應用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物的製作方法

2023-05-27 17:49:41 2

專利名稱：應用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA克隆和 亞克隆的方法和組合物。在一個具體實施方案中，應用RecE/T或Reda/(3 重組酶，或任何功能等價系統啟動細菌同源重組，如來自噬菌體P22的 erf。具體地說，本發明涉及克隆方法，診斷方法，含有用作克隆載體的 多核苷酸的組合物，含有所迷多核苷酸組合物的細胞，以及由RecE/T和 Reda/P介導的克隆試劑盒。
2.
背景技術：
在大腸桿菌中進行DNA克隆和亞克隆是分子生物學的基礎。DNA 克隆是指一個過程，其中一個複製起點操作性連接於雙鏈DNA片段，並 在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴增。DNA亞克隆也是指一個過程，其中 雙鏈DNA片段取自 一個業已擴增的DNA分子，所述擴增可以在體外進 行，如通過PCR，也可在體內進行，如在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴 增，然後將該DNA片段操作性連接於複製起點。在大腸桿菌中進行的典 型克隆和亞克隆是將DNA片段的末端與線性化栽體末端連接，所迷栽體 包括大腸桿菌的複製起點和可選擇標記。栽體包括的可選擇標記可以確 保新克隆的產物、含有插入片段的質粒在導入其宿主細胞大腸桿菌時， 可以保留並擴增。
傳統的克隆方法具有某些局限性。例如，因為傳統的克隆方法需要 應用限制性酶，因此DNA片段的選擇就受到一定限制，即目標DNA區 域內必須有限制性酶的識別位點。限制性位點必須使酶切位於所需DNA 片段之外，而不能存在其中。由於絕大多數有用的限制性酶發揮作用相 當頻繁，因此所得線性DNA片段的大小也受到限制。
應用聚合酶鏈反應(PCR)產生DNA片段是傳統亞克隆的第二個主 要缺陷。PCR產物的末端不能用於連接反應，因為耐熱聚合酶在擴增的
10PCR產物3，末端添加了非模板核苷酸。而且，應用PCR還具有突變的髙 風險。因此，分子生物學家正在尋求新的更加有效的克隆DNA片段的方 法，特別是當這些片段比通過傳統的限制性酶或PCR方法所能獲得的片 段長時。
同源重組是克隆和亞克隆DNA片段的另一種替代方法。在含有宿主 同源重組系統的大腸桿菌中亞克隆PCR產物的方法業已有迷(Olineret al., 1993， Nucleic Acids Res. 21: 5192-97; Bubeck et al.， 1993， Nucl. Acids. Res. 21: 3601-3602)。在這些方法中，用於擴增目標DNA片段的PCR 引物，被設計為含有的末端序列與線性化的載體末端序列同源。然後將 PCR產物和線性化栽體導入大腸桿菌。在大腸桿菌宿主細胞中進行的同 源重組使PCR產物序列插入到質粒栽體中。儘管這些方法業已顯示可以 用於亞克隆PCR片段，但它們還沒有用於亞克隆較長的DNA片段，或 者克隆任何大小的DNA片段。
另 一種描述的體內亞克隆方法是應用兩個線性DNA分子轉化大腸 桿菌sbcBC宿主細胞，這兩個DNA分子中的一個具有複製起點，兩個分 子在其末端都有較長的同源區域。同源重組在體內發生，導致新形成的 質粒的環化和增殖(Degryse, 1996， Gene 170:45 )。然後，大腸桿菌sbcBC 宿主細胞介導同源重組的這種能力，又用於亞克隆來自腺病毒和皰疹病 毒基因組DNAs的大型DNA片段(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70: 4805; Messerle, et al.， 1997， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 14759- 14763; He, 1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514 )。如其所迷，通過在大腸 桿菌sbcBC宿主細胞中進行同源重組需要至少兩個預先準備的亞克隆步 驟，使較長的同源區域位於大腸桿菌複製起點的兩側。而且，還沒有文 獻表明可以在大腸桿菌sbcBC菌林中進行DNA克隆。
最近，由RecE/RecT ( RecE/T)或Reda/Re鄰(Reda/|3 )介導的同 源重組業已顯示可以用於在大腸桿菌中製備DNA分子(Zhang et al., 1998， Nature Genetics, 20， 123-128; Muyrers et al.， 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557)。這些文獻顯示，在大腸桿菌中，任何完整獨立的複製，環 狀DNA分子都可通過RecE/T或Reda/(3介導的重組來改變，該重組應用 線性DNA，該線性DNA分子的側翼短區域序列與環狀分子的對應區域 一致。通過同源重組技術將線性DNA分子整合到環狀分子中，使其側翼 序列間的序列置換環狀DNA分子的相應序列。
ii本文引用的文獻不應理解為這就是本發明的現有技術。
3.

發明內容
本發明提供應用細菌重組酶介導的同源重組進行DNA克隆和亞克 隆的方法和組合物。細菌重組酶優選RecE/T和/或Reda/|3。這些方法可 以用來克隆、亞克隆、增殖和擴增目標多核苷酸或多核苷酸混合物，使 用包括與目標指定靶DNA序列側翼序列同源的DNA短區域和一個複製 起點的栽體。
在一個實施方案中，本發明提供了 一種將雙鏈靶DNA導入栽體的方 法，包括培養表達功能性重組酶的細菌，所述細菌包括(a)耙DNA，含有 第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端，以及(b)栽體DNA，在栽體DNA鏈 上以下迷順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)複製起點，以及(iii)第二個 雙鏈同源臂，這樣，栽體DNA鏈的第一個同源臂序列與把DNA鏈的第 一個末端序列同源，栽體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第 二個末端序列同源，這樣，靶DNA可以在同源臂之間插入栽體DNA中。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體導入細胞，所述細胞含有雙鏈靶DNA，並表達細菌重組酶， 所述栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，， 以下述順序存在第一個同源臂，複製起點的一條鏈，以及第二個同源 臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5，，以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個 末端，這樣栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個 末端序列同源，載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 二個末端序列同源；以及b)將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件 下。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞，所迷細胞含有 雙鏈靶DNA，並表達細菌重組酶，所述栽體含有一個複製起點和兩個同 源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂， 複製起點，以及第二個同源臂；所迷靶DNA含有一個靶DNA序列和兩 個末端，在把DNA鏈上，從3，到5，第一個末端，靶DNA序列，以及 第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以
12下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列，所 述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同 源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源；所述 第二個寡核苷酸含有笫二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含 有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與 栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與 靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)將細胞置於可以發生細 胞內同源重組的條件下。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈耙DNA分子導入細胞，所述細胞含有一個栽體，並表達細菌重組 酶，所述靶DNA含有一個耙DNA序列和兩個雙鏈末端，在耙DNA鏈 上，從3，到5，，以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第 二個末端；所迷栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個同 源臂；這樣栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個 末端序列同源，栽體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 二個末端序列同源；以及b)將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件 下。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈粑DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞，所述細 胞含有一個栽體，並表達細菌重組酶，所述靶DNA含有一個靶DNA序 列和兩個末端，在耙DNA鏈上，從3，到5',以下迷順序存在第一個 末端，把DNA序列，以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個 寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序 列和第二個核苷酸序列，所迷第 一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一 個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末 端核苷酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈 以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列， 所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核普酸序列與耙DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；所 述栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，， 以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個同源臂；以及b)將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體和雙鏈靶DNA導入表達細菌重組酶的細胞，所述栽體含有一 個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以下述順序 存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個同源臂；所述粑DNA含有 一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上，從3，到5，，以下迷順序 存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個末端；這樣載體DNA鏈 上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，載體DNA 鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的笫二個末端序列同源；以及 b)將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
在該方法的一個特定實施方案中，宿主細胞還包括一個核苷酸序列， 該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶，栽體還包括 位點特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點，第一個識別位點位 於第一個和第二個同源臂外部，第二個位點特異性重組酶識別位點位於 第一個和第二個同源臂內部；在步驟b)進行期間或之後，誘導位點特異 性重組酶的表達。
在該方法的另一個特定實施方案中，宿主細胞還包括一個核苷酸序 列，該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶，栽體還 包括一個位點特異性重組酶識別位點，該位點位於第一個和第二個同源 臂內部；在步驟b)進行期間或之後，誘導位點特異性重組酶的表達。
在另一個實施方案中，提供了製備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體，雙鏈靶DNA分子，以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入 表達細菌重組酶的細胞，所述栽體含有一個複製起點和兩個雙鏈同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3',以下述順序存在第一個同源臂，複製 起點，以及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙 鏈末端，在粑DNA鏈上，從3，到5，，以下述順序存在第一個末端， 粑DNA序列，以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷 酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第 二個核苷酸序列，所述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源 臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷 酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第
14三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源，第 四個核苷酸序列與靶DN A鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)將細 胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
在該方法的一個特定實施方案中，宿主細胞還包括一個核苷酸序列， 該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶，栽體還包括 位點特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點，第一個識別位點位 於第一個和第二個同源臂外部，第二個位點特異性重組酶識別位點位於 第一個和第二個同源臂內部；在步驟b)進行期間或之後，誘導位點特異 性重組酶的表達。
在該方法的另一個特定實施方案中，其中，宿主細胞還包括一個核 苷酸序列，該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶， 栽體還包括一個位點特異性重組酶識別位點，該位點位於第一個和第二 個同源臂內部；在步驟b)進行期間或之後，誘導位點特異性重組酶的表 達。
在特定實施方案中，栽體還包括一個位於同源臂外部的可選擇標記， 這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，栽體可以下述兩種順序含有i)第 一個同源臂，可選擇標記，複製起點和第二個同源臂，或ii)笫一個同源 臂，複製起點，可選擇標記和第二個同源臂。在一個特定實施方案中， 可選擇標記使含有該栽體的細胞呈現抗生素耐藥性。
在多個特定實施方案中，細菌重組酶是RecE/T或Reda/(3重組酶， 或者同時應用RecE/T和Redot/(3。在另一些特定實施方案中，細胞是細 菌細胞。在另一些特定實施方案中，細胞是大腸桿菌細胞。在另一些特 定實施方案中，細胞是真核細胞，並重組表達RecE/T和/或Reda/p蛋白。 在另一些特定實施方案中，該方法還包括分離重組DNA分子，該分子含 有插入到栽體中的把DNA。
在另一個實施方案中，本發明還提供了用於定向克隆或亞克隆目標 乾DNA分子的雙鏈DNA載體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂，複製 起點，以及笫二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂 的核苷酸序列與笫 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一 條靶DNA鏈上的第二個 末端核苷酸序列同源。在有關栽體的一個特定實施方案中，複製起點是細菌複製起點。在另一個特定實施方案中，複製起點在大腸桿菌中發揮 作用。在另一個特定實施方案中，複製起點在哺乳動物細胞中發揮作用。
本發明還提供了含有雙鏈DNA栽體的細胞，該栽體可用於定向克隆 或亞克隆目標靶DNA分子，包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體 DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以 及第二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈 上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核 普酸序列同源。在一個特定實施方案中，細胞是細菌細胞。
本發明還提供了可用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，該 試劑盒包括一個或多個容器a)用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分 子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體 DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以 及第二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈 上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核 苷酸序列同源；以及b)含有細菌重組酶的細胞。在一個有關試劑盒的特 定實施方案中，同源臂的序列與基於BAC， PAC,人，質粒或YAC的克 隆栽體同源。在另一個有關試劑盒的特定實施方案中，第一個和第二個 雙鏈寡核苷酸具有的核苷酸序列與基於BAC, PAC,人，質粒或YAC的 克隆栽體同源。
在另一個實施方案中，提供了用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的 試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用於定向克隆或亞克隆目標 把DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以下述順序存在第一個同源臂，複製 起點，以及第二個同源臂；b)第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一個寡核苷 酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第 二個核苷酸序列，所述第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源 臂的核普酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷 酸序列同源；c)第二個寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核普酸序列與栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的笫二個末端核苷酸序列同源；以及d)含有 細菌重組酶的細胞。在一個有關試劑盒的特定實施方案中，細胞是大腸 桿菌細胞。在另一個有關試劑盒的特定實施方案中，細胞是具有攝取DNA 能力的凍存細胞。
在另 一個實施方案中，本發明提供了用於定向克隆或亞克隆靶DNA 分子的試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用於定向克隆或亞克 隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個 同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源 臂，複製起點，以及第二個同源臂；b)第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一 個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有笫一個核苷酸 序列和第二個核苷酸序列，所述第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第
一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個 末端核苷酸序列同源；以及c)第二個寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈， 該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序 列，所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序 列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源。 在一個有關試劑盒的特定實施方案中，DNA載體經純化處理。在另一個 有關試劑盒的特定實施方案中，DNA載體、第一個雙鏈寡核苷酸和第二 個雙鏈寡核苷酸均經純化處理。
在本發明提供的另 一個有關試劑盒的特定實施方案中，靶DNA分子 包括細菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。在另一個特定實施方案中， 耙DNA分子包括已知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關的基因突變或 多態性。在另一個特定實施方案中，細菌重組酶是RecE/T或Reda/(3重 組酶，或者是RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
本發明的方法還可用於診斷。例如，可以將質粒或線性DNA片段設 計成能夠俘獲特異性靶DNA,以檢測該DNA是否存在於受試者樣本中， 如，病毒DNA存在於患者樣本中。在一個實施方案中，本發明提供了檢 測當發生基因突變時，已知或疑與功能紊亂或疾病相關的靶DNA的方 法。在特定實施方案中，該靶DNA是細菌、病毒、寄生蟲或原生動物 DNA。在一個特定實施方案中，提供了一種方法，該方法進一步包括探 測含有插入到栽體中的靶DNA的重組DNA分子。在另一個實施方案中， 該方法還包括探測含有插入到栽體中的靶DNA的重組DNA分子。在另 一個實施方案中，本發明還提供了 一種探測感染性物質存在的
方法，其中，靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者，而且，第一個和 第二個同源臂與感染性物質中存在的DNA序列同源。在一個特定實施方 案中，靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者，而且，所述第二個和第 四個核苷酸序列與感染性物質中存在的DNA序列同源。在另 一個特定實 施方案中，感染性物質是病毒、細菌、原生動物、真菌或寄生蟲。
在另一個實施方案中，本發明還提供了一種探測遺傳性病況、疾病、 功能紊亂或多態性特徵存在的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性 病況、疾病、功能紊亂或多態性特徵的患者，而且，第一個同源臂的序 列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特徵相關 的位點上遊序列同源，第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性 病況、疾病、功能紊亂或多態性特徵相關的位點下遊序列同源。在一個 特定實施方案中，提供了一種探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功 能紊亂或多態性特徵存在的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性病 況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特徵的患者，而且，第一個 雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳 性功能紊亂或多態性特徵相關的位點上遊序列同源，第二個雙鏈寡核苷 酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂 或多態性特徵相關的位點下遊序列同源。在一個特定實施方案中，遺傳 性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特徵使患者患有或易感 腫瘤，哮喘，關節炎，耐藥，藥物毒性，或神經系統、神經精神、代謝、 肌肉、心血管或皮膚病況、疾病或功能紊亂。
4.


