-80和SPAN-80。
本發明提供的優選水包油乳狀液是由AMPHIGEN製劑構成的。
本發明的水包油乳狀液可以包括適當和合意的附加組分，包括防腐劑、滲透劑、生物粘附分子和免疫刺激分子。優選的免疫刺激分子包括，例如Quil A、膽固醇、GPI-0100、溴化二甲基雙十八烷基銨(DDA)。
在另一實施方式中，本發明提供了製備亞微型水包油乳狀液的方法。按照本發明，將乳狀液的各種組分，包括油、一種或多種表面活性劑、水性組分和適合用在乳狀液中的任何其它組分混合在一起。對該混合物進行初級乳化過程以形成水包油乳狀液，然後使其通過微流化器以獲得液滴直徑小於1微米，優選平均液滴尺寸小於0.5微米的水包油乳狀液。
在又一實施方式中，本發明提供了包含抗原和上述亞微型水包油乳狀液的疫苗組合物。將抗原非固有地或固有地，優選固有地併入乳狀液。
可以包含在本發明的疫苗組合物中的抗原可以是細菌、真菌或病毒抗原、或它們的結合。抗原可以呈現滅活的完整或部分細胞或病毒製品的形式，或通過傳統的蛋白質提純、基因工程技術或化學合成獲得的抗原分子形式。
在進一步實施方式中，本發明提供了含有與亞微型水包油乳狀液結合的一種或多種抗原的疫苗組合物的製備方法。
在製備本發明的疫苗組合物時，抗原可以固有地(例如在微流化之前)或非固有地(例如在微流化之後)與水包油乳狀液的組分結合。優選地，抗原固有地與水包油乳狀液的組分結合。
在又一實施方式中，本發明提供了包含微囊化抗原和上述亞微型水包油乳狀液的疫苗組合物，其中該微囊化抗原非固有地與乳狀液結合。
還意外地發現，皂草苷和甾醇在溶液中結合時，互相結合形成螺旋狀微胞形式的複合物。按照本發明，這些螺旋狀微胞複合物具有免疫刺激活性並尤其可用作疫苗組合物中的佐劑。
因此，本發明提供了包含皂草苷和甾醇的免疫組合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋狀微胞形式的複合物。本發明還提供了包含皂草苷、甾醇和抗原的組合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋狀微胞形式的複合物，並且其中抗原與螺旋狀微胞混合但沒有結合。
圖1描繪了用於非微流化疫苗組合物的分批製備的方法。在該方法中，在左方的加料容器中加入各種疫苗組分，並最終用泵送入摻合容器，在此將各組分通過簡單機械裝置混合在一起。
圖2描繪了包含固有地併入的抗原的微流化疫苗組合物的製備方法。在加料容器中加入各種疫苗組分，並轉移到預乳化摻合裝置中以通過簡單機械裝置混合。隨後，使乳狀液經過微流化器並收集在後微流化室中。
圖3描繪了非微流化AMPHIGEN製劑基疫苗、微流化AMPHIGEN製劑基疫苗和臺式(bench)摻合疫苗製品的液滴尺寸分布。
圖4表明在微流化疫苗製劑中不存在相分離。
圖5描繪了固有地併入微流化AMPHIGEN製劑基疫苗製品(A907505)和三種對照的非微流化AMPHIGEN製劑基疫苗製品(A904369、A904370和A904371)中的抗原穩定性的比較。所有四種疫苗製品都在4℃儲存2年。在儲存過程中的不同時間點(0、6、12或24個月)，使用所有四種製劑為三月齡的母牛接種疫苗。以2毫升疫苗劑量在第0和第21天進行疫苗接種，並在第二次接種後兩周收集血清。在每種血清樣品中測定BVD II型病毒的中和抗體滴定度。以5個動物的幾何平均值表示數據。
圖6顯示了施用微流化和非微流化疫苗之前和之後牛的最小均方直腸溫度。T01安慰劑組單劑量；T02安慰劑組-雙劑量；T03非微流化製劑-單劑量；T04非微流化製劑-雙劑量；T05微流化製劑-單劑量；T06微流化製劑-雙劑量。
圖7描繪了在施用非微流化和微流化疫苗製劑後在牛體內觀察到的最小均方注射部位反應。T03非微流化製劑-單劑量；T04非微流化製劑-雙劑量；T05微流化製劑-單劑量；T06微流化製劑-雙劑量。
圖8描繪了用含有重組PauA抗原和大腸桿菌完整細胞抗原的各種疫苗製劑進行疫苗接種後，來自乳房鏈球菌的重組PauA抗原的幾何平均IgG滴定度。
圖9描繪了用含有重組PauA抗原和大腸桿菌完整細胞抗原的各種疫苗製劑進行疫苗接種後，來自乳房鏈球菌的大腸桿菌完整細胞抗原的幾何平均IgG滴定度。
圖10A和10B描繪了在最初製成的(圖10A)和在製成後22個月(圖10B)的微流化Amphigen製劑的粒度分布。
圖11是表明用Quil A微胞和膽固醇晶體形成的螺旋狀微胞的電子顯微照片。
圖12是表明通過Quil A和膽固醇在BVD I型抗原表面上形成的螺旋狀免疫原複合物的電子顯微照片。
具體實施方式本發明人已經意外地發現，用由卵磷脂和礦物油的混合物構成的水包油乳狀液輔佐的疫苗製劑的微流化，不僅改進了疫苗製劑的物理外觀，還提高了疫苗製劑的免疫效用。微流化疫苗製劑還以改進的安全性為特徵。
根據這些發現，本發明提供了可用作疫苗組合物佐劑的亞微型水包油乳狀液。還提供了使用微流化器製造這些亞微型水包油乳狀液的方法。此外，本發明提供了亞微型疫苗組合物，其中將抗原與亞微型水包油乳狀液結合。還提供了製造這些疫苗組合物的方法。本發明進一步提供了包含與亞微型水包油乳狀液結合的微囊化抗原的疫苗組合物和製造這些疫苗的方法。
為了清楚地公開本發明，且不是限制性的，將發明詳述分成下列部分，它們描述或舉例說明了本發明的某些特徵、實施方式或應用。
亞微型水包油乳狀液在一個實施方式中，本發明提供了可用作疫苗佐劑的亞微型水包油乳狀液製劑。本發明的亞微型水包油乳狀液提高了疫苗組合物中抗原的免疫原性，可以安全地施用於動物並且在儲存過程中穩定。
本發明的亞微型水包油乳狀液是由不可代謝的油、至少一種表面活性劑和水性組分構成的，其中該油以亞微米範圍的平均油滴尺寸分散在水性組分中。
「亞微型」是指液滴具有小於1微米的尺寸，並且平均油滴尺寸小於1微米。優選地，乳狀液的平均液滴尺寸小於0.8微米；更優選小於0.5微米；進一步優選小於0.4微米，或大約0.1-0.3微米。
「平均液滴尺寸」定義為在粒度體積分布內的體積平均直徑(VMD)粒度。將各個粒徑乘以該尺寸的所有粒子的體積並求和，由此計算VMD。然後將其除以所有粒子的總體積。
本文所用的術語「不可代謝的油」是指不能被作為乳狀液施用對象的動物身體代謝的油。
本文所用的術語「動物」和「動物對象」是指所有非人類動物，包括例如牛、羊和豬。
適用於本發明的乳狀液中的不可代謝油包括鏈烷、鏈烯、炔和它們相應的酸和醇、它們的醚和酯、以及它們的混合物。優選地，油的各個化合物是輕質烴化合物，也就是說，這些組分含有6至30個碳原子。該油可以合成製備或由石油產物提純。用於本發明的乳狀液的優選的不可代謝油包括例如礦物油、石蠟油和環烷。
術語「礦物油」是指由礦脂經由蒸餾技術獲得的液態烴混合物。該術語與「液化石蠟」、「液體礦脂」和「石蠟油」同義。該術語還要包括「輕質礦物油」，也就是類似地通過礦脂蒸餾獲得但比重略低於石蠟油的油。參看，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版(Easton，Pa.Mack Publishing Company，1990，788和1323頁)。礦物油可以由多種商業來源獲得，例如J.T.Baker(Phillipsburg，PA)，USBCorporation(Cleveland，OH)。優選的礦物油是以名稱DRAKEOL出售的輕質礦物油。
通常，本發明的亞微型乳狀液的油組分存在量為1體積％至50體積％；優選10％至45％；更優選20％至40％。
本發明的水包油乳狀液通常包括至少一種(也就是一種或多種)表面活性劑。表面活性劑和乳化劑是在本文中可以互換使用的術語，其是使油滴表面穩定並使油滴保持所需尺寸的試劑。
適用於本發明乳狀液的表面活性劑包括天然的生物相容表面活性劑和非天然的合成表面活性劑。生物相容的表面活性劑包括磷脂化合物或磷脂的混合物。優選的磷脂是磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，例如大豆或蛋卵磷脂(egg lecithin)。卵磷脂可以通過水洗粗製植物油並分離和乾燥所得水合樹膠，從而作為磷脂和甘油三酯的混合物獲得。將通過丙酮洗滌去除甘油三酯和植物油後剩餘的丙酮不溶的磷脂和糖脂的混合物分餾，由此可以獲得精製產品。或者，可以由各種商業來源獲得卵磷脂。其它合適的磷脂包括磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、雙磷脂醯甘油和磷脂醯乙醇胺。磷脂可以從天然來源中分離或照慣例合成。
