判斷是否已適當進行非甲基化胞嘧啶轉化處理的試劑盒和方法及用其分析甲基化dna的方法

2023-05-27 17:19:11

專利名稱：判斷是否已適當進行非甲基化胞嘧啶轉化處理的試劑盒和方法及用其分析甲基化dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種判斷是否已適當進行非甲基化胞嘧啶轉化處理的試劑盒及方法 以及用其分析甲基化DNA的分析方法。
背景技術：
在人類等高等真核生物的染色體DNA中，由CG雙核苷酸序列構成的CpG部位的胞 嘧啶常會被甲基化。此CpG部位的胞嘧啶甲基化起到了調控基因表達的作用。比如，在基 因啟動子區有含有大量CpG部位的區域，此基因啟動子區中有無胞嘧啶甲基化，控制著該 基因從DNA轉錄的開與關。通過DNA的甲基化來控制基因表達在早期胚胎發育、組織特異性基因表達、基因 印記、X染色體失活、染色體穩定化、DNA複製的分型等事件上發揮著重要作用。有報告稱 DNA甲基化有可能強烈參與癌症等疾病。分析所述DNA甲基化的方法一般常用甲基化特異性PCR法和亞硫酸氫鹽測序法。 這些方法都是進行用可將非甲基化胞嘧啶轉化成其他鹼基的試劑(非甲基化胞嘧啶轉化 劑)亞硫酸氫鹽將待分析DNA的未被甲基化的胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)轉化成其他鹼基 的處理(非甲基化胞嘧啶轉化處理)。甲基化特異性PCR法用非甲基化胞嘧啶轉化處理後 的DNA，分別通過胞嘧啶轉化成其他鹼基時的引物組及胞嘧啶未轉化成其他鹼基時的引物 組，進行聚合酶鏈式反應，調查有無擴增產物，以此分析DNA的甲基化。因此，在甲基化特異性PCR法和亞硫酸氫鹽測序法中，如果非甲基化胞嘧啶轉化 處理未適當進行，就不能正確檢出甲基化DNA。為此，判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適 當進行，在正確檢出甲基化DNA上很有必要。專利文獻1中公開了一種確認是否適當進行重亞硫酸鹽處理的引物，該引物基於 不含CG序列的區域設計，且有將鹼基序列中胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶的鹼基序列。專利文獻1 專利公開2005-58217號公報

發明內容
本發明的目的之一是提供一種能夠正確判斷是否適當進行非甲基化胞嘧啶轉化 處理的試劑盒及方法。本發明的另一目的是提供一種能夠準確、高效地分析甲基化DNA的 甲基化DNA分析方法。即本發明涉及(1) 一種用於判斷是否適當進行了將非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 非甲基化胞嘧啶轉化處理的試劑盒，該試劑盒包括第一引物組，由數條引物構成，其中所述數條引物與非甲基化胞嘧啶轉化處理的 目標-生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交，第二引物組，由數條引物構成，其中所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的 核酸雜交；(2)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於所述不含胞嘧啶的鹼基序列和所述含胞嘧 啶而不含CpG位點的鹼基序列是存在於所述生物體的同一染色體上的鹼基序列；(3)上述(2)所述試劑盒，其特徵在於所述不含胞嘧啶的鹼基序列和所述含胞嘧 啶而不含CpG位點的鹼基序列在所述生物體DNA的鹼基序列中均包含在300bp以內的鹼基 序列中；(4)上述⑵或(3)所述試劑盒，其特徵在於第一引物組所含至少一條引物與使 用第二引物組的核酸擴增所擴增的核酸雜交；(5)上述⑵或(3)所述試劑盒，其特徵在於第二引物組所含至少一條引物與使 用第一引物組的核酸擴增所擴增的核酸中由胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的鹼基序列 構成的核酸雜交；(6)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於非甲基化胞嘧啶轉化處理是用亞硫酸氫鹽 對DNA進行處理；(7)上述⑴所述試劑盒，其特徵在於胞嘧啶以外的鹼基是尿嘧啶；(8)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於所述生物體DNA是人類基因組DNA ；(9)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於所述生物體DNA包含癌細胞的DNA ；(10)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於第一引物組包括由序列號1所示鹼基序 列構成的引物和由序列號2所示鹼基序列構成的引物；(11)上述(1)所述試劑盒，其特徵在於第二引物組包括由序列號3所示鹼基序 列構成的引物和由序列號4所示鹼基序列構成的引物；(12) 一種判斷使非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的非甲基化胞嘧啶轉 化處理是否適當進行的方法，包括以下步驟(A)將試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得 非甲基化胞嘧啶轉化試樣，(B)進行以下⑴、(ii)所述核酸擴增反應(i)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物 組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與上述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的 鹼基序列構成的核酸雜交，(ii)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第二引 物組進行核酸擴增反應，所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼 基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交；(C)測定上述步驟(B)的核酸擴增反應(i)所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反 應(ii)所獲得的擴增產物數量，(D)根據上述步驟(C)所得測定結果，算出在上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶 轉化試樣所含所有核酸中、所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 核酸的比例，及(E)根據上述步驟(D)所得計算結果，判斷上述步驟(A)是否適當進行；(13) 一種甲基化DNA的分析方法，包括以下步驟
(A)將試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得 非甲基化胞嘧啶轉化試樣，(B)進行以下⑴、(ii)所述核酸擴增反應(i)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物 組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與上述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的 鹼基序列構成的核酸雜交，(ii)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第二引 物組進行核酸擴增反應，所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼 基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交，(C)測定上述步驟(B)的核酸擴增反應(i)所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反 應(ii)所獲得的擴增產物數量，(D)根據上述步驟(C)所得測定結果，算出在上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶 轉化試樣所含所有核酸中、所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 核酸的比例，及(E)根據上述步驟(D)所得計算結果，判斷上述步驟(A)是否適當進行，(F)當在上述步驟(E)判斷上述步驟(A)適當進行時，用在上述步驟(A)獲得的非 甲基化胞嘧啶轉化試樣分析甲基化DNA。