圖1A-C。同源重組克隆和亞克隆方法的構成。
A. 栽體，包括一個複製起點(起點)， 一個可選擇標記(Sm),和 兩個同源臂(以A和B代表)。
B. 備選雙鏈寡核普酸銜接子(adaptor)。每個銜接子包括與同源臂(分 別為A和B )同源的區域(以A，和B'代表)；與靶DNA末端(分 別以C和D代表)同源的第二個區域(以C，和D，代表)。
C. 把DNA。把DNA末端核苷酸序列(C和D)可以與栽體的一個 同源臂(分別為A和B)的核苷酸序列同源，也可以與備選銜接
18子寡核苷酸(分別以C，和D，代表)的核苷酸序列同源。 圖2。方法1的實驗要點。通過同源重組技術進行亞克隆的栽體可以， 例如通過轉化，導入大腸桿菌宿主，該宿主中已經存在耙DNA以及 RecE/T或Reda/|3蛋白。該圖示意了攜帶大腸桿菌複製起點和可選擇標 記基因(Sm)的線性DNA分子，並有"同源臂"側翼，所述Sm優選其 產物具有抗生素耐藥性的基因。圖中所示的同源臂是位於線性DNA分子 兩端的灰色方框，同源臂是與靶DNA中位於亞克隆DNA區側翼的兩個 區域同源的短區域，該亞克隆DNA區側翼又稱為把DNA末端，在圖中 是被同源臂側翼包繞的粗線。轉化後，Sm基因的選擇性表達可用來鑑定 含有同源重組產物的細胞，所述同源重組位於線性DNA分子的同源臂與 把DNA之間。
圖3。以繪圖的方式代表方法2。該方法與用於圖1的方法類似，不 同點在於在該方法中，靶DNA分子沒有事先存在於大腸桿菌宿主中，而 是與線性DNA栽體分子一起，共同導入。靶DNA可以是任何來源的， 也可以是一種混合物，源自需要克隆的目標DNA區域，或者是富含DNA 的分子，源自需要亞克隆的DNA區域。如圖1所示，同源臂以灰色方框 代表。
圖4。以繪圖的方式代表方法3。克隆或亞克隆栽體包括一個大腸杆 菌複製起點和一個可選擇標記基因(Sm),其側翼是兩個同源短臂，以 灰色方框顯示。此外，栽體還包括兩個重組靶位點(SSRTs),其中一 個位於起點和可選擇標記基因之間。最為簡單的是，首先將栽體構建為 如圖所示的線性DNA片段。在環化基礎上，使第二個SSRT位於兩個同 源臂之間，定向成為相對於第一個SSRT的直接重複，這樣，在兩個SSRTs 之間的位點特異性重組就會產生兩個不同的環狀分子，從而將起點和可 選擇標記基因分開。將環化栽體轉化到表達RecE/T或Reda/(3蛋白或可 以表達RecE/T或Reda/|3蛋白的大腸桿菌菌林中。大腸桿菌菌林還攜帶 一個可誘導位點特異性重組酶(SSR)基因，該基因產物可以識別栽體 中的SSRTs，這樣，除非位點特異性重組酶基因被誘導或表達，SSRTs 間的位點特異性重組才會發生。製備攜帶栽體和調控位點特異性重組酶 基因的大腸桿菌細胞，使它們攜帶RecE/T或Reda/(3蛋白，並可用於轉 化。然後將含有預克隆區域的DNA分子導入宿主細胞。在同源臂間進行 同源重組後，誘導位點特異性重組酶蛋白的表達，並篩選可選擇標記基因的表達。在位點特異性重組前，細胞或者包括攜帶兩個SSRTs的未重 組栽體，或者包括所需同源重組產物，該產物僅攜帶一個SSRT，因為同 源重組將去除位於兩個同源臂之間的SSRT。位點特異性重組酶誘導表達 後，篩選可選擇標記的表達，這樣，包括同源重組產物的細胞將獲得生 存能力，因為該產物不再是位點特異性重組的底物。
圖5。通過RecE/T或Reda/(3同源重組，應用銜接子寡核苷酸克隆 或亞克隆。本示了上圖3所示方法2的變異。兩個銜接子寡核普酸， 每個都包括兩個同源區，其中一個同源區與栽體的一個同源臂同源，第 二個同源區與目標把DNA區域兩個末端的一個同源。栽體的環化和目標 DNA區域的克隆可通過載體和銜接子之間、以及銜接子和靶DNA之間 的同源重組完成。在該實施方案中，載體和靶DNA之間沒有序列同源性。 因此，通過應用相對於每個耙DNA的靶特異性銜接子寡核苷酸，可以應 用相同的栽體克隆或亞克隆不同的靶DNA。銜接子寡核苷酸還可用於方 法1和3 ,如上圖1和3所示。
圖6。溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠，顯示應用EcoRI消化DNA後的 結果。消化的DNA來自mAF4 BAC實驗的9個獨立克隆(泳道1 - 9 )。 泳道M是lkbDNA標準物(BRL， Bethesda, MD )。泳道10， EcoRI消 化的起始栽體。該實驗在部分6的實施例中將有詳細描述。
圖7A-B。從總酵母基因組DNA中克隆DNA區。
A. 圖示了一個擴增了 pl5A起點的PCR片段，其側翼是兩個98或 102 bp的同源臂，其任一側整合了 98或102 bp的酵母菌株MGD 353-13D中的氨苄青黴素耐藥基因。將PCR產物(0.5mg)和總 酵母基因組DNA(4.0mg)混和，電轉化到JC5519大腸桿菌中， 該菌株含有來自pBADa(3y的Reda/(3表達。通過篩選氨苄青黴素 耐藥來鑑定克隆。
B. 溴化乙啶染色的凝膠，確認IO個備選克隆中的正確克隆。
圖8A-C。在ET亞克隆中，線性栽體末端出現的重複序列或5，磷酸 的作用。
A,顯示了用於PCR擴增線性載體的寡核苷酸序列。斜體序列表示 PCR擴增線性載體所必需的寡核苷酸部分，其他核苷酸構成大 腸桿菌lacZ基因的同源臂。黑體序列在線性栽體的兩端都有出 現，這樣可以形成末端重複。線性栽體構建物a-x具有不同長度的重複序列。該線性栽體包括pl5A複製起點，加上氯黴素耐藥 基因Cm，，側翼是兩個同源臂，以及圖示的末端重複序列。
B. 圖示了用於檢測栽體構建物在ET亞克隆大腸桿菌lacZ基因效率 的策略，所示栽體構建物含有A中所示的不同重複序列。
C. 列表顯示了重複序列長度和磷酸化對ET亞克隆效率的作用。應 用含有A中所示重複序列的栽體得到的測試結果如表所示。
圖9A-B。應用pBAD-a(3丫 (tet)進行ET重組亞克隆。
A. 圖示pR6K/BADa(3丫質粒，包括R6K起點，pir-116複製子，來 自pBR322 (tet，)的四環素耐藥基因，以及阿拉伯糖抑制子 (araC)。
B. 比較應用pBAD-a(3y (tet) ( Co舊l ori)和pR6K/BAD a(3丫進行 ET重組亞克隆。
圖IOA-B。在BAC上亞克隆AF-4基因的19kb片段。
A. 質粒構建物和亞克隆策略，tet，，四環素耐藥基因。AraC，阿拉 伯糖抑制子。
B. 分析5個獨立克隆。溴化乙啶染色HindIII消化DNA凝膠，該 DNA來自5個獨立正確克隆和線性栽體。膠質亞克隆經DNA序 列分析確認。M， lkbDNA階梯。
圖UA-B。應用基因組DNA作為靶DNA源進行ET亞克隆。
A. 來自大腸桿菌的基因組DNA通過Xhol消化預線性化。該線性栽 體包括ColEl起點和卡那黴素耐藥基因kan，其側翼為同源臂， 可以將重組定位於大腸桿菌染色體的lacI/lacZ位點。
B, 對16個獨立克隆的限制性分析。泳道17代表線性載體。M, lkb DNA階梯。
圖12A-B。亞克隆來自鼠ES細胞基因組DNA的新黴素基因neo。
A. 亞克隆策略圖。
B. 卡那黴素耐藥克隆的限制性分析。 圖13。 ET克隆和亞克隆的組合。
5.
具體實施例方式
本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA克隆和 亞克隆的方法和組合物。本發明發明人發現，細菌重組酶可以某種特定
21方式，用來獲得高效靶克隆或亞克隆。
細菌重組酶優選應用RecE/T和/或Redoc/p。在大腸桿菌中，RecE/T 途徑以前業已有所描述，其組分也已被部分認識(Hall and Kobdner， 1994， Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91: 3205-3209; Gillen et al., 1981， J. Bacteriol. 145:521-532 )。通過RecE/T途徑的重組需要兩個基因的表達，rec E和 rec T,其DNA序列已經公開(Hall et al.， 1993， J. Bacteriol. 175: 277-278 )。 RecE蛋白的功能與人外顯子相似，後者又被稱為Redot， RecT蛋白的功 能與Re鄰以及噬菌體P22的erf相似(Gillen et al., 1977， J. Mol. Biol. 113: 27-41; Little, 1967， J. Biol. Chem. 242: 679-686; Radding and Carter, 1971， J. Biol. Chem. 246: 2513-2518; Joseph and Kolodner, 1983, Biol. Chem. 258: 10411-17; Joseph and Kolodner, 1983， Biol. Chem. 258: 10418-24; Muniyappa and Radding， 1986, J. Biol. Chem. 261: 7472-7478; Kmiec and Hollomon， 1981， J. Biol. Chem. 256: 12636-12639; Poteete and Fenton， 1983, J. Mol. Biol. 163: 257-275; Passy et al., 1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4279-4284，以及這些文獻引用的參考文獻)。
本文描述的是涉及應用細菌重組酶指導DNA克隆和亞克隆的方法 和組合物。本文應用的術語"DNA克隆"是指將任何來源的DNA插入 到自治複製栽體的過程，這樣，該DNA可以在宿主細胞中增殖。術語 "DNA亞克隆"是指將業已存在於自治複製載體的DNA片段穿梭於另 一自治複製栽體的過程，或者將來自富含DNA分子如純化病毒基因組的 DNA片段或經PCR擴增的DNA片段穿梭於另一自治複製栽體的過程。 術語"定向"或"靶"克隆和亞克隆是指應用同源臂以及(在很多實施 方案中是)銜接子寡核苷酸來選擇靶DNA，並通過同源臂的選擇和定向 作用，指導或定向靶DNA的插入。應該指出，本發明所有申請方法適用 於克隆和亞克隆DNA。
本發明組合物和方法的構建將在這裡給予詳盡闡述。具體地說，部 分5.1描述了本發明應用同源重組技術靶向克隆DNA片段的介導重組克 隆方法。下面的部分5,2描述了本發明組合物，包括設計用來定位、俘獲 和克隆目標靶DNA片段的DNA構建物。該部分還描述了編碼細菌重組 酶如RecE/T和/或Reda/(3蛋白的核酸分子，含有這些組合物的細胞，以 及構建這些核酸和細胞的方法。下面的部分5.3描述了細菌重組酶靶向克 隆方法的應用，以及探測基因表達和診斷疾病狀態的試劑盒。5.1通過同源重組技術克隆和亞克隆的方法
通過細菌重組酶介導的同源重組技術，可以應用本文描述的不同方 法，高效靶向克隆任何目標DNA。本文描迷的3種方法所需的常見組分 是一種表達細菌重組酶重組蛋白的細胞，和一個栽體。該栽體的一個示 例見圖1A。栽體包括3個必需元素 一個複製起點和兩個雙鏈DNA短 區，本文又稱為"同源臂"。
同源臂被特意設計成可以通過同源重組技術，允許栽體在兩個同源 臂之間"俘獲"目標把DNA。同源臂的序列、位置和定向性對於靶DNA 在兩臂之間的正確插入至關重要。在一個實施方案中，同源臂序列與粑 DNA的末端同源，兩個同源臂的DNA序列位於目標靶DNA的側翼，其 中 一個臂(在圖1中以A代表)對應於靶DNA (在圖1中以C代表)的 上遊DNA序列，第二個臂(在圖1中以B代表)對應於靶DNA (在圖 1中以D代表)的下遊序列。兩個臂相對於所需插入的定向性必須與同 源序列相對於靶DNA的定向性相同(見圖1)，這樣，同源臂與靶DNA 之間的重組才會導致把DNA被插入到兩個同源臂之間或"內部"(見圖 1)。在這裡， 一個位置被定義為同源臂"內部"是指，如果該位置位於 兩個同源臂之間，這樣，在一個方向上，第一個同源臂位於複製起點和 其本身之間，在另一個方向上，第二個同源臂位於複製起點和其本身之 間 反之， 一個位置被定義為同源臂"外部"是指，如果在一個方向上， 沒有同源臂可以將其本身與複製起點分開。因此，通過該定義，複製起 點和可選擇標記位於載體同源臂的"外部"(見圖1)，這樣，靶序列的 插入不會影響質粒上的複製起點和可逸擇標記。相反，通過該定義，靶 DNA是插入到同源臂的"內部"。圖1A形象地描繪出同源臂的"內部" 和"外部"。
在另一個實施方案中，同源臂序列與一套雙鏈銜接子寡核苷酸同源。 這些銜接子寡核苷酸如圖1B所示。每個銜接子寡核苷酸序列都包括栽體 一個同源臂的序列，以及與目標靶基因側翼序列同源的序列(見圖1C)。 因此， 一個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在 圖1中以A，代表)，以及靶DNA的上遊核苷酸序列(在圖1中以C，代 表)。第二個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在 圖1中以B，代表)，以及位於靶DNA下遊的核苷酸序列(在圖1中以D，
23代表)。以這種方式，銜接子寡核普酸可以通過改變其序列，用來使普
通的同源克隆栽體適應目標特異靶基因序列(見圖5)。可以用來進行本 發明多種實施方案的方法和組合物將在這裡給予詳盡描述。
下面描述的方法包括三種不同方法，通過同源重組技術進行定向克 隆。如下詳述，這三種方法的每一種都具有它們自己的優勢，可以優選 用來進行具體的克隆應用。這些方法和應用將在下面給予詳述。在一個 方法中，如圖2所示，克隆栽體被導入含有目標靶DNA的細胞。該方法 可用來將插入方便地從一個複製子穿梭於另一個複製子，而無需進行累 人的限制性分析和體外操作。該方法可用於靶DNA業已存在於大腸桿菌 複製子的情況，它的進一步應用需要對選擇部分進行亞克隆。例如，分 離自粘粒、噬菌體或BAC庫的DNA克隆可以通過將所選部分亞克隆到 新栽體中而方便地應用，所述亞克隆是為了對插入序列進行序列分析或 表達基因編碼的蛋白。在第二種方法中，如圖3所示，先製備克隆栽體 和目標把DNA，然後一起導入細胞。此外，如圖4所示，目標DNA被 加入到已經包括克隆載體的細胞中。後兩種方法可用於靶DNA來自外源 的情況，例如，DNA來自腫瘤細胞。
5,1.1方法l:將栽體導入含有靶DNA的宿主細胞
在一個實施方案中，如圖2所示，靶DNA業已存在於表達細菌重組 酶的宿主細胞中。例如，耙DNA可能位於獨立複製的DNA分子上，例 如但不限於質粒、噬菌體、細菌人工染色體(BAC)或大腸桿菌宿主細 胞中的大腸桿菌染色體。構建表達細菌重組酶的宿主細胞的方法在部分 5.2.2中將給予詳述，所示細菌重組酶如RecE/T或Reda/(3。
將栽體DNA導入宿主細胞。所示栽體DNA包括一個複製起點和兩 個同源臂，這兩個同源臂可以位於起點和標記的任一側。優選地，栽體 是線性分子，同源臂位於線性分子的兩端，儘管它們可以在內部。進入 細胞後，發生在載體DNA同源臂和靶序列之間的同源重組使靶DNA插 入到同源臂之間，並形成環狀游離體。然後將細胞轉移到選擇性培養基 中，篩選載體上存在選擇標記的細胞。由於只有環狀分子才能夠複製， 並在宿主細胞中被選擇，在選擇培養基中能夠生長的很多細胞都含有包 括把DNA的重組分子。
在一個實施方案中，線性栽體DNA片段的末端通過修飾核苷酸進行阻斷，以降低除了同源重組之外的其他方法導致的線性片段末端的連接 事件數量，即非法重組。這些修飾核苷酸，如磷酸硫代核苷酸，可以整
合到同源臂的5，末端核苷酸中。修飾核苷酸可以在用於構建栽體的寡核 苷酸引物合成過程中(見以下部分5.2.1 )導入，或者，也可以在合成後， 對線性栽體DNA的寡核普酸進行酶或化學修飾來添加。對寡核苷酸和線 性DNA片段進行這些修飾的方法是本領域眾所周知的，並在以下部分 5.2.2中有詳迷。
5.1.2方法2:將栽體和靶DNA共同導入宿主細胞
在另一個實施方案中，如圖3所示，體外混和栽體DNA和靶DNA, 然後共同導入含有RecE/T或Reda/p重組酶的細胞中。耙DNA可以是 任意來源的。例如，靶DNA可以來自生物樣本，例如但不限於全血，血 漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細胞，組織培養細胞，培
養基，也可以來自非生物樣本，如食物，水，或其他材料。從這些材料 中製備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
體外製備並混和栽體和靶DNA，然後共同導入表達細菌重組酶蛋白 的細胞中，優選通過共同電轉化轉化大腸桿菌。栽體DNA可以是線性 DNA形式，也可以是環狀質粒DNA的形式。在一個優選實施方案中， 栽體是線性DNA分子。靶DNA來源在重量上超過或多於，相對於栽體 DNA，這樣導入細胞中的目標靶DNA區域的拷貝數可以儘量多，從而使 重組產物的產量最大化。使細胞在選擇培養基中生長，以篩選環狀產物。 在一個優選實施方案中，載體包括一個抗生素耐藥標記，細胞生長於含 有這種抗生素的培養基中。在這種選擇培養基中能夠生長的集落含有環 化、重組形式的線性片段。
在一個實施方案中，如以下部分5.2.1所述，線性栽體DNA片段的 末端應用修飾核苷酸阻斷。這些修飾寡核苷酸的方法是本領域眾所周知 的，如以下部分5.2.2所述。
這種方法對於靶DNA不是源於大腸桿菌的情況特別有用，例如，靶 DNA來源於酵母或真核細胞。在一個實施方案中，該方法可以用於診斷 目的，探測在任意生物樣本中特定DNA的存在。例如，該方法可用來探測乳腺癌患者活檢樣本中特異性雌激素受體或BRCA 1等位基因的存在。 在另一個實施方案中，該方法可以作為聚合酶鏈反應(PCR)技術 擴增的替代方法，用來擴增DNA區域。通過同源重組、克隆和在大腸杆 菌中增殖的擴增方法，相對於基於PCR的技術，存在一些優勢。首先， PCR誤差對於很多應用目的來說是本質障礙。聯合應用PCR引物對可能 產生一些假反應產物。而且，在一個誤差引入DNA樣本後，該誤差在最 終反應產物中的數量隨著PCR擴增的每一輪，以指數級上升。相反，通 過同源重組克隆技術擴增在大腸桿菌中具有細胞閱讀前機制的優勢，這 樣，至少更可靠1000倍。第二，應用本方法，對待擴增DNA區域的大 小限制較少。應用PCR技術，擴增長度超過幾千鹼基對(超過5- 10kb) 的DNA區域就相當困難。而本方法適用於克隆更大的區域，至少大約 IO萬鹼基對。目前，克隆基因組包括創建大型隨機庫的冗長過程，隨後 還要進行每個克隆的分類和排序。應用本方法，可以設計同源臂，構建 栽體，將基因組定向克隆到大型、非冗餘、鄰近克隆中，即所謂的
"contigs"。第三，通過PCR技術製備DNA後，甚至還需要額外的過 程，進行PCR產物的克隆。同源重組克隆技術則避免了進行額外亞克隆 步驟的需要。只需要將待擴增的DNA區域插入到同源臂之間，然後與栽 體DNA —起轉化大腸桿菌宿主。
在該實施方案中的同源重組在將DNA加入細胞之前，可以體外進 行。例如，分離的RecE和RecT,或者含有RecE/T的細胞提取物可以加 入DNAs混合物中。當重組在體外發生時，DNA分子的篩選可以通過 應用重組混合物轉化適宜宿主細胞並如前所述篩選陽性克隆來實現。
5.1.3方法3:將靶DNA導入含有栽體DNA的宿主細胞
在另 一個實施方案中，靶DNA被導入已經含有栽體DNA的細胞中。 耙DNA可以是任意來源的，如上5.1.2所述，其形式可以是線性，也可 以是環狀。如上所迷，耙DNA—旦進入細胞，在同源臂和耗DNA之間 進行的同源重組就會使靶DNA插入到同源臂之間。但是，在這種情況下， 用來選擇未重組栽體的反選擇是必需進行的，因為所需產物和未重組栽 體都表達可選擇標記基因。本文將詳細描述多種進行該反選擇過程的實 施方案。例如，在一個實施方案中，應用了位點特異性重組和切除反應 的方法。該方法在圖5給予了描述。在另一個實施方案中，可誘導核酸