適合在本發明的亞微型乳狀液中使用的非天然合成表面活性劑包括脫水山梨糖醇基非離子表面活性劑，例如脂肪酸取代的脫水山梨糖醇表面活性劑(以名稱SPAN或ARLACEL市售)、聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN)、來自蓖麻油之類的來源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR)；聚乙氧基化脂肪酸(例如以名稱SIMULSOL M-53獲得的硬脂酸)、聚乙氧基化異辛基苯酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ)；聚氧乙烯nonphenyl醚(TRITONN)、聚氧乙烯異辛基苯醚(TRITONX)。優選的合成表面活性劑是以名稱SPAN和TWEEN獲得的表面活性劑。
優選用於本發明的水包油乳狀液中的表面活性劑包括卵磷脂、Tween-80和SPAN-80。
一般而言，表面活性劑(或如果使用兩種或多種表面活性劑，則是表面活性劑的組合)在乳狀液中的存在量為0.01至10體積％，優選0.1％至6.0％，更優選0.2％至5.0％。
水性組分構成乳狀液的連續相併可以是水、緩衝鹽水或任何其它合適的水溶液。
本發明的水包油乳狀液可以包括適當和合意的附加組分，包括防腐劑、滲透劑、生物粘附分子和免疫刺激分子。
生物粘附分子被認為可以提高在目標粘液表面上或透過目標粘液表面的抗原輸送和粘附，以產生黏膜免疫性。合適的生物粘附分子的例子包括酸性非自然生成的聚合物，例如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸(例如CARBOPOL、CARBOMER)；酸性合成改性的天然聚合物，例如羧甲基纖維素；中性合成改性的天然聚合物，例如(羥丙基)甲基纖維素；含鹼性胺的聚合物，例如脫乙醯殼多糖；可獲自天然來源的酸性聚合物，例如藻酸、透明質酸、果膠、黃蓍膠、和刺梧桐樹膠；和中性非天然生成的聚合物，例如聚乙烯基醇；或它們的混合物。
本文所用的短語「免疫刺激分子」是指提高由疫苗組合物中的抗原組分引發的保護性免疫應答的那些分子。合適的免疫刺激材料包括細菌細胞壁組分，例如N-乙醯基胞壁醯基-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺的衍生物，例如莫拉丁酯(murabutide)、蘇氨醯基MDP和胞壁醯基三肽；皂草糖苷及其衍生物，例如Quil A、QS21和GPI-0100；膽固醇；和季銨化合物，例如溴化二甲基雙十八烷基銨(DDA)和N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺(「阿夫立定(avridine)」)。
皂草苷是在許多植物中作為二次代謝物產生的糖苷化合物。皂草苷的化學結構產生大範圍的製藥和生物活性，包括一些潛在和有效的免疫活性。
皂草苷在結構上由連接到一個或多個糖鏈上的任何糖苷配基構成。皂草苷可以按照它們的糖苷配基組成進行分類三萜烯糖苷、類固醇糖苷、和甾體生物鹼糖苷。
皂草苷可以從皂皮樹的樹皮中分離。皂草苷很早就是已知的免疫刺激劑。Dalsgaard，K.，「Evaluation of its adjuvant activity with a specialreference to the application in the vaccination of cattle againstfoot-and-mouth disease」，Acta. Vet.Scand.691-40 1978。包含皂草苷的植物粗提物提高了口蹄疫疫苗的效力。然而，這種粗提物用於疫苗時具有負面副作用。因此，Dalsgaard通過滲析、離子交換和凝膠過濾色譜法從皂草苷中部分提純佐劑活性組分。Dalsgaard，K等人，「Saponinadjuvants III.Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina withadjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines」，Arch.Gesamte.Virusforsch.44243-254 1974。由此提純的佐劑活性組分被稱作「QuilA」。在重量基礎上，Quil A與粗製皂草苷相比，表現出提高的效力並表現出降低的局部反應。Quil A廣泛用於獸用疫苗。
通過高壓液相色譜法(HPLC)進行的Quil A的進一步分析，揭示了緊密相關的皂草苷的多相混合物，並發現了QS21-其是具有降低或最小毒性的有效佐劑。Kensil C.R.等人「Separation and characterizationof saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex，」J.Immunol.146431-437，1991。與多數其它免疫刺激劑不同，QS21是水溶性的並可用在含有或不含乳狀液型製劑的疫苗中。QS21已經表明在小鼠中引發Th1型應答，這激發IgG2a和IgG2b抗體以及響應亞單位抗原的誘發的抗原特異性CD8+CTL(MHC I類)的生成。人類臨床研究已經證明其在可接受的毒理學特徵下的輔助性。Kensil，C.R等人，「Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvantQS-21.In Vaccine Designthe subunit and Adjuvant Approach」，Eds.Powell，M.F.and Newman，M.J.Plenum Publishing Corporation，NewYork.1995，pp.525-541。
美國專利6,080,725描述了製造和使用皂草苷-親脂體結合物的方法。在這種皂草苷-親脂體結合物中，親脂體部分(例如脂質、脂肪酸、聚乙二醇或萜烯)經由三萜烯皂草苷的3-O-葡糖醛酸上存在的羧基共價連接到非醯化或脫醯基化(desacylated)三萜烯皂草苷上。親脂體部分與皂草苷(例如來自絲石竹(Gypsophila)、肥皂草和針珊瑚(Acanthophyllum)的Quillaja desacylsaponin、lucyoside P或皂草苷)的3-O-葡糖醛酸的連接提高了它們對體液和細胞介導的免疫性的輔佐效果。此外，親脂體部分與非醯化或脫醯基皂草苷(desacylsaponin)的3-O-葡糖醛酸殘基的連接產生更容易提純、毒性較低、化學上更穩定、並具有與原始皂草苷相同或更好的佐劑性能的皂草苷類似物。
GPI-0100是美國專利6,080,725中描述的皂草苷-親脂體結合物。經由葡糖醛酸的羧基，在脫醯基皂草苷中加入脂肪族胺，由此製造GPI-0100。
季銨化合物-已經提出了許多用作免疫學佐劑的脂肪族含氮鹼，包括胺、季銨化合物、胍、苯甲脒和硫脲鎓。具體的這類化合物包括溴化二甲基雙十八烷基銨(DDA)和N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺(「阿夫立定」)。
美國專利5,951,988提出含有與油組分結合的季銨鹽(例如DDA)的輔佐製劑。該製劑可以用於在疫苗組合物中與已知的免疫物質(例如病毒或細菌抗原)結合以提高免疫原性響應。該組合物還可以在不含結合抗原的情況下用作非特異性免疫刺激製劑。
美國專利4,310,550描述了與脂肪或脂質乳狀液一起配製的N，N-高級烷基-N，N』-雙(2-羥乙基)-丙二胺和N，N-高級烷基-亞二甲苯基二胺作為疫苗佐劑的用途。在美國專利4,310,550中描述了通過輔佐製劑的腸道外給藥，在人或動物中引發或提高抗原的免疫原性響應的方法。