圖1為本發明的判斷方法一實施方式的流程圖。圖2為本發明的分析方法一實施方式的流程圖。圖3為在實施例1算出分析試樣中所有核酸所含轉化核酸的比例的計算結果圖。圖4(A)為序列號7所示鹼基序列中核酸量確認用引物組1和轉化處理確認用引 物組2的各引物結合區域的簡要說明圖。(B)為序列號8所示鹼基序列中核酸量確認用引 物組1和轉化處理確認用引物組2的各引物結合區域的簡要說明圖。圖5為在試驗例1算出分析試樣中所有核酸所含轉化核酸的比例的計算結果圖。圖6為在實施例2算出分析試樣中所有核酸所含轉化核酸的比例的計算結果圖。圖7為在實施例3算出分析試樣中所有核酸所含轉化核酸的比例的計算結果圖。
具體實施例方式本發明在一個層面涉及一種判斷使非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行的試劑盒，該試劑盒包含第一引物組和第二引物 組，其中第一引物組由多條引物組成，所述多條引物與進行非甲基化胞嘧啶轉化處理目 標-生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交；第二引物組，由多 條引物構成，所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼基序列中的 胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交。本發明的試劑盒含有上述第一引物組和第二引物組。上述第一引物組能夠實際上 不受非甲基化胞嘧啶轉化處理影響地正確求出有關非甲基化胞嘧啶轉化試樣中所有核酸 數量的信息。上述第二引物組能夠正確求出有關上述非甲基化胞嘧啶轉化試樣的所有核酸中由於非甲基化胞嘧啶轉化處理而使非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的核酸數 量的信息。。因此，本發明的試劑盒因為能夠正確求出在全部核酸中非甲基化胞嘧啶轉化 為胞嘧啶以外的鹼基的核酸的比例，故能夠正確判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進 行，效果卓越。在本說明書中，所謂「甲基化胞嘧啶」指胞嘧啶的5位被甲基化的胞嘧啶。所謂「非 甲基化胞嘧啶」指胞嘧啶的5位未被甲基化的胞嘧啶。在本說明書中，胞嘧啶以外的鹼基比如有尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤等。在 後述用亞硫酸氫鹽進行非甲基化胞嘧啶轉化處理中，所述胞嘧啶以外的鹼基為尿嘧啶。
在本說明書中，所謂「非甲基化胞嘧啶轉化處理」指使DNA所含非甲基化胞嘧啶轉 化為胞嘧啶以外的鹼基的處理。非甲基化胞嘧啶轉化處理通過使讓非甲基化胞嘧啶轉化為 胞嘧啶以外的鹼基的非甲基化轉化劑與DNA接觸來進行。下面將經上述非甲基化胞嘧啶轉 化處理，非甲基化胞嘧啶轉化成胞嘧啶以外的鹼基的核酸也稱為轉化核酸。在本說明書中，所謂「非甲基化胞嘧啶轉化試樣」指經非甲基化胞嘧啶轉化處理獲 得的試樣。非甲基化胞嘧啶轉化劑無特別限定，只要是能將非甲基化胞嘧啶轉化成胞嘧啶 以外的鹼基的試劑即可。比如有亞硫酸氫鹽類等。亞硫酸氫鹽類包括亞硫酸氫鈉、亞硫酸 氫鉀等。當使用亞硫酸氫鹽作為非甲基化胞嘧啶轉化劑時，非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在本說明書中，生物體DNA只要是從生物體配製的DNA即可，無特別限定。生物體 DNA可以由從血液、淋巴細胞、尿液及活檢摘取的組織等配製。在本發明中，所述生物體DNA 以人的基因組DNA為宜，特別以癌細胞的DNA為佳。癌細胞的DNA中往往可以觀察到DNA 甲基化異常。通過上述非甲基化胞嘧啶轉化處理檢測DNA甲基化異常時，如果使用本發明 的試劑盒就可以確認上述非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行，從而可以更正確地分析 癌細胞DNA的甲基化DNA。在本說明書中，所謂「雜交」指引物在嚴格(stringent)條件下與核酸雜交。引物 與核酸雜交的狀態是引物與核酸在互補型鹼基序列退火的狀態。通過引物與核酸雜交可 以達到更適於進行核酸擴增反應的狀態。在此，所謂「嚴格條件」指進行多核苷酸的雜交、 即引物與靶核酸的雜交時該行業人士通常使用的條件。更具體而言，只要是第一引物和第 二引物能夠與非甲基化胞嘧啶轉化處理後的生物體DNA雜交的條件即可，無特別限定。雜 交時的嚴格度已知有溫度、鹽濃度、引物鏈長、引物鹼基序列的GC含量及雜交緩衝液中的 離液劑濃度的函數。嚴格條件可以使用如Sambrook，J.et al. (1998)分子克隆實驗室手 冊(第二版)冷泉港實驗室，紐約[Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2nd ed.)， ColdSpringHarborLaboratory Press, NewYork]上記述的條件等。第一引物組和第二引物組是通過核酸擴增反應使核酸擴增的引物組。核酸擴增反 應可以通過核酸擴增法進行。這種核酸擴增法只要是能定量測定擴增產物量的方法即可， 無特別限定。上述核酸擴增法比如可以列舉出聚合酶鏈式反應(PCR)法、鏈置換反應法、連 接酶鏈反應(LCR)法及轉錄擴增法等。PCR法可以用通用手法實施。鏈置換反應法比如有 LAMP法、ICAN(註冊商標)法及SMAP法等。轉錄擴增法比如有TAS法等。此外，在用第一 引物組進行的核酸擴增反應和用第二引物組進行的核酸擴增反應中，經亞硫酸氫鹽的非甲 基化胞嘧啶轉化處理產生的尿嘧啶可變為胸腺嘧啶。第一引物組和第二引物組可根據所用核酸擴增法的種類，以公認的方法設計。比如將後述各引物組的條件輸入市場出售的引物設計用軟體中，可以很容易地設計出各引物 組。設計用於定量PCR法一實時PCR法的引物組的軟體，比如有GENETYX和primer3等。 設計用於鏈置換反應法-LAMP法的引物組的軟體比如有Primer Explorer等。通過以公認 方法合成由所設計的鹼基序列構成的寡核苷酸，即可獲得各引物組的引物。組成各引物組 的引物數因所用核酸擴增法的種類而不同。比如如果是聚合酶鏈式反應法的話，各引物組 分別由二條引物構成。如果是LAMP法的話，則各引物組分別至少由四條引物構成。當所述引物組是用於PCR法的引物組時，正向引物和反向引物的Tm值的差最好在 2°C以內。引物組的各引物的鹼基序列的GC含量最好在40-60%。引物組的一條引物的鹼 基序列中鳥嘌呤最好未連續四個以上。引物組的各引物長度最好為10-40核苷酸長，15-35 核苷酸長更好。用這種引物組進行PCR法時，PCR時的退火溫度最好設定為接近引物組各 引物的Tm的溫度。本發明中的第一引物組由多條引物構成，這些引物與進行非甲基化胞嘧啶轉化處 理目標-生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交。由不含胞嘧 啶的鹼基序列構成的核酸不存在經非甲基化胞嘧啶轉化處理而轉化的胞嘧啶，鹼基序列不 會轉化。因此，第一引物組所含引物可不受非甲基化胞嘧啶轉化處理的影響地與上述核酸 雜交。因此，以非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含核酸為模板，測定用第一引物組進行核酸擴增 反應所獲得的擴增產物量，可以獲得有關非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含全部核酸量的正確 信息。