26酶被誘導，裂解未重組栽體。在兩個實施方案中，不含重組產物的栽體 均被消除。
栽體首先被構建成質粒，然後導入宿主細胞，並在宿主細胞中增殖。
如圖5所示，栽體含有(i)複製起點(任意起點)；(ii)可選擇標記(Sm ); (iii)兩個同源臂；以及(iv)可選擇的反標記，例如但不限於一對位點特異 性重組酶的識別位點，第一個識別位點位於同源臂外部，第二個識別位 點位於同源臂之內，或者核酸內切酶的識別位點，該酶可用於篩選起始 質粒栽體。在這裡， 一個位置被定義為同源臂"內部"是指，如果該位 置位於兩個同源臂之間，這樣，在一個方向上，第一個同源臂位於複製 起點和其本身之間，在另一個方向上，笫二個同源臂位於複製起點和其
本身之間。反之， 一個位置被定義為同源臂"外部"是指，如果在一個 方向上，沒有同源臂可以將其本身與複製起點分開。(見圖1,圖示了同 源臂"內部，，和"外部"含意)。複製起點和可選擇標記必須位於同源 臂的外部，如上部分5.1所述，這樣，把序列的插入才不會影響質粒上的 複製起點和可選擇標記。可選擇反標記、核酸內切酶位點或兩個位點特 異性重組酶靼位點的其中一個優選位於同源臂的"內部"(見圖5)，在 複製起點和可選擇標記的另 一側。
可以應用任何本領域已知的方法進行反選擇非重組載體。例如，在 一個實施方案中，反選擇可以通過一個可誘導位點特異性重組酶(SSR) 來實現。位點特異性重組酶是可以識別兩個靶位點的酶，這兩個靶位點 又稱為位點特異性重組酶耙位點(SSRTs),該酶通過這兩個位點發揮 作用，介導DNA鏈的交換和切除反應(Hallet et al.， FEMS Microbiol, Rev., 1997， 21: 157-78; Sauer， 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 521-7; Stark et al.， 1992, Trends Genet,，8: 432-9)。位點特異性重組酶的示例是本領域眾所 周知的，包括但不限於Cre， Flp， Kw或R重組酶(Nunes-Duby et al., 1998， Nucleic Acids Res. 26: 391-406; Ringrose et al.， 1997, Eur. J. Biochem. 248: 903-912; Utatsuetal.， 1987， J. Bacteriol. 169: 5537-5545 )。當兩個直接重 復SSRTs位於環狀質粒上時，兩個SSRTs之間的位點特異性重組就會形 成兩個環狀質粒。只有含有複製起點的產物保留在細胞中。因此，位於 環狀質粒兩個直接重複SSRTs之間的位點特異性重組，可以去除位於兩 個SSRTs之間、不包括複製起點的DNA序列。
DNA栽體可以構建包括兩個SSRTs，定向如直接重複，其中一個位於同源臂的內部，第二個位於同源臂的外部，在可選擇標記(SM)和復 制起點之間。以這種方式定位的SSRTs間發生的重組，可以導致複製起 點與可選擇標記的分離(見圖5)。因此，SSR可以作用於含有兩個SSRTs 的非重組DNA栽體，導致該質粒在宿主細胞中的消失。
然後通過標準方法，應用栽體DNA轉化宿主細胞。在該實施方案中， 宿主細胞必須包括1)RecE/T和/或Redoc/l3基因，以及2)編碼SSR的 基因。優選地，RecE/T和/或Reda/(3基因的表達是可以誘導的，但固定 表達也是可以的。編碼能夠識別SSRTs的位點特異性重組酶(SSR)的 基因必須是可誘導的。可誘導和固定啟動子在本領域是眾所周知的；它 們在重組基因構建和表達過程中的應用方法將在以下部分5.2.3中給予 描述。如果RecE/T和/或Reda/(3基因需要誘導表達，在製備功能細胞之 前，含有栽體的細胞必須在可以誘導表達的條件下生長。含有栽體DNA 的宿主細胞可以通過接種、生長於選擇培養基來篩選、維持。
然後從含有栽體的宿主細胞中製備功能細胞。應用靶DNA轉化細 胞，所述靶DNA可以是任意來源的，如從任何細胞中製備的總基因組 DNA。細胞短暫培養，使同源重組可以發生。同源重組可以去除含有一 個SSRT的同源臂之間的序列，並插入靶基因序列。然後誘導SSR的表 達。SSR會作用於未重組栽體的直接重複SSRTs,使可選擇標記與質粒 複製起點分開。含有插入靶序列的質粒只有一個SSRT，因此會保持完整。 在進行該步驟時，可以進行篩選，也可以不進行篩選，但在SSR誘導後， 即在位點特異性重組發生後，必須很快進行篩選步驟。以這種方式，SSR 的誘導可以篩選含有插入靶基因的質粒。
在另一個實施方案中，可以在同源重組發生之前、期間或之後，體 內應用核酸內切酶在兩個同源臂之間使栽體線性化。在重組之前進行栽 體線性化可以選擇正確重組產物，因為除非線性質粒發生環化，否則在 細胞中不能存活。重組後，核酸內切酶的持續活性將有助於篩選含有插 入序列的質粒，因為在重組期間，SSR去除了核酸內切酶識別位點，並 在該位置插入靶DNA。因為核酸內切酶只裂解非重組栽體，而使含有插 入靶序列的質粒保持完整，因此重組後核酸內切酶的持續活性可以篩選 非重組產物。在該實施方案中，必須應用識別位點非常少見的核酸內切 酶，這樣，在宿主細胞DNA中沒有其他識別位點存在。這些"少見切割 者"的示例在本領域是眾所周知的，包括但不限於人cos,酵母HO或內
28含子編碼的核酸內切酶如PI-Scel。核酸內切酶的識別位點應該克隆在兩 個同源臂之間，這樣，核酸內切酶的酶切消化就會在同源臂之間形成線 性化栽體。核酸內切酶基因的表達必須是可誘導的。可誘導蛋白表達的 構建和方法將在下面部分5.2.3加以探討。
在另一個實施方案中，可以應用SSR,例如Cre重組酶來代替核酸 內切酶，體內線性化未重組栽體(見MulUns et al., 1997, Nucleic Adds Res 25:2539-40 )。在這種情況下，構建的栽體只有一個位於同源臂內部的 SSRT位點。含有相同SSRT拷貝的超量寡核苷酸與靶DNA混和，並與 靶DNA—起，共轉化宿主。優選地，寡核苷酸是雙鏈短DNA分子。當 一個重組分子含有位於短寡核苷酸上的SSRT時，位點特異性重組酶將 在SSRT位點線性化栽體(Mullinsetal.， 1997,supra)。
在另一個實施方案中，可以將上述位點特異性重組和核酸內切酶方 法聯合應用。在這種情況下，未重組載體在同源臂內部含有SSRT和核 酸內切酶位點。在該方法的一個實施方案中，SSR和核酸內切酶可以在 一個單獨的可誘導啟動子控制下共同調節。這些蛋白質共同調節、可誘 導表達的構建和方法將在以下部分5.2.3中加以探討。
在另一個實施方案中，可以聯合採用這些位點特異性重組技術進行 反篩選。在該實施方案中，採用兩對SSR/SSRTs，例如Cre/lox和Flp/FRT。 載體包括針對第一個SSR, SSR1的兩個位點， 一個位於同源臂內部，第 二個位於同源臂外部，複製起點與可選擇標記之間。此外，該栽體還包 括針對第二個SSR, SSR2的一個位點，位於同源臂內部。SSR2的另一 個位點位於雙鏈短寡核苷酸上，並在細胞轉化期間，以超過靶DNA的量， 與靶DNA—起添加。在一個特定實施方案中，例如，線性化步驟的一個 SSR/SSRT對是Cre/loxP，去除步驟的第二對是Flp/FRT。
在另一個實施方案中，可以直接應用細胞反篩選。在這種情況下， 質粒複製起點在大腸桿菌中只有單一拷貝(或者拷貝數量非常低)。這 種類型的複製起點包括iteron型起點，如噬菌體P1起點，以及基於大腸 桿菌染色體的質粒起點，oriC。選擇適宜的複製起點，見Helinski， D.R., Toukdarian, A.E.， Novick, R.P. Chapter 122， pp 2295-2324 in "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" 2nd edition Frederick C. Niedhardt， Ed. ASM Press, Washington, 1996， ISBN 1-55581-084-5。在這 種情況下，構建的栽體可以沒有任何SSRTs,但在同源臂之間不能不包括反篩選基因。這些反篩選標記基因是本領域眾所周知的，例如，可應
用sacB， ccdB或四環素耐藥基因(適宜的反篩選基因和方法列表還見， Reyratet al.， 1998， Infect. Immun. 66: 4011-7)。預期的同源重組反應將去 除反篩選基因，這樣，攜帶預期重組產物的細胞將在反篩選壓力下存活， 而攜帶未重組栽體的細胞將死亡。
5.2通過同源重組技術進行克隆和亞克隆的組合物
本文描述了在多種實施方案中，通過同源重組技術進行克隆的組合 物。在以下部分5.2描述的每一種克隆方法，在一個單一細胞中都必須同 時存在以下三種組分第一，攜帶兩個DNA短區域(本文稱為"同源臂，，) 的栽體，該DNA短區域的序列與靶序列同源；第二， RecE/T和/或Reda/卩 蛋白對，或其他細菌重組酶；第三，靶DNA序列。由細菌重組酶介導的， 在同源臂與靶基因側翼區域存在的同源序列間發生的重組，可以將靶 DNA插入或"俘獲"到兩個同源臂之間。這裡將詳細描述它們構建的組 合物和方法。
5.2.1同源克隆栽體
同源克隆栽體可以是線性或環狀DNA載體，包括一個複製起點，一 個可選擇標記和兩個被設計成可以俘獲目標靶DNA的DNA短區域。可 以根據所用手段或方法，選擇數種形式的克隆栽體。它們構建的優選形 式和方法如圖1 -5所示，並將在這裡給予詳細描述。
5.2.1,1複製起點
栽體需要一個複製起點，使質粒複製、增殖。如果在大腸桿菌中克 隆和增殖，可以應用任何大腸桿菌複製起點，這些複製起點的示例是本 領域眾所周知的(見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,及其引用參考文獻)。目前可 以獲得的非限制性質粒複製起點的示例是Co舊l衍生性複製起點 (Bolivar et al.， 1977， Gene 2: 95-113;見Sambrook et al., 1989， supm)， 在如pACYC184質粒上存在的pl5A起點(Chang and Cohen, 1978， J. Bacteriol. 134: 1141-56;還見Miller, 1992, p. 10.4-10.11 ),以及適用於低 拷貝質粒表達的pSClOl起點，它們都是本領域眾所周知的。例如，在一個實施方案中，應用了從高拷貝質粒中獲得的複製起點，
如含有Co舊l衍生性複製起點的質粒，這些質粒的示例是本領域眾所周 知的(見Sambrook et al.， 1989, supra;還見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 及其引用參 考文獻)。 一個示例是來自pUC19的起點及其衍生物(Yanisch-Perron et al.， 1985， Gene 33: 103-119 ) 。 pUC載體的存在水平是每個細胞300 - 500 拷貝，並具有插入異源基因的便利克隆位點。為了極高水平表達，可以 應用X栽體，如人gtl 1 ( Huynh et al，， 1984， in "DNA Cloning Techniques: Vol I: A Practical Approach", D. Glover, ed， pp 49-78， IRL Press, Oxford), 或在含有T7和Sp6聚合酶表達系統的細胞中應用T7或SP6噬菌體啟動 子(Srudier et al.， 1990， Methods Enzymol. 185: 60-89 )。
在需要低水平表達時，可以應用中等或低拷貝的複製起點。中等拷 貝質粒在本領域是眾所周知的，如pBR322,具有Co舊l衍生性複製起點， 每個細胞中有20-IOO拷貝(Bolivar etal., 1977, Gene 2: 95-113;見 Sambrook et al.， 1989， supra),或pACYC100質粒系列中的pACYC184 質粒，具有pl5A起點，每個細胞中有10- 12拷貝(Chang and Cohen, 1978， J. Bacteriol. 134: 1141-56;還見Miller, 1992， p. 10.4-10.11)。低拷貝質粒 在本領域也是眾所周知的，例如，pSClOl，具有pSC101起點，每個細 胞中大約有5個拷貝。與pBR和pUC質粒一樣，pACYC和pSC101質 粒栽體都具有便利的克隆位點，並可在同一細胞中共同存在，因為它們 具有可兼容的複製起點和獨特的選擇性抗生素標記。其他適宜的質粒復 制起點包括基於質粒的X或噬菌體P1複製子，例如Lorist系列(Gibson etal.， 1987， Gene 53: 283-286)。
當所需表達水平更低時，可以應用來自細菌染色體的複製起點(見 Miller, 1992, supra; Niedhardt， F.C.， ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurmm， American Society for Microbiology, Washington D.C.; Yarmolmsky， MB. and Sternberg, N.， 1988, pp. 291-438, in Vol. 1 of The Bacteriophages, H. Calendar, ed., Plenum Press, Mew York) 。 jt匕夕卜，還 可應用合成複製起點。
5.2.1.2可選擇標記
為了在細胞中維持質粒栽體，典型的載體還包括一個可選擇標記。
31可以應用任何本領域已知的可選擇標記。在構建大腸桿菌栽體時，可以 應用任何使大腸桿菌有效產生抗生素耐藥的基因，以及任何使大腸桿菌 產生穩定的可鑑別或可篩選表型變化的基因。優選應用抗生素耐藥標記，
如來自TN903的卡那黴素耐藥基因(Friedrich and Soriano, 1991, Genes. Dev. 5: 1513-1523 ),或其他氨基糖戒類抗生素耐藥基因(所述其他氨基 糖甙類抗生素包括但不限於雙氫鏈黴素，慶大黴素，新黴素，巴龍黴素 和鏈黴素)，來自ISl的(3-內醯胺酶，使大腸桿菌產生青黴素類耐藥(包 括但不限於氨千青黴素，羧苄青黴素，甲氧西林，青黴素N,青黴素O 和青黴素V)。其他可選擇基因序列包括但不限於編碼多肽的基因序列， 該多肽可以產生zeocin耐藥(Hegedus et al., 1998， Gene 207: 241-249 )。 其他可以應用的抗生素是可以產生amphenicols如chloramphenicol耐藥 的基因，例如，可以應用chloramphenicol轉醯酶(CAT)的編碼序列 (Eik脂nns et al., 1991, Gene 102: 93-98 )。對於本領域技術人員，應該 指出，也可應用其他非抗生素方法，用來篩選質粒在細胞中的維持，例 如，可以應用多種營養缺陷性標記(見Sambrooketal., 1989, supra; Ausubel et al., s叩ra)。
5.2.1,3同源臂
載體的一個必需組分是兩個雙鏈DNA短區，這裡又稱為"同源臂"。 在一個實施方案中，如圖l所示，兩個同源臂(以"A"和"B"代表) 與目標耙DNA的側翼DNA序列(以"A，"和"B，"代表)同源，其中 一個臂與把DN A上遊DNA序列同源，第二個臂與位於靶DN A下遊的 序列同源。如這裡所用，如果兩個雙鏈DNA分子具有相同的恆定區，可 以任選插入一個或多個差異鹼基對，並能夠作為同源重組的底物，那麼 它們是"同源的"。在一個優選實施方案中，同源臂包括大約22-100 個鹼基對或更多的連續鹼基對，與目標靶DNA的雙鏈側翼區相同。同源 區還可以插入 一 個或多個不同殘基，只要同源臂仍然能夠成為同源重組 的有效底物。在一個優選實施方案中，為了使重組效率最優化，同源臂 的長度大約為50個核苷酸，其中20 - 30 (如25)個連續鹼基對序列相 同，沒有插入。儘管連續相同的區域可以更短(如，至少6， 8或10個 鹼基對)，但應用這種較短的連續相同區域，可以預見，重組效率可能 較低。例如，在一個實施方案中，連續相同區域的長度是6bp (Keimand
32Lark, 1990， J. Structural Biology 104: 97-106 )。同源臂的長度或其與耙 DNA側翼序列連續相同的長度沒有上限。
靶DNA側翼核苷酸序列在這裡又稱為靶DNA "末端"。因此，一 個靶DNA有兩個末端，第一個末端和第二個末端。兩個同源臂相對於所 需插入序列的定向性必須與同源序列相對於靶DNA的定向性一致(見圖 1)，這樣，在同源臂和第一個、第二個靶DNA末端之間的重組，可以 將靶DNA插入到兩個同源臂之間，
兩個同源臂的序列可以根據實驗設計來選擇。在選擇同源臂時的唯 一限制是，該序列不應在靶DNA內出現超過一次，而且在同源重組反應 期間，不應在宿主細胞的其他地方出現。在這種情況下，在其他同源重 組事件的背景中，仍然可以獲得所需同源重組產物。在一個實施方案中， 同源臂序列是常用克隆載體的多接頭側翼序列，所述常用克隆栽體如 BAC， PAC, YAC (酵母人工染色體)，噬菌體克隆栽體如入EMBL或XGT 序列，phagemid,粘粒，pBR322, pGEM， pGEX, pET，杆狀病毒栽體，病 毒栽體如腺病毒載體和腺病毒相關病毒栽體。因此，可以應用單一栽體 亞克隆任何在這些栽體中克隆的插入序列。含有這些同源臂的栽體對於 亞克隆插入序列特別有用，所述插入序列來自DNA文庫的陽性克隆，該 DNA文庫如BAC，PAC， YAC，粘粒或X庫。
在多個實施方案中，如下所迷，同源臂位於線性DNA分子的末端， 或者位於線性DNA分子之內，或者位於環狀DNA質粒栽體內。
同源臂的定向性相對於它們與靶核苷酸序列的定向性一致。換句話 說，同源臂的方向，使所需DNA序列在重組發生後，插入到同源臂之間。 當同源臂位於線性DNA末端時，插入DNA序列俘獲或插入到兩個同源 臂之間，並進而形成一個環狀可複製質粒。
5.2丄4銜接子塞核苷酸同源臂
在另一個實施方案中，同源臂的核苷酸序列與銜接子寡核苷酸的核 苷酸序列同源。兩個銜接子寡核苷酸的每一個都包括一個與一個同源臂 核苷酸序列同源的核苷酸序列，以及第二個與靶DNA兩個末端中的一個 同源的同源區域。銜接子寡核苷酸如圖1所示。栽體的同源臂以"A"和 "B"代表，與這些序列同源的銜接子寡核苷酸區域以"A，"和"B，"代 表。靶DNA的兩個末端以"C"和"D"代表，在銜接子寡核苷酸上與200910005085.1
之相應的同源序列以"C，"和"D，"代表。在該實施方案中，由RecE/T 或Reda/p介導的在栽體同源臂、銜接子寡核苷酸同源區與靶基因側翼末 端之間發生的重組，使靶DNA插入或"俘獲"到栽體同源臂之間。
5.2.1.5構建栽體
可以應用本領域已知的標準方法構建線性片段或環狀載體(見 Sambrook et al.， 1989, supra; Ausubel et al.， supra) 例:6口，可以應用合成 或重組DNA技術。在一個實施方案中，線性片段是通過PCR擴增技術 製備的。在該方法中，合成的寡核苷酸在它們的5'端包括同源臂序列， 在它們的3'端包括PCR引物序列。然後應用這些寡核苷酸作為PCR擴 增反應的引物，擴增包括複製起點和可選擇基因標記的DNA區域。在另 一個實施方案中，可以通過標準重組DNA技術構建質粒，使之包括兩個 適宜定向的同源臂，側翼包圍一個複製起點和一個可選擇基因標記(見， 例如Methods in Enzymology， 1987， Volume 154， Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York )。然後，例如，通過限制性核酸內切酶消化，使 質粒線性化。