在優選實施方式中，本發明提供了可用作疫苗佐劑的亞微型水包油乳狀液，其是由液滴尺寸小於1微米且平均液滴尺寸為大約0.25微米的AMPHIGEN製劑構成的。
本文所用的術語「AMPHIGEN製劑」是指通過將DRAKEOL卵磷脂油溶液(Hydronics，Lincoln，NE)與鹽水溶液在存在TWEEN80和SPAN80的情況下混合而形成的溶液。典型的AMPHIGEN製劑含有40體積％的輕質礦物油(v/v)、大約25％w/v卵磷脂、大約0.18體積％的TWEEN80(v/v)和大約0.08體積％的Span80(v/v)。
製備亞微型水包油乳狀液的方法在另一實施方式中，本發明提供了製備上述亞微型水包油乳狀液的方法。
按照本發明，將乳狀液的各種組分，包括油、一種或多種表面活性劑、水性組分和適合用在乳狀液中的任何其它組分結合併混合在一起。
對形成的混合物進行乳化過程，通常通過一次或多次穿過一個或多個均化器或乳化器，從而形成具有均一外觀和大約0.5微米的平均液滴尺寸的水包油乳狀液。為此可以使用任何市售的均化器或乳化器，例如Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)。
然後對由此形成的乳狀液進行微流化以使液滴尺寸達到亞微範圍。可以使用商業微流化器實現微流化，例如Microfluidics，Newton，Mass提供的型號11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；和Rainnie Minilab Type8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.，Hudson，Wis.)。這些微流化器通過在高壓下驅使流體經過小孔進行操作，由此兩種流體流在互作用室中高速相互作用以形成具有亞微米尺寸液滴的乳狀液。
可以通過本領域已知的各種方法，例如雷射衍射、使用市售粒度測量儀，測定液滴尺寸。這種尺寸取決於所用表面活性劑的類型、表面活性劑與油的比例、操作壓力、溫度、和類似因素。技術人員無需過度實驗，就可以確定這些參數的所需結合以獲得具有所需液滴尺寸的乳狀液。本發明的乳狀液的液滴直徑小於1微米，優選平均液滴尺寸小於0.8微米，更優選平均液滴尺寸小於0.5微米，進一步優選平均液滴尺寸小於0.3微米。
在本發明的優選實施方式中，將購自Hydronics(Lincoln，NE)並在輕質礦物油中含有25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液，與鹽水以及表面活性劑TWEEN80和SPAN80合併並混合，從而形成「AMPHGEN溶液」或「AMPHIGEN製劑」。然後將AMPHGEN溶液用Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器以大約3400rpm乳化以形成水包油乳狀液。隨後，使乳狀液一次通過以大約4500±500psi運行的微流化器。微流化的水包油乳狀液含有尺寸小於1微米的液滴，其平均液滴尺寸小於0.25微米。
含有併入亞微型水包油乳狀液中的抗原的疫苗組合物在另一實施方式中，本發明提供了包含抗原和上述亞微型水包油乳狀液的疫苗組合物。這些疫苗組合物以具有提高的免疫原效應和改進的物理外觀(例如在長期儲存後沒有觀察到任何相分離)為特徵。此外，本發明的疫苗組合物可以安全地施用於動物。
按照本發明，抗原可以非固有地，或優選固有地與乳狀液結合。術語「固有地」是指下述方法-其中抗原在微流化步驟之前與乳狀液組分結合。術語「非固有地」是指下述方法-其中在乳狀液已經微流化之後在乳狀液中加入抗原。非固有地加入的抗原可以是游離抗原或者其可以如下進一步所述封裝在微粒中。
本文所用的術語「抗原」是指在動物中產生免疫性並包含在疫苗組合物中以在作為疫苗組合物施用對象的動物體內產生保護性免疫應答的任何分子、化合物或組合物。
與抗原結合使用的術語「免疫原性」是指抗原在動物體內引起對該抗原的免疫應答的能力。免疫應答可以是主要由細胞毒素T-細胞介導的細胞免疫應答，或主要由helper T-細胞介導的體液免疫應答，這又反過來激活了B-細胞，由此導致抗體生成。
「保護性免疫應答」是指在動物體內產生的任何免疫應答，包括抗體和/或細胞介導的免疫應答，該免疫應答防止或可檢測到地降低由抗原或含該抗原的病原體引起的紊亂或疾病的發生、或消除或可檢測到地降低其嚴重程度、或可檢測得地減緩其進展速度。
可以包含在本發明的疫苗組合物中的抗原包括由致病細菌(例如豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonie)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、溶血曼海姆菌(Manheimia hemolytica)、牛支原菌(Mycoplasma bovis)、Mycoplasma galanacieum、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、副結核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、Clostridial spp.、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、Erysipelothrix rhusopathiae、空腸彎曲桿菌(Campylobacterspp.)、壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、Salmonella enterica serovars、Leptospira spp.)；致病真菌(例如假絲酵母(Candida))；原生動物(例如隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、新包蟲(Neospora canium)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、艾美蟲屬(Eimeria spp.))；蠕蟲(例如奧斯特線蟲(Ostertagia)、古柏線蟲(Cooperia)、血矛線蟲(Haemonchus)、片吸蟲屬(Fasciola))製成的抗原，它們是滅活的完整或部分細胞製品形式，或是通過傳統的蛋白質提純、基因工程技術或化學合成獲得的抗原分子形式。其它抗原包括致病病毒，例如牛皰疹病毒-1，3，6、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)1和2型、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬細小病毒、PRRS病毒、豬圓環病毒、流感病毒、豬水皰病病毒、Techen fever病毒、假狂犬病病毒，它們是滅活的完整或部分細胞製品形式，或是通過傳統的蛋白質提純、基因工程技術或化學合成獲得的抗原分子形式。
抗原的量應該使得抗原與水包油乳狀液結合時有效誘發動物體內的保護性免疫應答。使抗原有效的精確量取決於抗原的性質、活性和純度，並且可以由本領域技術人員確定。
疫苗組合物中存在的水包油乳狀液的量應該足以加強疫苗組合物中抗原的免疫原性。當合意且適當時，除了水包油乳狀液提供的表面活性劑外，還可以在疫苗組合物中加入附加量的表面活性劑或其它表面活性劑。一般而言，油組分在疫苗組合物最終體積中的存在量為1.0體積％至20體積％；優選1.0體積％至10體積％；更優選2.0體積％至5.0體積％。表面活性劑(或如果使用兩種或多種表面活性劑，則是表面活性劑的組合)在疫苗組合物最終體積中的存在量為0.1體積％至20體積％，優選0.15體積％至10體積％，更優選0.2體積％至6.0體積％。
除了抗原和水包油乳狀液，免疫組合物可以包括適當和合意的其它組分，例如上文對於水包油組合物所述的防腐劑、滲透劑、生物粘附分子、和免疫刺激分子(例如Quil A、膽固醇、GPI-0100、溴化二甲基雙十八烷基銨(DDA))。