當生物體DNA使用的是人類基因組DNA時，具體的第一引物組比如可列舉出包含序 列號1所示鹼基序列構成的引物和序列號-.2所示鹼基序列構成的引物的引物組等。本發明中的第二引物組由多條引物構成，其中所述數條引物與通過將含胞嘧啶而 不含CpG位點的生物體DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列 構成的核酸雜交。如上所述，胞嘧啶的甲基化發生在CpG位點的胞嘧啶中，因此，在生物體 DNA中，含胞嘧啶而不含CpG位點的鹼基序列不會含有甲基化胞嘧啶。因此，由含胞嘧啶而 不含CpG位點的鹼基序列構成的生物體DNA經非甲基化胞嘧啶轉化處理，所有胞嘧啶轉化 成胞嘧啶以外的鹼基，鹼基序列發生轉化。由此，第二引物組中所含引物可以與因非甲基化 胞嘧啶轉化處理，雜交目標-生物體DNA的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的核酸互補性 雜交。但是，對於雜交目標-生物體DNA的胞嘧啶未轉化為胞嘧啶以外的鹼基的核酸，第二 引物組中所含引物不能與胞嘧啶未轉化為胞嘧啶以外的鹼基的部分互補性雜交。結果，當 因非甲基化胞嘧啶轉化處理，雜交目標-生物體DNA的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基時， 用第二引物組與非甲基化胞嘧啶轉化試樣進行核酸擴增反應會有效地生成擴增產物。另一 方面，當雜交目標-生物體DNA的胞嘧啶未轉化為胞嘧啶以外的鹼基時，不能有效地生物擴 增產物。據此，可以非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含核酸為模板，測定用第二引物組進行核酸 擴增反應所獲得的擴增產物量，以獲得有關非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含轉化核酸數量的 正確信息。當生物體DNA使用的是人類基因組DNA時，具體的第二引物組比如可列舉出包 含序列號3所示鹼基序列構成的引物和序列號4所示鹼基序列構成的引物的引物組等。第二引物組的引物的3』末端一側序列、最好3』末端與通過非甲基化胞嘧啶轉化 處理而轉化的鹼基互補。引物的3』末端一側如果存在與作為模板的核酸非互補的部分，則 核酸擴增反應的效率下降。即如果將第二引物組的引物的3』末端一側設計為與經非甲基 化胞嘧啶轉化處理而轉化的鹼基互補，當以生物體DNA的胞嘧啶未轉化成胞嘧啶以外的鹼基的核酸為模板時，核酸擴增反應的效率就會降低。因此，採用第二引物組，可以使核酸擴 增反應以非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含轉化核酸為模板，更具特異性。結果，使用有如上設 計的引物的第二引物組進行核酸擴增，通過測定所獲得的擴增產物數量，就可以獲取更正 確的有關非甲基化胞嘧啶轉化試樣中所含轉化核酸數量的信息。在癌細胞中，有時會發生一部分染色體數量異常增加的染色體異常。因此，如果第 一引物組及第二引物組是分別以對不同染色體DNA進行非甲基化胞嘧啶轉化處理所獲得 的核酸為模板的話，可能無法正確判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。因此，最好 對所述生物體的同一染色體的DNA進行非甲基化胞嘧啶轉化處理，將該處理獲得的核酸作 為第一引物組及第二引物組雙方的模板。即，在本發明中，生物體DNA的鹼基序列中不含胞 嘧啶的鹼基序列和所述生物體DNA中含胞嘧啶而不含CpG位點的鹼基序列最好是在該生物 體的同一染色體上存在的鹼基序列。如此，當第一引物組及第二引物組是以來自同一染色 體的核酸為模板的引物組時，即使所用核酸是引起染色體數量異常的癌細胞DNA進行非甲 基化胞嘧啶轉化處理所獲得的核酸，也能夠正確判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進 行。在癌細胞中，有時會發生其他染色體異常，比如缺失、倒位、特定序列的複製數增 減等。因此，如果第一引物組及第二引物組其中之一的模板核酸來源於引起染色體異常的 區域的話，可能無法正確判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。因此，最好第一引物 組及第二引物組在核酸擴增反應中以非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含核酸中相互鄰近的區 域為模板。具體而言，在非甲基化胞嘧啶轉化處理目標的生物體DNA的鹼基序列中，最好 在300bp以內的鹼基序列內包含與第一引物組所含至少一條引物有互補性的、不含上述胞 嘧啶的鹼基序列以及與第二引物組所含至少一條引物有互補性的、含有上述胞嘧啶而不含 CpG位點的鹼基序列中由胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的鹼基序列。即，在非甲基化胞嘧 啶轉化試樣所含核酸的鹼基序列中，最好在300bp以內的鹼基序列內包含與第一引物組所 含至少一條引物雜交的鹼基序列以及與第二引物組所含至少一條引物雜交的鹼基序列。在用第一引物組進行核酸擴增所擴增的核酸與用第二引物組進行核酸擴增所擴 增的核酸之間有重複區域，可以進一步減少染色體異常對判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是 否適當進行的影響。即，最好用非甲基化胞嘧啶轉化試樣和第一引物組進行核酸擴增時所 擴增的核酸的鹼基序列與用非甲基化胞嘧啶轉化試樣和第二引物組進行核酸擴增時所擴 增的核酸的鹼基序列中存在同一鹼基序列。更具體地說就是最好[1]第一引物組所含至少一條引物是能與用第二引物組進行核酸擴增時所擴增的 核酸雜交的引物；[2]第二引物組所含至少一條引物是能與用第一引物組進行核酸擴增時所擴增的 核酸的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的鹼基序列構成的核酸雜交的引物。在本發明的試劑盒中，第一引物組的各引物及第二引物組的各引物可以分別裝在 不同的容器中提供。引物可以以乾燥狀態提供，也可以以溶解於溶劑中的狀態提供。溶解 引物的溶劑可列舉出無核酸酶純水(比如PCR級水)以及適於使核酸保持穩定的緩衝液。 適於使核酸保持穩定的緩衝液比如有經熱處理、使核酸酶及微生物等失活的TE緩衝液[組 分10mM Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8· 0) UmM EDTA]等。本發明試劑盒所包含的第一引物組及第二引物組非常適合用於判斷非甲基化胞
9嘧啶轉化處理是否適當進行。本發明還包括用該第一引物組和第二引物組判斷是否適當進 行了非甲基化胞嘧啶轉化處理的方法。本發明的判斷是否適當進行了非甲基化胞嘧啶轉化處理的方法(以下也稱「本發 明的判斷方法」)其特徵在於包括以下步驟(A)將試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得 非甲基化胞嘧啶轉化試樣，(B)進行以下⑴、(ii)所述核酸擴增反應(i)用上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物 組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與上述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的 鹼基序列構成的核酸雜交，(ii)用上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第二引 物組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體 DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交，(C)測定上述步驟(B)的核酸擴增反應(i)所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反 應(ii)所獲得的擴增產物數量，(D)根據上述步驟(C)所得測定結果，算出在上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶 轉化試樣所含所有核酸中、所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 核酸(轉化核酸)的比例，及(E)根據上述步驟(D)所得計算結果，判斷上述步驟(A)是否適當進行。本發明的判斷方法的一大特徵在於在為了測定非甲基化胞嘧啶轉化試樣中的 DNA含量而用非甲基化胞嘧啶轉化試樣和第一引物組進行核酸擴增反應的同時，還為測定 非甲基化胞嘧啶轉化試樣中的轉化核酸數量而用非甲基化胞嘧啶轉化試樣和第二引物組 進行核酸擴增反應。圖1所示為本發明的判斷方法一實施方式的流程圖。本發明的判斷方法首先將試樣中所含生物體DNA的非基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶 以外的鹼基，獲得非甲基化胞嘧啶轉化試樣(步驟Si)。步驟Sl相當於上述步驟(A)。含有生物體DNA的試樣可以通過眾所周知的方法獲得。比如可以從生物體的組織 和細胞提取DNA，溶解到水或緩衝液中製備含有生物體DNA的試樣。提取DNA除可以使用苯 酚提取法、苯酚_氯仿提取法等公知的方法外，還可以使用市場出售的DNA提取試劑盒。溶 解DNA的水或緩衝液最好能穩定保存溶解的DNA。上述溶解DNA的水或緩衝液比如可以是 不含核酸酶的PCR級水和TE緩衝液〔組分=IOmM Tris-HCl緩衝液(ρΗ8· 0) UmM EDTA〕等。試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶的轉化可以通過使前述非甲基化胞嘧 啶轉化劑和生物體DNA接觸的非甲基化胞嘧啶轉化處理進行。使用亞硫酸氫鹽作為非甲基 化胞嘧啶轉化劑時，如前所述，甲基化胞嘧啶不轉化，非甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶。在步驟Si，比如當使用亞硫酸氫鹽類的亞硫酸氫鈉進行非甲基化胞嘧啶轉化處理 時，可以在含有生物體DNA的試樣中添加亞硫酸氫鈉溶液，在適當的溫度條件下培養，使生 物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶。亞硫酸氫鹽在含有生物體DNA的試樣中的添加 量最好是使亞硫酸氫鹽在含亞硫酸氫鹽和生物體DNA的未反應混合物中的濃度達到3Μ以 上。在上述非甲基化胞嘧啶轉化處理中，比如當在含有2 μ g生物體DNA的試樣中添加亞硫酸氫鈉溶液使其最終濃度達到5M時，亞硫酸氫鈉溶液與含生物體DNA的試樣的反應時間可 以設為40分鐘-16小時，反應溫度為50°C -80°C。非甲基化胞嘧啶轉化處理的反應條件不 受上述反應條件的限制，可以適當設定。接著，用在步驟Sl獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣進行第一引物組的核酸擴增 反應(步驟S2)及第二引物組的核酸擴增反應(步驟S3)。步驟S2相當於步驟(B)的核酸 擴增反應(i)。步驟S3相當於步驟(B)的核酸擴增反應(ii)。上述步驟S2的核酸擴增反 應目的是確認總核酸量，上述步驟S3的核酸擴增反應的目的是確認轉化核酸的數量。步驟S2和步驟S3的核酸擴增反應可以採取上述核酸擴增法、如PCR法、鏈置換反 應法、LCR法、轉錄擴增法等進行。在這些核酸擴增法中從測定後述擴增產物的便捷性來說， 上述PCR法之一的實時PCR及上述鏈置換反應法之一的實時LAMP最好。用PCR法或LAMP 法擴增核酸，反應液的光學狀態(濁度、吸光度和螢光強度等)會隨核酸的擴增而變化。因 此，用上述實時PCR及實時LAMP法可以通過實時測定其光學狀態，定量測定擴增產物量。接下來，測定在步驟S2和步驟S3的核酸擴增反應所獲得的擴增產物的數量(步 驟S4)。步驟S4相當於步驟(C)。當使用實時PCR法作為上述步驟S2及步驟S3的核酸擴增法時，由於是實時監視 擴增產物DNA，在指數函數的增幅區域進行該DNA的定量，因此，能夠根據聚合酶鏈式反應 中的擴增速度論正確地定量該DNA。實時PCR法可以列舉出用發螢光的夾層的夾層法以及 使用由對擴增產物序列有特異性的螢光色素標記寡核苷酸構成的探針(如TaqMan探針、環 狀探針(CyclingProbe))的探針法。這些方法中從能夠簡便地進行擴增產物檢測及定量的 角度看，以夾層法為好。在夾層法中，夾層是一種能與通過聚合酶鏈式反應合成的雙鏈DNA 結合、在勵起光的照射下發螢光的物質。在夾層法中，通過檢測基於與擴增產物雙鏈DNA 結合的夾層所發螢光的螢光強度，即可監視擴增產物的生成量。夾層比如有(Molecular Probes公司)生產的SYBR (註冊商標)綠等。當上述步驟S2和步驟S3中的核酸擴增法使用的是實時LAMP法時，可以以伴隨核 酸擴增生成的副產品焦磷酸鎂(magnesium pyrophosphate)作為擴增產物的指標進行測 定。具體而言，焦磷酸鎂不溶於水，隨著焦磷酸鎂的增多，反應液變白濁。通過實時光學測 定反應液的濁度(或吸光度)就可定量測定擴增產物量。在實時LAMP法中也可以用上述
夾層法。在步驟S4，根據檢量線算出擴增產物的數量。上述檢量線可以通過眾所周知的方 法繪製。上述檢量線比如可以使用標準DNA與各引物組進行核酸擴增反應，根據實時監測 各擴增產物量獲得的擴增曲線、標準DNA的拷貝數、反應的周期等繪製而成。基於步驟S4對擴增產物量的測定結果，算出轉化核酸在非甲基化胞嘧啶轉化試 樣所含全部核酸中所佔的比例(步驟S5)。步驟S5相當於步驟(D)。轉化核酸在非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含全部核酸中所佔的比例可以按照下列 公式(1)算出〔用第二引物組的核酸擴增反應(ii)的擴增產物量〕/〔用第一引物組的核酸擴增 反應⑴的擴增產物量〕X100(% ) (1)根據步驟S5算出的結果，判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行(步驟S6)。 步驟S6相當於步驟(E)。
在上述公式(1)中，當算出轉化核酸在非甲基化胞嘧啶轉化試樣所含全部核酸中 所佔的比例時，計算結果越接近100%，越可以判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理適當進行。另 一方面，計算結果越接近0%，越可以判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理未適當進行。也可以設 定閾值，當計算結果比閾值高時，判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理適當進行，當計算結果比閾 值低時，判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理未適當進行。在此，閾值可以從轉化核酸在非甲基化 胞嘧啶轉化試樣所含全部核酸中所佔比例和有關使用該非甲基化胞嘧啶轉化試樣進行的 甲基化DNA分析結果的數據累積導出。閾值可隨數據累積量、核酸擴增反應種類、所用各引 物組種類以及非甲基化胞嘧啶轉化處理的反應條件等變動，比如可以設定為5% -25%，最 好設定為10% -20%。本發明的判斷方法可以通過使用本發明的試劑盒輕鬆實施。採用本發明的試劑盒和本發明的判斷方法，可以判斷在分析甲基化DNA時進行的 非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。因此，通過使用本發明的試劑盒和本發明的判斷 方法，可以正確地分析甲基化DNA。因此，本發明還包含甲基化DNA的分析方法。本發明的甲基化DNA分析方法包括以下步驟(A)將試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得 非甲基化胞嘧啶轉化試樣，(B)進行以下⑴、(ii)所述核酸擴增反應(i)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物 組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與上述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的 鹼基序列構成的核酸雜交，(ii)用上述步驟㈧獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第二引 物組進行核酸擴增反應，其中所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體 DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交，(C)測定上述步驟(B)的核酸擴增反應(i)所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反 應(ii)所獲得的擴增產物數量，(D)根據上述步驟(C)所得測定結果，算出在上述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶 轉化試樣所含所有核酸中、所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的 核酸的比例，及(E)根據上述步驟(D)所得計算結果，判斷上述步驟(A)是否適當進行，(F)當在上述步驟(E)判斷上述步驟(A)適當進行時，用在上述步驟(A)獲得的非 甲基化胞嘧啶轉化試樣分析甲基化DNA。本發明的甲基化DNA分析方法的一大特徵在於在分析甲基化DNA之前，先用上述 判斷方法判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行，當非甲基化胞嘧啶轉化處理適當進 行時才分析甲基化DNA。本發明的甲基化DNA分析方法在進行甲基化分析中使用的是適當 經非甲基化胞嘧啶轉化處理的非甲基化胞嘧啶轉化試樣，因此具有能正確、高效地分析甲 基化DNA的卓越效果。圖2所示為本發明分析方法一實施方式的流程圖。上述步驟(A)-(E)與本發明的判斷方法的操作相同。圖2的步驟S7-S12與圖1 所步驟S1-S6的操作相同。
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在本發明的甲基化DNA分析方法中，當在步驟S12[步驟(E)]判斷非甲基化胞嘧 啶轉化處理已適當進行時，用非甲基化胞嘧啶轉化試樣分析甲基化DNA (步驟S13)。當非甲 基化胞嘧啶轉化處理未適當進行時，返回步驟S7 [步驟(A)]，從獲得非甲基化胞嘧啶轉化 試樣的操作重新開始即可。甲基化DNA的分析比如可以採取甲基化特異性PCR法、分析非甲基化胞嘧啶轉化 試樣中核酸的鹼基序列的方法以及用固定有疾病相關基因的DNA、轉錄因子的DNA、表達調 控因子的DNA和啟動子區的DNA等的DNA晶片進行分析的方法等。作為DNA晶片最好是鋪 瓦式地固定有從基因的表達信息中業已解讀的基因組數據等間隔抽取的鹼基序列作為檢 測用探針的平鋪陣列(Tiling Array)。本發明的甲基化DNA分析方法中，可以用適當的非甲基化胞嘧啶轉化試樣分 析甲基化DNA。因此，可以對生物體內活動狀態因CpG位點的甲基化而改變的基因、作 為疾病發作和病情發展的指標的因子、藥物靶因子等進行高處理量分析和高通量篩選 (High-Throughput Screening)。下面用實施例詳細說明本發明，但本發明不受這些實施例的限定。實施例(實驗例1)根據人類基因組DNA鹼基序列，設計以部分該人類基因組DNA構成的鹼基序列 (序列號7)為靶序列的引物組，合成各引物，其中該引物組由二種引物組成，這兩種引物 能與不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交。其結果，獲得了包含由序列號1所示鹼基序列構成的正向引物和由序列號2所 示鹼基序列構成的反向引物的引物組。將所得引物組作為確認來自人的試樣中所含的全部 核酸量的引物組(以下稱「核酸量確認用引物組1」)。將所得核酸量確認用引物組1的正 向引物和反向引物分別溶於無核酸酶純水，製備到最終濃度為 ο μ M，獲得核酸量確認用引 物組1的正向引物水溶液和反向引物水溶液。再根據人類基因組DNA鹼基序列，設計由二種引物組成的引物組，併合成各引物， 其中所述這二種引物與含胞嘧啶而不含CpG位點的鹼基序列中胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外 的其他鹼基(尿嘧啶)的鹼基序列構成的核酸雜交。其結果，獲得了包含由序列號5所示鹼基序列構成的正向引物和由序列號6所 示鹼基序列構成的反向引物的引物組。將所得引物組作為通過確認全部核酸中所含轉化核 酸的量來確認非甲基化胞嘧啶轉化處理已適當進行的引物組(以下稱「轉化處理確認用引 物組1」)。將所得轉化處理確認用引物組1的正向引物和反向引物分別溶於無核酸酶純 水，製備到最終濃度為 ο μ Μ，獲得轉化處理確認用引物組的正向引物水溶液和反向引物水 溶液。將核酸量確認用引物組1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分別封存於無核 酸酶的容器中。再將轉化處理確認用引物組1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分別封 存於無核酸酶的容器中。以核酸量確認用引物組1和轉化處理確認用引物組1的組合作為 實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒。(實施例1)(配製分析用試樣)
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在2μ g來自人的正常乳腺組織的基因組DNA (BioChain公司制)中添加0. 3M氫 氧化鈉水溶液300 μ L，所得混合物在37°C培養10分鐘。在培養後的產物中添加IOM亞硫 酸氫鈉溶液300 μ L，所得混合物在80°C培養40分鐘，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，用核酸 純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名=Qiaquick PCR純化試劑盒)提純經亞硫酸氫鹽處理 獲得的產物中所含核酸。在所得核酸中添加氫氧化鈉至最終濃度為0. 3M，室溫培養5分鐘。 用核酸純化用離心柱(GE醫療集團制，商品名=Micr0Spin S-300HR柱)提純，獲得分析用 試樣1。用不同於上述分析用試樣1製備方法中所用來自人正常乳腺組織的基因組DNA的 另一種來自人正常乳腺組織的基因組DNA(BioChain公司制)，進行同樣操作，獲得分析用 試樣2。(測定定量PCR的擴增產物量，以確認核酸量)用實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒如下定量PCR，以判斷在分 析用試樣1和2是否分別適當進行亞硫酸氫鹽處理。在1 μ L分析用試樣1或分析用試樣2中，添加12. 5 μ L核酸擴增用試劑(Roche Diagnostics公司制，商品名FastStart SYBR Green Master Mix)、實驗例1的非甲基化胞 嘧啶轉化處理判斷用試劑盒所含核酸量確認用引物組1的正向引物水溶液(ΙΟμΜ)Ιμ 、 此核酸量確認用引物組1的反向引物水溶液(10 μ Μ) 1 μ L和水9. 5 μ L，配製PCR用反應液。 用該PCR用反應液進行定量PCR。定量PCR的反應條件是95°C保溫10分鐘後，以95°C 30 秒、62°C 30秒、72°C 30秒為一周期，反應40個周期，再在95°C 60秒、62°C 30秒、95°C 30秒 的條件下進行反應。根據用核酸量確認用引物組1和序列號9所示鹼基序列構成的標準DNA進行的 定量PCR所生成的檢量線，算出用核酸量確認用引物組1進行的定量PCR所得擴增產物量。(測定定量PCR的擴增產物量，以確認轉化核酸量)接著，除用實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒所含轉化處理確認 用引物組1取代核酸量確認用引物組1外，以同樣操作進行了定量PCR。根據用轉化處理確認用引物組和序列號10所示鹼基序列構成的標準DNA進行的 定量PCR所生成的檢量線，算出用轉化處理確認用引物組1進行定量PCR獲得的擴增產物量。(算出全部核酸中所含轉化核酸量的比例)從核酸總量確認用定量PCR的擴增產物量和轉化核酸量確認用定量PCR的擴增產 物量，根據以下公式⑵[轉化核酸量確認用定量PCR的擴增產物量]/[核酸總量確認用定量PCR的擴增 產物量]XlOO ) (2)算出分析試樣中所有核酸中所含轉化核酸的比例，作為「轉化核酸量在分析用試 樣1或分析用試樣2所含核酸總量中的比例」。其結果見圖3。圖3中，條1表示使用分析 用試樣1及實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒時的結果。條2表示使用分 析用試樣2及實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒時的結果。從圖3所示結果可以看出，使用實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑 盒可以針對來源於組織的DNA求出經亞硫酸氫鹽處理後的試樣中的全部核酸中所含轉化核酸的比例。由此結果表明，根據上述分析試樣中的所有核酸中所含轉化核酸的比例，可以 判斷DNA的亞硫酸氫鹽處理等非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。(實驗例2)根據序列號7所示鹼基序列，設計由二種引物組成的引物組，合成各引物，其中 所述二種引物能與不含CpG位點含胞嘧啶的鹼基序列中由胞嘧啶已轉化為胞嘧啶以外的 其他鹼基(尿嘧啶)的鹼基序列構成的核酸雜交。其結果，獲得了包含由序列號3所示鹼基序列構成的正向引物和由序列號4所 示鹼基序列構成的反向引物的引物組。將所得引物組作為通過確認全部核酸中所含轉化核 酸量來確認非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行的引物組(以下稱「轉化處理確認用引 物組2」)。將所得轉化處理確認用引物組2的正向引物和反向引物分別溶於無核酸酶純水， 製備到最終濃度為 ο μ M，獲得轉化處理確認用引物組2的正向引物水溶液和反向引物水 溶液。將核酸量確認用引物組1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分別封存於無核 酸酶的容器中。再將轉化確認用引物組2的正向引物水溶液和反向引物水溶液分別封存於 無核酸酶的容器中。以核酸量確認用引物組1和轉化確認用引物組2的組合作為實驗例2 的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒。序列號7所示鹼基序列中核酸量確認用引物組1和轉化處理確認用引物組2的 各個引物的結合區域見圖4(A)。圖4(A)中，Gec-F結合區域表示核酸量確認用引物組1的 正向引物的結合區域。Gec-R結合區域表示核酸量確認用引物組1的反向引物的結合區域。 BSc-F結合區域表示轉化處理確認用引物組2的正向引物的結合區域。BSc-R結合區域表 示轉化處理確認用引物組2的反向引物的結合區域。另外，轉化處理確認用引物組2的各 引物的結合區域顯示為各引物與靶序列中的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的核酸雜交的區域。(製備例1)用DNA提取試劑盒(QIAGEN公司制，商品名矽膠膜柱血液大提試劑盒(QIAmp Blood Maxi Kit))從乳癌細胞株MCF7提取基因組DNA。在2 μ g所得基因組DNA中添加 0. 3M氫氧化鈉水溶液300 μ L，所得混合物在37°C培養10分鐘。在培養後的產物中添加IOM 亞硫酸氫鈉溶液300 μ L，所得混合物在80°C培養40分鐘，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，所 得產物中所含核酸用核酸純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名QiaquiCk PCR純化試劑盒) 提純。在所得核酸中添加氫氧化鈉至最終濃度0.3M，室溫培養5分鐘。所得產物用核酸純 化用離心柱(GE醫療集團制，商品名=MicroSpin S-300HR柱)提純，獲得製備例1的分析 用試樣。(製備例2)通過與製備例1同樣的操作從乳癌細胞株MCF7提取出基因組DNA2y g，在2μ g所 得基因組DNA中添加0. 2M氫氧化鈉水溶液56 μ L，所得混合物在37°C培養10分鐘。在培 養後的產物中添加0. 1化/1對苯二酚水溶液3(^1^和3M亞硫酸氫鈉溶液520 μ L，所得混合 物在50°C培養16小時，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，所得產物中所含核酸用核酸純化試劑 盒(QIAGEN公司制，商品名QiaquiCk PCR純化試劑盒)提純。在所得核酸中添加氫氧化 鈉至最終濃度0. 3M，室溫培養5分鐘。所得產物用核酸純化用離心柱(GE醫療集團制，商品名=MicroSpin S-300HR柱)提純，獲得製備例2的分析用試樣。(試驗例1)為確認製備例1分析用試樣和製備例2分析用試樣的亞硫酸氫鹽處理是否適當進 行，用實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒或實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉 化處理判斷用試劑盒進行了確認核酸量的定量PCR和測定轉化核酸量的定量PCR。(測定定量PCR擴增產物量，以確認核酸量)測定核酸量的定量PCR，除用製備例1分析用試樣或製備例2分析用試樣取代實施 例1中使用的分析用試樣1或分析用試樣2外，其他操作與實施例1相同。根據用核酸量確認用引物組1和序列號8所示鹼基序列構成的標準DNA進行的 定量PCR所生成的檢量線，算出用核酸量確認用引物組1進行的定量PCR所得擴增產物量。 上述序列號8所示鹼基序列構成的標準DNA中核酸量確認用引物組1的各引物的結合區 域見圖4(B)。圖4(B)中，Gec-F結合區域表示核酸量確認用引物組1的正向引物的結合區 域。Gec-R結合區域表示核酸量確認用引物組1的反向引物的結合區域。(測定定量PCR的擴增產物量，以確認轉化核酸量)確認轉化核酸量的定量PCR，除用製備例1分析用試樣或製備例2分析用試樣取代 實施例1中使用的分析用試樣1或分析用試樣2外，其他操作與實施例1相同。根據用轉化處理確認用引物組2和序列號8所示鹼基序列構成的標準DNA進行 的定量PCR所生成的檢量線，算出用轉化處理確認用引物組2進行定量PCR獲得的擴增產 物量。上述序列號8所示鹼基序列構成的標準DNA中轉化處理確認用引物組2的各引物 的結合區域見圖4(B)。圖4(B)中，BSc-F結合區域表示轉化處理確認用引物組2的正向引 物的結合區域。BSc-R結合區域表示轉化處理確認用引物組2的反向引物的結合區域。(算出轉化核酸量在核酸總量中所佔的比例)從核酸量確認用定量PCR的擴增產物量和轉化核酸量確認用定量PCR的擴增產物 量，根據上述公式(2)算出分析試樣中所有核酸中所含轉化核酸的比例，其結果見圖5。圖5中，條1表示使用製備例1分析用試樣及實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處 理判斷用試劑盒時的結果。條2表示使用製備例1分析用試樣及實驗例2的非甲基化胞嘧 啶轉化處理判斷用試劑盒時的結果。條3表示使用製備例2的分析用試樣及實驗例1的非 甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒時的結果。條4表示使用製備例2分析用試樣及實驗 例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒時的結果。實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒的轉化處理確認用引物組1所 含引物的結合區域存在於不同於序列號7所示區域所在染色體的另一種染色體中。因此， 當被實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒的核酸量確認用引物組1及轉化處 理確認用引物組1所含引物擴增的區域的任何一個複製數因染色體異常而發生變化時，使 用核酸量確認用引物組1的核酸擴增反應所生成的擴增產物及使用轉化處理確認用引物 組2的核酸擴增反應所生成的擴增產物其各自絕對量變化的程度會有所不同。因此，當使 用實驗例1的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒時，如果轉化核酸在總核酸中的比例 呈異常值，則認為其原因在於癌細胞中的染色體異常。與此相對，實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒的核酸量確認用引 物組1及轉化處理確認用引物組2所含所有引物的結合區域均在人基因組DNA中序列號7所示極為有限的靶序列構成的區域(224bp)中(參照圖4)。即，在實驗例2的非甲基化胞 嘧啶轉化處理判斷用試劑盒中，核酸量確認用引物組1所含引物雜交部分的鹼基序列和轉 化處理確認用引物組2所含引物雜交部分的鹼基序列均包含在224bp的鹼基序列中。因此，即使在上述靶序列構成的區域中出現染色體異常，該染色體異常對使用核 酸量確認用引物組1的核酸擴增反應及使用轉化處理確認用引物組2的核酸擴增反應都同 樣有影響。即，即使使用核酸量確認用引物組1的核酸擴增反應所生成的擴增產物和使用 轉化處理確認用引物組2的核酸擴增反應所生成的擴增產物其各自的絕對量有變化，總核 酸中所含轉化核酸的比例不會變。顯然，使用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒可以正確判斷染色 體往往發生異常的癌細胞的基因組DNA的非甲基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。(製備例3)以與製備例1同樣的操作從乳癌細胞株MCF7提取基因組DNA2 μ g，在提取的2 μ g 基因組DNA中添加健康人的血清300 μ L，配製含血清的試樣。將配製的含血清的試樣中所 含DNA用DNA純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名Qiaquick PCR純化試劑盒)提純。在純 化的DNA中添加0. 3Μ氫氧化鈉水溶液300 μ L，所得混合物在37°C培養10分鐘。在培養後 的產物中添加IOM亞硫酸氫鈉溶液300 μ L，所得混合物在80°C培養40分鐘，進行亞硫酸氫 鹽處理。然後，所得產物中所含核酸用核酸純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名=Qiaquick PCR純化試劑盒)提純。在所得核酸中添加氫氧化鈉至最終濃度0. 3M，室溫培養5分鐘。所 得產物用核酸純化用離心柱(GE醫療集團制，商品名=MicroSpin S-300HR柱)提純，獲得 製備例3的分析用試樣。(製備例4)以與製備例1同樣的操作從乳癌細胞株MCF7提取基因組DNA2 μ g，在提取的2 μ g 基因組DNA中添加健康人的血清300 μ L，配製含血清的試樣。將配製的含血清的試樣中所 含DNA用DNA純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名Qiaquick PCR純化試劑盒)提純。在 純化的DNA中添加0. 3M氫氧化鈉水溶液300 μ L，所得混合物在37°C培養10分鐘。培養後 的產物中添加0. llg/L對苯二酚水溶液30 μ L和3Μ亞硫酸氫鈉溶液520 μ L，所得混合物 在50°C培養16小時，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，所得產物中所含核酸用核酸純化試劑盒 (QIAGEN公司制，商品名=Qiaquick PCR純化試劑盒)提純。在所得核酸中添加氫氧化鈉至 最終濃度為0. 3M，室溫培養5分鐘。所得產物用核酸純化用離心柱(GE醫療集團制，商品 名=MicroSpin S-300HR柱)提純，獲得製備例4的分析用試樣。(製備例5)以與製備例1同樣的操作從乳癌細胞株MCF7提取基因組DNA2 μ g，在提取的2 μ g 基因組DNA中添加健康人的血清300 μ L、18M胍-HC1300 μ L和20mg/mL蛋白酶Κ(希格瑪 公司制)20 μ L，所得混合物在50°C培養60分鐘。培養後所得產物中添加IOM氫氧化鈉水 溶液20 μ L，所得混合物37°C培養10分鐘。培養後所得產物中添加IOM亞硫酸氫鈉溶液 640 μ L，所得混合物在80°C培養40分鐘，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，所得產物中所含核 酸用核酸純化試劑盒(QIAGEN公司制，商品名QiaquiCk PCR純化試劑盒)提純。在所得 核酸中添加氫氧化鈉至最終濃度為0. 3M，室溫培養5分鐘。所得產物用核酸純化用離心柱 (GE醫療集團制，商品名=MicroSpin S-300HR柱)提純，獲得製備例5的分析用試樣。
(實施例2)除使用製備例3-5的分析用試樣之一取代實施例1所用分析用試樣1或分析用試 樣2之外，進行與實施例1同樣的操作，用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑 盒算出分析試樣中總核酸中所含轉化核酸的比例。其結果見圖6。圖6中，條1表示使用制 備例3分析用試樣時的結果。條2表示使用製備例4分析用試樣時的結果。條3表示使用 製備例5分析用試樣時的結果。從圖6所示結果可以看出，使用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑 盒可以針對來自染色體往往異常的乳腺癌細胞株的DNA，求出經亞硫酸氫鹽處理後的試樣 中所有核酸中所含轉化核酸的比例。顯然，使用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷 用試劑盒無論採取什麼方式進行亞硫酸氫鹽處理，都能求出經亞硫酸氫鹽處理後的試樣中 所有核酸中所含轉化核酸的比例。由此結果表明，根據上述分析試樣中所有核酸中所含轉 化核酸的比例，在各種非甲基化胞嘧啶轉化處理的情況下，都能夠判斷該非甲基化胞嘧啶 轉化處理是否適當進行。(製備例6-8)用從不同患者獲得的三種人乳腺癌組織基因組DNA1-3 [分別為BioChain公司制] 如下獲得製備例6-8的分析用試樣。在2 μ g上述人乳腺癌組織基因組DNA中添加0. 3M氫氧化鈉水溶液300 μ L，在 37°C培養10分鐘。在培養後的產物中添加IOM亞硫酸氫鈉溶液300 μ L，所得混合物在80°C 培養40分鐘，進行亞硫酸氫鹽處理。然後，所得產物中所含核酸用核酸純化試劑盒(QIAGEN 公司制，商品名Qiaquick PCR純化試劑盒)提純。在所得核酸中添加氫氧化鈉至最終 濃度為0.3M，室溫培養5分鐘。所得產物用核酸純化用離心柱(GE醫療集團制，商品名 MiCrOSpinS-300HR柱)提純，獲得製備例6_8的分析用試樣。(實施例3)除使用製備例6-8的分析用試樣之一取代實施例1所用分析用試樣1或分析用試 樣2之外，用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒，進行與實施例1同樣的操 作，算出各分析試樣中總核酸中所含轉化核酸的比例。其結果見圖7。圖7中，條1表示使 用製備例6分析用試樣時的結果。條2表示使用製備例7分析用試樣時的結果。條3表示 使用製備例8分析用試樣時的結果。從圖7所示結果可以看出，使用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑 盒，不僅對來源於細胞的DNA試樣，對來源於乳腺癌組織的DNA試樣也可以求出經亞硫酸氫 鹽處理後的試樣中所有核酸中所含轉化核酸的比例。顯然，如果使用實驗例2的非甲基化胞嘧啶轉化處理判斷用試劑盒，無論用什麼 種類的生物體試樣、無論採取什麼方式進行亞硫酸氫鹽處理，都能求出經亞硫酸氫鹽處理 後的試樣中所有核酸中所含轉化核酸的比例。由此結果表明，根據上述分析試樣中所有核 酸中所含轉化核酸的比例，在各種非甲基化胞嘧啶轉化處理的情況下，都能夠判斷該非甲 基化胞嘧啶轉化處理是否適當進行。序列表序列號1為引物序列。序列號2為引物序列。
序列號:3為引物序列。
序列號:4為引物序列。
序列號:5為引物序列。
序列號:6為引物序列。
序列號:7為靶序列。
序列號8為標準DNA序列。
序列號9為確定核酸量的引物組1相應的標準DNA序列。
序列號10為確認轉化處理的引物組1相應的標準DNA的序列。
權利要求
一種用於判斷是否適當進行了使非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的非甲基化胞嘧啶轉化處理試劑盒，該試劑盒包括第一引物組，由數條引物構成，其中所述數條引物與作為非甲基化胞嘧啶轉化處理的目標的生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交，第二引物組，由數條引物構成，其中所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述不含胞嘧啶的鹼基序列和所述含 胞嘧啶而不含CpG位點的鹼基序列是存在於所述生物體的同一染色體上的鹼基序列。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述不含胞嘧啶的鹼基序列和所述含 胞嘧啶而不含CpG位點的鹼基序列在所述生物體DNA的鹼基序列中均包含在300bp以內的 鹼基序列中。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特徵在於第一引物組所含的至少一條引物 與使用第二引物組的核酸擴增所擴增的核酸雜交。
5.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特徵在於第二引物組所含的至少一條引物 與使用第一引物組的核酸擴增所擴增的核酸中由胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的鹼基 序列構成的核酸雜交。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於非甲基化胞嘧啶轉化處理是用亞硫酸 氫鹽對DNA進行處理。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於胞嘧啶以外的鹼基是尿嘧啶。
8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述生物體DNA是人類基因組DNA。
9.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述生物體DNA包含癌細胞的DNA。
10.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於第一引物組包括由序列號1所示鹼 基序列構成的引物和由序列號2所示鹼基序列構成的引物。
11.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於第二引物組包括由序列號3所示鹼 基序列構成的引物和由序列號4所示鹼基序列構成的引物。
12.—種判斷使非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的非甲基化胞嘧啶轉化處理 是否適當進行的方法，包括以下步驟(A)將試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得非甲 基化胞嘧啶轉化試樣；(B)進行以下(i)、(ii)所述核酸擴增反應(i)用所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物組進 行核酸擴增反應，其中所述數條引物與所述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基 序列構成的核酸雜交，( )用所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第二引物組 進行核酸擴增反應，所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼基序 列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交；(C)測定所述步驟⑶的核酸擴增反應⑴所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反應 ( )所獲得的擴增產物數量；(D)根據所述步驟(C)所得測定結果，算出在所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化 試樣所含所有核酸中所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的核酸 的比例；及(E)根據所述步驟⑶所得計算結果，判斷所述步驟㈧是否適當進行。
13. 一種甲基化DNA的分析方法，包括以下步驟(A)使試樣中所含生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基，獲得非甲 基化胞嘧啶轉化試樣；(B)進行以下(i)、(ii)所述核酸擴增反應(i)用所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組成的第一引物組進 行核酸擴增反應，其中所述數條引物與所述生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基 序列構成的核酸雜交，( )用所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化試樣和數條引物組 成的第二引物組進行核酸擴增反應，所述數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生 物體DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交；(C)測定所述步驟⑶的核酸擴增反應⑴所獲得的擴增產物數量和核酸擴增反應 ( )所獲得的擴增產物數量；(D)根據所述步驟(C)所得測定結果，算出在所述步驟(A)獲得的非甲基化胞嘧啶轉化 試樣所含所有核酸中所述生物體DNA的非甲基化胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外的鹼基的核酸 的比例；及(E)根據所述步驟⑶所得計算結果，判斷所述步驟㈧是否適當進行；(F)當在所述步驟(E)判斷所述步驟(A)適當進行時，用在所述步驟(A)獲得的非甲基 化胞嘧啶轉化試樣分析甲基化DNA。
全文摘要
用由數條引物組成的第一引物組和由數條引物組成的第二引物組判斷非甲基化胞嘧啶轉化處理是否成功，其中，第一引物組的數條引物與作為非甲基化胞嘧啶轉化處理的目標的生物體DNA的鹼基序列中由不含胞嘧啶的鹼基序列構成的核酸雜交，第二引物組的數條引物與通過將含胞嘧啶而不含CpG位點的生物體DNA鹼基序列中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶以外鹼基而獲得的鹼基序列構成的核酸雜交。
文檔編號C12Q1/68GK101983245SQ20098011215
公開日2011年3月2日 申請日期2009年3月16日 優先權日2008年3月31日
發明者山本憲明, 岡智子, 梶田昌裕, 田井嘉悅, 酒井綾子 申請人:希森美康株式會社