在另一個實施方案中，例如，可以應用下述方法構建用於上面部分 5丄3的栽體DNA。合成兩個寡核苷酸，其中一個包括，從5，到3，， 一 個載體特異性限制性位點， 一個左側同源臂和一個PCR引物。另一個寡 核苷酸包括，從5，到3',相同的栽體特異性限制性位點， 一個SSRT， 一個右側同源臂和一個PCR引物。選擇兩個同源臂側翼包圍靶DNA。 SSRT是可以被任何位點特異性重組酶(SSR)如Cre, Flp， Kw或R重組 酶識別的位點。設計的合成寡核苷酸必須使兩個SSRTs在栽體中定向為 直接重複序列。兩個PCR引物被用來擴增DNA模板，該模板包括一個 質粒起點， 一個可選擇基因和在起點和可選擇基因間的相同SSRT。然後 應用限制性酶酶切PCR反應產物，並通過連接有效環化，所述限制性酶 可以識別寡核苷酸5，末端包括的位點。然後應用環狀產物轉化大腸桿菌， 以擴增、產生大量栽體。
在另一個實施方案中，線性片段可以通過採用具有可選擇標記、起
34點和兩個克隆位點的質粒來構建，然後將寡核苷酸同源臂克隆到每個克
隆位點中。然後應用限制性酶酶切質粒DNA,以產生由同源臂限定的線 性片段。該方法優選用於構建更複雜的質粒一一例如，為了包括真核表 達元件，含有真核增強子和啟動子元件的質粒。此外，其他序列元件也 可亞克隆到栽體上。
栽體還可以包括蛋白表達、操作或維持插入靶DNA所需的其他目標 核苷酸序列。例如，在栽體的適宜位置，還可以包括啟動子序列，增強 子序列，翻譯序列如Shine和Dalgarno序列，轉錄因子識別位點，Kozak 共識序列，以及終止信號。在非細菌細胞，如在植物、昆蟲、酵母或哺 乳動物細胞中重組克隆，必須有其他序列元件，如種特異性複製起點， 轉錄、過程和翻譯信號。這些元件包括但不限於真核複製起點，增強子， 轉錄因子識別位點，CAT盒，或Pribnow盒。
在一個實施方案中，RecE/T和/或Redoc/(3或其他細菌重組酶是從細 胞的表達質粒中重組製備的，所選栽體必須與下面部分5.2.3中所述的細 菌重組酶表達質粒兼容。本領域技術人員非常清楚，在單一細胞中多個 質粒表達所必須的兼容性需求。在原核細胞中增殖兩個或多個構建物的 方法是本領域技術人員眾所周知的。例如，含有多個複製子的細胞，可 以應用含有適宜兼容複製起點的栽體和獨立篩選系統來選擇並維持(見 Miller et al., 1992, supra; Sambrook et al.， 1989, supra)。
S.2.2細菌重組酶
本發明主要描述了關於RecE/T和/或Reda/(3的應用。但是，經驗豐 富的技術人員應該很清楚，本發明同樣適用於其他細菌重組酶的應用， 採用 一對同源雙鏈DNA分子作為底物，所述其他細菌重組酶具有介導同 源重組的能力。這裡應用的細菌重組酶是一種在細菌、或噬菌體或細菌 起點中內源表達的重組酶，並具有介導同源重組的能力。在多個實施方 案中，細菌重組酶是RecE/T和/或Reda/(3重組酶。在另一個特定實施方 案中，啟動同源重組的功能等價系統包括來自噬菌體P22的erf蛋白。而 且，在本發明的應用中，細菌重組酶的各別蛋白組分可以由其他功能組 分來取代。
這裡應用的"RecE，，和"RecT"首先指大腸桿菌，如大腸桿菌K12， 中的RecE或RecT。大腸桿菌RecE和RecT的核苷酸和胺基酸序列是眾所周知的(RecE， GenBank Accession No. M24905和SWISS-PROT Accession No. PI5033; RecT， GenBank Accession No. L23927和 SWISS-PROT Accession No. P33228 ) 。
"Reda"和"Red(3"指噬菌體入 編碼蛋白。Reda具有與RecE 5，到3'核酸外切酶相似的5，到3'核酸外切 酶活性，Red(3具有與RecT相似的DNA退火活性。這兩種人蛋白的核 苷酸和胺基酸序列也是眾所周知的(見GenBank Accession Nos. J02459; M17233 )。
經驗豐富的技術人員應該很清楚，涉及RecE/T和/或Reda/p的參考 文獻也適用於RecE/T和Reda/f3聯合應用的情況，除非有特別說明或有 上下文指示。在一個特定實施方案中，聯合應用兩種酶複合物對於重組 效率具有協同作用。
可以應用的重組酶還包括重組酶組分的等位基因變異體。例如，在 本發明RecE/T和Reda/(3重組系統中應用的胺基酸序列還可以包括由 RecE， RecT， Reda或Redp的任何等位基因變異體編碼的胺基酸序列，只 要這些等位基因變異體是功能變異體，並至少在一定程度上具有同源重 組活性。這些等位基因變異體可以應用標準重組DNA技術(見，例如 Methods in Enzymology， 1987， volume 154， Academic Press; Sambrook et al., 1989， Molecular Cloning - A Laboratory Ma隠l， 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York)或蛋白進化方法(Je,tus et al.， 1998， Curr. Opin. Biotechnol. 9: 534-548)進行常規鑑定、製備。
通常情況下，編碼這些等位基因變異體的核苷酸應該可以在中度嚴 格條件下(應用，例如標準Southern印跡雜交條件，最後在42'C用0.2 x SSC/0.1%SDS清洗；Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I， Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York， at p.2.10.3 )或高度嚴格條件下(應用，例如標準Southern 印跡雜交條件，最後在68。C用0.1 x SSC/0.1%SDS清洗；Ausubel et al.， supra)，與編碼RecE， RecT， Reda或Red(3的互補序列雜交。
這裡應用的RecE, RecT, Reda或Re鄰還包括從嗟菌體或細胞中書亍 生的RecE, RecT， Reda或Red(3的同系化合物，所述噬菌體的宿主和所 迷細胞均是腸桿菌科的原核細胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限於埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，檸檬酸細菌屬，克雷白桿菌屬以及變性菌屬。
這些RecE, RecT， Reda或Red(3的同系化合物通常由噬菌體基因組中的 基因編碼，該基因產物參與噬菌體生命周期中重組酶介導的過程，如在X 噬菌體生命周期中的Reda和Red(3。
RecE/T同系化合物可以應用標準原核基因和重組DNA技術進行常 身見鑑定、製備(見如，Sambrook et al.， supra, and Ausubel et al., supra)。 重組DNA可以通過克隆基因組或cDNA文庫，或通過PCR擴增技術獲 得。例如，基因組文庫可以通過標準分子生物學技術獲得，也可通過商 業渠道或非商業渠道獲得。然後應用能夠與大腸桿菌recE或recT探針雜 交的核酸進行篩檢(Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72:3961 )，分離陽性克隆，並進行序列分析。
在一個特定實施例中，RecE或RecT的同系化合物在鼠沙門氏傷寒 桿菌中常規鑑定。RecE和recT基因在大腸桿菌K-12中的性質已經非常 清楚，RecE ( GenBank Accession No. M24905和SWISS-PROT Accession No. P15033 )和RecT ( GenBank Accession No. L23927和SWISS-PROT Accession No. P33228 )的核苷酸和蛋白序列也已知(還見Bachmann, 1990: Microbiol. Rev. 54: 130-197; Rudd, 1992， in Miller， 1992， supra, pp. 2.3-2.43)。可以應用鼠沙門氏傷寒桿菌的完整基因組粘粒或人文庫。然 後在如上所述的雜交條件下，通過與大腸桿菌RecE或RecT探針雜交來 篩檢鼠沙門氏傷寒桿菌文庫。例如，由於兩個基因的同源性預期非常高， 因此優選標準中等嚴格的雜交條件。
在一個實施方案中，這樣的條件包括含有DNA的濾器在含有6X SSC, 5XDenhart，s溶液，0.5 % SDS和100ug/ml變性鮭魚精子DNA的溶 液中，55'C預處理6小時。雜交在相同溶液中進行，應用的探針是5-20 x 10、pm"P標記的。濾器在55。C的雜交混合物中孵育18-20小時，然 後用含有lXSSC和0.r/。SDS的溶液，60'C清洗2次，30分鐘。然後將 濾器印跡乾燥，暴露於X線片，放射自顯影。可以應用的其他中等嚴格 條件是本領域眾所周知的。濾器的清洗是在37'C,應用含有2XSSC, 0.1 。/。SDS的溶液，進行1小時。隨後進行的含有鼠沙門氏傷寒桿菌克隆的 分離、純化和特徵分析可以按照本領域眾所周知的方法進行(見Ausubel et al., supra)。這些序列可以用來構建本發明鼠沙門氏傷寒桿菌RecE/Ts。
此外，鼠沙門氏傷寒桿菌基因還可從鼠沙門氏傷寒桿菌mRNA中分
37離。mRNA可以從表達RecE或RecT蛋白的細胞中分離。通過逆轉錄 mRNA可以製備cDNA，然後應用本領域已知的方法進行篩檢，如上述 篩檢基因組文庫的方法(見Ausubel et al.， supra ) 此外，recE或recT cDNA 還可應用PCR技術進行鑑定，如RACE( cDNA末端的快速擴增，Ausubel etal.,supra)，在該技術中，應用兩個根椐大腸桿菌recE或recT序列設 計的引物"前導"引物的序列與大腸桿菌recE或recT mRNA的5，端 相同，"反向"引物與其3，端互補。PCR產物可以通過序列分析進行校 正，然後亞克隆，用於構建本發明的RecE/T。這些cDNA序列也可應用 本領域眾所周知的方法，用於分離鼠沙門氏傷寒桿菌基因組recE或recT 序歹寸(Sambrook et al.， 1989, supra; Ausubel et al., supra)。
編碼本發明RecE/T重組酶的核酸分子還可根據本領域技術人員眾 所周知的重組和合成方法，進行合成和/或構建(見如，Sambrook etal., supra and Ausubel et al.， supra)。
如下所述，控制序列表達的能力對於應用本發明方法是非常有益的， 這種序列表達的控制可以使表達能夠調節(如可誘導)，並使表達水平 範圍非常寬。
核酸分子可以，例如在染色體外維持，如在質粒、粘粒或噬菌體上。 此外，核酸分子還可以應用，例如噬菌體轉導或轉位，整合到染色體上， 如大腸桿菌染色體上。這樣，RecE/T編碼序列就可以通過標準技術，經 工程學手段以高拷貝、低拷貝或單一拷貝存在於每個細胞中。也可應用
多種不同的調控序列來驅動重組蛋白的表達。表達/菌林構建的每一方面 都可操作，用以製備重組蛋白表達水平各異的細胞。應該指出，重組蛋 白編碼序列在染色體上的單一拷貝還有其他優勢，即這樣的配製使菌株 的構建更加容易。
5.2.2.1蛋白表達
細菌重組酶在細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中的表達或者是固 定的，或者是可誘導的。在一個優選實施方案中，重組蛋白在細菌中表 達，最優選在大腸桿菌中表達。例如，宿主細胞可以在其染色體上包括 recE和recT基因。內源性表達RecE/T的大腸桿菌示例是已知的，例如 大腸桿菌sbcA菌抹(Zhang et al., 1998, supra)。此外，RecE/T還可從 非染色體DNA中重組表達，優選在質粒栽體上，如pBADET丫 ( Zhang etal., 1998， supra)或pGETrec (Narayanan et al., 1999， Gene Ther. 6: 442-447)。同樣，Reda/(3對於整合了人前噬菌體的菌抹可以是內源性 的，也可以由質粒表達，如pBADap丫 ( Muyrers et al,, 1999, supra)。可 以根椐標準重組DNA技術構建RecE/T和/或Reda/|3表達構建物(見， 例:i口 Methods in Enzymology， 1987， volume 154， Academic Press; Sambrook et al.， 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York,每部文獻在此全文引入，作為參考)。
在一個實施方案中，RecE/T和/或Reda/p在大腸桿菌中由高拷貝質 粒表達，所述高拷貝質粒如含有Co舊l衍生性複製起點的質粒，其示例 是本領域眾所周知的(見Sambrook etal.， 1989， supra;還見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,及其引用的參考文獻)，如pUC19及其衍生物(Yanisch-Perronetal., 1985， Gene 33: 103-119 )。
關於在不同表達水平進行表達(調節的或固定的)調控的問題，本 領域技術人員知道很多這樣的調控序列。如下所述，產生寬範圍表達水 平的能力對於應用本發明方法是有益的。這種表達可以通過固定以及調 控或誘導的形式實現。
通過應用多種可誘導調控序列，可以實現不同表達水平的誘導表達。 在一個實施方案中，例如，這些多肽的編碼序列通過lacOP調控序列轉 錄時，應用lacI基因及其誘導子IPTG可以產生RecE/T的可誘導、高水 平表達。
RecE和RecT可以通過不同啟動子表達，或者，recE和recT基因可 以在多順反子mRNA中通過單一啟動子表達。這些異源啟動子可以是可 誘導的，也可以是固定的。該表達優選通過可誘導啟動子調控。不同表 達水平的可誘導表達可以通過多種可誘導調控序列實現。在一個實施方 案中，例如，這些多肽的編碼序列通過lacOP調控序列轉錄時，應用lad 基因及其誘導子IPTG可以產生RecE/T的可誘導、高水平表達。大量其 他可誘導啟動子系統也可應用，它們對於本領域技術人員來說是眾所周 知的。通過應用不同強度的啟動子，RecE/T或Redot/p構建物的表達水 平也可不同。誘導的araC啟動子，TET系統(Geissendorfer and Hillen， 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663 )，噬菌體人溫度的PL啟動子和可誘 導入抑制子CI857( Pirrotta， 1975， Nature 254: 114-117; Petrenko et al" 1989, Gene 78: 85-91 ) , trp啟動子和trp抑制子系統(Bennett et al., 1976, Proc. Natl, Acad. Sci USA 73: 2351-55; Wameetal，， 1986， Gene 46: 103-112)， lacUV5啟動子(Gilbert and Maxam, 1973， Proc. Natl, Acad. Sci USA 70: 1559-63 ) ， lpp (Nokamura et al.， 1982, J. Mol. Appl. Gen, 1: 289-299 ), T7基因-10啟動子，phoA(鹼性磷酸酶)，recA (Horiietal.， 1980)以 及tac啟動子，可以通過色氨酸誘導的trp-lac融合啟動子(Amannetal.， 1983， Gene 25: 167-78),例如，都是常用的強啟動子，每種啟動子控制 的蛋白水平，都可累積達到細胞總蛋白的大約1-10%。如果需要更強的 啟動子，tac啟動子的強度大約比lacUV5強10倍，但會導致高水平基線 表達，因此，應只用於需要過量表達的情況。如果需要更弱的啟動子， 其他細菌啟動子是本領域眾所周知的，例如，麥芽糖、半乳糖或其他所 需啟動子(這些啟動子的序列可以通過Genbank獲得，(Burks et al.， 1991 Nucl. Acids Res. 19: 2227-2230 )
用於本文描述方法的細胞可以是含有RecE/T和/或Reda/p重組酶的 任何細胞。優選地，宿主細胞是革蘭陰性細菌細胞。更優選，宿主細胞 是腸細菌屬細胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限於埃希氏菌屬，沙門 氏菌屬，檸檬酸細菌屬，克雷白桿菌屬以及變性菌屬。最優選的宿主細 胞是大腸桿菌細胞。細胞可以來自任何生物體，包括但不限於酵母、蠅 類、鼠或人類細胞，只要這些細胞能夠經工程學修飾表達適宜的重組酶。 重組酶優選來自大腸桿菌的RecE/T重組酶，或者來自噬菌體人的Reda/(3 重組酶，或者是來自腸桿菌屬或腸桿菌屬噬菌體的RecE/T或Reda/(3重 組酶系統的功能等價物，這些系統可以介導同源序列區域之間的 重組。
表達RecE/T和/或Reda/p蛋白的細胞可以通過事先電賦能製備，並 儲存於-7(TC。
此外，本發明方法還可在其他任何能夠表達RecE/T和/或Reda/p的 細胞中進行。例如，多種宿主栽體系統可以用來表達蛋白編碼序列。這 些包括但不限於病毒(如牛痘表達，腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系 統，病毒(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統，微生物，例如含有酵母栽體的酵母，或者噬菌體、DNA、質粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌。 栽體的表達元件在其強度和特異性方面各不相同。根據應用的宿主栽體 系統，可以選擇應用任何一種適宜的轉錄、翻譯元件。在特定實施方案 中，表達RecE/T和/或Reda/(3基因，或者編碼RecE/T和/或Reda/p功 能活性部分的序列。在另 一個實施方案中，表達含有RecE/T和/或Reda/(3 蛋白功能區的RecE/T和/或Reda/(3片段。