本發明的疫苗組合物還可以包括獸醫可接受的載體。術語「獸醫可接受的載體」包括任何和所有溶劑、分散介質、塗料、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、殺菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸附延緩劑、和類似物。稀釋劑可以包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油、和類似物。等滲劑可以包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、和乳糖等。穩定劑包括清蛋白等。
在優選實施方式中，本發明提供了疫苗組合物，其包括至少一種BVDV I型或BVDV II型抗原，該抗原固有地併入水包油乳狀液中，該水包油乳狀液含有尺寸小於1微米的液滴並優選具有小於0.8微米，更優選小於0.5微米的平均液滴尺寸，進一步優選具有大約0.5微米的平均液滴尺寸。BVDV I型和/或II型抗原優選為滅活的病毒製品形式。亞微型水包油乳狀液優選由AMPHIGEN製劑(也就是含有輕質礦物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的製劑)構成。疫苗組合物優選還包括Quil-A、膽固醇和thimerosol。
在另一優選實施方式中，本發明提供了在水包油乳狀液中包括鉤端螺旋體抗原和至少一種BVDV I型或BVDV II型抗原的疫苗組合物。優選為滅活的細胞或病毒製品形式的抗原固有地併入水包油乳狀液中，該水包油乳狀液含有尺寸小於1微米的液滴並優選具有小於0.8微米，更優選小於0.5微米的平均液滴尺寸，進一步優選具有大約0.5微米的平均液滴尺寸的。亞微型水包油乳狀液優選由AMPHIGEN製劑(也就是含有輕質礦物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的製劑)構成。疫苗組合物優選還包括一種或多種選自Quil-A、膽固醇、DDA、GPI-100和氫氧化鋁(AlOH)的免疫刺激分子。
在又一優選實施方式中，本發明提供了在水包油乳狀液中包括至少一種細菌抗原(例如重組乳房鏈球菌PauA蛋白或大腸桿菌的細胞製品或二者的結合)的疫苗組合物。該抗原固有地與水包油乳狀液結合，該水包油乳狀液含有尺寸小於1微米的液滴，優選具有小於0.8微米，更優選小於0.5微米的平均液滴尺寸，進一步優選具有大約0.25微米平均液滴尺寸。亞微型水包油乳狀液優選由AMPHIGEN製劑(也就是含有輕質礦物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的製劑)構成。疫苗組合物優選還包括一種或多種選自Quil-A、DDA和GPI-100的免疫刺激分子。
本發明的疫苗組合物可以通過已知途徑施用到動物上，包括口服、鼻內、黏膜、局部、透皮和腸道外(例如靜脈內、腹膜內、皮層內、皮下或肌肉內)途徑。給藥可以使用結合途徑進行，例如，首先使用腸道外途徑給藥，然後使用黏膜途徑給藥。
製備疫苗組合物的方法在又一實施方式中，本發明提供了含有一種或多種抗原和亞微型水包油乳狀液的疫苗組合物的製備方法。
在製備本發明的疫苗組合物時，抗原可以固有地或非固有地與水包油乳狀液的組分結合。優選地，抗原固有地與水包油乳狀液的組分結合。
抗原可以與乳狀液的各種組分結合，包括油、一種或多種表面活性劑、水性組分和任何其它適當的組分，從而形成混合物。對混合物進行初步摻合過程，通常通過一次或多次穿過一個或多個均化器或乳化器進行，從而形成含有抗原的水包油乳狀液。為此可以使用任何市售均化器或乳化器，例如Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)或Microfluidics(Newton，MA)。或者，可以首先使用均化器或乳化器將乳狀液佐劑的各種組分，包括油、一種或多種表面活性劑和水性組分結合以形成水包油乳狀液；然後在該乳狀液中加入抗原。初步摻合後水包油乳狀液的平均液滴尺寸為大約1.0-1.2微米。
然後對含有抗原的乳狀液進行微流化以使液滴尺寸達到亞微米範圍。可以使用商業微流化器，例如Microfluidics，Newton，Mass提供的型號11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass)；和RainnieMinilab Type8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.，Hudson，Wis.)實現微流化。
可以通過本領域已知的各種方法，例如雷射衍射、使用市售粒度測量儀，測定液滴尺寸。這種尺寸取決於所用表面活性劑的類型、表面活性劑與油的比例、操作壓力、溫度、和類似因素。人們可以確定這些參數的所需結合以獲得具有所需液滴尺寸的乳狀液。本發明的乳狀液的油滴直徑小於1微米。優選平均液滴尺寸小於0.8微米。更優選地，平均液滴尺寸小於0.5微米。進一步優選地，平均液滴尺寸為0.1至0.3微米。
在本發明優選的實施方式中，將在輕質礦物油中含有25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液與表面活性劑TWEEN80和SPAN80和鹽水溶液合併並混合以形成含有40％輕質礦物油、卵磷脂、0.18％TWEEN80和0.08％SPAN80的混合物。然後將該混合物以大約3400rpm用Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器乳化，以形成乳狀液產物，其也稱作「AMPHIGEN製劑」或「AMPHIGEN溶液」。隨後，藉助於乳化器，例如Ross均化器，將所需抗原與AMPHIGEN溶液和任何其它適當組分(例如免疫刺激分子)結合以形成包含抗原的水包油乳狀液。使這種乳狀液一次通過以大約10000±500psi運行的微流化器。微流化的水包油乳狀液含有尺寸小於1微米的液滴，其平均液滴尺寸小於大約0.25微米。
在另一優選實施方式中，在將水包油乳狀液(例如AMPHIGEN製劑)與所需抗原結合之前，將抗原與皂草糖苷(例如Quil A)結合以形成混合物。例如在均化容器中對這種抗原-皂草苷混合物進行均化。然後在均化的抗原-皂草苷混合物中加入甾醇，例如膽固醇。然後對含有抗原、皂草苷和甾醇的混合物進行進一步均化。然後，例如藉助於均化器將均化的抗原-皂草苷-甾醇混合物與水包油乳狀液(例如AMPHIGEN製劑)結合。然後對含有抗原、皂草苷和甾醇的均化的水包油乳狀液進行高壓均化，例如微流化。
含有在亞微型水包油乳狀液中的微囊化抗原的疫苗組合物和製備方法在又一實施方式中，本發明提供了包含封裝在微粒中的抗原(或「微囊化抗原」)的疫苗組合物，其中微囊化抗原非固有地併入上述亞微型水包油乳狀液中。
將抗原吸收或夾帶在粒狀載體中的方法是本領域已知的。參看，例如，Pharmaceutical Particulate CarriersTherapeutic Applications(JustinHanes，Masatoshi Chiba and Robert Langer.Polymer microspheres forvaccine delivery.InVaccine design.The subunit and adjuvant approach.Eds.Michael F.Powell and Mark J.Newman，1995 Plenum Press，NewYork and London)。粒狀載體可以將所選抗原的多種複製品呈遞給動物對象體內的免疫系統，並有助於將抗原俘獲並保留在局部淋巴結中。粒子可以被巨噬細胞吞噬，並可以通過細胞因子釋放來提高抗原呈遞。在該領域中已經描述了粒狀載體，並其包括例如由聚甲基丙烯酸甲酯聚合物生成的那些，以及由聚(丙交酯)和聚(丙交酯-co-乙交酯)生成的被稱作PLG的那些。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可生物降解的，而PLG粒子可以通過與乳酸和羥基乙酸(它們沿正常的代謝路徑分泌)連接的酯鍵的無規非酶促水解進行生物降解。
