分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法

2023-05-27 15:46:56

專利名稱：分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種分子設計結合藻尿膽 素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光複合物的功能組 分。根據其吸收光譜和螢光光譜特徵，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱 CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱 PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱 CPC)和 變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含α和β亞基，每個亞 基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜 性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可 見光，發射約580nm的螢光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的螢光；CPC吸收約 620nm的可見光，發射約640nm的螢光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的螢光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ；PEC的α 亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ；PEC的β亞基結合的輔基 色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ；CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素 PCB。藻紅藍蛋白PEC的α亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-α subunitin a heterologous host. J Bacteriol.2002 ； 184(17) :4666 4671)。我們發現，藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶不僅可以催化PCB異 構為PVB後與藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白結合，還能催化藻紅膽素PEB異構為PUB後與 藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白結合。通過基因工程技術，藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白 基因克隆於表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白；把藻 紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因、PEB生物酶合成基因克隆於表達載體。利用以上表達 載體，通過基因工程菌，可以直接生成結合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質。藻膽蛋白類螢光蛋白質可以應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。結合PUB 的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質具有與天然藻紅藍蛋白不同的光譜特性可為生物學檢測以及 醫療檢測提供更多選擇。本發明為藻紅藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用於醫藥和生物工 程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光 蛋白質的製備方法。它是應用藻紅藍蛋白α亞基裂合酶催化藻紅膽素(PEB)異構為藻尿膽素(PUB)與藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白共價結合，製備結合PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類螢光蛋白質。將含有藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因、藻紅藍蛋白α亞基類脫 輔基蛋白基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌，得到相應的工程菌， 通過這種方法得到的基因工程菌生產結合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質。為了解決上述問題，本發明所採用的技術方案如下
—種分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法，包 括如下步驟(1)採用基因工程方法，將α亞基裂合/異構酶基因或其同源基因克隆於表達載 體中，得到α亞基裂合/異構酶表達質粒；應用基因工程方法將藻紅藍蛋白α亞基類脫輔 基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；應用基因 工程方法將藻紅膽素PEB生物合成酶基因hol、pebA和pebB或其同源基因克隆於第三個和 /或第四個表達載體中，得到PEB合成質粒；(2)將α裂合/異構酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、PEB生物合成酶質粒依次 轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程菌通 過發酵工程能生產結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質，發酵後，按常規 蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質；所述的分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法， 其特徵在於應用α亞基裂合/異構酶催化藻紅膽素異構為藻尿膽素後與藻紅藍蛋白α亞 基類脫輔基蛋白進行共價結合而製備結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白 質。所述的α亞基裂合/異構酶基因是指與Anabaena sp. PCC7120中pecE和pecF 基因或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecE和pecF基因同源的基因。藻紅藍蛋白α亞基類 脫輔基蛋白基因是指與Anabaena sp. PCC7120或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecA同源的基因。本發明與現有技術相比，具有以下優點1、不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質， 大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；3、通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質 類似的蛋白，提取方便；4、生成結合PUB的新型藻紅藍蛋白α亞基類色素蛋白，具有與天然藻紅藍蛋白α 亞基類色素蛋白不同的光譜特性，為發展螢光藻膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選 擇。


圖1為本發明中PecE/PecF催化下生成的結合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光 蛋白質的光譜圖；實線吸收光譜，虛線為螢光光譜。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。實施例1(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE和 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸杆 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例2(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將E laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE和pecF 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿菌中能表達 藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例3(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE和 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸杆 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。
(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例4(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE 和pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/ 異構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例5(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE和 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸杆 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet_l中，所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種於PH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例6(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. Iaminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE 和pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/ 異構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種於PH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21 (DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘(10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例7(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE和 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸杆 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種於PH 7. 0的LB培養基中， 37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例8(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶基因pecE 和pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構酶表達質粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處於第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處於第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊，一對；上遊下遊引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種於PH 7. O的LB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養 基，37°C振蕩培養過夜；取100 μ L飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37°C振蕩培養 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉澱菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉澱用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰 上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘後加 入300 μ LLB培養基，37°C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基 平板上，倒置於37°C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽 和；分別從中取100 μ L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°C振蕩培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株進行大量表達。 上述製備方法適用於採用各種藍藻中的α亞基裂合/異構酶、藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因來製備結合PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類螢光蛋白質，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發明只選用了 GenBank中已公開全 序列的藍藻Anabaena sp. PCC7120和已公開部分序列的藍藻M. Iaminosus sp. PCC7603、 Calothrixsp. PCC7601為例對本發明方法加以說明，本領域的技術人員可以根據上述公開 的內容採用其它原料實施本發明。
權利要求
一種分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)採用基因工程方法，將α亞基裂合/異構酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到α亞基裂合/異構酶表達質粒；應用基因工程方法將藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；應用基因工程方法將藻紅膽素PEB生物合成酶基因或其同源基因克隆於第三個和/或第四個表達載體中，得到PEB合成質粒；(2)將α裂合/異構酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、PEB生物合成酶質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程能生產結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質，發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質；
2 根據權利要求1所述的分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質 的製備方法，其特徵在於應用α亞基裂合/異構酶催化藻紅膽素異構為藻尿膽素後與藻 紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白進行共價結合而製備結合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類螢光蛋白質。
3.根據權利要求1和2所述的方法，其特徵在於α亞基裂合/異構酶基因是指與魚 腥藻 Anabaena sp. PCC7120 中 pecE 和 pecF 基因或層理鞭枝藻 M. Iaminosus sp. PCC7603 中pecE和pecF基因同源的基因，藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白基因是指與Anabaena sp. PCC7120 或 M. Iaminosus sp. PCC7603 中 pecA 同源的基因。
4.根據權利要求1所述的分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質 的製備方法，其特徵在於所述的宿主菌採用大腸桿菌。
全文摘要
本發明涉及一種分子設計結合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質的製備方法，通過應用藻膽蛋白α亞基裂合/異構酶催化藻紅膽素異構為藻尿膽素PUB後與藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白共價結合，製備結合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質，本發明的方法應用生物過程生產結合PUB的藻紅藍蛋白類α亞基螢光蛋白質，是一種環境友好的生產方法；藻紅藍蛋白α亞基類螢光蛋白質能應用於生物學和醫藥功能材料領域，特別是應用為生物學和醫學檢測領域的螢光探針。
文檔編號C12N15/70GK101824427SQ200910037628
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月6日 優先權日2009年3月6日
發明者佟順剛, 夏坤 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司