將DNA片段插入栽體的任一種上迷方法都可用於構建含有嵌合基 因的表達栽體，所述嵌合基因包括適宜的轉錄/翻譯調控信號和蛋白編碼 序列。這些方法包括體外重組DNA和合成技術，以及體內重組技術(基 因重組)。編碼RecE/T或Reda/(3蛋白或多肽片段的核酸序列的表達， 可以通過第二個核酸序列調控，這樣，RecE/T或Reda/p蛋白或多肽可 以在轉化了重組DNA分子的宿主細胞中表達。例如，ReeE/T或Reda/(3 蛋白的表達可以通過任何本領域已知的啟動子/增強子元件來調控。可用 於調控RecE/T或Reda/|3表達的啟動子包括但不限於SV40早啟動子區 域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310 ), Rous肉瘤病毒3 ， 端長末端重複序列包括的啟動子(Yamamotoetal., 1980， Cell 22: 787-797)，皰滲病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(Wagner etal.， 1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 ),金屬硫因基因調控序列 (Brinster et al.， 1982, Nature 296: 39-42 );植物表達栽體包括nopaline 合成酶啟動子區域(Her認-Estrellaetal.， 1984， Nature 303: 209-213 )或 花椰菜嵌合病毒35S RNA啟動子(Gardner et al., 1981， Nucl. Acids Res. 9: 2871 )，以及光合成酶二磷酸核酮糖羧化酶啟動子(Herrera-Estrella et al.， 1984，Nature310: 115-120);來自酵母或其他真菌的啟動子元件，如Gal 4啟動子，ADC (乙醇脫氫酶)啟動子，PGK (磷酸甘油激酶)啟動子， 鹼性磷酸酶啟動子，以及下述具有組織特異性並已用於轉基因動物的動 物轉錄調控區域在胰腺腺泡細胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因調控 區域(Swift et al.， 1984, Cell 38: 639-646; Omitz et al.， 1986， Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515 );在胰腺(3細胞中具有活性的胰島素基因調控區域(Hanahan， 1985， Nature 315: 115-122)，在淋巴細胞中具有活性的免疫球蛋白基因 調控區域(Grosschedl et al., 1984， Cell 38: 647-658; Adames et al.， 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7:
411436-1444)，在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中具有活性的鼠哺乳動物 腫瘤病毒調控區域(Lederetal., 1986, Cell 45: 485-495 )，在肝臟細胞中 具有活性的白蛋白基因調控區域(Pinkertetal., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276 )，在肝臟細胞中具有活性的甲胎蛋白基因調控區域(Krumlauf et al.， 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al.， 1987, Science 235: 53-58 );在肝臟細胞中具有活性的oc 1-抗胰蛋白酶基因調控區域(Kelsey etal.， 1987， Genes and Devel. 1: 161-171 )，在髓細胞中具有活性的|3球 蛋白基因調控區域(Mogrametal.， 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al.， 1986， Cell 46: 89-94);在腦少突細胞中具有活性的髄磷脂鹼性蛋白 基因調控區域(Readheadetal.， 1987， Cell 48: 703-712);在骨骼肌中具 有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調控區域(Sani, 1985, Nature 314: 283-286 )，以及在下丘腦具有活性的促性腺激素釋放激素基因調控區域 (Mason et al.， 1986， Science 234: 1372-1378 )。
在一個特定實施方案中，應用的栽體包括一個與細菌重組酶(如 RecE或RecT)編碼核酸操作性相連的啟動子， 一個或多個複製起點， 並可任選一個或多個可選擇標記(如抗生素耐藥基因)。
所選載體必須與上面部分5.2.1所述的栽體質粒兼容。本領域技術人 員非常清楚，在單一細胞中維持多個質粒所必須的兼容性需求。在原核 細胞中增殖兩個或多個構建物的方法是本領域技術人員眾所周知的。例 如，含有多個複製子的細胞，可以應用含有適宜兼容複製起點的栽體和 獨立篩選系統來常規選擇並維持(見Miller et al.， 1992, supra; Sambrook etal.， 1989， supra)。
5,2.3宿主細胞
recE和recT和/或reda和redp基因產物的任何細胞，也可以是這些基因 能夠異源表達的任何細胞。可以應用的可能細胞類型示例包括但不限於 原核真核細胞，如細菌、酵母、植物、嚙齒類動物、鼠、人類、昆蟲或 哺乳動物細胞。在一個優選實施方案中，宿主細胞是細菌細胞。在最優 選實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌細胞。可以應用的特定大腸桿菌菌 抹示例是JC 8679和JC 9604。 JC 8679和JC 9604的基因型是Sex ( Hfr， F+， F-，或F): F-JC 8679包括的變異recBC 21, recC 22， sbcA 23， thr-l，ara-14, leu B 6, DE (gpt-proA) 62， lacYl, tsx-33, gluV44 (AS), galK2(Oc), LAM-his-60， relA 1, rps L 31 (strR)， xyl A5, mtl-1, argE3 (Oc)和thi-1 。 JC 9604包括相同的變異，以及recA56變異。
在另一個實施方案中，應用真核細胞作為本文描述的克隆和亞克隆 方法的宿主細胞。可以應用任何表達或經工程學修飾可以表達細菌重組 酶或其功能等價物的細胞。可以應用來自人類、鼠、猴子或其他任何生 物體的細胞系。例如，用於本發明方法的非限制性細胞系示例包括CHO， VERO, BHK， HeLa, COS， MDCK, 293， 3T3以及WI38細胞。
多種宿主栽體系統都可用於導入或表達RecE/T，Redoc/p或其功能等 價系統的蛋白編碼序列。這些方法是本領域眾所周知的(見Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Intersdence, New York)。這些包括但不限於病毒(如牛痘表達， 腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統，病毒(如杆狀病毒)感染的昆蟲 細胞系統，微生物，例如含有酵母栽體的酵母，或者噬菌體、DNA、質 粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌。蛋白表達的方法也在上面部分5.2,2 中給予探討。
5.2.4把DNA
應根據實驗設計選擇靶DNA,靶DNA可以是任意雙鏈DNA,其長 度可以只有l個鹼基對，也可以超過10萬個鹼基對。在一個特定實施方 案中，耙DNA長度高達IOO， 125, 200或300 kb。在另一個特定實施方 案中，靶DNA含有25 - 100千鹼基對，例如，與BAC栽體中存在的相 似。把DNAs的其他特定實施方案將在部分6的實施例中給予說明。靶 DNA可以存在於任何獨立複製的DNA分子上，例如^f旦不限於質粒，BAC 或大腸桿菌染色體。靶DNA還可位於任意來源的DNA分子是，包括但 不限於來源於原核細胞、古細菌或真核細胞的DNA，或者來源於病毒、 噬菌體或合成體的DNA。例如，可以從下述來源獲得核酸序列人類， 豬，牛，貓，禽類，馬，犬，昆蟲(如果蠅)，無脊推動物(如C. elegans)， 植物等。DNA可以通過本領域已知的標準方法來製備(見，例如Sambrook， et al, 1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover (ed), 1985， DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd.， Oxford, U.K. Vol. I,II)。
5.3本發明的應用方法 5,3.1將DNA導入宿主細胞
任何已知將含有靶DNA的DNA製劑導入宿主細胞的方法，均適用 於上述方法。這些方法在本領域已知，包括但不限於細胞的電轉化，應 用氯化4丐或銣製備功能細胞，應用包衷於病毒顆粒中的靶DNA轉化 DNA。對於真核細胞，方法包括但不限於電轉化、轉染磷酸4丐沉澱的DNA 和病毒包裹。在一個優選實施方案中，應用電轉化。處理含有RecE/T或 Reda/(3蛋白的細胞，使之適用於標準方法的電轉化(見Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York )。優選地，大約50ul標準電轉化功能細胞 製劑用於標準方法的電轉化。在需要轉化線性或環狀栽體的實驗中，優 選應用S0.3ug的栽體。在需要轉化含有靶DNA的DNA製劑的實驗中， 優選應用20.3ug。對於共轉化實驗，優選在電轉化前混和DNAs。電轉化 後，優選將細胞在培養基中稀釋，並在條件培養前孵育大約1.5小時，作 為復甦期，所述條件能夠鑑別由可選擇標記基因導致的表型改變。
在應用位點特異性重組或核酸內切酶酶切栽體的實驗中，在製備電 轉化功能細胞之前，或者在電轉化後的復甦期間，或者在鑑定可選擇標 記的培養期間，可以誘導SSR或核酸內切酶的表達，或者誘導SSR和核 酸內切酶的聯合表達，或者誘導兩個SSR的聯合表達。
任選的表型改變是對一種抗生素的耐藥性，將細胞培養於含有相應 抗生素的平板上。在這種情況下，過夜培養後顯示抗生素耐藥性的集落 主要含有所需亞克隆產物。
在另一個實施方案中，DNA通過轉導導入宿主細胞，轉導的DNA 業已包裝在噬菌體顆粒中。本領域已知P1或人噬菌體的轉導和包裝過程。 入包裝提取物可以通過商業渠道購買(例如，通過Promega, Madison, WI )。
5.3.2寡核苷酸
與本發明方法聯合應用的寡核苷酸同源臂、引物和銜接子寡核苷酸 通常長度大約為10-ioo個核苷酸。在某些特定方面，寡核苷酸長度是 10個核苷酸，15個核苷酸，20個核苷酸，50個核苷酸，或者100個核苷酸，或者高達200個核苷酸。在優選實施方案中，寡核苷酸長度大約 為90個核苷酸。
寡核苷酸可以通過本領域已知的任何方法進行合成(例如，在 Applied Biosystems 392/394 DNA合成儀上進行標準亞磷酸胺化學合成)。 而且，合成試劑可以通過任一家供應商獲得。
的任何方法合成，例如，應用自動DNA合成儀(如可以通過商業渠道從 Biosearch, Applied Biosystems等購買)。作為示例，硫代磷酸寡核苷酸 可以通過Stein等的方法合成(1988， Nucl. Acids Res. 16， 3209 ),甲基磷 酸化寡核苷酸可以通過應用控制孔玻璃多聚體支持物來製備(Sarin et al.， 1988， Proc. Natl. Acad， Sci. USA 85， 7448-7451 )等。
一個寡核苷酸可以包括至少 一個修飾鹼基，只要這種修飾不會干擾 同源重組。例如，這些修飾包括但不限於5-氟尿嗜啶，5-溴尿嘧愛，5-氯尿嗜啶，5-碘尿嘧啶，次黃噪呤，黃嘌呤，4-乙醯胞嘧啶，5-(羧羥甲 基)尿嘧啶，5-羧甲氨甲基-2-硫尿嘧啶核苷，5-羧甲氨甲基尿嘧啶，雙氬 尿嘧啶，P-D-galactosylqueosine，次黃嘌呤核苷，N6-異戊烯腺噪呤，1-甲基鳥噪呤，1-甲基次黃噪呤核苷，2,2-二甲基烏嘌呤，2-甲基腺嘌呤， 2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-曱基胞嗜啶，N6-腺嘌呤，7-甲基烏嘌 呤，5-甲氨曱基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，P-D-mannosylqueosine ， 5，-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫-N6-異戊烯腺噪呤，尿嘧啶 -5-氧乙酸(v)，甲尿嗜啶，queosine， 2-硫胞嘧咬，5-甲基-2-硫尿嘧咬，2-硫尿嗜啶，4-疏尿嗜啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v), 5-甲基-2-疏尿嘧啶，3-(3-氨-3-N-2-羧丙基)尿嘧咬，以及2，6-二氨基嘌呤。
寡核苷酸包括至少一個修飾的磷酸主幹，只要這種修飾不會干擾同 源重組。這些修飾包括但不限於硫代磷酸酯，二疏代磷酸酯，疏代亞磷 醯胺，亞磷醯胺，亞磚醯二胺，曱基碳磷酸化合物，烷基磷酸三酯，以 及甲縮醛或其類似物。
5.3.3 DNA擴增
可以應用聚合酶鏈反應(PCR)連同本發明，從某一來源(如，組 織樣本，基因組或cDNA文庫)擴增所需序列。代表已知序列的寡核苷
45酸引物可以用作PCR引物。進行典型的PCR需要應用熱循環儀(如來自 Perkin-Elmer Cetus )和熱穩定聚合酶(如Gene AmpTM牌的Taq聚合酶)。 待擴增核酸模板包括但不限於任何物種的mRNA, cDNA或基因組DNA。 PCR擴增方法是本領域眾所周知的(見，例如美國專利號4,683,202, 4,683,195和4.889.818; Gyllenstein et al.， 1988, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85， 7652-7656; Ochman et al.， 1988, Genetics 120， 621-623; Loh， et al.， 1989， Science 243， 217-220)。
5.4診斷應用的方法
技術領域：
本發明方法可用於探測、預後、診斷或監測多種與異源或變異DNA 相關的感染、病況、疾病和功能紊亂，或監測其治療情況。例如，如下 部分5.4.1所述，這些方法可以用於探測、預後、診斷或監測多種感染和 疾病，如與病毒感染、細菌感染或原生動物、寄生蟲或其他已知病原體 感染有關的疾病。如下部分5.4.2所述，這些方法可以用於探測、預後、 診斷或監測多種與變異DNA存在相關的感染、病況、疾病和功能紊亂，
如基因突變或單核苷酸多態性(SNP)。以診斷為目的的方法將在這裡 給予詳盡闡述。
5,4,1探測異源DNA
上面描迷的本發明方法還可用於探測異源DNA,如在暴露於病原體 的患者中，探測源於病原體暴露而產生的病毒或細菌DNA。患者可能出 現也可能沒出現病原體感染症狀，或與病原體存在相關的疾病或功能紊 亂。例如，在一個實施方案中，靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有這種 疾病或感染的患者DNA中製備。設計並製備具有與異源靶DNA同源序 列的同源臂。然後應用上面部分5.1所述任一方法，將樣本DNA導入表 達細菌重組酶並含有栽體DNA的大腸桿菌宿主細胞中。在另一個實施方 案中，銜接子寡核苷酸可以設計包括與栽體序列同源的第一個序列，以 及與異源乾DNA同源的第二個序列，其定向性細節如上面部分5.1所述。 這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA和栽體DNA —起，共同轉染表達 RecE/T或Reda/(3的大腸桿菌宿主細胞，也可以直接轉染已經包括栽體 DNA和樣本DNA的細胞。然後如上面部分5.1所迷，將細胞在選擇培養 基中培養，呈現選擇抗性的細胞可以用來分析適宜大小插入序列的存在。
46把DNA可以從患者或受試者的生物樣本中分離，例如但不限於全 血，血漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細胞，組織培養細
胞，培養基，也可以從非生物樣本中分離，如食物，水或其他材料。從 這些材料中製備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
例如，在一個實施方案中，需要探測或診斷一種病毒感染或疾病， 同源臂包括與已知病毒DNA的DNA序列同源的DNA序列。這些方法 可以用來探測、分離病毒DNA,其形式可以是病毒DNA鏈，也可以是 DNA或RNA病毒的DNA複製中間產物。
例如，在一個實施方案中，可以應用同源臂直接確定DNA基因組或 DNA病毒的複製中間產物，所述同源臂序列被設計成與病毒序列同源， 這些DNA病毒包括但不限於B型肝炎病毒，細小病毒如腺相關病毒和巨 細胞病毒，P叩ova病毒如乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒和SV40,腺病毒，皰 滲病毒如I型單純皰滲病毒(HSV-I) 、 II型單純皰滲病毒(HSV-II)和 EB病毒，以及痘病毒如痘症(天花)和牛痘病毒。在另一個實施方案中， 可以應用同源臂直接確定從DNA中間產物複製獲得的逆病毒RNA病毒 的複製中間產物，所述同源臂序列被設計成與病毒序列同源，這些RNA 病毒包括但不限於I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I) , II型人類免疫缺陷 病毒(HIV-II) , I型嗜人類T淋巴細胞病毒(HTLV-I) , II型嗜人類T 淋巴細胞病毒(HTLV-II)。在另一個實施方案中，為了探測、分離從 RNA中間產物複製獲得的RNA病毒的基因組或複製中間產物，可以根 據本領域眾所周知的方法，分離RNA，並應用逆轉錄酶將其轉錄成RNA 的cDNA拷貝。這些cDNA拷貝就可作為靶DNA來探測RNA病毒的存 在，所述RNA病毒如流感病毒，麻滲病毒，狂犬病病毒，Sendai病毒， 細小核糖核酸病毒如脊髓灰質炎病毒，柯薩奇病毒，鼻病毒，呼腸病毒， 披膜病毒如風滲病毒(德國麻滲)和Semliki森林病毒，蟲媒病毒，以及 A型肝炎病毒。
在另一個優選實施方案中，需要診斷或探測細菌感染，同源臂包括 與已知細菌DNA序列同源的DNA序列。例如，在一個實施方案中，同 源臂DNA序列可以與病原細菌的cDNA或基因組DNA同源，所述細菌 包括但不限於釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，淋病奈瑟球菌，腦膜炎奈瑟球菌，白喉棒狀桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌，產氣莢膜梭狀芽胞桿菌，破傷 風梭狀芽胞桿菌，流感嗜血桿菌，肺炎克雷白桿菌，臭鼻克雷白桿菌， 鼻硬結克雷白桿菌，金黃色葡萄球菌，霍亂弧菌，大腸桿菌，綠膿桿菌，
胚胎彎曲桿菌，空腸彎曲桿菌，嗜水氣單胞菌，cereus桿菌，遲鈍愛德 華菌，小腸結腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌， 志賀痢疾桿菌，弗氏志賀菌，宋內志賀菌，鼠傷寒沙門氏菌，梅毒螺旋 體，極細密螺旋體，品他病密螺旋體，奮森氏疏螺旋體，出血性黃疽鉤 端螺旋體，結核分支桿菌，鼠弓形體，卡氏肺囊蟲，土拉弗朗西斯菌， 流產布魯氏菌，豬布魯氏菌，馬爾他布魯氏菌，Mycoplasma spp.,惠蟲 熱立克次體，Chlamydia spp.，以及幽門螺旋桿菌。