還使用可生物降解的微球實現疫苗的受控釋放。例如，可以實現較長時間的抗原連續釋放。根據聚合物的分子量和聚合物中乳酸與羥基乙酸的比例，PLGA聚合物可以具有從數天或數周至數月或一年的水解速率。緩慢的受控釋放可能導致與多次注射後觀察到的情況類似形成高抗體含量。或者，可以通過選擇具有不同水解速率的聚合物，實現疫苗抗原的脈動釋放(pulsatile release)。聚合物的水解速率通常取決於聚合物的分子量和聚合物中乳酸與羥基乙酸的比例。由兩種或多種具有不同抗原釋放速率的聚合物構成的微粒，提供了抗原的脈動釋放並模擬多劑疫苗接種方案。
按照本發明，可以使用本領域已知的任何程序(例如在實施例17中舉例說明的程序)將抗原(包括上述任何抗原)吸收到粒狀聚合物載體，優選PLG聚合物上，由此形成微囊化抗原製品。然後將微囊化抗原製品與如上所述的亞微型水包油乳狀液混合併分散在該乳狀液中，從而形成疫苗組合物。
在優選實施方式中，本發明提供了包含封裝在PLG聚合物中的抗原的疫苗組合物，其中微囊化抗原非固有地分散在微流化的水包油乳狀液中，該乳狀液由輕質礦物油、卵磷脂、TWEEN80、SPAN80和鹽水構成，並具有小於1.0微米的平均液滴尺寸。
由皂草苷和甾醇形成的複合物在一個實施方式中，本發明提供含有皂草苷和甾醇的組合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋狀微胞形式的複合物。按照本發明，這些複合物具有免疫刺激活性。
「免疫刺激」是指該複合物可以提高抗原組分所引發的免疫應答，或該複合物可以引發不依賴於單獨抗原組分的免疫應答。
按照本發明，用於本發明的組合物中的優選皂草苷是Quil A。
優選用在本發明的佐劑組合物中的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、麥角鈣化甾醇和膽固醇。這些甾醇在本領域內是公知的，例如，在Merck Index，11thEdn.第341頁中公開了膽固醇作為在動物脂肪中發現的一種天然存在的甾醇。最優選地，甾醇是膽固醇。
組合物中皂草苷甾醇的比例通常為大約1∶100至5∶1重量比。該比例優選為1∶1。
在另一實施方式中，本發明提供了含有皂草苷、甾醇和抗原的疫苗組合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋狀微胞形式的複合物，且其中抗原與該螺旋狀微胞混合但沒有結合到其中。
下面是本發明的具體實施方式
的實施例。這些實施例僅用於舉例說明，而不是要以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1AMPHIGEN製劑的製備以兩步法製備AMPHIGEN製劑。在第一步中，將80升Drakeol卵磷脂油溶液、116升Tetanus Toxoid鹽水、1.2升SPAN80和2.8升Tween80混合在一起，並用Ross乳化器乳化。Drakeol卵磷脂油溶液含有25％的大豆磷脂和75％的礦物油。乳化產物經過Ross乳化器再循環最少5體積或最短10分鐘。將乳化產物在2-7℃儲存最多24小時，以用於進一步處理。將來自Ross乳化器槽的乳液轉移到Gaulin均化器中，並在4500psi的壓力下均化20分鐘。然後將所得40％Drakeol卵磷脂油溶液(以下稱為「AMPHIGEN製劑」或「AMPHIGEN溶液」)分配到無菌的聚丙烯羧基(polypropylene carboxy)容器中。在位於class10,000受控環境中的class100分配通風櫥(dispensing hood)內進行分配。將容器儲存在2-7℃下。除非另行說明，在下述實驗中使用該AMPHIGEN製劑。
實施例2通過BVD疫苗的快速摻合均化進行的初步摻合圖1中顯示了用於該均化法的裝置。使用無菌技術或蒸汽轉換閥，將裝有BVD I型抗原(滅活的BVD I型病毒製品)的瓶子連接到摻合容器上的底部端。在完成所需體積的BVD I型抗原的轉移後，用裝有滅活的BVD II型病毒製品(滅活的BVD II型病毒製品)的瓶子代替BVD I型瓶子。當完成所需量的BVD II型抗原的轉移後，將Ross均化器連接到便攜容器上，並以最大RPM(3300rpm)引發再循環。容器攪拌保持在中速。
使用無菌技術或蒸汽轉換閥，將裝有濃度為50毫克/毫升Quil-A的瓶子連接到摻合容器上的均化器串聯(in-line)端上。通過抽吸管(linesuction)將所需量的Quil-A溶液送入容器中。當完成Quil-A溶液的轉移後，將瓶子移開。按照相同方式，將所需量的膽固醇乙醇溶液(18毫克/毫升)轉移到混合容器中。隨後，在摻合容器中加入所需量的AMPHIGEN製劑，10％thimerosol溶液和Basic Modified Eagles media(「BME」)填充劑溶液。
所有加料完成後，使混合再持續15分鐘。將所得製劑等分成2毫升劑量，並代表非微流化AMPHIGEN製劑-基BVD疫苗。每劑疫苗含有500微克Quil-A、500微克膽固醇、2.5％AMPHIGEN製劑和0.009％thimerosol。根據gp53的ELISA滴度測定對這兩種不同的BVD菌株的抗原濃度。
實施例3通過微流化的二次摻合圖2描述了用於通過微流化進行二次摻合的方法。微流化器是蒸汽滅菌的。首先，將輔助處理組合室(auxiliary processing modulechamber)安裝在該裝置中，並在第二室位置上安裝空白室。通過將來自供料容器排放閥的輸送管路連接到微流化器入口，將含有如實施例2所述製成的完全輔助(fully adjuvanted)BVD疫苗的容器連接到微流化器上。將氮氣連接到供料容器空氣過濾器入口上，並將容器壓力設置調節至20+/-5PSI。將收集器排放閥連接到來自微流化器出口的輸送管路上。在進行所有必要的連接後，開啟閥門，在10,000+/-500PSI的工作壓力下開始進行微流化。全部疫苗一次通過微流化器，並收集在微流化後的室中。將該製品等分成2毫升劑量，並代表微流化的AMPHIGEN製劑-基BVD疫苗。
實施例4經臺式摻合製備疫苗組合物添加BVD抗原和填充劑，由此將如實施例1中所述製成的AMPHIGEN製劑稀釋至2.5％。在實驗臺上用攪拌棒混合所得溶液，而非使用均化器。最終製品含有下列成分BVD1型和2型抗原，2.5％AMPHIGEN製劑(其如實施例1中所述含有油、卵磷脂、SPAN和TWEEN)和鹽水。TWEEN80和SPAN80在最終疫苗製品中的存在量分別為0.18體積％和0.08體積％。
實施例5非微流化和微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品之間液滴尺寸分布的比較如實施例2中所述製成的非微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗、如實施例3中所述製成的微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗、以及如實施例4中所述通過臺式摻合製成的製品，被用於比較疫苗製品的液滴尺寸。將來自各個製品的兩毫升樣品加入Malvern2000雷射衍射計，並測定液滴尺寸分布。如圖3中所示，結果表明，微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品具有0.1微米左右的最大粒子體積，而非微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品具有1微米左右的最大粒子分布體積。
實施例6疫苗相分離的降低將三種不同的疫苗製劑如實施例2中所述製成的非微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗、如實施例3中所述製成的微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗、以及如實施例4中所述通過臺式摻合製成的疫苗，一起比較以確定長時間儲存時它們的相分離性能。使所有這些製品在4℃靜置大約一個月，並根據疫苗製品頂部乳狀層外觀來監測相分離。如圖4中所示，與其它兩個製品比較時，在微流化AMPHIGEN製劑-基製品中不存在相分離。
實施例7針對牛病毒性腹瀉病毒的微流化和非微流化牛疫苗的製備通過微流化法將牛病毒性腹瀉病毒抗原固有地混入AMPHIGEN製劑中。術語「固有地混入」是指在微流化之前將抗原加入AMPHIGEN製劑中的方法。使抗原與輔佐製劑的組分一起受到微流化過程的物理力。在對照的非微流化組中，抗原製品通過摻合分散在AMPHIGEN製劑中。
對照的和微流化製品的最終組成如下對gp53的滅活後ELISA滴度為2535 RU/劑的BVD I型、對gp53的滅活後ELISA滴度為3290RU/劑的BVD II型、濃度為1.25毫克/劑的Quil-A、濃度為1.25毫克/劑的膽固醇、最終濃度為2.5％的AMPHIGEN製劑、以及最終濃度為0.009％的thimerosol。疫苗劑量為5毫升。
實施例8在微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品中的固有地混入的BVD病毒抗原的長期穩定性進行該試驗以測定固有地混入的抗原在長期儲存過程中的穩定性。滅活的BVD II型病毒抗原在微流化過程中固有地混入AMPHIGEN製劑中以獲得微流化疫苗製品(A907505)。使用在非微流化AMPHIGEN製劑中含有相同抗原的三種其它疫苗製品(A904369、A904370和A904371)作為對照物。在非微流化的製品中，將抗原與AMPHIGEN製劑混合，並通過使用Ross均化器摻合以進行混合。所有四種疫苗製品在4℃下儲存兩年。在儲存過程中不同的時間點(0、6、12或24個月)，使用所有四種製劑為三月齡母牛接種疫苗。
在第0天和21天時，經皮下途徑用2毫升疫苗製劑給三個齡母牛接種疫苗。在第35天收集來自被接種疫苗的動物的血清，並根據經BVDV-E2 ELISA的抗體滴度，測量對疫苗的血清學響應。如圖5所示，微流化疫苗製品在所有受試時間點(0、6、12和24個月)均表現出較高的抗體滴度，表明在微流化過程中固有地混入抗原時，抗原製品的穩定性沒有損失。此外，還令人驚訝地發現，微流化疫苗製品在所有時間點均引發提高的免疫應答。
實施例9微流化後，疫苗引發的直腸溫度升高的減輕使用如實施例7中所述製成的微流化和非微流化疫苗製品，在0天為牛接種疫苗，在從接種前一天至接種後四天的期間內監測直腸溫度。疫苗劑量為2毫升。以單或雙劑量疫苗對該組接種疫苗。在第1天至第4天(含第1天和第4天)每天測量並記錄直腸溫度。在施用試驗製品前測量第0天時的直腸溫度。
如圖6所示，結果表明，在使用單或雙劑量的非微流化疫苗製劑接種的那些動物中，在接種疫苗後大約24小時直腸溫度急劇升高。但是，在用微流化形式的疫苗接種的動物中，接種疫苗後直腸溫度的升高僅僅是最低程度的，且明顯低於用非微流化製劑接種的動物(圖6)。
實施例10當用微流化疫苗製劑接種疫苗時，注射部位反應體積更快消解如實施例7中所示製成的微流化和非微流化疫苗製品，用於在第0天為牛接種疫苗。本研究中包括的動物是雜交肉牛。在每個安慰劑治療組(T01和T02)中有三隻動物。在T03至T06的每一組中有六隻動物。疫苗劑量為2毫升，在第0天用一或二劑疫苗對該組接種。在第0天，在右頸施用試驗製品。接受雙劑量(4毫升)試驗製品的動物(T02、T04和T06)如單次注射那樣在一側接受全部雙劑量。在第0天至第4天(含第0天和第4天)和第6、9與14天，在頸右側觀察注射部位，包括注射部位反應大小的估算。在第0天，在試驗製品給藥之前觀察注射部位。用一或二劑量的安慰劑接種的組在注射部分反應體積方面沒有表現出任何明顯的增加，因此，這些數據沒有顯示在圖7中。在非微流化疫苗製劑的情況下，在一劑量和二劑量接種之間，注射部位反應體積成比例增加。另一方面，在微流化疫苗製品的情況下，儘管單劑量導致較大的注射部位反應體積，但用第二劑量注射不會導致進一步的增加。此外，在用微流化疫苗製劑注射的動物中，與用非微流化疫苗製劑注射的動物相比，注射部位反應體積以較快的速度消解。這些結果顯示在圖7中。
實施例11含有固有地混入的BVD病毒和鉤端螺旋體抗原和免疫刺激分子(例如Quil-A和DDA)的微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品的製備在適當的佐劑中，以大約1.4×109生物體/5毫升劑量的直接計數配製福馬林滅活的鉤端螺旋體hardjo-bovis菌株CSL。以大約2400Nephalomeric Units/5毫升劑量配製福馬林滅活的鉤端螺旋體Pomona菌株T262。基於預處理的發酵流體的nephalometric測量而計算Nephalomeric Units。以大約3000相對單位/5毫升劑量的E2 Elisa滴度配製BVD病毒1型。以大約3500相對單位/5毫升劑量的E2 Elisa滴度配製BVD病毒2型。基於在組合前(pre-assembly)、滅活後的批量(bulk)流體的E2 ELISA滴度來計算該相對單位。Quil-A和膽固醇均以每劑量0.5毫克的濃度使用。分別以0.009％和2.5％的最終濃度使用Thimerosol和AMPHIGEN製劑。以2.0％的最終濃度使用氫氧化鋁(Rehydragel LV)。當使用DDA作為免疫調節劑時，DDA被包括在AMPHIGEN製劑中。該AMPHIGEN製劑(即，40％Drakeol-卵磷脂儲液)含有1.6毫克/毫升DDA，並且在適當稀釋時，該最終疫苗製品含有2.5％AMPHIGEN製劑和0.1毫克/毫升DDA。
在不同疫苗製品的製備中，將BVD部分、Leptos、Quil-A、膽固醇、thimerosol、AMPHIGEN製劑、和作為填充劑的鹽水加入Silverson均化器中，並以10,000±500RPM混合15分鐘。隨後在10,000psi下經200微米篩將這些組分微流化。
當疫苗製劑含有氫氧化鋁時，在無氫氧化鋁的情況下進行微流化。在完成微流化後，加入氫氧化鋁，並用攪拌子在4℃混合過夜。
實施例12用於激發(challenge)研究的BVD病毒疫苗的製備本實驗中使用的疫苗製品含有來自BVD病毒1型和BVD病毒2型的抗原。以對於gp53為2535RU/劑的滅活後ELISA滴度使用BVD1-5960抗原。以對於gp53為3290RU/劑的滅活後ELISA滴度使用BVD2-890抗原。以0.5毫克/毫升的濃度使用Quil A和膽固醇。分別以0.009％和2.5％的最終濃度使用Thimerosol和AMPHIGEN製劑。當使用DDA作為免疫調節劑時，DDA被包括在AMPHIGEN製劑中。該AMPHIGEN儲液(40％Drakeol-卵磷脂儲液)含有變化量的DDA，且當適當稀釋時，該最終疫苗製品含有2.5％AMPHIGEN製劑和濃度為0.5毫克/劑至2.0毫克/劑的DDA。以2％的最終濃度使用鋁凝膠(Rehydragel-LV)。以2、3和5毫克/劑使用GPI-0100。
將所有組分加入Silverson均化器中，並以10,500rpm摻合15分鐘，隨後在10,000psi下經過200微米室而由此微流化。當疫苗製品含有氫氧化鋁時，在無氫氧化鋁的情況下進行微流化。在完成微流化後，加入氫氧化鋁，並用攪拌子在4℃混合過夜。
實施例13用含有鉤端螺旋體抗原的微流化Amphigen疫苗製劑接種後，對鉤端螺旋體激發的保護表1-治療組
表1顯示了在本研究中測試的疫苗製品中的輔佐製劑的組成。如實施例11所述製備疫苗製品。在每一組中有六隻動物。在本研究中使用大約7月齡的肉用雜交小母牛。在第0天和21天，用5毫升疫苗體積經皮下途徑進行疫苗接種。用來自NADC(National AgriculturalDisease Center)的L.hardjo-bovis菌株203進行激發。在第57-59天期間用1毫升接種體(innoculum)激發。在眼睛和陰道聯合給藥而激發。激發材料含有5.0×106鉤端螺旋體/毫升。每周收集尿液用於lepto培養、FA和PCR。在第112和113天進行腎收集。