在另一個實施方案中，同源臂DNA序列可以與病原性真菌的cDNA 或基因組DNA同源，所述真菌包括但不限於Coccidioidesimmitis，煙曲 黴，白色念珠菌，皮炎芽生菌，新型隱球菌，以及莢膜組織胞漿菌。
在另一個優選實施方案中，需要診斷或探測原生動物感染，同源臂 可以包括與已知原生動物DNA序列同源的DNA序列。例如，這些同源 臂DNA序列可以與任何已知原生動物的cDNA或基因組DNA同源。特 別感興趣的病原性原生動物如Entomoeba histolytica, 口腔毛滴蟲，人毛 滴蟲，陰道毛滴蟲，甘比亞錐蟲，羅德西亞錐蟲，克氏錐蟲，熱帶利什 曼原蟲，巴西利什曼原蟲，肺炎肺嚢蟲，間日痴原蟲，惡性痴原蟲，以 及三日疾原蟲。
在另一個優選實施方案中，需要診斷或探測寄生蟲感染，同源臂可 以包括與已知寄生蟲DNA序列同源的DNA序列。例如，這些同源臂DNA 序列可以與任何已知寄生蟲的cDNA或基因組DNA同源，這些寄生蟲包 括，例如蠕蟲，包括蟯蟲，毛首鞭蟲，蛔蟲，旋毛蟲，糞類圓線蟲，日 本血吸蟲，曼氏血吸蟲，埃及血吸蟲以及鉤蟲。
5.4,2在細胞DNA中診斷突變和多態性
本發明方法還可用於在患者樣本中分離、探測遺傳紊亂，並預後、 診斷或監測與變異DNA相關的多種病況、疾病和功能紊亂，所述變異 DNA如基因突變或單核普酸多態性(SNP)，以及探測罹患某種疾病或 功能紊亂的遺傳傾向性。
例如，在一個實施方案中，靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有某種
48遺傳性疾病或功能紊亂的患者樣本DNA中分離製備。在一個優選實施方 案中，設計並製備含有同源臂的栽體，並導入表達細菌重組酶如RecE/T 和/或Redot/[3的大腸桿菌宿主細胞中，所述同源臂的序列與特定目標基因 或目標基因組區域同源。然後將樣本DNA導入宿主細胞。在另一個實施 方案中，設計的銜接子寡核苷酸包括與栽體序列同源的第一個序列，以 及與目標靶基因DNA同源的第二個序列，其定向性細節如上面部分5.1 所述。在一個優選實施方案中，這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA — 起，共同轉染表達RecE/T和/或Redot/(3並含有栽體DNA的大腸桿菌宿主 細胞。此外，還可應用上面部分5.1詳細描述的任何其他用於同源重組克 隆的方法。然後如上面部分5.1所述，在選擇培養基中培養細胞，分析抗 選擇細胞中適宜大小插入序列的存在。然後通過本領域眾所周知的限制 性分析或序列分析技術，分析DNA中目標突變或DNA變異體的存在(見， ，H口 Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
在另 一個實施方案中，同源臂或銜接子寡核苷酸可以包括目標基因 突變或DNA多態性序列。在該實施方案中，只有樣本DNA包括該突變 時，重組才會發生。該方法可用於診斷性篩檢大規模樣本中的特定突變 或DNA多態性，因為只有包括這一特定突變的細胞才會對選擇具有抗 性。
耙DNA可以從任何DNA樣本中獲得，如基因組DNA， cDNA或線 粒體DNA。例如，在一個實施方案中，粑DNA可以是人類染色體的一 個區域。在另一個實施方案中，靶DNA是混和形式，例如從眾多目標受 試者中獲得的基因組DNA混和物，所述目標受試者如罹患某一特定功能 紊亂的患者。這樣的靶DNA可以從生物樣本中分離，例如但不限於全血， 血漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細胞，組織培養細胞， 培養基，也可以從非生物樣本中分離，如食物，水或其他材料。從這些 材料中製備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
可以應用該方法檢測的遺傳性功能紊亂的非限制性示例包括與遺傳 性疾病相關的突變和SNPs，如與乳腺癌相關的Brca-l，與囊性纖維化、Tay-Sachs病、鐮狀細胞性貧血、血友病、動脈硬化、糖尿病、白血病、 前列腺癌及其他腫瘤、以及肥胖相關的突變。這些遺傳性疾病還包括退 行性、非退行性神經系統疾病如阿爾茨海默病，帕金森氏病，肌萎縮性 脊髓側索硬化，Huntington's病，Wilson's病，脊髓小腦性共濟失調， Friedreich's共濟失調和其他共濟失調，(月元)病毒性疾病包括 Creutzfeldt-Jakob病，齒狀核紅核pallidoluysian萎縮，海綿腦病，肌強直 性萎縮，抑鬱，精神分裂以及癲癇。遺傳性疾病還可能包括代謝性疾病， 例如，^氐血糖或苯丙酮尿症。還包括心血管疾病和病況，這些疾病的非 限制性示例包括動脈硬化，心肌梗塞和高血壓。本發明還可用來探測、 診斷萊姆病，結核和性傳播疾病。
在另 一個實施方案中，本發明同源重組克隆方法可用於檢測一種疾 病或功能紊亂的遺傳學基礎。例如，靶DNA可以從罹患某種功能紊亂的 患者樣本中分離，所迷功能紊亂的遺傳學基礎尚不知曉。在另一個實施
方案中，該克隆方法可用於在一群已知或懷疑患有某種功能紊亂的患者 中，分離已知或懷疑與該疾病或功能紊亂相關的染色體區域。然後，應 用本領域眾所周知的變異DNA繪圖技術，如限制性片段長度多態性或其 他SNP探測技術，可以進一步分離、分析獲得的DNA，探測基因突變或 多態性的存在(見如，Nikiforovetal.， 1997年10月21日授予的美國專 利號5，679,524; Mcintosh et al.， 1998年12月30日備案的PCT publication WO 98/59066; Goeletetal.， 1995年5月U日備案的PCT publication WO 95/12607; Wang et al., 1998， Science 280: 1077-1082; Tyagi et al., 1998， Nature Biotechnol. 16: 49-53; Chen et al., 1998， Genome Res. 8: 549-556; Pastinen et al.， 1996, Clin. Chem. 42: 1391-1397; Chen et al.， 1997， Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10756-10761; Shuber et al.， 1997， Hum. Mol. Gen. 6: 337-347; Liu et al., 1997， Genome Res. 7: 389-398; Livak et al., 1995, Nature Genet 9: 341-342; Day and Humphries, 1994, Amial. Biochem. 222: 389-395 )。
目標化學物質相關性靶功能紊亂的非限制性示例包括譯喘，關節炎， 銀屑病，excema，過敏，耐藥，藥物毒性以及腫瘤，例如但不限於人類 肉瘤和癌症，如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤， 脊索瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴血管肉瘤，淋巴血管內皮肉瘤，滑 膜瘤，間皮瘤，Ewing，s腫瘤，平滑肌肉瘤，對黃紋肌肉瘤，結腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀上皮細胞癌，基底細胞癌，腺癌， 汗腺癌，脂肪腺癌，乳頭癌，乳頭腺癌，嚢腺癌，髓樣癌，支氣管癌，
腎癌，肝細胞瘤，膽管癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚胎性癌，Wilm's 腫瘤，宮頸癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，表皮癌，神經 膠質瘤，星型細胞瘤，成神經管細胞瘤，顱咽管瘤，室鼓膜瘤，松果體 瘤，成血管細胞瘤，聽神經瘤，少突神經膠質細胞瘤，腦膜瘤，黑色素 瘤，成神經細胞瘤，視網膜母細胞瘤；白血病，如急性淋巴細胞白血病 和急性髓細胞白血病(成髓細胞白血病，前髄細胞白血病，髓單核細胞 白血病，單核細胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(慢性髄細胞(粒 細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病)，多發性骨髄瘤，Waldenstrom's 巨球蛋白血症，以及重鏈病。該同源重組克隆方法還可進一步用於診斷、 探測異常差異，以及診斷,限患自身免疫性疾病的患者，所述自身免疫性 疾病包括但不限於胰島素依賴性糖尿病，多發性硬化，系統性紅斑狼瘡， Sjogren's症候群，硬皮病，多肌炎，慢性活動性肝炎，混和性結締組織 病，原發性膽汁性肝硬化，有害的貧血，自身免疫性甲狀腺炎，特發性 Addison's病，白癜風，麩質敏感性腸病，Graves病，重症肌無力，自身 免疫性中性粒細胞減少症，特發性血小板減少性紫癜，類風溼關節炎， 肝硬化，尋常性天皰瘡，自身免疫性不育，Goodpasture's病，大皰性類 天皰疳，盤狀狼疫，潰瘍性結腸炎，以及dense deposit病。
同源重組克隆方法還可用於分離、診斷、探測與疾病無關的DNA突 變、改變、變異和SNPs。非限制性示例包括在非編碼基因組序列中出現 的DNA突變、改變、變異和SNPs,或者與人類不同血型相關的DNA突 變、改變、變異和SNPs。
在本發明一個優選方面中，本發明方法可以具體用於分離、探測、 診斷、預後或監測人類DNA突變、改變、變異和SNPs。但是，應該理 解，這裡描迷的方法還可用於分離、探測、診斷、預後或監測其他哺乳 動物疾病，例如，農用動物包括牛、馬、羊、山羊和豬，居家寵物包括 貓和狗，以及植物包括農作物和園藝植物。
5,5試刑盒
本發明還提供了可以使本文描述的同源重組克隆和亞克隆方法更易 於應用的試劑盒。在一個實施方案中，提供的試劑盒包括一個或多個容器a)用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽 體包括一個複製起點和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從5，到3',以 下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個同源臂；這樣， 第 一條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈 上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷 酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)含有 細菌重組酶的細胞。該細胞可以內源性表達該重組酶，也可以重組表達 該重組酶。
在另一個實施方案中，提供了用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的 試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用於定向克隆或亞克隆目標 靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製 起點，以及第二個同源臂，這樣，第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂 的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個 末端核苷酸序列同源；b)第 一個雙鏈寡核苷酸，含有第 一個寡核苷酸DNA 鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個序列和第二個序列，所述 第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源， 第二個核普酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源；c)第二個 寡核苷酸，含有第二個寡核普酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有 第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核普酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶 DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及d)含有細菌重組酶蛋白，如 RecE/T和/或Redoc/p蛋白的細胞。在一個特定實施方案中，細胞是大腸 桿菌細胞。
在另 一個實施方案中，本發明提供的試劑盒包括一個或多個容器 a)用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包 括一個複製起點和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從5，到3',以下述 順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個同源臂，這樣，笫一 條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的 第一個末端序列同源，第一條栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序 列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源；b)第一個雙鏈寡
52酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含 有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列，所述第一個核苷酸序列與 載體DNA鏈上的第 一 個同源臂的核普酸序列同源，第二個核苷酸序列與 粑DNA鏈的第一個末端核普酸序列同源；以及c)第二個寡核苷酸，含有 第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序 列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二 個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末 端核苷酸序列同源。
在多個特定實施方案中，試劑盒的靶DNA可以是細菌、病毒、寄生 蟲、原生動物或病原DNA。在其他特定實施方案中，試劑盒耙DNA可 以包括已知或懷疑與某一功能紊亂或疾病相關的基因突變或多態性。在 另一個特定實施方案中，銜接子寡核苷酸序列或栽體同源臂序列與基於 BAC, PAC，入，質粒或YAC的克隆栽體同源。
6.實施例克隆和亞克隆RecE/T和Reda/B
在本部分給出的實施例描述了應用本發明同源重組方法，成功克隆、
亞克隆的多個實驗。還顯示了亞克隆方法的不同手段。特別需要指出的 是， 一個實施例成功克隆了比前述任何插入片段都大的片段一一從大約 150 kb的BAC栽體中定向亞克隆了 25 kb的DNA片段。
6.1,方法和材料
應用標準PCR反應條件擴增線性DNA片段。從pACYC177擴增1972 bp的pl5A起點和卡那黴素耐藥基因(來自Tn903 ) 。 pl5A起點允許該 質粒或重組體可以在細胞中與攜帶Co氾l兼容組起點的質粒共同存在。 從pACYC184擴增1934 bp的氯黴素(來自Tn9 )耐藥基因和pl5A起點。
用於PCR反應的寡核苷酸包括，在其3'端，作為pACYC質粒引物 的18-30核苷酸序列，以及5，端，與靶DNA側翼區同源的50 - 60個核 苷酸延伸序列。對於較長的寡核苷酸，應用的PCR反應退火溫度是62 'C。通過應用QIAGEN PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產物，並 用dH20洗脫。通過應用DpnI消化PCR產物，去除才莫板DNA。消化後， 應用乙醇沉澱PCR產物，然後再次懸浮於dH20中，濃度為0.5ug/ul。
53通過標準方法製備電轉化功能細胞。簡而言之，過夜培養的細胞應
用含有適宜抗生素的LB培養基稀釋100倍。生長到最佳密度，0D6W= 0.25 -0.4的大腸桿菌細胞在冰上冷凍15分鐘。然後在-5。C以7，000rpm離心 細菌細胞10分鐘。用10%的水凍甘油再懸沉澱的細菌細胞，然後在-5 。C以7,000rpm離心IO分鐘，以產生沉澱。以冰凍10%甘油清洗、再離 心3次後，以等細胞體積的水凍10%甘油懸浮細胞沉澱。將功能細胞以 50ul等分存於eppendorf管，放入液氮冷凍，存於-70'C。
應用質粒pBAD-ET丫或pBAD-oc^的實馬全包括應用標準方法將這些 質粒轉化到大腸桿菌宿主中，然後在添加了 0.2%葡萄糖、50ug/ml氨千 青黴素的LB培養基中培養過夜，直至生長到飽和，然後應用添加了 50ug/ml氨節青黴素的LB培養基稀釋培養物IOO倍，並繼續生長到OD600 為0.15。然後添加L-阿拉伯糖至終濃度為0.1%。在細胞生長到OD6oo為 0.25-0.4後,在冰上冷凍15分鐘。
^脊化
將lul的DNA溶液(包括大約20.5ug的共轉化DNA，或者大約^:0.3ug 的載體DNA，為細胞提供錨定靶，或者大約20.5ug的DNA，含有細胞錨 定栽體的靶基因)與功能細胞混和。將細胞、DNA混合物轉移到水凍小 杯中。應用Bio-Rad基因脈衝儀進行電轉化，設置為25uFD， 2.3 kV,脈 衝對照設置為200 ohms。電轉化後，加入LB培養基(1 ml)。細胞在 37。C搖動孵育1 - 1.5小時，然後接種到含有與載體可選擇標記基因相應 的抗生素平板上。
6.2結果
表1總結了 6個實驗的結果，在這6個實驗中，應用不同來源的 RecE/T或Reda/(3表達亞克隆了不同目標靶DNA區域。笫一列以"ET" 表達開頭，是指RecE/T或Redoc/(3來源，如表所示，其來源可以是大腸 桿菌宿主JC8679或JC9604的內源性RecE/T,也可以是源於質粒 pBADa(3丫的pBAD-recE/T。第二列指示所用大腸桿菌宿主。第三列指示 靶基因。在第一個實驗中，大腸桿菌染色體上的recE/T基因在大腸桿菌菌林 JC8679中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2 概括的策略實現。設計、合成的寡核苷酸具有以下序列 5 ， -TTCCTCTGTATTAACCGGGGAATACAGTGTAATCGATAATTCAGA GGAATAGCTCGAGTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3，(序列1) 和
5 ， -CAGCAATGTCATCGAGCTG AG ACTTACTG AT ACCGGG ACCCGCGT GGTAATTCTCGAGTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3 ，(序列2 ) 來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因。該 實驗結果概括於表1的第一行。表1.
ET表達大腸桿菌宿主靶基因集落總數正確％ ( 18)
內源性JC8679大腸桿菌染色體54089
recE/T上的recE/T
內源性JC8679大腸桿菌染色體76094
recE/T上的lacZ
內源性JC9604大腸桿菌染色體2卯100
recE/T上的lacZ
pBAD-recJC5519高拷貝質粒上的〉3,000100
E/T慶大黴素
pBAD-apy訓Ol大腸桿菌染色體 上的lacZ37094
pBAD-a(3丫HS996BAC中mAF4的 內含子316083
在第二個實驗中，大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌林JC8679 中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2概括的策 略實現。載體通過PCR技術進行製備，PCR中所用寡核苷酸具有如下序 列
5 ， -TC A AC ATT A AATGTGAGCGAGT A AC AACCCGTCGG ATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAG T-3，(序歹'j3)
和
555 ， -TCAGGGGAA AACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGG ATTG A TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3'(序歹") 來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因。該 實驗結果概括於表1的第二行。
在第三個實驗中，大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌林 JC9604中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2 概括的策略實現。栽體通過PCR技術進行製備，PCR中所用寡核苷酸具 有如下序列
5 ， -TC A AC ATTAAATGTGAGCGAGTAAC AACCCGTCGG ATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT G-3，(序列5) 和
5 ， -TC AGGGG AAAACCTT ATTTATC AGCCGGAAAACCTACCGGATTG A TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3'(序歹')6 ) 來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因。該 實驗結果概括於表1的第三行。
在第四個實驗中，位於高拷貝質粒pFastBACl (Gibco)上的慶大黴 素基因通過圖3概括的策略，在大腸桿菌菌林JC5519中亞克隆。在 pBAD-recE/T質粒轉化JC5519後，通過該質粒表達RecE/T，並在製備 功能細胞前，應用阿拉伯糖誘導。栽體通過PCR技術進行製備，PCR中 所用寡核苷酸具有如下序列
5 ，曙TGC ACTTTG ATATCG ACCC A AGTACCGCC ACCTAAC AATTCGTTC AAGCCGAGGATCCTTAATAAGATCATCTTCTGAGATCGTTTTGG-3， (序列7)
和
5' -TGC ATT AC AGTTT ACGAACCG AAC AGGCTTATGTC A ACTGGGTTC GTGCCTTCAGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3， (序列8)
來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因，將 PCR產物與BamHI消化的pFastBACl混和，共轉化，並接種於含有慶大
黴素和卡那黴素的平板上。
在第五個實驗中，位於大腸桿菌染色體上的lacZ基因通過圖2概括的策略，在大腸桿菌菌株HBIOI中亞克隆。在pBAD-recE/T質粒轉化 HB101後，通過該質粒表達RecE/T，並在製備功能細胞前，應用阿拉伯 糖誘導。栽體通過PCR技術進行製備，PCR中所用寡核苷酸具有如下序 列
5 ，畫TCAAC ATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCTTATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT G-3，(序列9) 和
5，-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGA TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3，(序歹'j 10) 來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因 該 實驗結果概括於表1的第五行。
在第六個實驗中，攜帶鼠AF4基因的大約150kbBAC克隆的25kb 區域通過圖3概括的策略，在大腸桿菌菌抹HS996中亞克隆。在 pBAD-recE/T質粒轉化HS996後，通過該質粒表達RecE/T,並在製備功 能細胞前，應用阿拉伯糖誘導。栽體通過PCR技術進行製備，PCR中所 用寡核苷酸具有如下序列
5'-TGTAGCTGAGCCCAGGGGCAAGGCTGCTTTGTACCAGCCTGCTGT CTGCGGGGGCATCACCTGGAATTCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGA TCGTTTTGG-3，(序列U )
和
5 ， -TGGGTGTC AACCTC AGGCTTTCTC ACACGC AAT AC AGGTAGGGAC TTGCACCCCTACACACCGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCA TCAAATG-3，(序歹ij 12)
來擴增pACYC177上的pl5A複製起點和Tn903卡那黴素耐藥基因。PCR 產物與0.5ug純化BACDNA混和，然後共轉化，該實驗結果概括於表1 的第六行。圖6顯示的是溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠，顯示了應用EcoRI 消化的DNA,該DNA分離自9個來自mAF4 BAC實驗的獨立集落(泳 道l-9)，對照是應用EcoRI消化的起始栽體(泳道IO)。
在第七個實驗中，應用圖7概括的策略，克隆了含有來自酵母菌林 MGD 353-13D的氨卡青黴素耐藥基因的基因組DNA區域。如圖A所示， 含有pl5A複製起點的DNA片段，其側翼是98或102bp的同源臂，所述同源臂指向酵母菌株MGD 353-13D中的氨節青黴素耐藥基因側翼區 域的98或102bps。應用大腸桿菌菌林JC5519, Redot/(3的表達由質粒 pBADot(3Y-TET提供，然後，在製備功能細胞前，應用阿拉伯糖誘導。
pBADa(3丫-TET是pBADaPY的衍生物，其中，氨千青黴素耐藥基因被四 環素耐藥基因所取代。克隆栽體通過PCR技術進行製備，PCR中所用寡 核苷酸具有如下序列
5' -TCTTTTACTTTC ACC AGCGTTTCTGGGTG AGC AAAAACAGGAAGG CAAAATGCCGCAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT ACTCATAACACCCCTTGTATTAC丁GTTTATGTAAGCAGACAG-3，(序 列13)
和
5'-TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATG GATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTA AGCATTGGTAATTAA丁AAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3' (序列14)
來擴增pACYC177上的pl5A複製起點。PCR產物與4ug Ncol消化的 MGD 353-13D酵母基因組DNA混和，然後共轉化包括Reda/(3表達的 JC5519， Reda/(3表達來自pBADa(3丫，在37。C、 L-肉湯中培養90分鐘復 蘇期後，接種於含有氨千青黴素的平板。通過氨千青黴素耐藥選擇鑑定 克隆。共有18個克隆進行了 DNA分析。圖7B顯示了 IO個正確克隆的 溴化乙啶染色凝膠。
這裡描述的實施例說明，RecE/T和Reda/(3同源重組克隆方法可以 將多種環狀靶基因成功克隆到大腸桿菌染色體上，所述環狀靶基因從高 拷貝質粒到低拷貝較大靶基因(BAC)。
7.栽體重複序列和磷酸化對克隆效率的影響
本部分給予的實施例描述了應用RecE/T或Reda/(3介導的同源重組 ("ET克隆")技術進行高效克隆和亞克隆的最佳條件。特別是如圖8 所示，去除載體中的重複序列可以改善克隆效率。相反，在線性栽體末 端出現的5'磷酸化對ET克隆的效率影響卻很小。
首先，在下述實驗中檢測了重複序列對克隆效率的影響。如圖8所 示，作為克隆栽體的線性栽體包括pl5A複製起點，氯黴素耐藥基因(Cm，) ， PCR擴增線性栽體所需的核苷酸序列(圖8中以斜體代表)， 大腸桿菌lacZ基因的側翼同源臂，以及在線性栽體兩端存在的不同長度 的末端重複序列(以黑體代表)。將線性栽體轉化到表達pBADReda/p
(Zhang et al.， 1998, Nat. Genet. 20: 123-128 )的JC8679(內源性ET; Clark, 1974, Genetics, 78， 259-271 )或JC5519( WUletts and Clark, 1969, J. Bacteril. 100: 231-239)中。圖8表中顯示了應用指示寡核苷酸PCR擴增線性栽體 後，在ET亞克隆後，LB平板(含有50ug/ml的氯黴素)上含有的集落 數量。其中18個集落進行了限制性消化。用正確重組體數量除以總集落 數量得出重組效率。因此，末端重複〉6個核苷酸可以顯著降低￡丁亞克 隆效率。所有背景集落都含有再連接的線性栽體。
還檢測了磷酸化對重組效率的影響，結果如圖8所示。應用T4DNA 激酶和Y-ATP使線性栽體末端磷酸化。如圖8最後一列所示，沒有觀察 到對ET亞克隆或栽體再連接的影響。
該實施例顯示，在線性栽體末端或在同源臂與栽體必需元件之間存 在的重複序列，導致的重組可以顯著降低ET克隆和亞克隆效率，所示必 需元件即複製起點和可選擇標記。因此，在一個優選實施方案中，同源 克隆栽體序列在編碼複製起點和可選擇標記序列的外部，不包括任何S5 個鹼基的直接重複序列。
8, RecE/T和Reda/B克隆和亞克隆的其他實施例
本部分給出的實施例描述了其他實驗，這些實驗顯示應用RecE/T或 Reda/(3介導的同源重組技術，成功進行克隆和亞克隆的方法。
義應^f肅涼J:
如上所述，"ET功能宿主"是指能夠表達RecE/T和/或Reda/|3的 任何大腸桿菌細胞。這可以通過多種途經實現，如(i)內源性表達RecE/T 或Reda/p的菌林，或者(ii)通過外源導入質粒表達RecE/T或Reda/f3的
和YZ2二00、1)的質粒表i栽體的構建。ET功能宿主'的其他變異體和示例 見Murphy et al., 2000， Gene 246: 321-330; Yu et al.， 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 5978-5983; and Datsenko and Wanner, 2000， Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6640-6645。在第一類中，應用的兩個菌林攜帶sbcA突變，因此在RecAX JC 9604; Gillen et al,， 1981， J. Bacteriology 145: 521-532 )或RecA十(JC8679; Gillen etal.， supra)背景下內源性表達RecE/RecT。應用這些菌抹的優勢在於， 它們可以直接應用，不必為使該菌林具有ET克隆功能而首先導入一個質 粒。缺點在於RecE和RecT在克隆全過程中始終固定表達，特別是在 RecA+背景下，增加了分子內不欲重組的風險。第二個缺點在於，這些 JC菌林未經修飾用於克隆和增殖宿主。它們包括完整的活性限制/修飾系 統，因此大大降低了大分子如BACs導入這些宿主的效率。
選擇內源性表達RecE/T或Reda/p的宿主菌林，還是導入質粒表達 RecE/T或Reda/(3的宿主菌林，有賴於環狀靶序列的性質。無論選擇哪 種策略，製備品質優良的功能細胞都是至關重要的。如果宿主菌林缺乏 內源性ET克隆潛能，該菌林必須首先轉化pBAD-a(3丫或pBAD-ETY。獲 得的菌林必須應用終濃度為0.1 %的L-阿拉伯糖誘導生長，然後準備電轉 化。依椐經驗，細胞的最佳收穫點是OD咖大約為0.35，特別是當靶序 列是大DNA底物時。如果細胞的OD6oo大於0.5,就不應該應用了。最 佳導入時間大約為1小時。必須應用電轉化，因為沒有發現其他DNA導 入方法能發揮作用。製備品質良好的電轉化細胞對於獲得ET重組體是至 關重要的。在製備電轉化功能細胞期間，所有步驟均需在水上或預冷的 小桶、轉子上進行。將電轉化功能細胞高度濃縮對於OD6o。-0.35時收 獲的250ml培養物，我們常規製備成不超過10等分的功能細胞，每等分 50ul。獲得的轉化效率大大依賴於所用宿主菌林，但典型的變異大約為 109cfu/ug。關於如何製備電轉化功能細胞和如何進行電轉化的詳細實驗 流程可以從以下網址獲得
http:〃www. embl-heiddberg.de/ExternalInfo/stewart/index.html。
如圖9A所示，構建質粒pR6K/BAD-a(3"Ktet),使BAC宿主菌抹HS996 (Invitrogen)具有進行ET重組的能力。該質粒基於pBAD24骨架 (Guzman et al.， 1995， J Bacteriol 177: 4121-4130 ) 。 Redot (或RecE)由 L-阿拉伯糖可誘導pBAD啟動子誘導表達，Red(3(或RecT)由固定EM-7 啟動子i秀導表達。RecT相對於RecE，或Red(3相對於Reda的過量表達， 可以增加ET克隆的效率(以選擇平板上的集落數量為標準)。最後，該 質粒固定表達Red丫蛋白，在這種情況下，該蛋白的表達由固定Tn5啟動 子誘導，所迷啟動子對於抑制最常應用的宿主菌林中存在的RecBCD酶活性是必須的(Murphy, 1991， J. Bacteriology 173: 5808- 5821 )。如果不 使其失活，RecBAD會完全抑制ET克隆，其原因可能是該酶的核酸外切 酶活性使線性DNA在有機會重組前就被降解。因此，pBAD-a(3y(tet)組 成了一個移動系統，可以將可調節ET克隆特性通過轉化傳遞到接受宿主 菌林中。假設RecE或Reda的表達具有誘導性，為使重組發生，RecE/T 和Reda/p系統中兩個組分同時表達的絕對需求也得到滿足，重組窗的限 制就是阿拉伯糖誘導時間和最不穩定組分的半衰期。將這些因素綜合考 慮，並結合最常用的宿主是recA，當然宿主也可以是recBC或recBC — 的擬表型(取決於Redy的表達)，這意味著不欲分子內重組發生的風險 顯著降低。pBAD-a(3丫(tet)的另 一個有用特徵是當這些質粒在培養期間沒 有被選擇時，它們傾向於迅速消失。這可能是由於Redy的固定表達，也 會依賴宿主細胞的其他因素發生變化，例如RecBCD的存在。
pR6K/BAD-ot|3Y的複製需要R6K起點和Pir-l 16蛋白(Metcalf et al., 1994， Gene 138， 1-7 ) 。 pR6K/BAD/aP丫攜帶來自pJP5603的R6K起點 (Penfold and Pemberton， 1992， Gene 118: 145-6)，在細菌中控制R6K ori 質粒複製的pir-U6複製子基因，以及來自pBR322的四環素耐藥基因tet。 Pir-116是一個拷貝突變體，允許含有R6K起點的質粒在大腸桿菌菌林中 以超過每細胞200拷貝的量存在。pir-116基因來從大腸桿菌菌林 BW3647,通過PCR擴增，並在lacZ啟動子後克隆。
為了製備pR6K/BAD/aP丫，將R6K起點、pir-l 16和tet通過ET重組 導入pBAD-a(3y ( Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27: 1555-1557 )，置換原來存在於pBAD-aP丫上的Co舊l起點和氨千青黴素 耐藥基因。同樣製備pR6K/BAD/ETV和pR6K/BAD/recT。基於R6K的任 何質粒相較於基於Co舊l的親本質粒，拷貝數大約高2倍。在標準BAC 亞克隆練習中並行比較pR6K/BAD/a(3丫和pBAD-a(3丫，結果發現基於R6K 的質粒工作效率更高(見圖9B)。在這些pR6K質粒中存在的R6K複製 系統不含任何與其他複製起點顯著同源的序列，所述其他複製起點包括 pl5a和Co舊l。而且，基於R6K的質粒與其他任何複製起點兼容。因此， 如ColEl和pl5A的複製起點可以包括在用於ET亞克隆的線性栽體中。
圖10顯示了亞克隆一個19kb的片段，該片段包括BAC上AF-4基
61因的外顯子2和3。首先，將pR6K/BAD-a(3y轉化到攜帶BAC的菌抹中。 隨後，在含有15ug/ml四環素和12.5ug/ml氯黴素的LB培養基中培養這 些轉化菌抹。應用L-阿拉伯糖誘導生長細胞1小時，然後製備電轉化功 能細胞。這些細胞通過電轉化導入線性栽體，所示栽體包括pl5A複製起 點和氨千青黴素耐藥基因，(3-內醯胺酶(bla)，其側翼為兩個長度為50 個核苷酸的同源臂，可以指導AF-4BAC上的靶DNA同源重組。在含有 50ug/ml氨千青黴素的LB平板上生長後，收穫重組體。
如圖10B所示，選擇5個獨立集落進行分析。從5個獨立集落中制 備DNA，然後應用HindII消化，並在溴化乙啶染色凝膠上進行分析。 HindIII消化的正確集落和線性栽體以及1 kb DNA階梯(Gibco BRL)作 為標記。正確亞克隆通過DNA序列分析進行確認。
如圖11實驗所示，基因組DNA還可作為革巴DNA的直接來源。在該 實驗中，線性栽體包括ColEl起點和卡那黴素耐藥基因(kan)，其側翼 為同源臂，可以指導發生於大腸桿菌染色體上lacI/lacZ位點的重組(見 圖11A)。基因組DNA分離自大腸桿菌，並經XhoI消化，預先線性化。 混和線性載體和預線性化的基因組DNA，共同電轉化導入內源性表達 RecE/RecT的YZ2000。通過在含有50ug/ml卡那黴素的LB平板上選擇， 獲得含有lacl和lacZ基因、ColEl起點和kan的所需亞克隆。如圖11B 所示，16個獨立集落的限制性分析發現，含有正確產物(泳道1 - 16)。 泳道17為線性栽體，泳道M是作為標記的1 kbDNA階梯(Gibco BRL )。
另一個成功ET重組克隆示例如圖12所示。在該實驗中，通過應用 同源臂克隆栽體，在鼠ES細胞基因組DNA中直接克隆片段。如概括了 克隆策略的圖12A所示，來自鼠ES細胞基因組DNA的新黴素耐藥基因 (neo)作為靶DNA。線性栽體包括ColEl複製起點和氯黴素耐藥基因 Cm，，其側翼為兩個臂，與Tn5-neo基因同源。所需鼠ES細胞系可以通 過轉染包括Tn5-neo的片段製備，所迷片段在PGK啟動子控制下，並加 polyA尾。從G418耐藥集落中分離基因組DNA，並用針剪切，通過苯酚 /氯仿抽提，創建大約20-40 kb的線性片段。
通過共同電轉化線性栽體和剪切的基因組DNA，將其導入JC8679 的衍生物YZ2000 (Clark， supra)，進行ET克隆，在YZ2000中，降解
62異源甲基化DNA的限制性系統由於去除了 mcrA, mcrBC， hsdRMS和mrr 基因而部分削弱。由於過量表達RecT可以顯著增加整體ET重組效率， 因此應用pR6K/BAD/recT質粒轉化YZ2000。攜帶pR6K/BAD/recT的 YZ2000，在收穫前1小時應用L-阿拉伯糖誘導，然後應用0.5ug線性載 體和5.0ug剪切鼠ES細胞基因組DNA共同電轉化。在含有50ug/ml氯 黴素的LB平板上平均收穫25 - 35個集落。在含有50ug/ml卡那黴素的 平板上再次增殖這些集落，通過Tn5-neo表達法測試的30個集落中發現 有6個生長。在圖12部分B中，對卡那黴素耐藥集落的限制性分析顯示， 所有6個測試集落都是正確的(泳道2-7)。假陽性限制性圖i普如泳道 1所示，該集落在有氯黴素的情況下可以生長，但在卡那黴素存在的情況 下無法生長。所有這些假陽性集落都包括再連接的栽體。
圖13顯示了 一個聯合ET亞克隆和克隆的實驗。線性栽體包括ColEl 複製起點和卡那黴素耐藥基因Km'。線性載體的每個末端都包括BstZ171 位點和2個同源臂。在線性栽體末端存在的同源臂(在圖13中以小方框 表示)與人噬菌體靶DNA同源。第二套同源臂(在圖13中以大方框表示) 與大腸桿菌染色體上的lacI-lacZ基因同源。
在第一步亞克隆中，線性載體與線性化人噬菌體靶DNA共同電轉化 到具有ET特性的大腸桿菌菌抹JC8679AlacZ中。該步驟導致6.7kb的入 DNA片段亞克隆到線性栽體上，該片段包括exo, bet，gam，rexA和c1857 基因，進而產生pYZN/入-PR。下一步ET重組應用一個新的線性栽體， 該載體包括由突變laxP位點(laxP*， Araki et al., 1997， Nucleic Acids Research, 25: 868-872)側翼包繞的氯黴素耐藥基因cat,以及與 pYZN/ i-PR上人DNA同源的末端臂。該線性栽體與pYZN/入-PR —起， 共同電轉化到具有ET特性的大腸桿菌菌林JC8679AlacZ中，導致 pYZN/X-PR/Cm的形成。通過BstZ171消化，該質粒釋放含有cat的人DNA 片段，該片段由與lacI-lacZ同源的兩個末端臂側翼包繞。該片段用於定 位大腸桿菌菌林JC5519 ( Willetts and Clark, 1969, J Bacteriol， 100: 231-239 )的染色體，該菌林表達來自pBADRecE/T的RecE和RecT( Zhang etal.， 1998, Nature Genetics 20: 123-128) 。 ET重組後，在存在20ug/ml 氯黴素的情況下選擇生長，產生YZ2001/Cm菌株。通過應用706-Cre質 粒，去除cat基因，產生YZ2001,所述質粒與705-Cre不同的是，它攜 帶四環素耐藥基因(tet)而非氯黴素耐藥基因，如文獻所述(Buchholz etal.， 1996， Nucleic Acids Research, 24: 3118-3119)。因此，YZ2001攜帶 6.7 kb的X DNA片段(exo…-c1857 )，以及染色體上的突變laxP位點。 由於YZ2001/Cm允許人基因exo， bet和gam的熱誘導表達，因此具有條 件ET特性。例如，可以應用相似的策略製備敲除構建物或進行BAC修 飾。
因此，上面給予的實施例顯示了幾種應用RecE/T和Reda/(3介導的 同源重組技術成功克隆和亞克隆的方法。
這裡公開的特定實施方案不應限制本發明和權利要求的範圍，因為 這些實施方案是為了舉例說明本發明的幾個方面。任何等價實施方案都 應該屬於本發明範疇。實際上，通過前面的描述，除了本文已經顯示或 描述的修飾，本領域技術人員可以輕而易舉地對本發明進行多種其他修 飾。這些修飾也應該屬於後面權利要求的範疇。在本申請文件中，引用 了很多參考文獻，每篇文獻的內容均在此全文引入，作為本申請文件的 參考。
權利要求
1.一種將雙鏈靶DNA導入載體的方法，包括培養表達功能性重組酶的細菌，所述細菌細胞包括(a)靶DNA，含有第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端，以及(b)載體DNA，在載體DNA鏈上以下述順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)複製起點，以及(iii)第二個雙鏈同源臂，這樣，載體DNA鏈的第一個同源臂序列與靶DNA鏈的第一個末端序列同源，載體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第二個末端序列同源，這樣，靶DNA可以在同源臂之間插入載體DNA中。
2. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體導入細胞，所述細胞含有雙鏈靶DNA，並表達細菌 重組酶，所述栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA 鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點的 一條鏈，以及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5'，以下迷順序存在第一個末端，耙DNA序列，以及 第二個末端；這樣，栽體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一 個末端序列同源，栽體DNA鏈上的笫二個同源臂序列與靶DNA 鏈上的第二個末端序列同源；以及b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
3. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞，所述 細胞含有雙鏈靶DNA，並表達細菌重組酶， 所迷栽體含有一個複製起點和兩個雙鏈同源臂，在栽體DNA鏈 上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以 及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5，，以下列順序存在第一個末端，靶DNA序列， 以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述第一個核普酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷 酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序， 從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的笫二個末端核苷酸序列 同源；以及b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
4. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈靶DNA分子導入細胞，所述細胞含有一個栽體，並表 達細菌重組酶，所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5',以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列， 以及第二個末端；所述栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第 二個同源臂；這樣，栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一 個末端序列同源，載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA 鏈上的第二個末端序列同源；以及b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
5. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈靶DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細 胞，所述細胞含有一個載體，並表達細菌重組酶，所述靶DNA 含有一個把DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上，從3，到5'， 以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個末端； 所迷第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷 酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷 酸序列同源；所迷第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下迷順序，從3，到5，含有笫三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列 同源；並且所述栽體含有一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第 二個同源臂；以及 b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
6. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體和雙鏈靶DNA導入表達細菌重組酶的細胞，所述栽體含有 一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第 二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5，，以下迷順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及 第二個末端；這樣栽體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個 末端核苷酸序列同源，栽體DNA鏈上的第二個同源臂核苷酸序 列與把DNA鏈上的笫二個末端序列同源；以及b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
7. 製備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體，雙鏈靶DNA分子，以及第一個、第二個雙鏈寡 核苷酸導入表達細菌重組酶的細胞，所述栽體含有 一個複製起點和兩個雙鏈同源臂，在栽體DNA鏈 上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以 及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5'，以下迷順序存在第一個末端，靶DNA序歹L 以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述笫 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端序列 同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列 同源；以及b) 將細胞置於可以發生細胞內同源重組的條件下。
8. 權利要求6的方法，其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點特異性重組酶的核苷酸序列，栽體進一步包括位點特異 性重組酶識別的第一個和第二個識別位點，第一個識別位點位於第一 個和第二個同源臂的外部，第二個位點特異性重組酶識別位點位於第 一個和第二個同源臂的內部；在步驟b)進行期間或進行之後，誘導位 點特異性重組酶的表達。
9. 權利要求7的方法，其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點特異性重組酶的核苷酸序列，栽體進一步包括位點特異 性重組酶識別的第 一 個和第二個識別位點，第 一 個識別位點位於第一 個和第二個同源臂的外部，第二個位點特異性重組酶識別位點位於第 一個和第二個同源臂的內部；在步驟b)進行期間或進行之後，誘導位 點特異性重組酶的表達。
10. 權利要求6的方法，其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點特異性核酸內切酶的核苷酸序列，栽體進一步包括位點 特異性核酸內切酶的識別位點，該位點位於第一個和第二個同源臂的 內部；在步驟b)進行期間或進行之後，誘導位點特異性核苷內切酶的 表達。
11. 權利要求7的方法，其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點特異性核酸內切酶的核苷酸序列，栽體進一步包括位點 特異性核酸內切酶的識別位點，該位點位於第一個和第二個同源臂的 內部；在步驟b)進行期間或進行之後，誘導位點特異性核苷內切酶的 表達。
12. 權利要求2- 11任一項的方法，其中栽體還進一步包括一個可選擇標 記，位於第一個和笫二個同源臂的外部，這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，栽體可以下述兩種順序含有i)第一個同源臂，可選擇標 記，複製起點和第二個同源臂，或ii)第一個同源臂，複製起點，可選 擇標記和第二個同源臂。
13. 權利要求12的方法，其中可選擇標記可以將抗生素耐藥性傳遞給含有 該載體的細胞。
14. 權利要求2- 11任一項的方法，其中細菌重組酶是RecE/T或Reda/{3 重組酶，或RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
15. 權利要求2- 11任一項的方法，其中細胞是細菌細胞。
16. 權利要求2- 11任一項的方法，其中細胞是大腸桿菌細胞。
17. 權利要求2- 11任一項的方法，其中細胞是重組表達RecE/T和/或 Reda/(3重組酶的真核細胞。
18. 權利要求2 - 11任一項的方法，該方法還進一步包括分離重組DNA 分子，所述重組DNA分子含有插入到栽體中的靶DNA。
19. 用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，所迷栽體 包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以 下述順序存在第一個同源臂，複製起點和第二個同源臂；這樣第一 條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈的 第一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷 酸序列與第 一條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
20. 權利要求19的栽體，其中複製起點是細菌的複製起點。
21. 權利要求19的栽體，其中複製起點在大腸桿菌中發揮作用。
22. 權利要求19的栽體，其中複製起點在哺乳動物細胞中發揮作用。
23. 含有雙鏈DNA栽體的細胞，該栽體用於定向克隆或亞克隆目標靶 DNA分子，包括一個複製起點和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從 5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂，複製起點和第二個同源臂； 這樣第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶 DNA鏈的第一個末端序列同源，第一條栽體DNA鏈上的第二個同源 臂的核苷酸序列與第 一 條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
24. 權利要求23的細胞，所述細胞是細菌細胞。
25. 用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器 a) 用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個 同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一 條把DNA鏈上的 第二個末端核苷酸序列同源；以及b) 含有細菌重組酶的細胞。
26. 權利要求25的試劑盒，其中同源臂的序列與基於BAC, PAC,人，質 粒或YAC的克隆栽體同源。
27. 權利要求25的試劑盒，其中第一個和第二個雙鏈寡核苷酸具有的核苷 酸序列與基於BAC, PAC,人，質粒或YAC的克隆栽體同源。
28. 用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器a) 用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該 栽體包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5， 到3'，以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個 同源臂；和b) 第一個雙鏈寡核苷酸，含有笫一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以 下述順序，從3，到5，含有第一個序列和第二個序列，所述第一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列同 源，第二個核普酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷酸序列同 源；c) 第二個雙鏈寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順 序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所 述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷酸 序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及d) 含有細菌重組酶的細胞。
29. 權利要求25或28的試劑盒，其中細胞是大腸桿菌細胞。
30. 權利要求25或28的試劑盒，其中細胞是具有攝取DNA能力的凍存 細胞。
31. 用於定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器 a) 用於定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個複製起點和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3',以下述順序存在第一個同源臂，複製起點，以及第二個 同源臂；b) 第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以 下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序 歹i，所述第 一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一 個同源臂的 核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與把DNA鏈的第 一 個末端 核苷酸序列同源；以及c) 第二個雙鏈寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順 序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所 迷第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸 序列同源，第四個序列與靶DNA鏈的第二個末端核普酸序列同 源。
32. 權利要求25, 28或31的試劑盒，其中DNA栽體是經純化處理的。
33. 權利要求28或31的試劑盒，其中DNA栽體、第一個雙鏈寡核苷酸 和第二個雙鏈寡核苷酸均是經純化處理的。
34. 權利要求25， 28或31的試劑盒，其中靶DNA分子包括細菌、病毒、 寄生蟲或原生動物DNA。
35. 權利要求25， 28或31的試劑盒，其中靶DNA分子包括已知或懷疑 與某種功能紊亂或疾病相關的基因突變或多態性。
36. 權利要求25 - 29任一項的試劑盒，其中細菌重組酶是RecE/T或 Reda/(3重組酶，或者是RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
37. 權利要求2-ll任一項的方法，其中靶DNA在發生基因突變時，已 知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關。
38，權利要求2-11任一項的方法，其中靶DNA是細菌、病毒、寄生蟲 或原生動物DNA。
39. 權利要求2， 4， 6， 8或IO的方法，該方法還進一步包括探測重組DNA 分子，所迷重組DNA分子包括插入到栽體中的靶DNA。
40. 權利要求3， 5， 7, 9或11的方法，該方法還進一步包括探測重組DNA 分子，所述重組DNA分子包括插入到栽體中的靶DNA。
41. 探測感染物質存在的方法，包括實施權利要求39的方法，其中耙DNA 來自懷疑罹患感染性疾病的患者，並且，第二個和第四個核苷酸序列 與感染物質DNA中存在的序列同源。
42. 探測感染物質存在的方法，包括實施權利要求40的方法，其中把DNA 來自懷疑罹患感染性疾病的患者，並且，第一個和第二個同源臂序列 與感染物質DNA中存在的序列同源。
43. 權利要求41或42的方法，其中感染物質是病毒、細菌、原生動物、 真菌或寄生蟲。
44. 探測遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特徵存在的方法，包括實 施權利要求39的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、疾 病、功能紊亂或多態性特徵的患者，而且，第一個同源臂的序列與已 知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特徵相關的位 點上遊序列同源，第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病 況、疾病、功能紊亂或多態性特徵相關的位點下遊序列同源。
45. 探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特徵存在的 方法，包括實施權利要求40的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺 傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特徵的患者，而且， 第一個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾 病、遺傳性功能紊亂或多態性特徵相關的位點上遊序列同源，第二個 雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺 傳性功能紊亂或多態性特徵相關的位點下遊序列同源。
46. 權利要求44或45的方法，其中遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功 能紊亂或多態性特徵使患者具有罹患腫瘤，哮喘，關節炎，耐藥，藥 物毒性，或神經系統、神經精神、代謝、肌肉、心血管或皮膚病況、 疾病或功能紊亂的傾向性。
47. 權利要求19的栽體，其中栽體還進一步包括一個位於第一個和第二個 同源臂外部的可選擇標記，這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3',栽 體可以下述兩種順序含有i)笫一個同源臂，可選擇標記，複製起點 和第二個同源臂，或ii)第一個同源臂，複製起點，可選擇標記和第二個同源臂。
48. 權利要求47的栽體，其中栽體序列在複製起點和可選擇標記的5，端 或3，端均不包括一個或多個直接重複序列，所述直接重複序列包括至 少25個核苷酸鹼基對。
全文摘要
本發明涉及應用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物。具體地，本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA亞克隆的方法和組合物。本發明涉及克隆的方法，含有用作克隆載體的多核苷酸的組合物，含有所述多核苷酸組合物的細胞，以及由細菌重組酶介導的克隆試劑盒，所述重組酶如RecE/T和Redα/β。
文檔編號C12N1/21GK101492694SQ20091000508
公開日2009年7月29日 申請日期2000年7月10日 優先權日1999年7月9日
發明者F·A·斯圖爾特, J·P·P·穆伊雷爾斯, Y·張 申請人:歐洲分子生物學實驗室