表2-鉤端螺旋體激發研究的結果
表2顯示了來自鉤端螺旋體激發研究的數據。在測定被激發動物體內的鉤端螺旋體感染百分比時，使用下列標準。如果腎臟培養物僅對一個樣品呈陽性，則該動物被認為對鉤端螺旋體是陽性的。如果動物僅在一個樣品中對FA或PCR呈陽性，該動物被認為是陰性的。如果樣品僅在一個樣品中對FA和PCR均呈陽性，其被認為對鉤端螺旋體是陽性的。
表2顯示的結果表明，基於所有三個化驗，在所有疫苗組中，尿的排洩持續時間明顯較短。就尿和腎臟的移生(colonization)而言，不含AlOH而含QAC的製劑與不含AlOH而含DDA的製劑的效力相當。在本激發研究中，AlOH不會改進，甚至會降低含QAC或含DDA的疫苗的效力。
表3-激發前幾何平均滴度峰值日(第35天)的鏡檢凝集滴度範圍
在接種的動物中檢測針對疫苗製劑中的兩種鉤端螺旋體抗原的血清學響應，並在第35天記錄峰值響應。在血清學響應和對激發的保護之間不存在相關性。疫苗製劑中鋁凝膠的存在降低了保護水平，儘管鋁凝膠在疫苗中的存在提高了血清學響應。
實施例14在用含有AMPHIGEN製劑和DDA的微流化疫苗製品免疫後，引發對BVD病毒抗原的免疫應答和對BVD2型病毒激發的保護在本實驗中使用四至七月齡的血清反應陰性小牛。有六個不同的組，每個組有10隻動物(表4)。在第0天和第21天，每隻動物在肩胛骨和頭部之間大致正中的側頸處接受一劑2毫升皮下劑量的疫苗或安慰劑。
表4-治療組
在研究的第44天鼻內施用5毫升劑量的激發病毒製品(每鼻孔大約2.5毫升)。在本研究中使用Noncytopathic BVD病毒2型，isolate#24515(Ellis Strain)、lot#46325-70作為激發菌株。在激發開始及其剛完成時，滴定激發材料的保留樣品(每次滴定重複兩次)。每5毫升劑量的平均存活病毒滴度在激發前為5.3log10FAID50/5毫升，在激發後為5.4log10FAID50/5毫升(FAID等於TClD50)。
從第-3天至第58天每天監測動物。根據因BVD2感染導致的臨床體徵，在第42天至第58天對每隻動物進行0、1、2或3的臨床疾病評分。在激發前記錄第44天的評分。在第0、21、35、44和58天從每隻動物中採集血液樣品(兩個13毫升血清分離管，SST)以測定BVD1型和BVD2型病毒中和抗體的血清滴度。
在第42天至第58天(含第42天和第58天)，從每隻動物中採集血液樣品，並測定血沉棕黃層細胞(buffy coat cell)中BVD病毒的存在。在第44天，在激發前採集樣品。
為了測定白細胞數量，在第42天至第58天(含第42天和第58天)從每隻動物中採集血液樣品(一個4毫升EDTA管)。在第44天，在激發前採集樣品。
白細胞減少被確定為WBC數由基準線(激發前兩天和激發當天的預激發WBC數的平均值)降低40％或更多。
臨床疾病評分用於如下界定疾病的狀況如果評分≤1，那麼無疾病，如果評分＞2，那麼有疾病。
如表5和6所示，用含有BVD病毒抗原與AMPHIGEN製劑、Quil A或DDA並微流化的疫苗接種過的組，以對BVD1型和BVD2型病毒均較大的血清病毒中和滴度進行血清轉化。在這些組中，在激發後表現出病毒血症的動物的百分比也顯著降低，而在對照組中100％的動物都患上了病毒血症(表7)。此外，在這些接種過的組中，疾病的發病率也明顯降低(表8)。類似地，在疫苗組中表現出白細胞減少的動物的百分比也降低，且與含Quil A的組相比，在含DDA的組中白細胞減少症更明顯減少(表9)。在對照組中，與接種疫苗組相比，體重增長顯著降低(表10)。
血清學在第0天接種疫苗前，對BVD病毒1和2型的抗體而言，研究中的所有動物是血清反應陰性的(SVN＜1∶2)(數據未顯示)。在第二次接種疫苗(第35天)後14天，對BVD病毒1和2型的抗體而言，施用安慰劑(T01)的所有動物均保持血清反應陰性；對BVD病毒1和2型的抗體而言，用ITAs(調查測試抗原(Investigational Test Antigen))接種的所有動物均為血清反應陽性(SVN≥1∶8)。在第35天，一隻被施用如下疫苗的動物對BVD病毒2型的抗體具有3的SVN滴度，該疫苗被佐以AMPHIGEN製劑，其DDA為2毫克/劑(表11和12)。
在第44天激發前，所有對照動物(T01)，除一隻以外，對BVD病毒1和2型的抗體均為血清反應陰性(SVN＜1∶2)(數據未顯示)。一隻對照動物(#2497)對BVD病毒1型的抗體是血清反應陽性的(SVN＝10)，對BVD病毒2型的抗體是血清反應陰性的。在激發後14天，所有研究中的動物對BVD病毒1和2型的抗體均是血清反應陽性的。
表5.BVD病毒1型幾何平均血清病毒中和滴度
表6.BVD病毒2型幾何平均血清病毒中和滴度
表7.激發後的BVD病毒分離
表8.激發後BVD病的臨床體徵
表9.激發後的白血球減少症
表10.研究中的體重和體重增加
病毒分離如表13中所示的數據，在激發過程中(第44天至58天)，對照組(T01)中全部十隻動物都患上了病毒血症(在一天或幾天分離BVD病毒)。在施用ITAs的組中，患病毒血症的動物的頻率在每組10隻動物中為1、0、3、2和2(分別為T02、T03、T04、T05和T06)。對照組與施用ITAs的組之間的差別在統計學上是顯著的(P≤0.05)。對對照組而言，與施用ITAs的組相比(0.0至0.5天)，病毒血症天數的最小均方也明顯較高(10.4天)。
臨床疾病臨床體徵評分為2或3的動物被認為表現出BVD疾病的徵兆。如表14中所示，具有BVD病毒病臨床體徵的動物的頻率在對照組(T01)中為10隻中的9隻，而在施用ITAs的每一組中(分別為T02、T03、T04、T05和T06)為10隻中的1、2、0、0和0隻。對照組與施用ITAs的組之間的差別在統計學上是顯著的(P≤0.05)。
白細胞減少如表15中所示，在激發過程中(第44天至58天)，對照組(T01)中全部十隻動物都患上了白細胞減少症(第42-44天，白細胞數量由激發前的基準線降低40％)。在施用ITAs的各組中(分別為T02、T03、T04、T05和T06)，患白細胞減少症的動物的頻率為10隻動物中的6、2、4、3和2隻。對照組與施用了佐以0.5毫克/劑的AMPHIGEN製劑和氫氧化鋁的疫苗的組(T03)之間的差別，在統計學上是顯著的(P≤0.05)。對對照組而言，與施用ITAs的組相比(0.2至1.2天)，白細胞減少症天數的最小均方也明顯較高(7.8天)。
實施例15在用含有GPI-0100的微流化疫苗製劑免疫後，引發對BVD病毒抗原的免疫應答和對BVD2型病毒激發的保護按照實施例14中所述的一套實驗條件，直接比較Quil A與GPI-0100。如表11和12所示，用含有Quil A或GPI-0100的微流化AMPHIGEN製劑-基製品中的BVD抗原接種的動物，對BVD1型和BVD2型病毒都具有顯著的抗體滴度。BVD1型病毒的抗體滴度遠高於BVD2型病毒。然而，隨後用BVD2型病毒進行的激發表現出強保護作用，並且用含有GPI-0100的微流化AMPHIGEN製劑-基疫苗製品接種的牛中明顯降低了疾病發生率。
表11.BVD病毒1型幾何平均血清病毒中和滴度
表12.BVD病毒2型幾何平均血清病毒中和滴度
表13.激發後的BVD病毒分離
表14.激發後BVD病的臨床體徵
表15.激發後的白細胞減少症
總之，通過在接種動物中不存在副反應或死亡率，證明每種疫苗的安全性。通過在100％接種動物中的血清轉化(對BVD-1和BVD-2的SVN抗體滴度＞1∶8)，驗證每種疫苗的效力。僅用佐以2毫克GPI-0100的疫苗被驗證具有令人滿意的抗激發性。
實施例16在微流化水包油乳狀液中包含微囊化抗原的疫苗製品將3克海藻糖(Fluka)加入水中以產生333毫克/毫升的海藻糖儲液。在海藻糖溶液中加入溶於0.8％SDS溶液(SDS/rPauA)中的重組PauA抗原，以獲得494μg rPauA/ml的最終濃度。在下一步驟中，將10克聚交酯羥基乙酸(PLG-Resomer RE 503H，Boeringher Ingelheim)溶於200毫升二氯甲烷(MeCl2)中。將所得PLG/MeCl2溶液與第一步驟中製成的SDS-rPauA/海藻糖溶液合併。使用來自MicrofluidicsModel M110EH的微流化器對合併的溶液進行微流化，並使用TemcoSpray Dryer Model SD-05將微流化製品噴霧乾燥。使用500微米篩收集噴霧乾燥後的材料。
使用蛋白質印跡分析(Western blot analysis)量化這種噴霧乾燥材料中rPauA的濃度。將1.04毫克噴霧乾燥材料溶於50微升丙酮，並在室溫下以13,200rpm離心10分鐘。去除上清液。將上清液和丸粒餾分(pellet fraction)在生物安全罩中乾燥2.5小時。使丸粒再懸浮於47.43微升樣品溶液(25微升樣品緩衝劑+10微升還原劑+65微升水)中。將乾燥的上清液餾分用20微升樣品溶液再懸浮。在蛋白質印跡分析中，使用純化PauA作為標準物以量化噴霧乾燥材料中的rPauA含量。
將100克甘露醇(Sigma)溶於500毫升注射用水(WFI)中，由此製備20％甘露醇儲液。將溶液用熱板/攪拌器加熱至40℃並冷卻至30℃。將溶液通過0.22微米無菌濾器(Millipore)無菌過濾。將12.5克羧甲基纖維素(Sigma)溶於500毫升WFI中並在4℃混合過夜，以製備2.5％羧甲基纖維素溶液。將溶液在121℃高壓滅菌。
將噴霧乾燥產生的粉末在含有5％甘露醇、0.3％羧甲基纖維素和1∶5000thimerosol的溶液中重構。將最終溶液等分到3毫升瓶中並使用冷凍乾燥器(USIFROID)凍幹。凍乾粉末代表微囊化rPauA。將微囊化亞單位蛋白抗原懸浮在包含AMPHIGENg製劑的2毫升微流化水包油乳狀液中(例如實施例20中所述的微流化乳狀液)，並用作疫苗。
實施例17在水包油乳狀液中包含細菌完整細胞抗原和重組蛋白抗原的微流化疫苗製劑的製備製備既含重組乳房鏈球菌PauA蛋白又含大腸桿菌病毒細胞(它們如實施例2和3所述固有地加入水包油乳狀液中)的兩種疫苗製品。重組PauA抗原為100微克/劑的濃度，且大腸桿菌細胞的最終計數為4×109/劑。兩種疫苗製劑的乳狀液佐劑組成顯示在表16中。
表16.含有重組蛋白和完整大腸桿菌細胞的疫苗製劑
實施例18對在水包油乳狀液中含有rPauA和完整細胞細菌劑的微流化疫苗的免疫應答在此實驗中使用成熟奶牛。動物在登記時處於它們的第一或第二哺乳期的末端。對於每一疫苗製劑，皮下注射2毫升，注射三次，一次在乾燥時(D-0)，28天後一次(D＝28)，產犢後4至10天再一次(C+4-C+10)。第一和第三劑在頸部左側給藥，第二劑在頸部右側給藥。在每次接種疫苗之前和在第三次接種疫苗之後大約14天和32天，採集血液。通過ELISA測定大腸桿菌和rPauA抗原的抗體滴度。如圖8所示，結果表明，在用含有GPI-0100作為免疫刺激物的疫苗製劑接種的組中，rPauA的抗體滴度較高，並在初次接種後第70天達到峰值。對大腸桿菌抗原的抗體滴度表示在圖9中。在兩種疫苗製劑中，對大腸桿菌抗原的抗體滴度相當，儘管作為免疫刺激物的GPI-0100的存在，與含有DDA作為免疫刺激物的製劑相比，引發了相對較高的抗體滴度。
實施例19微流化AMPHIGEN製劑基疫苗製品的殺病毒活性分析為了確定微流化是否使病毒失活，測定三種微流化AMPHIGEN製劑基疫苗製品的殺病毒活性。這三種製品含有三種不同的牛傳染病毒，也就是牛皰疹病毒(BHV)、副流感病毒3(PI3)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)。
按照USDA 9CFR.113.35要求，進行三種疫苗製品的殺病毒活性檢測。
表16所示的結果表明，AMPHIGEN製劑基疫苗製品的微流化不會導致疫苗製品的明顯失活。
表16.微流化疫苗的殺病毒活性分析
A＝以650毫升/分鐘加入的膽固醇B＝以28毫升/分鐘加入的膽固醇C＝以5毫升/分鐘加入的膽固醇M200＝用200微米篩微流化M75＝用75微米篩微流化M75@37C＝在微流化前加熱至37℃的流體高於0.7的值指示殺病毒效果。
實施例20微流化AMPHIGEN製劑的製備將DRAKEOL卵磷脂油溶液(含有25％卵磷脂的輕質礦物油)與TWEEN 80(最終濃度為0.18％)和Span80(最終濃度為0.08％)在36±1℃下混合8-22小時以結合，由此製備AMPHIGEN製劑。然後藉助於Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器以大約3400rpm將油混合物加入鹽水中。隨後使混合物一次經過微流化器，該微流化器帶有在4500±500psi下的200μm互作用室。圖10A和10B表明微流化AMPHIGEN製劑的穩定性。在開始時，起始時間點(圖10A)通過雷射衍射測得的粒度分布幾乎等於在4℃儲存22個月後的粒度分布(圖10B)。
實施例21Quil A-膽固醇免疫原性複合物的電子顯微分析為了測定通過Quil A和膽固醇形成的免疫原性複合物的性質，在存在或不存在抗原的情況下製造這兩種組分的混合物。
在含有50毫升KR-Hals緩衝劑的燒杯中，用磁子攪拌溶液的同時加入BVD I型抗原。此後，在攪拌溶液的同時逐滴加入Quil A(50毫克/毫升)的濃縮儲液以實現50微克/毫升的最終濃度。添加Quil A後，加入膽固醇在乙醇中的儲液(18毫克/毫升)直至50微克/毫升的最終濃度。
在第二燒杯中，以相同方式在不含任何BVD I型抗原的50毫升緩衝劑中加入Quil A和膽固醇。
對於透射電子顯微術，使10微升每種樣品吸附到帶有聚醋酸甲基乙烯脂/碳支承平臺的400目銅網上(Electron Microscopy Sciences，Inc.，Fort Washington，PA)。使用10微升過濾的2％磷鎢酸，pH5.2作為造影劑，將樣品負性染色。使用JEOL1230透射式電子顯微鏡(JEOL Inc.，Tokyo，Japan)在80kV加速電壓下檢測樣品。用Gatan BioScan792照相機進行數碼成像。在4489EM膜上進行薄膜顯微並列印到KodabromeII RC F3紙(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)上。
在僅含膽固醇和Quil A而不含任何BVD I型抗原的溶液中，與QuilA微胞和膽固醇晶體一起檢測螺旋狀微胞(圖11)。將螺旋狀微胞纏繞並顯示網狀。在包含BVD I型抗原的樣品中，發現螺旋形微胞無規環繞某些緻密區(圖12)。緻密區代表BVD1型抗原，且發現由Quil A和膽固醇結合形成的螺旋狀免疫原性複合物吸附在BVD I型抗原表面上。
權利要求
1.一種包括皂草糖苷、甾醇和抗原的疫苗，其中所述皂草糖苷和所述甾醇互相結合以形成螺旋狀微胞形式的複合物，並且其中所述抗原與所述螺旋狀微胞混合，但是沒有結合到其中。
2.如權利要求
1所述的疫苗組合物，進一步包括獸醫可接受的載體。
3.如權利要求
2所述的疫苗組合物，其中所述獸醫可接受的載體是水包油乳狀液。
4.如權利要求
1所述的疫苗組合物，其中所述皂草糖苷是三萜系化合物。
5.如權利要求
4所述的疫苗組合物，其中所述三萜系化合物是Quil A。
6.如權利要求
1所述的疫苗組合物，其中所述甾醇是膽固醇。
7.如權利要求
1所述的疫苗組合物，其中所述抗原包括病毒抗原、細菌抗原、或其組合。
8.如權利要求
7所述的疫苗組合物，其中所述抗原包括BVDV 1型或2型抗原。
專利摘要
本發明提供了可用作疫苗佐劑以提高抗原免疫原性的亞微型水包油乳狀液。本發明還提供了含有固有地或非固有地與這種乳狀液結合的抗原的疫苗組合物。本發明還提供了製備乳狀液和疫苗的方法。
文檔編號A61K39/09GK1997390SQ20058001198
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月24日
發明者P·J·多米諾維斯奇, P·K·克洛斯, R·L·克雷布斯, R·M·曼南 申請人:輝瑞產品有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan