用於治療代謝病症的組合物和方法與流程
2023-05-26 22:20:16 2
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相關申請的交叉引用
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發明領域
本發明尤其涉及適用於治療代謝相關病狀的多肽複合物及其組合物。
引言
肥胖最通常由過度食物攝入加上有限能量消耗和/或缺乏體育鍛鍊所引起。肥胖增加發展諸如以下的各種疾病的可能性：糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、睡眠呼吸暫停、痛風、風溼病和關節炎。此外，死亡風險與肥胖直接相關，以使得例如身體質量指數超過40導致預期壽命平均降低超過10年。
當前藥理學治療形式包括靶向多種受體類別(例如CB1、5-HT2C和NPY)的食慾抑制劑；下丘腦中的食慾迴路調節劑和胃飢餓素的分子作用；和靶向脂酶的營養吸收抑制劑。不幸地，當前形式中尚無一者顯示有效治療肥胖，而不引起有害作用，所述有害作用中的一些可能非常嚴重。
高血糖水平刺激胰腺β細胞分泌胰島素。胰島素進而刺激葡萄糖進入肌肉和脂肪細胞，從而導致糖原和甘油三酯的儲存和蛋白質的合成。各種細胞類型上胰島素受體的活化通過增加葡萄糖攝取和利用以及通過降低肝葡萄糖輸出來降低循環葡萄糖水平。此調控網路內的破環可導致糖尿病和相關病理性症候群，其影響大的且日益增大百分比的人群體。
患有葡萄糖代謝病症的患者可能患有高血糖、高胰島素血症和/或葡萄糖不耐症。往往與葡萄糖和/或胰島素水平異常相關的病症的實例是胰島素抗性，其中肝臟細胞、脂肪細胞和肌細胞喪失其對正常血液胰島素水平作出反應的能力。
鑑於肥胖症、糖尿病和相關代謝病症和非代謝病症的發病率和嚴重性，調節例如食慾、葡萄糖和/或胰島素水平和增強患者中對波動的葡萄糖水平的生物反應的治療形式仍受到關注。
已將野生型GDF15(還稱為MIC-1(巨噬細胞抑制性細胞因子-1))與體重調節相聯繫(Tsai VW等人,PLoS One 2013；8(2):e55174；US8,192,735)。
概述
提供用於治療代謝病症的修飾的GDF15多肽。修飾的GDF15多肽可存在於複合物中。本公開的複合物可包含兩種GDF15多肽。
在某些情況下，本發明的複合物包含：包含IgG Fc序列的第一多肽，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；和包含IgG Fc序列的第二多肽，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列，其中所述第一多肽與所述第二多肽經由將所述第一多肽的突起安置於所述第二多肽的空腔中而二聚化，且其中所述第一多肽的C末端或所述第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端。
在某些情況下，本發明的複合物包含第一異二聚體和第二異二聚體，所述第一異二聚體和所述第二異二聚體各自包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；且所述第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中所述第一多肽與所述第二多肽經由將所述第一多肽的突起安置於所述第二多肽的空腔中而二聚化，其中所述第一多肽的C末端或所述第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端，且其中所述第一異二聚體中的GDF15突變蛋白與所述第二異二聚體中的GDF15突變蛋白二聚化，從而形成包含所述第一異二聚體和所述第二異二聚體的複合物。
在示例性實施方案中，所述第一多肽的C末端可綴合至GDF15突變蛋白的N末端。在其他情況下，所述第二多肽的C末端可綴合至GDF15突變蛋白的N末端。
本文還涵蓋一種包含IgG Fc序列的第一多肽，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列，其中所述第一多肽與第二多肽二聚化，所述第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；和包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白，其中所述第一多肽的C末端綴合至GDF15突變蛋白的N末端。所述第一多肽可存在於還可包含第二多肽的複合物中。
本文還公開一種包含IgG Fc序列的第一多肽，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列，其中所述第一多肽與第二多肽二聚化，所述第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；和包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白，其中所述第一多肽的C末端綴合至GDF15突變蛋白的N末端。所述第一多肽可存在於還可包含第二多肽的複合物中。
在某些情況下，所述複合物中的GDF15突變蛋白可包含與野生型GDF15的胺基酸序列(SEQ ID NO:1)至少90％相同的連續胺基酸序列。例如，GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中相應胺基酸的產生N連接的糖基化共有位點的至少一個取代，例如所述取代可以是D5T或D5S。在其他情況下，所述取代可以是R21N。
在示例性情況下，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的產生N連接的糖基化共有位點的以下多對取代中的至少一者：R16N和H18T/S；S23N和E25T/S；L24N和D26T/S；S50N和F52T/S；F52N和A54T/S；Q51N和R53T/S；R53N和A55T/S；S64N和H66T/S；L65N和R67T/S；S82N和N84T/S；K91N和D93T/S；D93N和G95T/S；T94N和V96T/S；V96N和L98T/S；S97N和Q99T/S；以及A106N和D108T/S。
在示例性情況下，GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的產生N連接的糖基化共有位點的以下多對取代中的至少一者：R16N和H18T；S23N和E25T；L24N和D26T；S50N和F52T；F52N和A54T；Q51N和R53T；R53N和A55T；S64N和H66T；L65N和R67T；S82N和N84T；K91N和D93T；D93N和G95T；T94N和V96T；V96N和L98T；S97N和Q99T；以及A106N和D108T。
在一些情況下，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的產生N連接的糖基化共有位點的以下多對取代中的至少一者：R16N和H18S；S23N和E25S；L24N和D26S；S50N和F52S；F52N和A54S；Q51N和R53S；R53N和A55S；S64N和H66S；L65N和R67S；S82N和N84S；K91N和D93S；D93N和G95S；T94N和V96S；V96N和L98S；S97N和Q99S；以及A106N和D108S。
在某些實施方案中，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：S23N和E25T/S；R53N和A55T/S；S64N和H66T/S；K91N和D93T/S；D93N和G95T/S；S97N和Q99T/S；以及A106N和D108T/S。
在某些實施方案中，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：S23N和E25T；R53N和A55T；S64N和H66T；K91N和D93T；D93N和G95T；S97N和Q99T；以及A106N和D108S。
在某些實施方案中，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：S23N和E25S；R53N和A55S；S64N和H66S；K91N和D93S；D93N和G95S；S97N和Q99S；以及A106N和D108S。
在某些實施方案中，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：S64N和H66T/S；K91N和D93T/S；D93N和G95T/S；以及S97N和Q99T/S。例如，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：S64N和H66T；K91N和D93T；D93N和G95T；以及S97N和Q99T；或S64N和H66S；K91N和D93S；D93N和G95S；以及S97N和Q99S。
在其他實施方案中，所述GDF15突變蛋白可包含SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：K91N和D93T或D93S；以及D93N和G95T或G95S。
在其他實施方案中，所述複合物中的GDF15突變蛋白可包含可為至少98個胺基酸長且可與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少90％相同的連續胺基酸序列，其中所述GDF15突變蛋白的C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在其他實施方案中，連續胺基酸序列可以是至少98個胺基酸長且可與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少95％相同，其中所述GDF15突變蛋白的C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
存在於本文所公開的複合物中的示例性GDF15突變蛋白包含至少98個胺基酸長、與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少90％相同且相對於SEQ ID NO:1具有胺基酸缺失的連續胺基酸序列。例如，多肽可相對於SEQ ID NO:1具有N末端截短。所述N末端截短相對於SEQ ID NO:1可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸，例如1-14個胺基酸、2-14個胺基酸、3-14個胺基酸、2-3個胺基酸、3-5個胺基酸或4-6個胺基酸。
本文所公開的示例性複合物包含GDF15突變蛋白，所述GDF15突變蛋白包含至少98個胺基酸長且與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少95％相同的連續胺基酸序列，其中多肽的C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在某些情況下，GDF15突變蛋白中的連續胺基酸序列是至少98個胺基酸長且不包含對應於存在於SEQ ID NO:1的N末端的第一個胺基酸的第一個胺基酸，其中C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在某些情況下，所述GDF15突變蛋白中的連續胺基酸序列是至少98個胺基酸長且不包含對應於存在於SEQ ID NO:1的N末端之前兩個胺基酸之前兩個胺基酸，其中C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在某些情況下，所述連續胺基酸序列是至少98個胺基酸長且不包含對應於存在於SEQ ID NO:1的N末端之前三個胺基酸之前三個胺基酸，其中C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在某些情況下，所述連續胺基酸序列是至少98個胺基酸長且不包含對應於存在於SEQ ID NO:1的N末端之前六個胺基酸之前六個胺基酸，其中C末端胺基酸對應於SEQ ID NO:1中位置112處的異亮氨酸。
在某些情況下，所述連續胺基酸序列是至少98個胺基酸長且不包含對應於存在於SEQ ID NO:1的N末端之前十四個胺基酸之前十四個胺基酸。
在某些情況下，所述第一多肽(例如Fc-鈕)或第二多肽(例如Fc-孔)的C末端經由接頭綴合至GDF15突變蛋白的N末端。示例性接頭包括序列(G4S)n，其中n＝1-10，例如1-5或2-5，例如2、3、4或5。
在某些情況下，IgG Fc包含與SEQ ID NO:2(人IgG1Fc序列)中的胺基酸序列至少90％相同的連續胺基酸序列。工程化的突起可包含人IgG1Fc序列中的相應胺基酸的至少一個取代，其中根據EU編號，所述取代位於選自由以下組成的組的位置處：胺基酸殘基347、366和394。例如，根據EU編號，所述至少一個取代選自由以下組成的組：Q347W/Y、T366W/Y和T394W/Y。
在某些情況下，工程化的空腔包含人IgG1Fc序列中的相應胺基酸的至少一個取代，其中根據EU編號，所述取代位於選自由以下組成的組的位置處：胺基酸殘基366、368、394、405和407。例如，根據EU編號，所述至少一個取代選自由以下組成的組：T366S、L368A、T394S、F405T/V/A和Y407T/V/A。
在某些情況下，根據EU編號，突起可包含取代T366W/Y且空腔可包含取代T366S、L368A和Y407T/V/A。
例如，根據EU編號，突起可包含取代T366W/Y且空腔可包含取代Y407T/V/A。在其他情況下，根據EU編號，突起可包含取代T366Y且空腔可包含取代Y407T。在其他實例中，根據EU編號，突起可包含取代T366W且空腔可包含取代Y407A。在其他實例中，根據EU編號，突起可包含取代T394Y且空腔可包含取代Y407T。
在某些實施方案中，所述第一多肽和第二多肽的IgG Fc序列可各自包含鉸鏈區，所述鉸鏈區在所述第一多肽與所述第二多肽之間形成至少一個二硫鍵。在某些實施方案中，所述第一多肽和第二多肽的IgG Fc序列可各自包含鉸鏈區、CH2區和CH3區，其中所述鉸鏈區在所述第一多肽與所述第二多肽之間形成至少一個二硫鍵。
本文還提供一種編碼以上所描述的第一多肽和第二多肽的核酸分子。所述核酸分子可可操作地連接至使得編碼所述多肽的核酸分子在體外或體內表達的表達控制元件。還涵蓋一種包含核酸分子的載體。所述載體可以是病毒載體。在某些情況下，提供一種編碼所述第一多肽的第一核酸和一種編碼所述第二多肽的第二核酸。核酸各自可操作地連接至使得所述第一多肽和第二多肽分別由第一核酸和第二核酸表達的表達控制元件。還公開一種包含所述第一核酸的第一載體和一種包含所述第二核酸的第二載體。如在此所提及，所述載體可以是病毒載體。
一些實施方案包括表達以上所提及的多肽中的一者或多者的轉化宿主細胞。例如，提供一種包含所述第一核酸和第二核酸的宿主細胞。所述宿主細胞表達所述第一多肽和所述第二多肽。
在本公開的特定實施方案中，將以上所提及的複合物中的一者或多者進行配製以產生藥物組合物，其中所述組合物還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。在某些實施方案中，藥物組合物還包含至少一種另外的預防劑或治療劑。
還提供一種以上所提及的用於治療或預防受試者的體重病症；用於治療或預防受試者的葡萄糖代謝病症的複合物中的一種或多種的組合物(例如藥物組合物)。所述組合物可包含有效治療或預防受試者的體重病症的量的複合物。所述組合物可包含有效治療或預防受試者的葡萄糖代謝病症的量的複合物。
本公開的其他實施方案包含一種特異性地結合至以上所提及的第一多肽或第二多肽中的一者的抗體。
此外，本公開涵蓋包含與至少一種藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑一起配製的如以上所描述的抗體的藥物組合物。此類藥物組合物還可含有至少一種另外的預防劑或治療劑。
本發明的某些實施方案涵蓋一種含有以上所提及的藥物組合物和任選的一種或多種另外組分的無菌容器。例如(但不限於)，無菌容器可以是注射器。在其他實施方案中，無菌容器是試劑盒的一個部件；所述試劑盒還可含有例如含有至少一種預防劑或治療劑的第二無菌容器。
本文還公開一種製備以上所提及的多肽和複合物的方法。所述方法可包括培養表達所述多肽的宿主細胞；和分離包含所表達的多肽的複合物。
本公開還涵蓋一種通過向受試者施用治療有效量的以上所提及的複合物來治療或預防受試者(例如人)的葡萄糖代謝病症的方法。在一些方法中，治療或預防使得受試者的血糖減少、受試者的血漿胰島素減少、體重減輕和/或食物攝入減少或受試者的葡萄糖耐受性增加。在特定實施方案中，葡萄糖代謝病症是糖尿病。
還公開一種治療或預防受試者的體重病症的方法。所述方法可包括向所述受試者施用本發明的複合物，其中所述複合物以有效治療或預防所述受試者的體重病症的量施用。在一些方法中，治療或預防使得所述受試者的體重減輕和/或食物攝入減少。
在一些實施方案中，受試者是肥胖的和/或具有體重病症。
雖然不限於任何特定施用途徑或給藥方案，但在一些實施方案中施用通過胃腸外(例如皮下)注射來進行。
附圖簡述
圖1描繪(Fc/Fc)-GDF15分子的異二聚體的同二聚複合物的卡通示意圖，其中Fc/Fc多肽是鈕入孔Fc對(A-F)，以及GDF15分子上用於增強異二聚體的同二聚複合物的表達和組裝的N-連接聚糖併入(E,F)。
圖2A描繪因工程化的(Fc/Fc)-GDF15複合物的Expi 293F瞬時表達產生的回收率。回收率如下：(0＝聚集體/無表達、100mg/L)。在(Fc/Fc)-GDF15中在GDF15序列上添加N-連接聚糖在純化之後提供總回收率的顯著增加。圖2B提供因不綴合至Fc的野生型GDF15和GDF15糖基化突變體(糖突變蛋白)的Expi 293F瞬時表達產生的回收率。
圖3描繪在膳食誘導肥胖(DIO)小鼠模型中在每周一次皮下遞送0.4nmol/kg的(Fc/Fc)-GDF15複合物持續4周，接著以14天恢復期後的體重減輕。B13a/B13b變體與B9a/B9b和B11a/B11b變體相比具有顯著改善的功效。
圖4描繪在DIO小鼠模型中在每周一次皮下遞送0.4nmol/kg的(Fc/Fc)-GDF15複合物持續4周，接著以14天恢復期後的體重減輕百分比。在給藥後恢復14天之後，B13a/B13b變體的減去媒介物的體重變化％大於20％。
圖5描繪在DIO小鼠模型中在每周一次皮下遞送4.0nmol/kg的(Fc/Fc)-GDF15複合物持續4周，接著以14天恢復期後的體重減輕。
圖6描繪在DIO小鼠模型中在每周一次皮下遞送4.0nmol/kg的(Fc/Fc)-GDF15複合物持續4周，接著以14天恢復期後的體重減輕百分比。
圖7和8概述所觀察到的圖3和5中所描繪的0.4nmol/kg和4.0nmol/kg劑量組的各組DIO小鼠(n＝6)的體重降低(包括SEM和p值)。對於所有組，經由未配對t檢驗(*＝p<0.05，**＝p<0.01且***＝p<0.001)。
圖9概述圖4和6中所描繪的0.4nmol/kg和4.0nmol/kg劑量組的各組DIO小鼠(n＝6)的體重降低百分比(包括SEM和p值)。對於所有組，經由未配對t檢驗(*＝p<0.05，**＝p<0.01且***＝p<0.001)。
詳述
在進一步描述本公開的方法和組合物之前，應了解本公開不限於本文所闡述的特定實施方案，且還應了解本文所用術語僅出於描述特定實施方案的目的，且不旨在具限制性。
在提供數值範圍的情況下，應了解在所述範圍的上限與下限之間的各中間值(除非上下文另外明確規定，否則以下限單位的十分之一為間隔)和任何其他所陳述值或在所述所陳述範圍內的中間值涵蓋於本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括於所述較小範圍內，且還涵蓋於本發明內，受所陳述範圍內任何具體排除的限制的限制。在所陳述範圍包括一個或兩個限制的情況下，排除那些被包括的限制中的任一者或兩者的範圍也包括在本發明中。除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。
必須指出，除非上下文另外明確規定，否則如本文和所述權利要求中所用，單數形式「一個(種)(a/an)」和「所述」包括複數指示物。因此，例如，提及「複合物」包括提及一種或多種複合物等。應進一步指出，權利要求可撰寫成排除任何任選的要素。因此，此陳述旨在充當結合對權利要求要素的引述使用諸如「僅僅」、「僅」等的此類排他性術語或使用「負」限制之前提基礎。
本文所論述的出版物僅僅由於其公開內容在本申請提交日期之前而提供。不應將本文中的任何內容理解為承認本發明由於先前發明而無權先於此類出版物。另外，所提供的出版日期可不同於可能需要單獨證實的實際出版日期。
定義
在本文中可互換使用的術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」是指任何長度的聚合形式的胺基酸，其可包括遺傳編碼和非遺傳編碼胺基酸、化學或生物化學修飾或衍生胺基酸和具有修飾的多肽主鏈的多肽。所述術語包括融合蛋白，包括但不限於具有或不具有N末端甲硫氨酸殘基的與異源胺基酸序列的融合蛋白、與異源和同源前導序列的融合蛋白；免疫標記蛋白等。在特定實施方案中，所述術語是指具有任何長度的聚合形式的胺基酸，其包括遺傳編碼胺基酸。在特定實施方案中，所述術語是指具有任何長度的聚合形式的胺基酸，其包括融合至異源胺基酸序列的遺傳編碼胺基酸。在特定實施方案中，所述術語是指長度為98-112個胺基酸的胺基酸，其任選地融合至異源序列。在特定實施方案中，在適當時，當提及本文所公開並描述的蛋白質和分子時，術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」是指如本文所定義的多肽。
如本文所用的術語「複合物」是指包含至少兩種多肽的蛋白質複合物，所述多肽各自包含N末端和C末端。所述至少兩種多肽可經由共價和非共價相互作用(例如，靜電、π作用、範德華力和疏水作用)中的一者或兩者彼此締合。所述至少兩種多肽可相同，即具有相同胺基酸序列；或可不同，即不具有相同胺基酸序列。在兩種多肽相同的情況下，具有兩種多肽的複合物稱為同二聚體。在多肽不同的情況下，具有兩種多肽的複合物稱為異二聚體。在三種多肽相同的情況下，具有三種多肽的複合物稱為同三聚體。在三種多肽中的至少一者不同於其他多肽的情況下，具有三種多肽的複合物稱為異三聚體。在四種多肽相同的情況下，具有四種多肽的複合物稱為同四聚體。在四種多肽中的至少一者不同於其他多肽的情況下，具有四種多肽的複合物稱為異四聚體。在第一多肽與第二多肽二聚化以形成異二聚體且兩種此類異二聚體二聚化以形成複合物的四種多肽(兩個第一多肽分子和兩個第二多肽分子)的示例性複合物可稱為兩種異二聚體的同二聚複合物。
本公開涵蓋如上文所定義的複合物，包括但不限於具有與第二多肽締合的第一多肽的異二聚體，其中所述第一多肽是「鈕」Fc且第二多肽是「孔」Fc，且其中第一多肽或第二多肽融合至GDF15(或GDF15突變蛋白，諸如本文所描述的GDF15突變蛋白)胺基酸序列。所述第一多肽和第二多肽可經由非共價相互作用(例如疏水作用，諸如Fc的鈕區與孔區之間的疏水性相互作用)、共價鍵(例如二硫鍵，諸如第一多肽和第二多肽中Fc的鉸鏈區之間的一個或兩個或更多個二硫鍵)或兩者彼此物理締合。
本公開還涵蓋包含兩種彼此締合的異二聚體的複合物，各異二聚體具有第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是「鈕」Fc且第二多肽是「孔」Fc，且其中第一多肽或第二多肽融合至GDF15(或GDF15突變蛋白)胺基酸序列。在複合物內，兩種異二聚體可通過非共價相互作用(例如疏水作用)、共價鍵(例如二硫鍵)或兩者物理締合。複合物中各個異二聚體中的第一多肽和第二多肽可通過非共價相互作用(例如疏水作用)、共價鍵(例如二硫鍵)或兩者彼此物理締合。
本公開還涵蓋包含兩種彼此締合的異二聚體的複合物，各異二聚體具有第一多肽和第二多肽，其中第一多肽是「鈕」Fc且第二多肽為「孔」Fc，且其中第一多肽或第二多肽融合至GDF15(或GDF15突變蛋白)胺基酸序列。在複合物內，兩種異二聚體可通過GDF15多肽之間的非共價相互作用(例如疏水作用)或共價相互作用(例如二硫鍵)物理締合，且各個異二聚體中的第一多肽和第二多肽可通過非共價相互作用(例如鈕入孔)、共價鍵(例如二硫鍵)或兩者彼此物理締合。
術語「患者」或「受試者」可互換地用於指人或非人動物(例如哺乳動物)。
術語「治療(treat)」、「治療(treating)」、「治療(treatment)」等是指在已診斷、觀察和其類似方式得出疾病、病症或病狀或其症狀之後開始的行為過程(諸如施用藥劑，例如多肽、複合物或包含多肽、複合物的藥物組合物)，以暫時或永久地消除、減輕、抑制、緩和或緩解折磨受試者的疾病、病症或病狀的潛在病因中的至少一種或與折磨受試者的疾病、病症、病狀相關的症狀中的至少一種。因此，治療包括抑制(即阻止疾病、病症或病狀或與其相關的臨床症狀發生或進一步發展)活性疾病(例如從而降低在血流中胰島素和/或葡萄糖的水平、以增加葡萄糖耐受性，從而使葡萄糖水平的波動減至最小和/或從而防止產生由葡萄糖穩態破壞引起的疾病、降低體重、抑制體重增加)。
如本文所用的術語「需要治療」是指由醫師或其他照護者作出的受試者需要或將受益於治療的判斷。此判斷是基於醫師或照護者的專長領域中的多種因素來進行。
術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」、「預防(prevention)」等是指通常在傾向於具有特定疾病、病症或病狀的受試者的情形下，以一定方式(例如在疾病、病症、病狀或其症狀發作之前)開始以暫時或永久地預防、壓制、抑制或降低受試者發生疾病、病症、病狀或其類似者的風險(如通過例如不存在臨床症狀來確定)或延遲其發作的行為過程(諸如施用藥劑，例如多肽、複合物或包含多肽、複合物的藥物組合物)。在某些情況下，所述術語還指減緩疾病、病症或病狀的進展或抑制其發展成有害的或以其他方式不需要的病況。
如本文所用的術語「需要預防」是指由醫師或其他照護者作出的受試者需要或將受益於預防性照護的判斷。此判斷是基於醫師或照護者的專長領域中的多種因素來進行。
短語「治療有效量」是指單獨或作為藥物組合物的一部分且以單次劑量或作為一系列劑量的一部分，以當向患者施用時能夠對疾病、病症或病狀的任何症狀、方面或特徵具有任何可檢測、積極作用的量向受試者施用藥劑。治療有效量可通過測量相關生理作用來確定。例如，在高血糖病狀的情況下，血糖的降低或減少或葡萄糖耐受性測試中的改善可用於確定藥劑的量是否有效治療高血糖病狀。例如，治療有效量是足以減少或降低任何水平(例如，基線水平)的空腹血糖(FPG)的量，其中例如所述量足以使大於200mg/dl的FPG水平降至小於200mg/dl，其中所述量足以使175mg/dl與200mg/dl之間的FPG水平降至小於起始水平，其中所述量足以使150mg/dl與175mg/dl之間的FPG水平降至小於起始水平，其中所述量足以使125mg/dl與150mg/dl之間的FPG水平降至小於起始水平等(例如使FPG水平降至小於125mg/dl、小於120mg/dl、小於115mg/dl、小於110mg/dl等)。在HbA1c水平的情況下，有效量是足以使水平減少或降低超過約10％至9％、超過約9％至8％、超過約8％至7％、超過約7％至6％、超過約6％至5％等的量。更具體地說，本公開涵蓋HbA1c水平減少或降低約0.1％、0.25％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、33％、35％、40％、45％、50％或更多。治療有效量可結合給藥方案和對受試者的病狀的診斷分析等進行調節。
短語「以足以實現改變的量」意指在施用特定治療之前(例如基線水平)與之後測量的指示物水平之間存在可檢測差異。指示物包括任何客觀參數(例如葡萄糖或胰島素的水平或食物攝入或體重)或主觀參數(例如受試者的幸福感或食慾)。
如本文所用的短語「葡萄糖耐受性」是指當葡萄糖攝入波動時，受試者控制血糖和/或血漿胰島素含量的能力。例如，葡萄糖耐受性涵蓋受試者在約120分鐘內使血糖水平降回在攝入葡萄糖之前所測定的水平的能力。
術語「糖尿病」和「糖尿病的」是指經常以高血糖和糖尿為特徵的涉及胰島素不充分產生或利用的碳水化合物代謝的進行性疾病。術語「糖尿病前期」和「糖尿病前期的」是指受試者不具有典型地在糖尿病中所觀察到的特徵、症狀等但具有若不進行治療則可能發展成糖尿病的特徵、症狀等的病況。這些病狀的存在可使用例如空腹血糖(FPG)測試或口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)來確定。兩者通常需要受試者在開始測試之前空腹至少8小時。在FPG測試中，在空腹結束之後測量受試者的血糖；一般而言，受試者空腹過夜且在早上受試者進食之前測量血糖。健康受試者的FPG濃度通常將在約90與約100mg/dl之間，「糖尿病前期」受試者的FPG濃度通常將在約100與約125mg/dl之間，而「糖尿病」受試者的FPG含量通常將高於約126mg/dl。在OGTT中，在空腹之後測量受試者的血糖，且在飲用富含葡萄糖的飲料之後兩小時再次測量。消耗富含葡萄糖的飲料之後兩小時，健康受試者的血糖濃度通常低於約140mg/dl，糖尿病前期受試者的血糖濃度通常是約140至約199mg/dl，而糖尿病受試者的血糖濃度通常是約200mg/dl或高於200mg/dl。雖然以上提及的血糖值有關人受試者，但在鼠受試者中正常血糖、中度高血糖和明顯高血糖按比例不同。在四小時空腹之後，健康鼠受試者的FPG濃度通常將在約100與約150mg/dl之間，「糖尿病前期」鼠受試者的FPG濃度通常將在約175與約250mg/dl之間，而「糖尿病」鼠受試者的FPG濃度通常將高於約250mg/dl。
如本文所用的術語「胰島素抗性」是指正常量的胰島素不能產生正常生理或分子反應的病狀。在一些情況下，內源性產生或外源性施用的超生理量的胰島素能夠完全或部分克服胰島素抗性且產生生物反應。
術語「代謝症候群」是指包括但不限於以下特性的相關群集：高胰島素血症、葡萄糖耐受性異常、肥胖症、脂肪再分配至腹部或上身部分、高血壓、纖維蛋白溶解異常和血脂異常，其以高甘油三酯、低高密度脂蛋白(HDL)-膽固醇和高小而密的低密度脂蛋白(LDL)粒子為特徵。具有代謝症候群的受試者處於發展2型糖尿病和/或其他病症(例如動脈粥樣硬化)的危險的中。
短語「葡萄糖代謝病症」涵蓋以與受試者中相對於健康個體葡萄糖水平增加和/或胰島素水平增加相關的臨床症狀或臨床症狀組合為特徵的任何病症。葡萄糖和/或胰島素水平增加可表現於以下疾病、病症和病狀中：高血糖症、II型糖尿病、妊娠期糖尿病、I型糖尿病、胰島素抗性、葡萄糖耐受性受損、高胰島素血症、葡萄糖代謝受損、糖尿病前期、其他代謝病症(諸如代謝症候群，其還稱為症候群X)和肥胖症等。本公開的複合物及其組合物可用於例如實現和/或維持葡萄糖穩態，例如使血流中的葡萄糖水平降低和/或使胰島素水平降低至在健康受試者中所發現的範圍。
如本文所用的術語「高血糖症」是指相對於健康受試者，升高量的葡萄糖在受試者的血漿中循環的病狀。高血糖症可使用本領域中已知的方法診斷，包括如本文所描述測量空腹血糖水平。
如本文所用的術語「高胰島素血症」是指當伴隨著血糖水平增加或者正常時，存在升高水平的循環胰島素的病狀。高胰島素血症可由與以下相關的胰島素抗性引起：血脂異常，諸如高甘油三酯、高膽固醇、高低密度脂蛋白(LDL)和低高密度脂蛋白(HDL)；高尿酸水平；多囊性卵巢症候群；II型糖尿病和肥胖症。在血漿胰島素水平高於約2μU/mL時診斷為高胰島素血症。
如本文所用，短語「體重病症」是指與過高體重和/或增強的食慾相關的病狀。各種參數用於確定受試者與參考健康受試者相比是否過重，包括受試者的年齡、身高、性別和健康狀態。例如，可通過評估受試者的身體質量指數(BMI)來考慮受試者過重或肥胖，身體質量指數通過受試者的體重(千克)除以受試者的身高(米)的平方來計算。BMI在約18.5至約24.9kg/m2範圍內的成人視為具有正常重量；BMI在約25與約29.9kg/m2之間的成人可視為過重(肥胖前期)；且BMI為約30kg/m2或更高的成人可視為肥胖。增強的食慾經常促成過高體重。存在若干與增強的食慾相關的病狀，包括例如夜間進食症候群，其特徵在於往往與失眠相關的早上厭食和晚上貪食，但其可與下丘腦損傷有關。
術語「活化劑」是指例如刺激、增加、活化、促進、增強活化、敏化或上調一種或多種藥劑(例如用於治療或預防代謝病症的多肽或複合物)的功能或活性的試劑。此外，活化劑包括通過與本發明的多肽相同的作用機制起作用(即以類似於多肽的方式調節與多肽相同的信號傳導途徑的試劑)且能夠引發類似於(或大於)多肽的生物反應的試劑。活化劑的實例包括激動劑，諸如小分子化合物。
術語「調節劑」統指本發明的多肽和活化劑。
術語「調節(modulate)」、「調節(modulation)」等是指試劑(例如活化劑)直接或間接增加一種或多種多肽(或編碼其的核酸分子)的功能或活性的能力；或試劑產生類似於一種或多種多肽的作用的能力。
應了解，在本公開通篇中根據單字母或三字母代碼提及胺基酸。為了讀者的方便，以下提供單字母和三字母胺基酸代碼：
如本文所用，術語「變體」涵蓋天然存在的變體(例如同源物和等位基因變體)和非天然存在的變體(例如，重組修飾的)。天然存在的變體包括同源物，即自一種物種至另一物種，分別在核苷酸或胺基酸序列方面不同的核酸和多肽。天然存在的變體包括等位基因變體，即在一種物種內自一個個體至另一個體，分別在核苷酸或胺基酸序列方面不同的核酸和多肽。非天然存在的變體包括分別在核苷酸或胺基酸序列中包含變化的核酸和多肽，其中序列變化是人工引入的，例如變化在實驗室或其他設備中通過人的幹預(「人的手」)而產生。
關於GDF15的術語「天然」或「野生型」是指生物活性的天然存在的GDF15，包括生物活性的天然存在GDF15變體。所述術語包括112胺基酸人GDF15成熟序列(SEQ ID NO:1)。
如本文所用的術語「突變蛋白」廣義上是指重組蛋白，即在胺基酸序列中包含人工引入的變化(例如胺基酸序列中的在實驗室或其他設備中通過人的幹預(「人的手」)產生的變化)的多肽。這些多肽通常攜帶單個或多個胺基酸取代或缺失，且經常衍生自已經歷定點或隨機誘變的克隆基因或完全合成的基因。因此，本發明的「GDF15突變蛋白」涵蓋例如相對於參考多肽(例如相對於天然/野生型成熟人GDF15(SEQ ID NO:1))的胺基酸取代和/或胺基酸缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14或更多個胺基酸的N末端截短)。
如本文關於天然人GDF15或GDF15突變蛋白所用，術語「修飾的」、「修飾」等是指改變人GDF15、天然存在的GDF15變體或GDF15突變蛋白的性質的一種或多種變化，其中所述變化不改變GDF15多肽(天然或突變蛋白)本身的一級胺基酸序列。此類性質包括例如溶解度、循環半衰期、穩定性、清除率、免疫原性或致敏性和可製造性(例如成本和效率)。「修飾」包括不改變GDF15多肽(天然或突變蛋白)本身的一級胺基酸序列的共價化學修飾。可對人GDF15、天然存在的GDF15變體或GDF15突變蛋白進行的變化包括但不限於以下中的一種或多種：聚乙二醇化(共價連接一個或多個聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物)；糖基化(例如N-糖基化)、聚唾液酸化和羥乙基澱粉化(hesylation)；麥芽糖結合蛋白融合；白蛋白融合(例如HSA融合)；通過例如綴合脂肪酸鏈(醯化作用)進行的白蛋白結合；Fc-融合；以及與PEG模擬物融合。一些特定實施方案需要涉及融合至Fc的修飾，而其他特定修飾需要涉及糖基化的修飾，或其組合。
術語「DNA」、「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」等在本文中可互換地用於指任何長度的聚合形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸的非限制性實例包括線性和環狀核酸、信使RNA(mRNA)、互補DNA(cDNA)、重組多核苷酸、載體、探針、引物等。
術語「探針」是指DNA或RNA中對應於目標基因或序列的片段，其中所述片段已進行放射性標記(例如通過併入32P或35S)或以另外一些可檢測分子(諸如生物素、地高辛(digoxygenin)或螢光素)標記。在具有互補序列的數段DNA或RNA將雜交時，可使用探針來例如標記病毒斑、細菌菌落或凝膠上含有目標基因的條帶。探針可以是克隆DNA或其可以是合成的DNA鏈；後者可用於如下自分離蛋白質獲得cDNA或基因組克隆：通過例如對蛋白質的一部分進行微測序，合成攜帶所述序列的寡核苷酸，放射性標記所述序列且使用其作為探針來篩選cDNA庫或基因組庫。
術語「異源」是指兩種組分根據結構定義為衍生自不同來源。例如，在多肽的背景下，「異源」多肽可包括衍生自不同多肽的可操作地連接的胺基酸序列(例如第一組分包含重組多肽，且第二組分衍生自天然GDF15多肽)。類似地，在編碼嵌合多肽的多核苷酸的背景下，「異源」多核苷酸可包括可衍生自不同基因的可操作地連接的核酸序列(例如第一組分來自編碼根據本文所公開的一個實施方案的多肽的核酸，且第二組分來自編碼載體多肽的核酸)。其他示例性「異源」核酸包括包含編碼序列的核酸可操作地連接至來自不同於編碼序列的基因來源的調控元件(例如啟動子)的表達構建體(例如用於提供在可具有不同於啟動子、編碼序列或兩者的基因來源的目標宿主細胞中的表達)。例如，可操作地連接至編碼GDF15多肽或其結構域的多核苷酸的T7啟動子被稱為是異源核酸。在重組細胞的背景下，「異源」可指存在具有不同於其所在的宿主細胞的基因來源的核酸(或基因產物，諸如多肽)。
術語「可操作地連接」是指分子之間為提供所需功能而連接。例如，在核酸的背景下，「可操作地連接」是指核酸序列之間的功能性連接。舉例而言，核酸表達控制序列(諸如啟動子、信號序列或轉錄因子結合位點陣列)可可操作地連接至第二多核苷酸，其中表達控制序列影響第二多核苷酸的轉錄和/或翻譯。在多肽的背景下，「可操作地連接」是指胺基酸序列(例如不同結構域)之間為提供所描述多肽活性的功能性鍵聯。
如本文所用，在多肽結構的背景下，「N末端」(或「氨基末端」)和「C末端」(或「羧基末端」)分別指多肽的最遠氨基和羧基端，而術語「N末端的」和「C末端的」是指多肽的胺基酸序列中分別相對於N末端和C末端的位置，且分別可包括N末端和C末端的殘基。「緊接著N末端」或「緊接著C末端」是指相對於第二胺基酸殘基的第一胺基酸殘基的位置，其中所述第一和第二胺基酸殘基共價結合以提供連續胺基酸序列。
在胺基酸序列或多核苷酸序列(例如「衍生自」GDF15多肽的胺基酸序列)的背景下，「衍生自」意在指示多肽或核酸具有基於參考多肽或核酸(例如天然存在的GDF15多肽或GDF15編碼核酸)的序列，且不意在限制蛋白質或核酸的來源或製備方法。舉例而言，術語「衍生自」包括參考胺基酸或DNA序列的同源物或變體。
在多肽的背景下，術語「分離」是指若目標多肽是天然存在的，則其處於不同於其可天然存在的環境中。「分離」意在包括實質上富集目標多肽和/或其中目標多肽部分或實質上純化的樣品內的多肽。在多肽並非天然存在的情況下，「分離」指示多肽已自其通過合成或重組手段製備的環境中分離。
「富集」意指樣品以非天然方式加以操縱(例如在實驗室中，例如由科學工作者或臨床醫師進行)，以使得目標多肽按以下濃度存在：a)與起始樣品(諸如生物樣品，例如多肽天然存在或多肽在施用之後存在的樣品)中的多肽濃度相比較大(例如至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或大更多倍)的濃度，或b)大於製備多肽的環境(例如在細菌細胞中)的濃度。
「實質上純」指示組分(例如多肽、二聚體、四聚體、複合物)構成組合物總含量的大於約50％，且通常總多肽含量的大於約60％。更通常，「實質上純」是指總組合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多為目標組分的組合物。在一些情況下，所述組分將構成組合物總含量的大於約90％或大於約95％。
術語「抗體」(Ab)和「免疫球蛋白」(Ig)是指具有相同結構特徵的糖蛋白。雖然抗體對特定抗原展現結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體與缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子兩者。以下詳細描述抗體。
術語「單克隆抗體」是指獲自實質上同源抗體的群體的抗體，即包含所述群體的個別抗體為相同的，除了可以微小量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗體具高度特異性，其針對單一抗原位點。與多克隆抗體製劑相比之下，其可包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。
在抗體的背景下，術語「分離的」是指抗體已與其天然環境的汙染物組分分離和/或自其天然環境的汙染物組分中回收；此類汙染物組分包括可妨礙抗體的診斷性或治療性用途的物質，且可包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。
短語「保守胺基酸取代」是指以下組內的胺基酸殘基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；以及6)D、E。保守胺基酸取代可通過將蛋白質中的胺基酸用具有類似側鏈酸性、鹼性、電荷、極性或尺寸的側鏈的胺基酸置換來保留蛋白質活性。對取代、插入或缺失的指導可基於不同變體蛋白質或來自不同物種的蛋白質的胺基酸序列的比對來進行。
生長分化因子15(GDF15)
GDF15(還稱為MIC-1(巨噬細胞抑制細胞因子-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎盤骨形態發生蛋白)、NAG-1(非類固醇消炎藥(NSAID)活化基因)、TGF-PL和PTGFB)是轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員。GDF15(其被合成為62kDa細胞內前體蛋白形式，所述62kDa細胞內前體蛋白隨後由furin樣蛋白酶裂解)以25kDa二硫化物連接蛋白形式被分泌。(參見例如Fairlie等人,J.Leukoc.Biol 65:2-5(1999))。GDF15mRNA可見於包括肝、腎、胰腺、結腸和胎盤的若干組織中，且在諸如肝、腎、心臟和肺的器官損傷期間GDF15在肝中的表達可顯著上調。
GDF15前體是308個胺基酸的多肽(NCBI參考序列NP_004855.2)，其含有29個胺基酸的信號肽、167個胺基酸的前肽結構域和具有112個胺基酸的成熟結構域，所述成熟結構域由furin樣蛋白酶自前肽結構域切除。308-胺基酸GDF15多肽被稱為「全長」GDF15多肽；112-胺基酸GDF15多肽(「全長」GDF15的胺基酸197-308)是「成熟」GDF15多肽(SEQ ID NO:1)。除非另外指出，否則術語「GDF15」是指112個胺基酸的成熟人序列。此外，特定GDF15殘基的數字參考是指112個胺基酸的成熟序列(即殘基1是Ala(A)，且殘基112是Ile(I)；參見SEQ ID NO:1)。值得注意的是，雖然GDF15前體胺基酸序列預示三個切除位點，從而產生三種推定形式的「成熟」人GDF15(即110、112和115個胺基酸)，但是將112個胺基酸的成熟序列視為恰當的。
本公開的範圍包括來自包括以下的其他哺乳動物物種的GDF15直向同源物及其修飾形式和其用途：小鼠(NP_035949)、黑猩猩(XP_524157)、猩猩(XP_002828972)、恆河猴(EHH29815)、大熊貓(XP_002912774)、長臂猿(XP_003275874)、豚鼠(XP_003465238)、雪貂(AER98997)、奶牛(NP_001193227)、豬(NP_001167527)、狗(XP_541938)和鴨獺屬(鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)；AFV61279)。成熟形式的人GDF15與小鼠直向同源物具有約67％胺基酸相同性。
為了方便起見，此後所描述的修飾的人GDF15分子、GDF15變體(例如突變蛋白)和修飾的GDF15突變蛋白以下統稱為「多肽」。應注意，結合本公開的多肽和核酸分子對「人」的任何提及不意在限制獲得多肽或核酸的方式或其來源，而是僅參考所述序列，因為其可對應於天然存在的人多肽或核酸分子的序列。在特定實施方案中，修飾的人GDF15分子是N-糖基化二聚體。除人多肽和編碼其的核酸分子之外，本公開涵蓋來自其他物種的GDF15相關多肽和相應核酸分子。
A.具有所需物理性質的多肽
本公開部分地涵蓋包括與SEQ ID NO:1的胺基酸序列(成熟112個胺基酸長的人GDF15)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的連續胺基酸序列的多肽。所述多肽可相對於SEQ ID NO:1的胺基酸序列包含一個或多個胺基酸取代和/或缺失。在某些實施方案中，除胺基酸取代之外，本公開的多肽還可相對於SEQ ID NO:1的胺基酸序列包含胺基酸缺失。在一些實施方案中，本公開的多肽可相對於SEQ ID NO:1的胺基酸序列包含胺基酸缺失。
出於方便和清楚的目的，使用SEQ ID NO:1的胺基酸序列作為本文中所存在的多肽的參考序列。因此，胺基酸殘基位置在本文中參考SEQ ID NO:1進行編號。以下呈現SEQ ID NO:1的序列：
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
在一些實施方案中，本公開的多肽可包含一個、兩個、三個或更多個胺基酸取代、添加或缺失，從而在SEQ ID NO:1中不存在N連接的糖基化共有位點的位置處引入一個或多個N連接的糖基化共有位點。N連接的糖基化共有位點包括序列NXS/T，其中N是Asn；X是不同於脯氨酸的胺基酸；隨後是Ser(S)或Thr(T)。
本公開的多肽的實例包括在SEQ ID NO:1的胺基酸序列中不存在糖基化共有位點(例如N連接的糖基化共有位點)的胺基酸位置處具有一個、兩個、三個、四個或更多個糖基化共有位點的多肽。
在某些實施方案中，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含一個胺基酸取代，從而在取代位置處提供一個N連接的糖基化共有位點(例如SEQ ID NO:1中的NGD序列可通過一個取代變成NGT/S；取代位置加下劃線)。在其他情況下，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含兩個胺基酸取代，從而在取代位置處提供一個N連接的糖基化共有位點(例如SEQ ID NO:1中的KTD序列可通過兩個取代變成NTT/S；取代位置加下劃線)。在一些實施方案中，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含三個胺基酸取代，從而在取代位置處提供一個N連接的糖基化共有位點(例如SEQ ID NO:1中的GPG序列可通過三個取代變成NTT/S；取代位置加下劃線)。
在某些實施方案中，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含一個或多個胺基酸缺失，從而在缺失位置處提供N連接的糖基化共有位點。例如，SEQ ID NO:1中的NGDHCPLGPGRCCRLHT(SEQ ID NO:119)序列可通過缺失胺基酸D至H(加下劃線))而改變，從而提供N連接的糖基化共有位點：NGT。
在某些實施方案中，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含一個或多個胺基酸添加，從而在添加位置處提供N連接的糖基化共有位點。通過添加一個胺基酸引入N連接的糖基化共有位點的實例包括添加N至SEQ ID NO:1中的序列LHT中，從而產生序列LNHT，其中NHT是N連接的糖基化共有位點。
如上文所提及，多肽可相對於SEQ ID NO:1包含一個或多個取代且取代可如SEQ ID NO:1中相應胺基酸的位置進行編號。
在某些實施方案中，多肽可包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的連續胺基酸序列，其中所述連續胺基酸序列具有取代D5T/S或R21N。
在某些實施方案中，多肽可包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的連續胺基酸序列，其中所述連續胺基酸序列具有相對於SEQ ID NO:1中的相應胺基酸的以下多對取代中的至少一者：
i.R16N和H18T或R16N和H18S；
ii.S23N和E25T或S23N和E25S；
iii.L24N和D26T或L24N和D26S；
iv.S50N和F52T或S50N和F52S；
v.F52N和A54T或F52N和A54S；
vi.Q51N和R53T或Q51N和R53S；
vii.R53N和A55T或R53N和A55S；
viii.S64N和H66T或S64N和H66S；
ix.L65N和R67T或L65N和R67S；
x.S82N和N84T或S82N和N84S；
xi.K91N和D93T或K91N和D93S；
xii.D93N和G95T或D93N和G95S；
xiii.T94N和V96T或T94N和V96S；
xiv.V96N和L98T或V96N和L98S；
xv.S97N和Q99T或S97N和Q99S；和
xvi.A106N和D108T或A106N和D108S
例如，上述i)中的取代表示多肽在對應於SEQ ID NO:1中的胺基酸位置18的胺基酸位置處具有蘇氨酸(T)或絲氨酸(S)，其中在SEQ ID NO:1中組氨酸(H)存在於胺基酸位置18處。類似地，在位置5處D以T或S取代可由D5T/S表示。多肽中相對於SEQ ID NO:1的相應胺基酸的位置可通過比對胺基酸序列來確定。
在某些實施方案中，多肽可包含兩個胺基酸取代(一對取代)，其在SEQ ID NO:1中不存在N-糖基化共有序列的位置處提供單個N-糖基化共有序列。此類取代的實例包括R16N和H18T/S；K91N和D93T/S；T94N和V96T/S；以及上文所列的其他取代。R16N和H18T/S表示多肽在對應於SEQ ID NO:1的位置16的位置處具有N，其中在SEQ ID NO:1中R存在，且多肽在對應於SEQ ID NO:1中存在H的位置18的位置處具有T或S。由於SEQ ID NO:1中的序列RXH(在位置16-18處)不包含N-連接糖基化共有序列的任何殘基，所以所述對取代使得N-連接糖基化共有序列引入。
在替代實施方案中，單個胺基酸取代可足以提供N-連接糖基化共有序列，例如，由於序列NGD(在位置3-5處)存在於SEQ ID NO:1中，D以T或S單個取代分別產生序列NGT或NGS，其均是N-糖基化共有序列。
在某些情況下，可向野生型GDF15中引入超過一個N-糖基化共有序列。例如，野生型GDF15胺基酸序列可通過取代和/或缺失修飾以提供一個、兩個、三個、四個或更多個N-糖基化共有序列。在某些實施方案中，多肽可包括112個連續胺基酸，其與SEQ ID NO:1的112胺基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中112個連續胺基酸包括一個、兩個、三個、四個或更多個N-糖基化共有序列，諸如1-12、1-10、1-8、1-6、1-4、1-3或1-2個N-糖基化共有序列。
在某些實施方案中，多肽可包含112個連續胺基酸，其與SEQ ID NO:1的112胺基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中112個連續胺基酸包括本文所闡述的各對取代中的一對、兩對、三對、四對或更多對。
本公開還涵蓋作為上文所描述的多肽的活性片段(例如子序列)的多肽。活性片段或子序列的長度可以是40個胺基酸至111個胺基酸，例如40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、106、109或多至111個胺基酸。
多肽與參考序列相比在限定長度的連續胺基酸(例如「比較窗口」)上具有限定的序列同一性。用於比較的序列的比對方法是本領域中熟知的。用於比較的序列的最佳比對可例如通過Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法、通過Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比對算法、通過Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性查找法、通過這些算法的計算機化實現方式(Wisconsin Genetics Software Package,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通過人工比對和視覺檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編1995補充版)來進行。
作為實例，適合的多肽可包含與SEQ ID NO:1中具有40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或多至112個胺基酸的連續段具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
本文所公開的多肽的示例性片段包含相對於SEQ ID NO:1具有胺基酸缺失的多肽。例如，多肽可相對於SEQ ID NO:1具有N末端截短和/或C末端截短。截短可相對於參考多肽(例如SEQ ID NO:1)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在某些實施方案中，相對於SEQ ID NO:1，目標多肽可包含引入N-連接糖基化共有序列的一個或多個取代，諸如本文所公開的多肽；和N末端截短和/或C末端截短。
在某些實施方案中，多肽可以是至少98個胺基酸長且與SEQ ID NO:1中具有98個胺基酸的相應段具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的胺基酸序列同一性。此多肽可缺少存在於SEQ ID NO:1的N末端的前兩個至前十四個胺基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸)，而保留存在於SEQ ID NO:1的C末端的胺基酸。換言之，缺失胺基酸對應於SEQ ID NO:1的N末端胺基酸。
在某些實施方案中，GDF15突變蛋白可以是至少106個胺基酸長且與SEQ ID NO:1中具有106個胺基酸的相應段具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的胺基酸序列同一性。GDF15突變蛋白可缺少存在於SEQ ID NO:1的N末端的前六個胺基酸。
在某些實施方案中，多肽可以是至少109個胺基酸長且與SEQ ID NO:1中具有109個胺基酸的相應段具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的胺基酸序列同一性。GDF15突變蛋白可缺少存在於SEQ ID NO:1的N末端的前三個胺基酸。
本公開的示例性多肽相對於WT hGDF15可包含兩個N末端胺基酸(ΔN2)缺失且可融合至N末端的Fc序列。然而，當提及胺基酸取代的位置時，所指示的殘基編號是對應於WT成熟hGDF15(WT；SEQ ID NO:1)中的位置的編號。因此，在多肽的N末端丟失在N末端的前兩個胺基酸的胺基酸N可稱為殘基3，不過其在GDF15突變蛋白多肽胺基酸序列中是第一個胺基酸且前面是異源胺基酸序列(例如Fc)。
如上文所提及，相對於SEQ ID NO:1的序列，這些多肽片段可包含引入N-糖基化共有序列的一個或多個胺基酸取代，諸如一個、兩個或更多個本文所公開的胺基酸取代。
如以上所指出且如以下更詳細描述，本公開的多肽可通過例如以下來修飾：聚乙二醇化(共價連接一個或多個聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物)；糖基化(例如N-糖基化)；聚唾液酸化；白蛋白融合分子，包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、犬血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))；通過例如綴合脂肪酸鏈(醯化作用)進行的白蛋白結合；Fc-融合；以及與PEG模擬物融合。在某些實施方案中，修飾以位點特異性方式引入。在其他實施方案中，修飾包括接頭。接頭可使修飾部分綴合至多肽。
在特定實施方案中，本公開涵蓋通過與白蛋白綴合來修飾成熟人GDF15和GDF15突變蛋白(諸如以上所描述的多肽)。在其他實施方案中，本公開涵蓋經由N-糖基化或O-糖基化來修飾多肽。以下進一步描述白蛋白及其多肽綴合物(例如融合蛋白)和糖基化多肽的特徵。
Fc-GDF15融合多肽及其複合物
在示例性實施方案中，本文所公開的GDF15多肽可以融合多肽形式存在，所述融合多肽包含融合至本文所描述的多肽(例如人GDF15分子、修飾的人GDF15分子、GDF15突變蛋白和修飾的GDF15突變蛋白)中的一者或多者的胺基酸序列的Fc多肽或其片段。如本文所提供，GDF15多肽可以是野生型多肽或突變蛋白，例如糖基化突變蛋白。如本文所用，在多肽(例如GDF15多肽)的背景下，「糖基化突變蛋白」或「糖突變蛋白」或「糖基化變體」或「糖變體」是指在胺基酸序列中的一個位置處包含一個或多個糖基化共有位點的多肽，在所述位置處參考(野生型)多肽不包含糖基化共有位點。在某些情況下，融合多肽可包含融合至本文所公開的GDF15糖突變蛋白的N末端的Fc-序列。
本文所描述或本領域中已知的任何Fc多肽序列均可以是本公開的融合蛋白的組分。融合蛋白的組分可任選地通過接頭(諸如本文所描述的那些接頭)共價鍵合。在本公開的實施方案中的一些中，融合蛋白包含Fc多肽序列作為N末端部分且包含本文所描述的多肽作為C末端部分。
在某些情況下，本文所公開的Fc-GDF15融合多肽的Fc配偶體可以是具有人IgG Fc(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的序列或其變體的Fc。提供呈SEQ ID NO:2形式的人IgG1Fc的胺基酸序列：
鉸鏈區是斜體的，CH2結構域加下劃線且CH3結構域加雙下劃線。Fc序列中胺基酸的位置的編號根據EU編號(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))來進行。因此，根據EU編號，SEQ ID NO:2中位置1處的穀氨酸殘基「E」編號是216；CH2結構域以編號為231的丙氨酸(A)開始；CH3結構域以編號341的甘氨酸(G)開始。
本文所公開的Fc-GDF15融合多肽的Fc配偶體可以是具有與SEQ ID NO:2至少90％相同(例如與SEQ ID NO:2至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或更高相同)的連續胺基酸序列的Fc。在某些實施方案中，Fc配偶體可以是包含CH3結構域或與SEQ ID NO:2中的CH3結構域至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的連續胺基酸序列的Fc片段。在某些實施方案中，Fc配偶體可以是包含CH2結構域和CH3結構域或與SEQ ID NO:2中的CH2和CH3結構域至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的連續胺基酸序列的Fc片段。在某些實施方案中，Fc配偶體可以是包含部分鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域或與SEQ ID NO:2中的鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的連續胺基酸序列的Fc片段。在某些實施方案中，Fc配偶體可具有與SEQ ID NO:2中所列的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在某些情況下，Fc-GDF15融合多肽的Fc配偶體可包含工程化的突起，所述突起可與包含工程化的空腔的另一Fc多肽締合。在其他情況下，Fc-GDF15融合多肽的Fc配偶體可包含工程化的空腔，所述空腔可與包含工程化的突起的另一Fc多肽締合。具有工程化的突起和/或空腔的示例性Fc序列描述於US 8,216,805中。在某些情況下，突起和空腔可工程化至Fc多肽的CH3結構域中。在某些情況下，與本公開的Fc-GDF15融合多肽締合的Fc配偶體不綴合至GDF15多肽。因此，Fc配偶體與Fc-GDF15融合多肽二聚化，從而形成異二聚體，且每個異二聚體具有一個GDF15分子。
「突起」或「鈕」可通過將第一多肽中CH3結構域中的小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)置換而工程化。任選地在第二多肽的CH3結構域中通過將大胺基酸側鏈用較小者(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換而產生具有與突起相同或類似尺寸的補體「空腔」或「孔」。
「第一多肽」可以是待與第二多肽締合的任何多肽。第一多肽和第二多肽在「界面」(以下所定義)處相遇。除界面之外，第一多肽可包含一個或多個另外結構域，諸如CH2結構域或鉸鏈區。在某些情況下，第一多肽包含可形成第一多肽的界面的CH3結構域。
「第二多肽」可以是待經由「界面」與第一多肽締合的任何多肽。除界面之外，第二多肽可包含一個或多個另外結構域，諸如CH2結構域或鉸鏈區。在某些情況下，第二多肽包含可形成第二多肽的界面的CH3結構域。
「界面」包含第一多肽中的那些「接觸」胺基酸殘基(或其他非胺基酸基團，諸如碳水化合物基團、NADH、生物素、FAD或血紅素基團)，所述「接觸」胺基酸殘基與第二多肽的界面中的一個或多個「接觸」胺基酸殘基(或其他非胺基酸基團)相互作用。在某些情況下，界面可以是免疫球蛋白的結構域，諸如恆定結構域(或其片段)。在某些情況下，界面包含免疫球蛋白的CH3結構域，其衍生自IgG抗體，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
「突起」是指至少一個胺基酸側鏈，其自第一多肽的界面伸出且因此可安置於在鄰近界面(即第二多肽的界面)中的補體空腔中，從而穩定異二聚體，且由此例如相對於同二聚體形成更有利於異二聚體形成。空腔可存在於原始界面中或可以合成方式(例如通過改變編碼界面的核酸)引入。突起可以合成方式(例如通過改變編碼界面的核酸)、例如通過重組手段引入。
「空腔」是指至少一個胺基酸側鏈，其自第二多肽的界面凹入並且因此容納第一多肽的鄰近界面上的相應突起。空腔可存在於原始界面中或可以合成方式(例如通過改變編碼界面的核酸)引入。例如，將編碼第二多肽的界面的核酸改變以編碼空腔。
突起還稱為「鈕」，且空腔還稱為「孔」。示例性突起和空腔公開於US8,216,805中且在以下胺基酸位置處包含取代：347、366、368、394、405和407。胺基酸位置的編號根據EU編號來進行。工程化的突起可包含人IgG1Fc序列中的相應胺基酸的至少一個取代，其中所述取代位於選自由以下組成的組的位置處：胺基酸殘基347、366和394。例如，至少一個取代選自由以下組成的組：Q347W/Y、T366W/Y和T394W/Y。在某些情況下，工程化的空腔包含人IgG1Fc序列中的相應胺基酸的至少一個取代，其中所述取代位於選自由以下組成的組的位置處：胺基酸殘基366、368、394、405和407。例如，至少一個取代選自由以下組成的組：T366S、L368A、T394S、F405T/V/A和Y407T/V/A。
在某些情況下，突起可包含取代T366W/Y且空腔可包含取代T366S、L368A和Y407T/V/A。
例如，突起可包含取代T366W/Y且空腔可包含取代Y407T/V/A。在其他情況下，突起可包含取代T366Y且空腔可包含取代Y407T。在其他實例中，突起可包含取代T366W且空腔可包含取代Y407A。在其他實例中，突起可包含取代T394Y且空腔可包含取代Y407T。
在某些實施方案中，融合多肽中GDF15多肽的Fc配偶體可包含改進融合多肽的性質的另外突變。因此，本文所描述的第一多肽和第二多肽中的Fc序列可包含另外突變。例如，Fc配偶體序列可包含去掉(例如降低或消除)以其他方式可為Fc配偶體的特徵的IgG效應子功能的突變。在某些情況下，Fc配偶體序列可包含去掉諸如以下的效應子功能的突變：補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
四種人IgG同種型以不同親和力結合活化Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受體和補體(C1q)的第一組分，從而產生非常不同的效應子功能。因此，結合區內的突變可對效應子功能具有顯著影響。
IgG結合於FcγR抑或C1q取決於位於鉸鏈區和CH2結構域中的殘基。CH2結構域的兩個區域對於FcγR和C1q結合為關健的，且在IgG2和IgG4中具有獨特的序列。在位置233-236處IgG2殘基和在位置327、330和331處IgG4殘基取代至人IgG1中顯示極大降低ADCC和CDC活性(Armour KL.等人,1999.Eur J Immunol.29(8):2613-24；Shields RL等人,2001,J Biol Chem.276(9):6591-604)。此外，Idusogie等人證實在包含K322的不同位置處的丙氨酸取代使補體活化顯著降低(Idusogie EE.等人,2000.J Immunol.164(8):4178-84)。類似地，鼠IgG2A的CH2結構域中的突變顯示減少與FcγRI和C1q的結合(Steurer W.等人,1995.J Immunol.155(3):1165-74)。在某些實施方案中，Fc多肽可在CH2結構域中包含去掉IgG效應子功能的突變。CH2區中的示例性突變包含：APELLGGP(SEQ ID NO:96)→APALLGGP(SEQ ID NO:98)；APELLGGP(SEQ ID NO:96)→APELAGGP(SEQ ID NO:99)；以及APELLGGP(SEQ ID NO:96)→APALAGGP(SEQ ID NO:97)。
在一些實施方案中，綴合至GDF15糖突變蛋白的Fc多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列(通常在其N末端)。在一些實施方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。在某些情況下，Fc序列可包含以下鉸鏈序列中的一者：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:100)；KSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:101)；SCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:102)；CDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:103)；DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:104)；KTHTCPPCP(SEQ ID NO:105)；THTCPPCP(SEQ ID NO:106)；或CPPCP(SEQ ID NO:107)；或其具有一個或多個取代(例如1-6個取代，例如1-5、1-4、1、2、3、4、5或6個取代)的變體。在某些情況下，Fc序列可包含與另一Fc的鉸鏈區形成共價鍵(例如一個或多個二硫鍵)的鉸鏈區。因此，在某些實施方案中，本文所公開的複合物中的第一和第二多肽可經由第一多肽和第二多肽的鉸鏈區之間的共價相互作用締合。共價相互作用可包括一個或兩個分子間二硫鍵。
在本文詳細描述內容中，涵蓋綴合至GDF15糖突變蛋白的包含Fc鈕或孔序列的第一多肽。這種多肽可呈與第二Fc多肽的複合物形式，所述第二Fc多肽與第一多肽可經由將Fc序列的鈕放入孔中而物理締合。
在某些情況下，公開一種第一Fc多肽與第二Fc多肽的複合物。所述第一或第二多肽中的一者可以是Fc與GDF15的融合多肽。如本文所指出，GDF15多肽可包含糖基化突變，從而導致GDF15多肽的糖基化。糖基化GDF15多肽還可稱為GDF15-聚糖或GDF15-糖突變蛋白。GDF15-聚糖或GDF15-糖突變蛋白可如本文所公開。在某些情況下，融合至本文所提供的Fc-鈕或Fc-孔多肽的GDF15-聚糖或GDF15-糖突變蛋白可以是包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的連續胺基酸序列的多肽，其中所述連續胺基酸序列相對於SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有取代D5T；D5S；或R21N。在某些實施方案中，融合至Fc-鈕或Fc-孔多肽的GDF15-聚糖或GDF15-糖突變蛋白可以是具有與SEQ ID NO:1的胺基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的多肽，其中所述胺基酸序列相對於SEQ ID NO:1的胺基酸序列包含以下多對取代中的一者或多者：
xvii.R16N和H18T或R16N和H18S；
xviii.S23N和E25T或S23N和E25S；
xix.S50N和F52T或S50N和F52S；
xx.F52N和A54T或F52N和A54S；
xxi.R53N和A55T或R53N和A55S；
xxii.S64N和H66T或S64N和H66S；
xxiii.K91N和D93T或K91N和D93S；
xxiv.D93N和G95T或D93N和G95S；
xxv.T94N和V96T或T94N和V96S；
xxvi.V96N和L98T或V96N和L98S；
xxvii.S97N和Q99T或S97N和Q99S；以及
xxviii.A106N和D108T或A106N和D108S
在某些情況下，複合物可包含第一和第二多肽。第一多肽可包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列可包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；且第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列，其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化，且其中第一多肽的C末端或第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端。因此，複合物包含第一多肽與第二多肽的異二聚體。由於第一或第二多肽融合至本文所公開的GDF15突變蛋白，所以每個異二聚體存在一個GDF15分子。在某些情況下，GDF15突變蛋白可以是本文所描述的GDF15突變蛋白。
如本文所論述，第一多肽和第二多肽可相互作用以經由共價和/或非共價相互作用(諸如疏水性相互作用、二硫鍵或兩者)形成異二聚體。
在某些實施方案中，公開包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物。第一異二聚體和第二異二聚體各自可包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽可包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列可包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；第二多肽可包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列可包含含有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化，其中第一多肽的C末端或第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端，其中第一異二聚體中的GDF15突變蛋白與第二異二聚體中的GDF15突變蛋白二聚化，從而形成包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物。在複合物包含與第二異二聚體物理締合的第一異二聚體的本公開複合物中，每個異二聚體-異二聚體複合物存在兩個GDF15分子。
如本文所指出，第一多肽和第二多肽可相互作用以經由共價和/或非共價相互作用(諸如疏水性相互作用、二硫鍵或兩者)形成異二聚體，且第一異二聚體和第二異二聚體二聚體可相互作用以通過共價和/或非共價相互作用(諸如疏水性相互作用、二硫鍵或兩者)形成二聚體-二聚體複合物。
在某些情況下，存在於各個本文所描述的異二聚體中(例如兩個異二聚體的複合物中)的GDF15突變蛋白的序列可相同或不同。在某些情況下，兩個異二聚體的複合物中的GDF15突變蛋白的序列可相同。
本文公開用於融合至GDF15突變蛋白且作為Fc-GDF15融合蛋白的結合配偶體的示例性Fc序列。在某些實施方案中，存在於本公開的複合物中的Fc序列的除工程化的「鈕」和「孔」序列之外的序列可類似或相同。
在某些情況下，可相互作用以形成本文所公開的複合物的第一多肽和第二多肽可如下闡述為配對I至VIII。在以下所列序列中，人免疫球蛋白G1(hIgG1)Fc序列隨後是接頭序列(加下劃線)，隨後是GDF15突變蛋白序列(粗體)。
配對I：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)2-ΔN2-GDF15(N3-I112)(D5T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對II：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN2-GDF15(N3-I112)(D5T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對III：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(R21N)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對IV：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(S23N/E25T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對V：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(F52N/A54T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對VI：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(R53N/A55T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對VII：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(K91N/D93T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
配對VIII：
第一多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(D93N/G95T)
第二多肽：hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
在某些情況下，可相互作用以形成本文所公開的複合物的第一多肽和第二多肽可分別具有與如以上在配對I至VIII中所公開的第一多肽和第二多肽的胺基酸序列至少80％相同的胺基酸序列。例如，序列同一性可以是至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更高。
在某些實施方案中，複合物可包含具有與SEQ ID NO:3的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:4的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽經由至少一個分子間二硫鍵共價連接。本文還提供一種包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物，所述第一異二聚體和第二異二聚體各自包含具有與SEQ ID NO:3的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:4的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽。
在某些實施方案中，複合物可包含具有與SEQ ID NO:5的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:6的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽經由至少一個分子間二硫鍵共價連接。本文還提供一種包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物，所述第一異二聚體和第二異二聚體各自包含具有與SEQ ID NO:5的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:6的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽。
在某些實施方案中，複合物可包含具有與SEQ ID NO:7的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:8的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽經由至少一個分子間二硫鍵共價連接。本文還提供一種包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物，所述第一異二聚體和第二異二聚體各自包含具有與SEQ ID NO:7的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第一多肽；和具有與SEQ ID NO:8的胺基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列的第二多肽。
在特定實施方案中，本文所公開的複合物可包含兩個異二聚體，各異二聚體包含：
(a)hIgG1-Fc多肽，其包含鈕(Fc-鈕)且具有序列：
(b)hIgG1-Fc多肽，其包含孔(Fc-孔)且具有以下序列：
其中Fc-鈕(a)或Fc-孔(b)在C末端融合至GDF15糖突變蛋白的N末端。GDF15糖突變蛋白的序列可如下：
ARNGTHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:128；GDF15(A1-I112)D5T)；或
NGTHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:129；ΔN2-GDF15(N3-I112)D5T)；或
GTHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:130；ΔN3-GDF15(G4-I112)D5T)；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVNASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:131；ΔN3-GDF15(G4-I112)R21N)；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVRANLTDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:132；ΔN3-GDF15(G4-I112)(S23N/E25T))；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQNRTANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:133；ΔN3-GDF15(G4-I112)(F52N/A54T))；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFNATNMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:134；ΔN3-GDF15(G4-I112)(R53N/A55T))；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQNTTTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:135；ΔN3-GDF15(G4-I112)(K91N/D93T))；或
GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTNTTVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:136；ΔN3-GDF15(G4-I112)(D93N/G95T))。
在某些實例中，Fc-鈕的胺基酸序列可與SEQ ID NO:127的胺基酸序列至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。在某些實例中，Fc-孔的胺基酸序列可與SEQ ID NO:4的胺基酸序列至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。在某些實例中，GDF15突變蛋白的胺基酸序列可與SEQ ID NO:128-136中任一者的胺基酸序列至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。
Fc-鈕或Fc-孔可經由接頭序列(G4S)n(其中n＝1-10，諸如2、3、4或5)與GDF15糖突變蛋白連接。
在某些實例中，本公開的複合物的回收率可以是至少50mg/L，例如至少超過55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L、150mg/L、160mg/L、170mg/L、180mg/L、190mg/L、200mg/L或更多。在某些情況下，本發明的複合物的回收率可以是至少50mg/L-300mg/L，諸如60mg/L-300mg/L、75mg/L-300mg/L、75mg/L-250mg/L、75mg/L-200mg/L、75mg/L-175mg/L、75mg/L-150mg/L、100mg/L-300mg/L、100mg/L-250mg/L、100mg/L-200mg/L、100mg/L-150mg/L、100mg/L-125mg/L、110mg/L-300mg/L或150mg/L-300mg/L。複合物的回收率是指自培養表達形成存在於各充分組裝複合物中的兩個二聚體的第一多肽和第二多肽的宿主細胞的培養基獲得的充分組裝的二聚體-二聚體複合物的量。
本公開還涵蓋Fc多肽融合配偶體和包含所述Fc多肽融合配偶體的融合蛋白，其中Fc多肽融合配偶體被修飾為帶電荷的Fc對的一個配偶體。「帶電荷Fc對的配偶體」是指(i)「帶負電荷」的Fc序列(任選地缺少鉸鏈區)，且包含帶電荷對突變或(ii)「帶正電荷」的「Fc序列」(任選地缺少鉸鏈區)，且包含帶電荷對突變。「帶正電荷」和「帶負電荷」在本文中用於便於提及以描述Fc序列中的電荷對突變的性質，而不指示整個序列或構建體必然具有正電荷或負電荷。適合用於本公開的多肽構建體(例如GDF15糖突變蛋白、修飾的GDF15糖突變蛋白)中的帶電荷Fc胺基酸序列描述於例如WO2013/113008中。
帶正電荷的Fc(「Fc(+)」)的實例包括包含缺少鉸鏈區的Fc序列的天冬氨酸-至-賴氨酸突變(E356K)和穀氨酸-至-賴氨酸突變(D399K)的Fc。帶負電荷的Fc(「Fc(-)」)的實例包括在缺少鉸鏈區的Fc序列中包含兩個賴氨酸-至-天冬氨酸突變(K392D、K409D)的Fc。此外，C末端賴氨酸(K477)還可任選地缺失。當Fc(+)多肽融合蛋白(例如Fc(+)GDF15突變蛋白融合蛋白)和Fc(-)多肽融合蛋白(例如Fc(-)GDF15突變蛋白融合蛋白)在一起孵育時，天冬氨酸殘基通過靜電力與賴氨酸殘基締合，從而促進GDF15多肽融合蛋白的Fc(+)序列與Fc(-)序列之間形成Fc異二聚體。
本公開還涵蓋命名為「半」構建體或「半Fc」構建體的構建體，其包含通過將第一Fc序列的N末端連接至第二Fc序列的C末端的接頭串聯連接的兩個Fc序列。在一些實施方案中，單體包含通過將GDF15序列的N末端連接至第一Fc序列的C末端的第一接頭連接至第一Fc序列的多肽(例如成熟修飾的GDF15或GDF15糖突變蛋白)序列，其中第一Fc序列通過將第一Fc序列的N末端連接至第二Fc序列的C末端的第二接頭連接至第二Fc序列。第一Fc序列和第二Fc序列還通過Fc鉸鏈區締合。兩個此類單體締合以形成二聚體，其中單體經由兩個多肽序列之間的鏈間二硫鍵連接。關於適合在本公開的GDF15突變蛋白情況下使用的半Fc多肽的實例，參見WO2013/113008。
本公開還涵蓋具有Fc多肽或其片段的多聚體(包括帶電荷Fc對的配偶體(例如Fc的多聚體))的融合蛋白。
本公開的複合物具有改進的性質，諸如增加的溶解度、減少的聚集作用和/或增加的血清半衰期。在某些情況下，複合物的溶解度通常相對於非綴合重組人GDF15和Fc(鈕或孔)綴合型野生型GDF15提高。在某些實施方案中，在pH 7.0下的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，複合物的溶解度是至少1mg/mL。在其他實施方案中，複合物的溶解度是至少2mg/mL、至少3mg/mL、至少4mg/mL或至少5mg/mL。在其他實施方案中，在pH 7.0下的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，複合物的溶解度是至少6mg/mL、至少7mg/mL、至少8mg/mL、至少9mg/mL或至少10mg/mL。在特定實施方案中，複合物的溶解度大於10mg/mL。
糖基化：出於本公開的目的，「糖基化」意在泛指使聚糖連接至蛋白質、脂質或其他有機分子的酶過程。結合本公開使用術語「糖基化」通常旨在意指添加或缺失一個或多個碳水化合物部分(通過移除潛在糖基化位點或通過用化學和/或酶手段消除糖基化)，和/或添加可能存在或可能不存在於天然序列中的一個或多個糖基化位點。此外，所述短語包括天然蛋白的糖基化的質變，其涉及所存在的各種碳水化合物部分的性質和比例的變化。
糖基化可顯著影響蛋白質的物理性質且還可在蛋白質穩定性、分泌和亞細胞定位中為重要的。實際上，本文所描述的GDF15突變蛋白多肽的糖基化賦予其物理性質的有益改進。舉例而言但不限於，GDF15突變蛋白的溶解度可通過糖基化改進，且此類改進可為實質性的(參見實施例)。通過此類修飾的GDF15突變蛋白展現的溶解度改進可例如能夠產生比非糖基化GDF15/GDF15突變蛋白更適合用於藥物施用的製劑。糖基化GDF15/GDF15突變蛋白多肽還可展現增強的穩定性。此外，多肽可改進一種或多種藥物動力學性質，諸如半衰期。
糖基化位點的添加可如以上所描述通過改變胺基酸序列來實現。多肽的改變可例如通過添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(對於O-連接糖基化位點)或天冬醯胺殘基(對於N-連接糖基化位點)或由其取代來進行。N-連接和O-連接寡糖的結構和各類型中所發現的糖殘基可不同。在兩者上共同發現的一種類型的糖是N-乙醯神經氨酸(以下稱為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接與O-連接寡糖的末端殘基且因其負電荷而可賦予糖蛋白酸性性質。本公開的一個特定實施方案包含如以上所描述的N-糖基化變體的產生和使用。
增加多肽上的碳水化合物部分的數目的另一方式是通過使糖苷化學或酶偶聯至多肽。
二氫葉酸還原酶(DHFR)缺乏型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是用於產生重組糖蛋白的常用宿主細胞。這些細胞不表達酶β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸基轉移酶，並且因此不以α-2,6鍵聯形式添加唾液酸至在這些細胞中所產生的糖蛋白的N-連接寡糖。
在特定實施方案中，包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白是糖基化的。因此，在特定實施方案中，本文所公開的複合物中的GDF15突變蛋白可在引入GDF15突變蛋白的N連接的糖基化共有位點處糖基化。在某些情況下，雖然本文所公開的複合物可包含糖基化GDF15，諸如在由細胞系表達期間產生的糖基化GDF15，但複合物可在產生後進行處理以移除碳水化物部分。產生後移除碳水化物部分可使得在於真核宿主細胞中表達期間附著於GDF15突變蛋白(和Fc序列)的實質上所有碳水化合物基團移除。
因此，本公開涵蓋在多肽序列的N末端和/或C末端綴合一種或多種另外組分或分子，諸如另一蛋白質(例如具有與主題蛋白質異源的胺基酸序列的蛋白質)，或載體分子。因此，可提供呈與另一組分或分子的綴合物形式的示例性多肽序列。
多肽還可綴合至大的緩慢代謝大分子，諸如蛋白質；多糖，諸如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠粒；聚合胺基酸，諸如聚穀氨酸、聚賴氨酸；胺基酸共聚物；滅活病毒粒子；滅活細菌毒素，諸如來自白喉、破傷風、霍亂、白細胞毒素分子的類毒素；滅活細菌；以及樹突細胞。如果需要，則可使用此類綴合形式來產生針對本公開的多肽的抗體。在某些情況下，本文所描述的複合物中的GDF15可以是綴合至大的緩慢代謝巨分子的多肽。
用於綴合的另外候選組分和分子包括適合於分離或純化的那些。特定非限制性實例包括結合分子，諸如生物素(生物素-親和素特異性結合對)、抗體、受體、配體、凝集素或包含固體載體的分子，所述固體載體包括例如塑膠或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁性珠粒、測試條和膜。
諸如陽離子交換色譜法的純化方法可用於通過電荷差異分離結合物，其有效地將綴合物分離成其各種分子量。例如，可負載陽離子交換柱且然後用約20mM乙酸鈉(pH約4)洗滌，且然後用在約3至5.5的pH值下(例如在pH約4.5下)緩衝的線性(0M至0.5M)NaCl梯度洗脫。通過陽離子交換色譜法獲得的級分的內容物可使用例如質譜法、SDS-PAGE的常規方法或用於根據分子量分離分子實體的其他已知方法根據分子量進行鑑別。
接頭：用於修飾本公開的多肽序列的前述組分和分子中的任一者均可任選地經由接頭綴合。適合的接頭包括「柔性接頭」，其通常具有足夠的長度，以允許修飾的多肽序列與所連接組分和分子之間一定程度的移動。接頭分子可以是約6-50個原子長。接頭分子還可以是例如芳基乙炔、含有2-10個單體單元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、胺基酸或其組合。適合的接頭可容易地選擇且可具有任何適合的長度，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50個胺基酸。
示例性柔性接頭包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物、甘氨酸-絲氨酸聚合物(例如(GmSo)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:120)、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQ ID NO:121)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:122)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:123)和(GGGSm)n(SEQ ID NO:124)及其組合，其中m、n和o各自獨立地選自至少1至20(例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的整數；和其他柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物是相對非結構化的，且因此可充當組分之間的中性系鏈。示例性柔性接頭包括但不限於GGSG(SEQ ID NO:21)、GGSGG(SEQ ID NO:22)、GSGSG(SEQ ID NO:23)、GSGGG(SEQ ID NO:24)、GGGSG(SEQ ID NO:25)和GSSSG(SEQ ID NO:26)。
另外柔性接頭包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-絲氨酸聚合物(例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:120)、(GGGS)n(SEQ ID NO:125)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:126)，其中n＝1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50)。示例性柔性接頭包括但不限於GGGS(SEQ ID NO:19)、GGGGS(SEQ ID NO:20)、GGSG(SEQ ID NO:21)、GGSGG(SEQ ID NO:22)、GSGSG(SEQ ID NO:23)、GSGGG(SEQ ID NO:24)、GGGSG(SEQ ID NO:25)和GSSSG(SEQ ID NO:26)。這些接頭序列的多聚體(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50個)可連接在一起以提供可用於將異源胺基酸序列綴合至本文所公開的多肽的柔性接頭。如本文所描述，異源胺基酸序列可以是信號序列和/或融合配偶體，諸如白蛋白、Fc序列等。
接頭的實例包括例如(GGGGS)n(SEQ ID NO:126)，其中n是1至約10的整數(例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；GGGSGGGSIEGR(SEQ ID NO:48)；GGGGG(SEQ ID NO:27)；EGGGS(SEQ ID NO:28)。
在一些情況下，接頭可以是可裂解接頭，例如酶可裂解接頭。在其他情況下，接頭可以是非可裂解接頭，例如在體內正常生理條件下不酶裂解的接頭。
例如，蛋白水解可裂解接頭可包括基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點，例如選自以下的MMP的裂解位點：膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3(MMP-1、MMP-8和MMP-13)；明膠酶A和B(MMP-2和MMP-9)；基質溶解素1、2和3(MMP-3、MMP-10和MMP-11)；基質溶解因子(MMP-7)；以及膜金屬蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。MMP-9的裂解序列是Pro-X-X-Hy(其中，X表示任意殘基；Hy，疏水性殘基)(SEQ ID NO:29)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(SEQ ID NO:30)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO:31)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO:32)。蛋白酶裂解位點的另一實例是纖溶酶原活化劑裂解位點，例如uPA或組織纖溶酶原活化劑(tPA)裂解位點。uPA和tPA的裂解序列的特定實例包括包含Val-Gly-Arg的序列。另一個實例是凝血酶裂解位點，例如CGLVPAGSGP(SEQ ID NO:33)。包含蛋白酶裂解位點的其他適合的接頭包括包含以下胺基酸序列中的一者或多者的接頭：1)SLLKSRMVPNFN(SEQ ID NO:34)或SLLIARRM PNFN(SEQ ID NO:35)，由組織蛋白酶B裂解；SKLVQASASGVN(SEQ ID NO:36)或SSYLKASDAPDN(SEQ ID NO:37)，由埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)蛋白酶裂解；RPKPQQFFGLMN(SEQ ID NO:38)，由MMP-3(基質溶解素)裂解；SLRPLALWRSFN(SEQ ID NO:39)，由MMP-7(基質溶解因子)裂解；SPQGIAGQRNFN(SEQ ID NO:40)，由MMP-9裂解；DVDERDVRGFASFL(SEQ ID NO:41)，由嗜熱菌蛋白酶樣MMP裂解；SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO:42)，由基質金屬蛋白酶2(MMP-2)裂解；SLLIFRSWANFN(SEQ ID NO:43)，由組織蛋白酶L裂解；SGVVIATVIVIT(SEQ ID NO:44)，由組織蛋白酶D裂解；SLGPQGIWGQFN(SEQ ID NO:45)，由基質金屬蛋白酶1(MMP-1)裂解；KKSPGRVVGGSV(SEQ ID NO:46)，由尿激酶型纖溶酶原活化劑裂解；PQGLLGAPGILG(SEQ ID NO:47)，由膜1型基質金屬蛋白酶(MT-MMP)裂解；HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT(SEQ ID NO:94)，由基質溶解素3(或MMP-11)、嗜熱菌蛋白酶、成纖維細胞膠原酶和基質溶解素-1裂解；GPQGLAGQRGIV(SEQ ID NO:49)，由基質金屬蛋白酶13(膠原酶-3)裂解；GGSGQRGRKALE(SEQ ID NO:50)，由組織型纖溶酶原活化劑(tPA)裂解；SLSALLSSDIFN(SEQ ID NO:51)，由人前列腺特異性抗原裂解；SLPRFKIIGGFN(SEQ ID NO:52)，由激肽釋放酶(hK3)裂解；SLLGIAVPGNFN(SEQ ID NO:53)，由嗜中性粒細胞彈性酶裂解；以及FFKNIVTPRTPP(SEQ ID NO:54)，由鈣蛋白酶(鈣活化中性蛋白酶)裂解。
除本文所提供的特定胺基酸序列和核酸序列之外，本公開還涵蓋具有序列與所述胺基酸和核酸至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列的多肽和核酸。在兩個或更多個多核苷酸序列或兩個或更多個胺基酸序列的背景下，術語「相同」或「同一性」百分比是指當在指定區域上比較和比對最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同，或具有指定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(例如在指定區域上至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同)。本公開尤其涵蓋存在於複合物中的第一和第二多肽，第一多肽和第二多肽具有序列分別與本文所提供的第一和第二多肽對的第一和第二多肽的胺基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的胺基酸序列。
產生多肽的方法
本公開的多肽可通過任何適合的方法來產生，包括重組和非重組方法(例如化學合成)。
A.化學合成
在化學合成多肽的情況下，合成可經由液相或固相方法來進行。固相肽合成(SPPS)允許併入非天然胺基酸和/或肽/蛋白質主鏈修飾。各種形式的SPPS(諸如Fmoc和Boc)均可用於合成本公開的多肽。化學合成的細節是本領域中已知的(例如Ganesan A.2006Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等人,2005Protein Pept Lett.12:723-8)。
B.重組產生
在使用重組技術產生多肽的情況下，可產生呈細胞內蛋白或呈分泌蛋白形式的多肽，其使用任何適合的構建體和任何適合的宿主細胞，所述任何適合的宿主細胞可以是原核或真核細胞，分別諸如細菌(例如大腸桿菌(E.coli))或酵母宿主細胞。可用作宿主細胞的真核細胞的其他實例包括昆蟲細胞、哺乳動物細胞和/或植物細胞。在使用哺乳動物宿主細胞的情況下，其可包括人細胞(例如HeLa、293、H9和Jurkat細胞)；小鼠細胞(例如NIH3T3、L細胞和C127細胞)；靈長類動物細胞(例如Cos 1、Cos 7和CV1)和倉鼠細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。在特定實施方案中，多肽和包含多肽的複合物在CHO中產生。在其他實施方案中，多肽和包含多肽的複合物在酵母細胞中產生，且在特定實施方案中，可以是遺傳工程化以產生具有哺乳動物樣N-聚糖的糖蛋白的酵母細胞。
適合用於表達多肽的多種宿主-載體系統均可根據本領域中已知的標準程序加以使用。參見例如Sambrook等人,1989Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press,New York；和Ausubel等人1995Current Protocols in Molecular Biology,Wiley和Sons編。用於將遺傳物質引入宿主細胞的方法包括例如轉化、電穿孔、綴合、磷酸鈣法等。可選擇用於轉移的方法以提供所引入的多肽編碼核酸的穩定表達。多肽編碼核酸可以可遺傳附加型元件(例如質粒)形式提供或可進行基因組整合。多種用於產生目標多肽的適當載體是可商購的。
載體可在宿主細胞中提供染色體外維護或可提供向宿主細胞基因組中的整合。表達載體提供轉錄和翻譯調控序列，且可在編碼區在轉錄起始區以及轉錄和翻譯終止區的轉錄控制下可操作地連接的情況下提供誘導性或組成性表達。一般而言，轉錄和翻譯調控序列可包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或活化子序列。啟動子可以是組成性或誘導性的，且可以是強組成性啟動子(例如T7)。
表達構建體通常具有定位於啟動子序列附近的適宜限制性位點以提供編碼目標蛋白質的核酸序列的插入。可存在在表達宿主中起作用的選擇性標記以促進對含有載體的細胞的選擇。此外，表達構建體可包含另外元件。例如，表達載體可具有一個或兩個複製系統，從而允許其維持於生物體中，例如用於表達的哺乳動物或昆蟲細胞中和用於克隆和擴增的原核宿主中。此外，表達構建體可含有選擇性標記基因以允許選擇轉化的宿主細胞。選擇性基因是本領域中熟知的且將隨所用宿主細胞而不同。
蛋白質的分離和純化可根據本領域中已知的方法來實現。例如，蛋白質可通過親和力純化分離自遺傳修飾以組成性地和/或在誘導後表達蛋白質的細胞的溶解產物；生長宿主細胞的培養基；或合成反應混合物，所述親和力純化可涉及使樣品(細胞溶解產物、培養基或反應混合物)與特異性地結合至所述蛋白質的標記接觸，洗滌以移除非特異性結合材料，且將特異性結合的蛋白質洗脫。分離的蛋白質可通過滲析和蛋白質純化方法中常用的其他方法進一步純化。在一個實施方案中，蛋白質可使用金屬螯合物色譜法分離。蛋白質可含有修飾以促進分離。在某些實施方案中，本公開的複合物可基於尺寸進行分離。
在某些實施方案中，包含第一多肽和第二多肽的複合物可分離自培養表達第一多肽和第二多肽的宿主細胞的培養基，第一多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化，其中第一多肽的C末端或第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端。
在某些實施方案中，包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物可自培養表達第一多肽和第二多肽的宿主細胞的培養基分離，第一異二聚體和第二異二聚體各自包含第一多肽和第二多肽，第一多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的突起的CH3序列；第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化，其中第一多肽的C末端或第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端，其中第一異二聚體中的GDF15突變蛋白與第二異二聚體中的GDF15突變蛋白二聚化，從而形成包含第一異二聚體和第二異二聚體的複合物。
如本文所指出，第一和第二核酸可存在於單一宿主細胞或兩種不同宿主細胞中的單一載體或分開的載體中。在某些情況下，本公開的第一多肽和第二多肽可分別由可存在表達於相同細胞中的第一和第二核酸編碼。在第一和第二核酸存在於不同細胞中的實施方案中，細胞可在產生過程期間的某一點融合。
複合物可製備成實質上純或分離的形式(例如不含其他多肽)。複合物可以相對於可存在的其他組分(例如其他多肽或其他複合物(例如同二聚體、同四聚體)或其他宿主細胞組分)富集所述複合物的組合物形式存在。例如，可提供純化複合物(例如異二聚體-異二聚體複合物)，以使得複合物以實質上不含其他所表達的蛋白質(例如小於90％、小於60％、小於50％、小於40％、小於30％、小於20％、小於10％、小於5％或小於1％的組合物由其他表達蛋白質組成)的組合物的形式存在。
抗體
本公開提供抗體，其包括特異性地結合本公開的多肽或融合蛋白的分離抗體。術語「抗體」涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和包括Fab和F(ab)'2的抗體結合片段，前提條件是其展現所需生物活性。基本全抗體結構單元包含四聚體，且各四聚體由兩對相同多肽鏈組成，各對具有一條「輕」鏈(約25kDa)和一條「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈的氨基末端部分包含具有約100至110或更多個胺基酸的主要負責抗原識別的可變區。相比之下，各鏈的羧基未端部分限定主要負責效應子功能的恆定區。人輕鏈被歸類為κ和λ，而人重鏈被歸類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。結合片段通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶或化學裂解來產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和單鏈抗體。
各重鏈在一端具有可變結構域(VH)，隨後是許多恆定結構域。各輕鏈具有在一端的可變結構域(VL)和在其另一端的恆定結構域；輕鏈的恆定結構域與重鏈的第一恆定結構域對準，且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對準。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過具有約12或更多個胺基酸的「J」區連接，且重鏈還包含具有多約10個胺基酸的「D」區。抗體鏈全部展現相同的相對保守框架區(FR)一般結構，所述相對保守框架區通過三個超可變區(還稱為「互補決定區」或「CDR」)連接。各對的兩條鏈的CDR通過框架區對準，從而能夠結合至特定表位。自N末端至C末端，輕鏈和重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
完整抗體具有兩個結合位點，且除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點相同。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜合抗體。雙特異性抗體可通過包括雜交瘤融合或連接Fab'片段的多種方法來產生。
如上文所闡述，結合片段可通過完整抗體的酶或化學裂解來產生。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同抗原結合片段(還稱為「Fab」片段)和不具有抗原結合活性的「Fc片段」。用胃蛋白酶消化抗體產生F(ab')2片段，其中抗體分子的兩條臂保持連接且包含兩個抗原結合位點。F(ab')2片段具有交聯抗原的能力。
如本文所用，術語「Fab」是指抗體中包含VH和VL區以及輕鏈的恆定結構域和重鏈的CH1結構域的片段。
當在本文中使用時，術語「Fv」是指抗體中保留抗原識別與抗原結合位點兩者的最小片段。在雙鏈Fv種類中，此區域包括呈非共價締合形式的一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域的二聚體。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可通過柔性肽接頭共價連接，以使得輕鏈和重鏈可以類似於雙鏈Fv種類的「二聚」結構形式締合。正是在此組態中，各可變結構域的三個CDR相互作用以限定VH-VL二聚體的表面上的抗原結合位點。雖然六個CDR一起賦予抗體的抗原結合特異性，但即使單一可變結構域(或僅包含三個對抗原具特異性的CDR的Fv的一半)還具有識別並結合抗原的能力。
當在本文中使用時，術語「互補決定區」或「CDR」是指與特定配體接觸且決定其特異性的免疫受體的部分。
術語「高變區」是指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區通常包含CDR的胺基酸殘基和/或「高變環」的那些殘基。
如本文所用，術語「表位」是指抗體在蛋白質抗原上的結合位點。表位決定簇通常包含化學活性表面分組的諸如胺基酸的分子或糖側鏈，以及特定三維結構和電荷特徵。當解離常數≤1μM、≤100nM或≤10nM時，認為抗體結合抗原。增加的平衡常數(「KD」)意指表位與抗體之間存在較小親和力，而降低的平衡常數意指表位與抗體之間存在較大親和力。KD「不超過」某一量的抗體意指抗體將以給定KD或更強地結合於表位。儘管KD描述表位與抗體的結合特徵，但「效力」描述關於抗體功能的抗體本身的有效性。平衡常數與效力之間未必存在相關性；因此，例如，相對低的KD不自然而然地意指高效力。
關於抗體的術語「選擇性地結合」不意指抗體僅結合至單一物質，而意指抗體對第一物質的KD小於抗體對第二物質的KD。排他地結合至表位的抗體僅結合至單一表位。
當向人施用時，含有齧齒動物(即鼠或大鼠)可變區和/或恆定區的抗體有時與例如快速自體內清除或身體對抗體產生免疫反應相關。為避免使用源自齧齒動物的抗體，可通過向齧齒動物中引入人抗體功能以使得齧齒動物產生完全人抗體來產生完全人抗體。除非本文具體地確定，否則「人」抗體和「完全人」抗體可互換使用。術語「完全人」在區分僅部分為人的抗體與全然或完全為人的抗體時可適用。熟練的技術人員了解產生完全人抗體的各種方法。
為解決可能的人抗小鼠抗體反應，可使用嵌合或以其他方式人源化的抗體。嵌合抗體具有人恆定區和鼠可變區，且因此可在一些患者中觀察到人抗嵌合抗體反應。因此，有利的是提供針對多聚酶的完全人抗體以避免可能的人抗小鼠抗體或人抗嵌合抗體反應。
完全人單克隆抗體可例如通過用熟練的技術人員已知的技術產生雜交瘤細胞系來製備。其他製備方法涉及使用編碼特定抗體的序列來轉化適合的哺乳動物宿主細胞，諸如CHO細胞。轉化可通過用於將多核苷酸引入宿主細胞的任何已知方法來進行，包括例如將多核苷酸包裝於病毒中(或包裝至病毒載體中)且用病毒(或載體)或通過本領域中已知的轉染程序轉導宿主細胞。用於將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法是本領域中熟知的，且包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸封裝於脂質體中和直接微量注射DNA至核中。可用作用於表達的宿主的哺乳動物細胞系是本領域中熟知的，且包括但不限於CHO細胞、HeLa細胞和人肝細胞癌細胞。
可使用抗體來檢測本公開的多肽。例如，可使用抗體作為診斷劑，其通過檢測受試者中一種或多種本公開多肽的水平，且將所檢測到的水平與標準對照水平或先前確定的受試者中(例如在任何疾病之前)的基線水平相比較來進行。
治療性和預防性用途
本公開提供用於如本文所描述通過施用本公開的複合物或其組合物治療或預防諸如以下的代謝和代謝相關疾病的方法：肥胖症和其他體重病症、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症和葡萄糖代謝病症。此類方法還可通過例如降低症狀的嚴重性或頻率而對一種或多種與疾病、病症或病狀相關的症狀具有有利作用。
為確定受試者是否可以是通過本文所提供的方法治療或預防體重病症(例如肥胖症)的候選者，應評價諸如但不限於病原學和受試者的病狀的程度(例如受試者與參考健康受試者相比有多過重)的參數。例如，BMI在約25與約29.9kg/m2之間的成人可視為過重(肥胖前期)，而BMI為30kg/m2或更高的成年可視為肥胖。如本文所論述，本發明的複合物可實現食慾抑制，例如降低食慾，從而導致體重減輕。
為確定受試者是否可以是通過本文所提供的方法治療或預防高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症和/或葡萄糖病症的候選者，可使用本領域中已知的各種診斷方法。此類方法包括本文中其他地方描述的那些(例如空腹血糖(FPG)評價和口服葡萄糖耐受性測試(oGTT))。
本文所提供的複合物當向受試者施用以治療或預防諸如肥胖症和其他體重病症、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症、葡萄糖代謝病症的代謝和代謝相關疾病時，可使得血糖水平降低、體重減輕和/或食物攝入減少。
在某些實施方案中，與在不存在複合物施用的情況下相比，本文涵蓋的複合物可將血糖水平、體重和/或食物攝入降低至少5％。例如，與開始治療或預防之前相比，本文涵蓋的複合物可將血糖水平、體重和/或食物攝入降低至少10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。
在某些實施方案中，用於治療代謝病症的本公開複合物可以是每個複合物包含兩個異二聚體分子的複合物，其中各異二聚體是相同的，且包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列可包含含有至少一個工程化的突起的CH3序列；第二多肽包含IgG Fc序列，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化，其中在各異二聚體中第一多肽的C末端或第二多肽的C末端綴合至包含至少一個N連接的糖基化共有位點的GDF15突變蛋白的N末端，其中異二聚體中的GDF15突變蛋白與另一異二聚體中的GDF15突變蛋白二聚化，從而形成包含兩個異二聚體的複合物。
在其他實施方案中，用於治療代謝病症的本公開複合物可以是每個複合物包含兩個異二聚體分子(異二聚體與異二聚體締合)的複合物，其中各異二聚體是相同的，且各異二聚體包含具有IgG Fc序列的第一多肽，所述IgG Fc序列可包含含有至少一個工程化的突起的CH3序列，其中第一多肽的C末端融合至GDF15糖突變蛋白的N末端；和包含IgG Fc序列的第二多肽，所述IgG Fc序列包含具有至少一個工程化的空腔的CH3序列；其中第一多肽與第二多肽經由將第一多肽的突起安置於第二多肽的空腔中而二聚化以形成異二聚體，其中異二聚體中的GDF15突變蛋白與另一異二聚體中的GDF15突變蛋白二聚化，從而形成包含兩個異二聚體的複合物。
藥物組合物
本公開的複合物可呈適合用於向受試者施用的組合物形式。一般而言，此類組合物是包含一種或多種複合物和一種或多種藥學上可接受或生理學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的「藥物組合物」。在某些實施方案中，複合物以治療有效量存在於藥物組合物中。藥物組合物可用於本公開的方法中；因此，例如，為實踐本文所描述的治療性和預防性方法和用途，可向受試者離體或體內施用藥物組合物。如本文所指出，複合物可以是或可以不是糖基化的。例如，複合物可在產生於真核宿主細胞中時進行糖基化且可在配製成藥物組合物之前經歷移除碳水化物部分的過程。碳水化合物部分的移除可使得在複合物中多肽的糖基化顯著降低或在複合物中完全不存在多肽的糖基化。
在特定實施方案中，本公開提供用於通過施用複合物、N-糖基化複合物或其組合物來治療葡萄糖代謝或體重病症的方法。在特定實施方案中，本公開方法用於通過施用複合物、N-糖基化複合物或其組合物來減少食物攝入或降低體重。本公開進一步提供前述序列、複合物、N-糖基化複合物或其組合物在製造用於治療選自諸如以下的代謝和代謝相關疾病的病狀的藥劑中的用途：肥胖症和其他體重病症、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症和葡萄糖代謝病症。本公開進一步提供一種前述序列、複合物、N-糖基化複合物或其組合物在製造用於治療葡萄糖代謝或體重病症的藥劑中的用途。本公開進一步提供一種前述序列、複合物、N-糖基化複合物或其組合物在製造用於降低食物攝入或體重的藥劑中的用途。
本文還提供用於治療或預防選自諸如以下的代謝和代謝相關疾病的病狀的本文所公開的序列、複合物和N-糖基化複合物的組合物(例如藥物組合物)：肥胖症和其他體重病症、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症和葡萄糖代謝病症。本公開進一步提供一種用於治療葡萄糖代謝或體重病症的前述序列、複合物或N-糖基化複合物的組合物(例如藥物組合物)。本公開進一步提供一種用於降低食物攝入或體重的前述序列、複合物或N-糖基化複合物的組合物(例如藥物組合物)。
本公開的藥物組合物可配製成與預期施用方法或途徑相容；示例性施用途徑闡述於本文中。此外，為治療或預防如由本公開涵蓋的疾病、病症和病狀，藥物組合物可與如本文所描述的其他治療活性劑或化合物(例如降葡萄糖劑)組合使用。
藥物組合物通常包含治療有效量的由本公開涵蓋的複合物中的至少一者和一種或多種藥學上和生理學上可接受的配製試劑。適合的藥學上可接受或生理學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑包括但不限於抗氧化劑(例如抗壞血酸和硫酸氫鈉)、防腐劑(例如苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯)、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、填充劑、增容劑、洗滌劑、緩衝劑、媒介物、稀釋劑和/或佐劑。例如，適合的媒介物可以是生理鹽水溶液或檸檬酸鹽緩衝鹽水，其可能補充有用於胃腸外施用的藥物組合物中常用的其他材料。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的生理鹽水是其他示例性媒介物。本領域的技術人員將容易地識別可用於藥物組合物和劑型中的多種緩衝劑。典型緩衝劑包括但不限於藥學上可接受的弱酸、弱鹼或其混合物。作為實例，緩衝組分可以是水溶性材料，諸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、穀氨酸及其鹽。可接受的緩衝劑包括例如Tris緩衝液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)和N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在已配製藥物組合物之後，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。此類製劑可以即用形式、需要在使用之前復水的凍幹形式、需要在使用之前稀釋的液體形式或其他可接受的形式儲存。在一些實施方案中，藥物組合物被提供於單用途容器(例如單用途小瓶、安瓿、注射器或自動注射器(類似於例如))中，然而在其他實施方案中，提供多用途容器(例如多用途小瓶)。任何藥物遞送設備均可用於遞送複合物，包括植入物(例如可植入泵)和導管系統，所述兩者是熟練的技術人員熟知的。通常為皮下或肌肉內施用的貯庫注射還可用於歷經規定時間段釋放本文所公開的複合物。貯庫注射通常是基於固體或基於油的且通常包含本文所闡述的配製組分中的至少一者。本領域的普通技術人員熟悉貯庫注射的可能製劑和用途。
藥物組合物可呈無菌可注射水性或油性懸浮液形式。此懸浮液可根據已知技術使用本文提及的那些適合的分散劑或潤溼劑和懸浮劑來配製。無菌可注射製劑還可以是於無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如呈1,3-丁二醇溶液的形式。可使用的可接受的稀釋劑、溶劑和分散介質包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、等滲氯化鈉溶液、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其適合的混合物。此外，無菌、固定油常規可用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用任何溫和固定油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，諸如油酸的脂肪酸適用於可注射物的製備。特定可注射製劑的延長吸收可通過包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來實現。
含有活性成分(例如本公開的複合物)的藥物組合物可呈適合用於口服使用的形式，例如呈片劑、膠囊、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散性粉末或顆粒、乳液、硬膠囊或軟膠囊或糖漿、溶液、微珠粒或酏劑形式。意圖用於口服使用的藥物組合物可根據藥物組合物的製造領域中已知的任何方法來製備，且此類組合物可含有一種或多種諸如以下的試劑：甜味劑、調味劑、染色劑和防腐劑，以提供藥學上精美且可口的製劑。片劑、膠囊等含有與適合用於製造片劑的無毒藥學上可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑和崩解劑，例如玉米澱粉或海藻酸；粘合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
適合用於口服施用的片劑、膠囊等可未包衣或通過已知技術包衣，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收且由此提供持續作用。例如，可使用時間延遲材料，諸如單硬脂酸甘油酯或雙硬脂酸甘油酯。其還可通過本領域中已知用於形成用於控制釋放的滲透性治療片劑的技術包衣。另外試劑包括生物可降解或生物相容粒子或聚合物，諸如聚酯、聚氨酸、水凝膠、聚乙烯吡咯啶酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸魚精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以控制所施用組合物的遞送。例如，口服試劑可俘獲於微膠囊中，所述微膠囊分別通過使用羥甲基纖維素或明膠-微膠囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊通過團聚技術或通過界面聚合來製備；或俘獲於膠體藥物遞送系統中。膠體分散系統包括巨分子複合物、納米膠囊、微球、微珠粒和基於脂質的系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體。製備脂質體的方法描述於例如美國專利號4,235,871、4,501,728和4,837,028中。用於製備以上所提及的製劑的方法對本領域的技術人員而言將顯而易見。
用於口服使用的製劑還可以硬明膠膠囊形式存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(碳酸鈣、磷酸鈣、高嶺土或微晶纖維素)混合；或以軟明膠膠囊形式存在，其中活性成分與水或油介質(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水性懸浮液含有與適合用於其製造的賦形劑混合的活性材料。此類賦形劑可以是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯-吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或潤溼劑，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或環氧烷與脂肪酸的縮合產物(例如聚氧-乙烯硬脂酸酯)，或環氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產物(例如十七亞乙基氧基十六醇)，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸的偏酯和己糖醇的縮合產物(例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸的偏酯和己糖醇酸酐的縮合產物(例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑。
油性懸浮液可通過將活性成分懸浮於植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油(諸如液體石蠟)中來配製。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或十六烷醇。可添加諸如以上所闡述的那些的甜味劑和調味劑以提供可口口服製劑。
適合用於通過添加水來製備水性懸浮液的可分散性粉末和顆粒提供與分散劑或潤溼劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。適合的分散劑或潤溼劑和懸浮劑例示於本文中。
本公開的藥物組合物還可呈水包油乳液形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油；或礦物油，例如液體石蠟；或這些物質的混合物。適合的乳化劑可以是天然存在的樹膠，例如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酸酐，例如脫水山梨糖醇單油酸酯；以及偏酯與環氧乙烷的縮合產物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
製劑還可包含載體以防止組合物自體內快速降解或消除，諸如控制釋放製劑，包括植入物、脂質體、水凝膠、前藥和微囊封遞送系統。例如，可單獨或與蠟組合使用時間延遲材料，諸如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公開涵蓋以用於直腸施用藥物的栓劑形式施用複合物。栓劑可通過將藥物與適合的非刺激性賦形劑混合來製備，所述非刺激性賦形劑在常溫下為固體，但在直腸溫度下為液體，且因此將在直腸中融化以釋放藥物。此類材料包括但不限於可可脂和聚乙二醇。
由本公開涵蓋的複合物可呈當前已知或將來研發的任何其他適合的藥物組合物(例如用於鼻內或吸入用途的噴劑)形式。
製劑中多肽的複合物的濃度可在很大程度上不同(例如以重量計自小於約0.1％(通常等於或至少約2％)至多達20％至50％或更多)，且將通常主要基於流體體積、粘度和基於受試者的因素根據例如所選特定施用模式來選擇。
本文涵蓋使用Nano Precision Medical的貯庫遞送技術(Nano Precision Medical；Emeryville,CA)。所述技術使用氧化鈦納米管膜，其產生諸如蛋白質和肽治療劑的巨分子的零級釋放速率。生物相容膜容納於小的皮下植入物中，從而提供治療劑巨分子的長期(例如長至一年)、恆定速率遞送。所述技術當前正在關於遞送GLP-1激動劑以治療II型糖尿病進行評估。在某些實施方案中，本文所公開的複合物可以是膜存在下的製劑。例如，複合物可滲透至膜中或由膜包圍。膜可呈圓片、管或球形。在某些實施方案中，管可以是納米管或球可以是納米球。
施用途徑
本公開涵蓋以任何適當的方式施用所公開的複合物及其組合物。適合的施用途徑包括胃腸外(例如肌肉內、靜脈內、皮下(例如注射或植入)、腹膜內、腦池內、關節內、腹膜內、腦內(實質內)和腦室內)、經口、鼻內、陰道、舌下、眼內、直腸、局部(例如經皮)、舌下和吸入。
通常是皮下或肌肉內施用的貯庫注射還可用於歷經限定時間段釋放本文所公開的複合物。貯庫注射通常是基於固體或基於油的且通常包含本文所闡述的配製組分中的至少一者。本領域的普通技術人員熟悉貯庫注射的可能製劑和用途。
關於抗體，在一個示例性實施方案中，本發明的抗體或抗體片段以10mg/ml儲存於無菌等滲水性鹽水溶液中，以用於在4℃下注射，且在100ml或200ml 0.9％氯化鈉中稀釋，以便在向受試者施用之前注射。抗體通過靜脈內輸注歷經1小時的過程以0.2與10mg/kg之間的劑量施用。在其他實施方案中，抗體通過靜脈輸注歷經15分鐘與2小時之間的時間施用。在其他實施方案中，施用程序經由皮下快速注射進行。
本公開涵蓋以下方法，其中本公開的複合物每天至少兩次、每天至少一次、每48小時至少一次、每72小時至少一次、每周至少一次、每2周至少一次或每月一次向受試者施用。
組合療法
本公開涵蓋與一種或多種活性治療劑或其他預防或治療形式組合使用本文所提供的複合物。在此類組合療法中，各種活性劑經常具有不同作用機制。此類組合療法可因允許藥劑中的一者或多者的劑量降低，從而降低或消除與藥劑中的一者或多者相關的有害影響而尤其有利；此外，此類組合療法可對潛在疾病、病症或病狀具有協同治療或預防作用。
如本文所用，「組合」意指包括可分開施用，例如分開配製以分開施用(例如，如可以試劑盒形式提供)的療法，和可以單一製劑(即「共製劑」)形式一起施用的療法。
在某些實施方案中，複合物連續施用或施加，例如其中一種藥劑在一種或多種其他藥劑之前施用。在其他實施方案中，複合物同時施用，例如其中兩種或更多種藥劑在相同或大致相同時間施用；兩種或更多種藥劑可存在於兩種或更多種分開的製劑中或組合至單一製劑(即共製劑)中。無論兩種或更多種藥劑連續抑或同時施用，均將其視為出於本公開的目的組合施用。
本公開的複合物可與適合用於治療、預防、抑制或緩解本文所闡述的疾病、病症或病狀的其他藥劑組合使用，所述其他藥劑包括通常向患有以下疾病的受試者施用的那些：肥胖症、飲食紊亂、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐症和其他葡萄糖代謝病症。
本公開涵蓋與包括以下的許多藥劑(及其多種類別)的組合療法：1)胰島素、胰島素模擬物和需要刺激胰島素分泌的藥劑，包括磺醯脲(例如氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、乙醯苯磺醯環已脲(acetohexamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide))和美格替奈(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)(PRANDIN)和那格列奈(STARLIX))；2)雙胍(例如二甲雙胍(metformin)(GLUCOPHAGE))及其藥學上可接受的鹽，尤其二甲雙胍鹽酸鹽，及其延長釋放製劑，諸如GlumetzaTM、FortametTM和GlucophageXRTM)和通過促進葡萄糖利用、降低肝葡萄糖產生和/或減少腸葡萄糖輸出起作用的其他藥劑；3)α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(miglitol))和減緩碳水化合物消化且因此減緩內臟的吸收且減輕餐後高血糖的其他藥劑；4)噻唑烷二酮(例如羅格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、格列吡嗪、巴格列酮(balaglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、萘格列酮(netoglitazone)、AMG 131、MBX2044、米格列酮(mitoglitazone)、羅格列酮(lobeglitazone)、IDR-105、曲格列酮、恩格列酮(englitazone)、噻格列酮(ciglitazone)、阿格列酮(adaglitazone)、達格列酮(darglitazone)，其增強胰島素作用(例如通過胰島素敏化)，包括胰島素和胰島素模擬物(例如德谷胰島素(insulin degludec)、甘精胰島素(insulin glargine)、賴脯胰島素(insulin lispro)、地特胰島素(insulin detemir)、谷賴胰島素(insulin glulisine)及各自的可吸入製劑)，因此促進周邊組織中的葡萄糖利用；5)胰高血糖素樣肽，包括DPP-IV抑制劑(例如阿格列汀(alogliptin)、奧格列汀(omarigliptin)、利格列汀(linagliptin)、維格列汀(vildagliptin)(GALVUS)和西格列汀(sitagliptin)(JANUVIA))和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和GLP-1激動劑及類似物(例如艾塞那肽(exenatide)(BYETTA和ITCA 650(一種皮下插入的滲透泵，其歷經12個月時間遞送艾塞那肽類似物；Intarcia,Boston,MA))和GLP-1受體激動劑(例如杜拉魯肽(dulaglutide)、索馬魯肽(semaglutide)、阿必魯肽(albiglutide)、艾塞那肽、利拉魯肽(liraglutide)、利西那肽(lixisenatide)、他司魯肽(taspoglutide)、CJC-1131和BIM-51077，包括其鼻內、經皮和每周一次製劑)；6)以及DPP-IV-抗性類似物(腸促胰島素模擬物)、PPARγ激動劑、PPARα激動劑(諸如非諾貝特酸(fenofibric acid)衍生物(例如吉非羅齊(gemfibrozil)、氯貝特(clofibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、苯扎貝特(bezafibrate)))、雙效PPAR激動劑(例如ZYH2、ZYH1、GFT505、西格列扎(chiglitazar)、莫格列扎(muraglitazar)、阿格列扎(aleglitazar)、索格列扎(sodelglitazar)和那格列扎(naveglitazar)、全效PPAR激動劑、PTP1B抑制劑(例如ISIS-113715和TTP814)、SGLT抑制劑(例如ASP1941、SGLT-3、恩格列淨(empagliflozin)、達格列淨(dapagliflozin)、卡格列淨(canagliflozin)、BI-10773、PF-04971729、瑞格列淨(remogloflozin)、TS-071、託格列淨(tofogliflozin)、伊格列淨(ipragliflozin)和LX-4211)、胰島素促分泌素、血管緊張素轉化酶抑制劑(例如阿拉普利(alacepril)、貝那普利(benazepril)、卡託普利(captopril)、西羅普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那拉普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、咪達普利(imidapril)、賴諾普利(lisinopril)、莫維普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)或群多普利(trandolapril))、血管緊張素II受體拮抗劑(例如氯沙坦(losartan)(即)、纈沙坦(valsartan)、坎地沙坦(candesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、替米沙坦(telmesartan)及與氫氯噻嗪(諸如)組合使用的這些藥物中的任一者)或其他抗高血壓藥物，諸如LCZ 696、RXR激動劑、糖原合酶激酶-3抑制劑、免疫調節劑、交感神經阻滯劑、β-腎上腺素能阻斷藥(例如普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡維洛爾(carvedilol)、美託洛爾(metoprolol)或酒石酸美託洛爾)、α腎上腺素能阻斷藥(例如多沙唑嗪(doxazocin)、哌唑嗪(prazocin)或α甲基多巴(methyldopa))中樞α腎上腺素能激動劑、周邊血管擴張劑(例如肼苯噠嗪(hydralazine))；β-3腎上腺素能受體激動劑、11β-HSD1抑制劑、中性內肽酶抑制劑(例如噻奧芬(thiorphan)和磷醯胺素(phosphoramidon))、醛固酮拮抗劑、醛固酮合酶抑制劑、腎素抑制劑(例如二肽和三肽的脲衍生物(參見美國專利號5,116,835)、胺基酸和衍生物(美國專利5,095,119和5,104,869)、由非肽鍵連接的胺基酸鏈(美國專利5,114,937)、二肽和三肽衍生物(美國專利5,106,835)、肽基氨基二醇(美國專利5,063,208和4,845,079)和肽基β-氨基醯基氨基二醇氨甲酸酯(美國專利5,089,471)；另外，如以下美國專利中所公開的多種其他肽類似物：5,071,837；5,064,965；5,063,207；5,036,054；5,036,053；5,034,512和4,894,437，和小分子腎素抑制劑(包括二醇磺醯胺和亞磺醯基(美國專利5,098,924)、N-嗎啉基衍生物(美國專利5,055,466)、N-雜環乙醇(美國專利4,885,292)和吡咯咪唑酮(美國專利5,075,451)；以及胃酶抑素衍生物(美國專利4,980,283)和含斯達酮(statone)的肽的氟衍生物和氯衍生物(美國專利5,066,643)、依那吉侖(enalkrein)、RO 42-5892、A 65317、CP 80794、ES 1005、ES 8891、SQ 34017、阿利吉侖(aliskiren)(2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-氨甲醯基-2-甲基丙基)-5-氨基-4-羥基-2,7-二異丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)-苯基]-辛醯胺半富馬酸酯)SPP600、SPP630和SPP635)、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5抑制劑(例如西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalfil)和伐地那非(vardenafil))、血管擴張劑、鈣離子通道阻斷劑(例如氨氯地平(amlodipine)、硝苯地平(nifedipine)、維拉帕米(veraparmil)、地爾硫卓(diltiazem)、戈洛帕米(gallopamil)、尼魯地平(niludipine)、尼莫地平(nimodipins)、尼卡地平(nicardipine))、鉀通道活化劑(例如尼可地爾(nicorandil)、吡那地爾(pinacidil)、克羅卡林(cromakalim)、米諾地爾(minoxidil)、阿普卡林(aprilkalim)、氯普唑侖(loprazolam))、降脂質劑，例如HMG-CoA還原酶抑制劑，諸如辛伐他汀(simvastatin)和洛伐他汀(lovastatin)，其以呈內酯前藥形式的和形式出售且在施用之後充當抑制劑；和二羥基開環酸HMG-CoA還原酶抑制劑的藥學上可接受的鹽，諸如阿伐他汀(atorvastatin)(尤其以出售的鈣鹽)、羅伐他汀(rosuvastatin)(尤其以出售的鈣鹽)、普伐他汀(pravastatin)(尤其以出售的鈉鹽)、西立伐他汀(cerivastatin)和氟伐他汀(尤其以出售的鈉鹽)；膽固醇吸收抑制劑，諸如依替米貝(ezetimibe)和與諸如以上提及的HMG-CoA還原酶抑制劑的任何其他降脂質劑且尤其與辛伐他汀或與阿伐他汀鈣組合的依替米貝；增加HDL的藥物(例如煙酸和煙酸受體激動劑)及其延長或控制釋放型式和/或加上HMG輔酶A還原酶抑制劑；諸如阿西莫司(acipimox)和阿西呋喃(acifran)的煙酸受體激動劑以及煙酸受體部分激動劑；胰高血糖素受體拮抗劑(例如MK-3577、MK-0893、LY-2409021和KT6-971)；膽汁酸螯合劑(例如考來替蘭(colestilan)、考來米得(colestimide)、鹽酸考來維侖(colesevalam hydrochloride)、考來替泊(colestipol)、消膽胺(cholestyramine)和交聯葡聚糖的二烷基氨基烷基衍生物)、醯基輔酶A:膽固醇醯基轉移酶抑制劑(例如阿伐米貝(avasimibe))；意圖用於炎症病狀中的藥劑，諸如阿司匹林(aspirin)、非類固醇消炎藥或NSAID、糖皮質素和選擇性環加氧酶-2或COX-2抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKA)(例如AZD6370)；11β-羥基固醇脫氫酶1型的抑制劑(例如美國專利號6,730,690和LY-2523199中公開的那些)；CETP抑制劑(例如安塞曲匹(anacetrapib)、依塞曲匹(evacetrapib)和託塞曲匹(torcetrapib))；果糖1,6-二磷酸酶的抑制劑(例如美國專利號6,054,587；6,110,903；6,284,748；6,399,782；和6,489,476中公開的那些)；乙醯輔酶A羧化酶-1或2的抑制劑(ACC1或ACC2)；PCSK9抑制劑；GPR-40部分激動劑；SCD調節劑；脂肪酸合酶的抑制劑；糊精和糊精類似物(例如普蘭林肽(pramlintide))；包括以上活性劑的化學上可能的藥學上可接受的鹽形式。
此外，本公開涵蓋與諸如刺激代謝或降低食慾的藥劑的用於促進重量減輕的藥劑和方法和用於促進重量減輕的改善的膳食和/或運動方案的組合療法。
本公開的複合物可在所述情況下以適當的任何方式與一種或多種其他藥劑組合使用。在一個實施方案中，在一段時間內維持用至少一種活性劑和至少一種本公開複合物治療。在另一實施方案中，用至少一種活性劑的治療減少或停止(例如當受試者穩定時)，同時用本公開複合物的治療維持在恆定給藥方案。在另一實施方案中，用至少一種活性劑的治療減少或停止(例如當受試者穩定時)，同時用本公開複合物的治療減少(例如較低劑量、較不頻繁給藥或較短治療方案)。在另一實施方案中，用至少一種活性劑的治療減少或停止(例如當受試者穩定時)，並且用本公開複合物的治療增加(例如較高劑量、較頻繁給藥或較長治療方案)。在另一實施方案中，用至少一種活性劑的治療維持，並且用本公開複合物的治療減少或停止(例如較低劑量、較不頻繁給藥或較短治療方案)。在另一實施方案中，用至少一種活性劑的治療和用本公開複合物的治療減少或停止(例如較低劑量、較不頻繁給藥或較短治療方案)。
給藥
本公開的複合物可以一定量向受試者施用，所述量取決於例如以下因素：施用目標(例如所需消退程度)；待治療的受試者的年齡、體重、性別以及健康和身體狀況；多肽和/或正在施用的製劑的性質；施用途徑；以及疾病、病症、病狀或其症狀的性質(例如葡萄糖/胰島素調節異常的嚴重性和病症的階段)。給藥方案還可將與正在施用的試劑相關的任何有害作用的存在、性質和程度考慮在內。有效劑量量和給藥方案可由例如安全性和劑量遞增試驗、體內研究(例如動物模型)和熟練的技術人員已知的其他方法容易地確定。
一般而言，給藥參數指示劑量小於可對受試者具不可逆毒性的量(即最大耐受量「MTD」)且不小於為對受試者產生可測量作用所需要的量。此類量將施用途徑和其他因素考慮在內，通過例如與吸收、分布、代謝和排洩(「ADME」)相關的藥物動力學和藥效動力學參數來確定。
有效劑量(ED)是在攝入其的受試者的一些部分中產生治療反應或所需作用的藥劑的劑量或量。藥劑的「半數有效劑量」或ED50是藥劑在施用其的群體的50％中產生治療反應或所需作用的劑量或量。雖然ED50常用為對藥劑的作用的合理預期的度量，但其未必是臨床醫師將全部相關因素考慮在內可能認為適當的劑量。因此，在一些情況下有效量大於所計算的ED50，在其他情況下，有效量小於所計算的ED50，且在其他情況下，有效量與所計算的ED50相同。
此外，本公開的複合物的有效劑量可以是當以一次或多次劑量向受試者施用時相對於健康受試者產生所需結果的量。例如，有效劑量可以是當向具有增加的血糖和/或血漿胰島素的受試者施用時，相對於健康受試者實現至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或超過80％的所需降低的劑量。
適當劑量水平通常將是每千克患者體重每天約0.001至100mg/kg，其可以單次或多次劑量施用。在一些實施方案中，劑量水平將是每天約0.01至約25mg/kg，而在其他實施方案中是每天約0.05至約10mg/kg。適合的劑量水平可以是每天約0.01至25mg/kg、每天約0.05至10mg/kg或每天約0.1至5mg/kg。在此範圍內，劑量可以是每天0.005至0.05、0.05至0.5或0.5至5.0mg/kg。
對於口服藥劑的施用，組合物可以片劑、膠囊等形式提供，其含有1.0至1000毫克的活性成分，具體地說1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的活性成分。複合物可按例如每天1至4次且往往每天一次或兩次的方案施用。
本公開的複合物的劑量可以適當頻率重複，所述適當頻率可在每天一次至每月一次範圍內，這取決於複合物的藥物動力學(例如半衰期)和藥效動力學反應(例如複合物的治療作用的持續時間)。在一些實施方案中，給藥經常在每周一次、每兩周一次、每月一次之間進行重複。在其他實施方案中，複合物可約每月施用一次。
在某些實施方案中，所公開複合物的劑量含於「單位劑型」中。短語「單位劑型」是指物理離散單元，各單元含有足以產生所需作用且單獨或與一種或多種其他藥劑組合的預定量的本公開複合物。應了解，單位劑型的參數將取決於特定藥劑和待實現的作用。
試劑盒
本公開還涵蓋包含所公開複合物及其藥物組合物的試劑盒。試劑盒通常如以下所描述呈容納各種部件的物理結構形式，且可用於例如實踐上文所描述的方法(例如向需要減輕重量的受試者施用複合物)。
試劑盒可包括本文所公開的複合物(提供於例如無菌容器中)中的一者或多者，其可呈適合用於向受試者施用的藥物組合物形式。複合物可以即用形式或以例如需要在施用之前復水或稀釋的形式提供。當複合物呈需要由使用者復水的形式時，試劑盒還可包括緩衝劑、藥學上可接受的賦形劑等，其與複合物一起或分開包裝。當涵蓋組合療法時，試劑盒可分開地含有若干試劑或其可已組合於試劑盒中。試劑盒的各部件可封閉於個別容器內且各種容器全部可在單一包裝內。本發明的試劑盒可設計用於適當維持部件容納於其中所必需的條件(例如冷藏或冷凍)。
試劑盒可含有包括其中部件的鑑別信息及其使用說明的標籤或包裝插頁(例如給藥參數、活性成分的臨床藥理學(包括作用機制)、藥物動力學和藥效動力學、有害作用、禁忌等)。標籤或插頁可包括製造商信息，諸如批號和到期日期。標籤或包裝插頁可例如整合至容納部件的物理結構中、分開地含於物理結構內或固定至試劑盒的部件(例如安瓿、管或小瓶)。示例性說明書包括關於用所公開的調節劑及其藥物組合物減少或降低血糖、治療高血糖症、治療糖尿病等的說明。
標籤或插頁可另外包括或併入諸如以下的計算機可讀介質中：磁碟(例如硬碟、卡、存儲磁碟)、光碟(諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM)、DVD、MP3、磁帶或電存儲介質(諸如RAM和ROM)或這些介質的混合形式，諸如磁/光存儲介質、FLASH介質或記憶型卡。在一些實施方案中，實際說明書不存在於試劑盒中，但提供用於自遠端源獲得說明書的方式，例如經由網際網路。
實驗
提出以下實施例以便為本領域的普通技術人員提供關於如何製備和使用本發明的完全公開內容和描述，且不意圖限制發明者視為其發明的內容的範圍，其也不意圖表示以下實驗為所有實驗或僅為所進行的實驗。已努力確保關於所用數字(例如量、溫度等)的準確性，但應考慮一些實驗誤差和偏差。
除非另外指示，否則份為重量份，分子量為重均分子量，溫度以攝氏溫度(℃)計，且壓力在大氣壓下或大氣壓附近。使用包括以下的標準縮寫：bp＝鹼基對；kb＝千鹼基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分鐘；h或hr＝小時；aa＝胺基酸；kb＝千鹼基；nt＝核苷酸；ng＝納克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩爾；mM＝毫摩爾；M＝摩爾；kDa＝千道爾頓；i.m.＝肌肉內；i.p.＝腹膜內；s.c.＝皮下；bid＝每天兩次；HPLC＝高效液相色譜法；BW＝體重；U＝單位；ns＝非統計顯著性；PG＝空腹血糖；FPI＝空腹血漿胰島素；ITT＝胰島素耐受性測試；PTT＝丙酮酸鹽耐受性測試；oGTT＝口服葡萄糖耐受性測試；GSIS＝葡萄糖刺激胰島素分泌；PBS＝磷酸鹽緩衝鹽水；PCR＝聚合酶鏈式反應；NHS＝N-羥基丁二醯亞胺；DMEM＝杜爾貝科氏改良的伊格爾氏培養基(Dulbeco’s Modification of Eagle’s Medium)；GC＝基因組拷貝；EDTA＝乙二胺四乙酸。
材料和方法
以下方法和材料用於以下實施例中。
動物。使膳食誘導肥胖(DIO)雄性C57BL/6J小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)維持含有60千卡％脂肪、20千卡％蛋白質和20千卡％碳水化合物的高脂肪膳食(D12492，Research Diets,Inc,New Brunswick,NJ)持續12-20周。所有動物研究均由NGM學會動物護理和使用委員會批准。DIO C57BL/6J小鼠提供類似人的肥胖症模型，其中肥胖症是基於卡路裡的過度攝入。C57BL/6J小鼠具有肥胖症傾向，其中觀察到顯著重量增加以及高胰島素血症和偶爾的高血糖症。菌株是最常用於模型化膳食誘導肥胖症的小鼠菌株。(Nilsson C.等人,Acta Pharmacologica Sinica(2012)33:173-181)。
核酸和胺基酸序列。基因庫登錄號BC000529.2闡述了編碼人GDF15變體的ORF的cDNA，且基因庫登錄號NP_004855.2闡述了由cDNA編碼的胺基酸序列。Fc-融合配偶體的cDNA在InvivoGen購買(pFUSE-CHIg-hG1，基因庫：AY623427.1，蛋白質ID＝AAT49050)且如所指示進行修飾。由pFUSE-CHIg-hG1載體編碼的Fc-融合配偶體的胺基酸序列是：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:55)
表達構建體的構建。將哺乳動物表達載體pTT5(加拿大國家研究委員會(National Research Council Canada))通過在PmeI與EcoRI位點之間插入Kozak元件和以下人IgK-信號肽序列來進行修飾：(CACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT)(SEQ ID NO:56)。雖然消除了兩個限制性位點，但產生了用於所分泌因子的進一步框內克隆的AgeI位點。對於單片段插入(例如人IgG1的Fc部分)，使用In-Fusion技術(Clontech)。對於兩個或更多個PCR產生的片段(即hIgG1-Fc+GDF15)的插入，根據製造商方案使用Gibson Assembly Master Mix(NEB)進行。將所有PCR片段均通過Sapphire PCR mix擴增且使用Qiagen凝膠萃取試劑盒進行凝膠純化。將TOP10電子感受態細胞(Life Technologies)以克隆反應轉化，塗鋪於含有卡本西林(carbenicillin)的LB-瓊脂平板上且在37℃下孵育過夜。拾取單菌落且通過測序進行分析。將來自陽性菌落的DNA擴增(DNA-Maxi-prep，Qiagen)，充分驗證序列且用於轉染用於重組蛋白表達的哺乳動物細胞。
為產生特定突變蛋白，用QuikChange Lightning或QuikChange Lightning多定點誘變試劑盒(Agilent)和適當引物遵循製造商方案進行定點誘變。
(Fc/Fc)-GDF15融合分子、野生型GDF15和GDF15-糖突變蛋白表達。自在Expi 293F細胞(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中的瞬時轉染物回收所有分子。將細胞常規地在Expi表達培養基(Invitrogen)中再次培養且以懸浮液培養物形式維持在各種型號的搖瓶中。通常，將細胞以5e5活細胞/毫升的細胞密度再次培養且在再次培養之前使其生長3天。將燒瓶維持在攪拌速率在110RPM下的New Brunswick振蕩器平臺(New Brunswick Scientific Company,Edison,NJ)上的溼潤CO2孵育器(37℃和5％CO2)中。
當在大於95％活力下培養物的細胞密度達到2.5e6活細胞/毫升時進行轉染。通常，對於50mL轉染，將2.5e6細胞/毫升×50mL細胞以42.5mL培養物體積接種於250mL搖瓶中。首先，將五十微克(50μg)由含有目標基因的表達載體組成的質粒DNA在2.5mL OPTI-MEM還原型血清培養基(Invitrogen)中稀釋。同時，還將2.67倍體積(於質粒DNA的量)的Expifectamine轉染試劑(Invitrogen)在2.5mL OPTI-MEM還原型血清培養基中稀釋。在室溫下孵育5分鐘之後，將稀釋的轉染試劑添加至稀釋的質粒DNA中以形成轉染勝任型複合物。在室溫下另一20分鐘孵育期之後，將5mL轉染複合物添加至42.5mL細胞培養物中。然後，將轉染細胞放置於維持在110RPM下的迴轉式振蕩器上的溼潤CO2孵育器中。轉染後二十四小時，為轉染培養物饋入250μL增強劑1溶液(Invitrogen)和2.5mL增強劑2溶液(Invitrogen)。然後，將培養物再放置於迴轉式振蕩器上的溼潤CO2孵育器中。轉染後六至七天，通過在3000RPM下離心30分鐘收穫培養物，然後經由0.2μm過濾器(Nalgene)過濾。然後，分析樣品在考馬斯染色凝膠(commassie stain gel)上的表達。
重組蛋白的純化。在純化之後，評估在條件培養基(CM)中表達的(Fc/Fc)-GDF15分子的回收率和活性。使CM通過負載容量不大於每毫升樹脂20mg/mL的mAb SelectSuRe柱(GE)。對於回收率評估，CM體積在50mL-1000mL範圍內。在mAb SelectSuRe負載CM之後，將柱用5-10柱體積的1XPBS(Corning Cellgro)洗滌，隨後是用低pH值甘氨酸緩衝液(Polysciences Inc)洗脫的步驟。洗脫之後，將(Fc/Fc)-GDF15匯集物用1M Tris pH 8.0(Teknova)中和pH值且然後注射至在1XPBS(Corning Cellgro)中預平衡的Superdex200(GE)柱上。將(Fc/Fc)-GDF15完整、完全組裝分子的級分匯集且評估純度並使用適當消光係數和分子量經由A280方法定量以測定基於起始CM體積的回收率。完全組裝分子是兩個異二聚體的二聚體-二聚體複合物。各異二聚體具有經由鈕入孔相互作用與Fc-GDF15糖突變蛋白締合的Fc，且兩個異二聚體經由GDF15-GDF15相互作用締合。
WT GDF15和GDF15糖突變蛋白的純化。將不綴合至Fc的野生型GDF15和GDF15糖突變蛋白使用離子交換捕獲自培養基中純化。將WT GDF15和GDF15糖突變蛋白使用有助於最佳洗脫的適當鹽/pH梯度洗脫且與宿主細胞蛋白質雜質分離。然後，所有GDF15分子均使用降低的硫酸銨線性梯度在pH 8.0下使用GE HiTrap苯基HP進一步純化。基於經由非還原型SDS-PAGE凝膠上的凝膠位移所得的純度和糖基化性質評估級分且進行匯集。類似於(Fc/Fc)-GDF15分子，野生型GDF15和GDF15糖突變蛋白是使用IgK信號肽表達的。
實施例1：異二聚鈕入孔(Fc/Fc)-GDF15融合分子的設計
Fc-GDF15設計描述於圖1中且一級序列展示如下(構建體B1a/b-B19a/b)。為實現Fc-GDF15分子的多產組裝，將有效系統設計成允許Fc/Fc二聚化，同時允許GDF15/GDF15二聚化。為避免單鏈Fc-GD F15的錯摺疊和聚集可能性，將異二聚融合配偶體設計成使得Fc/Fc相互作用允許高靈敏度GDF15/GDF15同二聚化。設計鈕入孔Fc/Fc異二聚體以解決Expi 293F瞬時系統的GDF15組裝和分泌。Fc/Fc異二聚鈕入孔系統使用與(G4S)n接頭(n＝2、3、4或5)和GDF15偶聯的[T366Y(鈕)//Y407T(孔)]或[T366W(鈕)//T366S-L368A-Y407V(孔)]系統評估。應指出，Fc的CH3結構域中胺基酸位置的編號是基於EU編號系統進行(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))。在所有情況下，Fc-融合(鈕/孔)配偶體偶聯至包含胺基酸殘基A1-I112、R2-I112、N3-I112、G4-I112、D5-I112、H6-I112或C7-I112的成熟GDF15的N末端。併入GDF15的N末端的截短(Δ1＝R2-I112、Δ2＝N3-I112、Δ3＝G4-I112、Δ4＝D5-I112、Δ5＝H6-I112或Δ6＝C7-I112)以增強穩定性，因為先前已證實N末端的序列(ARNGDH，SEQ ID NO:95)為具有蛋白水解敏感性的位點，且N末端截短相較於不包括這些N末端截短的GDF15提供優異穩定性。
圖1A-1D描述與異二聚Fc配偶體(鏈B)上的相應孔與鈕偶聯、與含有兩個分子間二硫鍵或沒有鉸鏈結構域(Δ鉸鏈)的野生型IgG鉸鏈偶聯的Fc-GDF15(鏈A)上鈕與孔的位置。對於Fc異二聚鈕或孔A/B鏈，引入AA突變(APELLGGP(SEQ ID NO:96)→APALAGGP(SEQ ID NO:97))以去除IgG1效應子功能。將(Fc/Fc)-GDF15異二聚鈕入孔設計關於組裝進行表達分析且報導於圖2A中。在所有情況下，鈕入孔(Fc/Fc)-GDF15的瞬時表達在純化之後產生回收率在0mg/L與74.9mg/L之間的恰當組裝產物(0＝聚集物/無表達，100mg/L)。在所有情況下，鈕入孔異二聚Fc/Fc-GDF15分子的組裝和分泌伴隨有各種汙染水平的錯摺疊同二聚物質，諸如Fc(孔):Fc(孔)、Fc(鈕):Fc(鈕)、Fc(鈕)-GDF15:Fc(鈕)-GDF15和Fc(孔)-GDF15:Fc(孔)-GDF15。基於表達分析，發現與異二聚Fc配偶體鏈上的T366S-L368A-Y407V(孔)偶聯(圖1D)的位於Fc-GDF15鏈上的T366W(鈕)產生具有最大穩定性且使Fc/Fc-同二聚產物的錯配降至最少的產物(圖2A-變體B5a/B5b)。這種設計是進一步表達工程化和優化的焦點。
瞬時表達Expi 293F來源的變體B5a/B5b回收率提供在0.0mg/L至24.9mg/L範圍內的回收率。為增強表達、組裝和回收，在GDF15的成熟序列內引入N-糖基化位點(圖1F)。在所設計的構建體中，GDF15上單一N-連接聚糖共有位點的存在顯著改善完全成熟(Fc/Fc)-GDF15鈕入孔異二聚體B5a/B5b的表達、組裝和回收(圖2A-變體B9a/B9b至B19a/B19b)。經由體外測定發現，對於受體結合和活性，接頭長度在(G4S)n中n＝5時為最佳。位置D5T上聚糖的存在完全移除成熟GDF15的位置N3上的一級脫醯胺位點，且如在實施例2中所證明似乎進一步增強分子的穩定性。
提出GDF15的序列內N-連接聚糖的存在幫助表達且使因由於在分泌過程中在內質網和高爾基體(Golgi Apparatus)中增加的滯留時間而累積所產生的錯摺疊產物減至最少。提出這種額外滯留時間對摺疊動力學具有有益作用，且使得異二聚(Fc/Fc)鈕入孔配對和自哺乳動物組織培養物的回收顯著改進。
以下提供變體(B1a/b-B19a/b)的序列。在以下展示的序列中，人IgK信號肽呈小寫字體形式，隨後是Fc序列。在還包括接頭和GDF15序列的序列中，Fc序列後面是接頭序列(加下劃線)，接頭序列後面是GDF15序列(粗體)。Fc序列中胺基酸取代的位置的編號是基於EU編號，取代相對於存在於人IgG1Fc(SEQ ID NO:2)中的相應位置的胺基酸。GDF15序列中N末端缺失和胺基酸取代的編號是相對於野生型人成熟GDF15(SEQ ID NO:1)。
B1a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366Y)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B1b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(Y407T)
B2a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(Y407T)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B2b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366Y)
B3a：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈,AA)(T366Y)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B3b：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈,AA)(Y407T)
B4a：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈,AA)(Y407T)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B4b：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈,AA)(T366Y)
B5a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B5b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B6a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)-(G4S)5-ΔN6-GDF15(C7-I112)
B6b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)
B7a：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈,AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)
B7b：hIgK-hIgG1-Fc(Δ鉸鏈AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B8a：hIgK-hIgG1-Fc(Δh,AA)(T366S)(L368A)(Y407V)-(G4S)5-ΔN6-GDF15(C7-I112)
B8b：hIgK-hIgG1-Fc(Δh,AA)(T366W)
B9a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)3-GDF15(A1-I112)(D5T)
B9b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B10a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)4-GDF15(A1-I112)(D5T)
B10b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B11a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-GDF15(A1-I112)(D5T)
B11b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B12a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)2-ΔN2-GDF15(N3-I112)(D5T)
B12b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B13a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN2-GDF15(N3-I112)(D5T)
B13b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B14a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(R21N)
B14b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B15a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(S23N/E25T)
B15b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B16a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(F52N/A54T)
B16b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B17a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(R53N/A55T)
B17b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B18a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(K91N/D93T)
B18b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
B19a：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366W)-(G4S)5-ΔN3-GDF15(G4-I112)(D93N/G95T)
B19b：hIgK-hIgG1-Fc(AA)(T366S)(L368A)(Y407V)
圖2B中所列的野生型人成熟GDF15(SEQ ID NO:1)和GDF15糖突變蛋白的序列如下：
IgK-野生型人成熟GDF15
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:108)
IgK-GDF15-糖突變蛋白R21N
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVNASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:109)
IgK-GDF15-糖突變蛋白R53N/A55T
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFNATNMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:110)
IgK-GDF15-糖突變蛋白S64N/H66T
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTNLTRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:111)
IgK-GDF15-糖突變蛋白P70N
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKNDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:112)
IgK-GDF15-糖突變蛋白Q90N
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLINKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:113)
IgK-GDF15-糖突變蛋白K91N/D93T
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQNTTTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:114)
IgK-GDF15-糖突變蛋白D93N/G95T
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTNTTVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:115)
IgK-GDF15-糖突變蛋白G95N
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTNVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:116)
IgK-GDF15-糖突變蛋白S97N/Q99T
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVNLTTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:117)
IgK-GDF15-糖突變蛋白L98N
mdmrvpaqllgllllwlrgarcARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSNQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:118)
GDF15分子使用IgK信號肽表達，所述IgK信號肽由293細胞所表達的信號肽酶自所分泌的多肽上裂解掉。野生型人成熟GDF15(SEQ ID NO:1)和GDF15糖突變蛋白的回收率列於圖2B中。
可以Fc-Fc(鈕/孔)GDF15糖突變蛋白表示的示例性GDF15糖突變蛋白描述於2015年7月28日提交的USSN14/811,578中。
實施例2：在DIO小鼠模型中(Fc/Fc)-GDF15融合分子對體重和食物攝入的影響
歷經35天的時間評價皮下施用的具有融合至重組人GDF15的重組Fc-異二聚體的融合分子(即兩個異二聚體的複合物，各異二聚體具有與Fc-GDF15糖突變蛋白多肽二聚化的Fc多肽)對體重的影響。簡言之，以單次皮下快速注射(10mL/kg)形式以0.4nmol/kg和4nmol/kg的劑量向稱重約35-40g的DIO小鼠每周施用融合分子B9a/B9b、B11a/B11b和B13a/B13b持續21天。在施用媒介物對照或融合分子之後，歷經35天時間段在各個時間點監測體重減輕，所述35天時間段包含21天蛋白質給藥，隨後是14天衝洗(劑量後)以監測功效。
如圖3-6中所展示，以0.4nmol/kg和4nmol/kg的劑量施用Fc融合分子(異二聚體-異二聚體複合物)產生顯著體重減輕。在各組小鼠中，n＝6且通過學生未配對T-檢驗在各指定時間點與媒介物對照組相比較來測定p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，ns＝不顯著)。如圖7中所展示，顯示在對所有組取樣的各時間點使用SEM分析的總體重。如圖8中所展示，顯示在對所有組取樣的各時間點使用SEM分析的體重變化(g)和p值。如圖9中所展示，顯示在對所有組取樣的各時間點使用SEM分析的體重變化百分比(％)和p值。
如圖3和5中所展示，在0.4nmol/kg劑量研究中，與B9a/B9b和B11a/B11b相比，在B13a/B13b的體重減輕中存在所觀察到的增加的功效。B13a/B13b的增加的體內功效歸因於由於GDF15的2個N末端殘基的截短(ΔAR)而產生的增強的穩定性。
本文描述了本發明的特定實施方案，包括發明人已知用於進行本發明的最佳模式。在閱讀前述描述後，所公開實施方案的變化對於在本領域中工作的個體而言可變得顯而易見，且預期那些熟練的技術人員可在適當時使用此類變化。因此，本發明意圖可不同於如本文所具體描述進行實踐，且如由適用法律所允許本發明意圖包括在此所附權利要求中所敘述的主題物的所有修改和等效形式。此外，除非本文另外指出或以其他方式上下文明顯矛盾，否則以上所描述的呈所有可能變化形式的要素的任何組合均由本發明涵蓋。
本說明書所引用的所有出版物、專利申請、登錄號和其他參考文獻以引用的方式併入本文中，如同指示各個別出版物或專利申請具體地且單獨地以引用的方式併入一般。
序列表
NGM生物製藥有限公司
沈文彥
D·林德浩特
R·霍爾丹卡
H·梅特恩
用於治療代謝疾病的組合物和方法
NGMB-142WO
US 62/073,737
2014-10-31
US 62/244,604
2015-10-21
136
PatentIn 3.5版
1
112
PRT
智人
1
Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
2
232
PRT
智人
2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
3
347
PRT
人工序列
合成多肽序列
3
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Gly Thr
225 230 235 240
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
245 250 255
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
260 265 270
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
275 280 285
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
290 295 300
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
305 310 315 320
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
325 330 335
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
340 345
4
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
5
362
PRT
人工序列
合成多肽序列
5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Gly Thr His
245 250 255
Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala
260 265 270
Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu
275 280 285
Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp
340 345 350
Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
355 360
6
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
7
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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8
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
8
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Pro Gly Lys
225
9
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
9
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10
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
10
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Pro Gly Lys
225
11
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
11
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys
245 250 255
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275 280 285
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355 360
12
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
12
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225
13
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
13
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys
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355 360
14
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
14
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Pro Gly Lys
225
15
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
15
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys
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355 360
16
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
16
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195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
17
361
PRT
人工序列
合成多肽序列
17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys
245 250 255
Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser
260 265 270
Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val
275 280 285
Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
355 360
18
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
18
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
19
4
PRT
人工序列
合成多肽序列
19
Gly Gly Gly Ser
1
20
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
20
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
21
4
PRT
人工序列
合成多肽序列
21
Gly Gly Ser Gly
1
22
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
22
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
23
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
23
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
24
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
24
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
25
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
25
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
26
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
26
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
27
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
27
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
28
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
28
Glu Gly Gly Gly Ser
1 5
29
4
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
(2)..(3)
此位置處之胺基酸可以是任何胺基酸
MISC_FEATURE
(4)..(4)
此位置處的胺基酸可以是任何疏水性胺基酸
29
Pro Xaa Xaa Xaa
1
30
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
(2)..(3)
此位置處的胺基酸可以是任何胺基酸
MISC_FEATURE
(4)..(4)
此位置處的胺基酸可以是任何疏水性胺基酸
MISC_FEATURE
(5)..(5)
此位置處的胺基酸可以是任何Ser或Thr
30
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
31
6
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
(2)..(2)
此位置處的胺基酸可以是Leu或Gln
31
Pro Xaa Gly Met Thr Ser
1 5
32
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
(2)..(2)
此位置處的胺基酸可以是Leu或Gln
32
Pro Xaa Gly Met Thr
1 5
33
10
PRT
人工序列
合成多肽序列
33
Cys Gly Leu Val Pro Ala Gly Ser Gly Pro
1 5 10
34
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
34
Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn
1 5 10
35
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
35
Ser Leu Leu Ile Ala Arg Arg Met Pro Asn Phe Asn
1 5 10
36
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
36
Ser Lys Leu Val Gln Ala Ser Ala Ser Gly Val Asn
1 5 10
37
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
37
Ser Ser Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Ala Pro Asp Asn
1 5 10
38
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
38
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Asn
1 5 10
39
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
39
Ser Leu Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser Phe Asn
1 5 10
40
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
40
Ser Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Asn Phe Asn
1 5 10
41
14
PRT
人工序列
合成多肽序列
41
Asp Val Asp Glu Arg Asp Val Arg Gly Phe Ala Ser Phe Leu
1 5 10
42
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
42
Ser Leu Pro Leu Gly Leu Trp Ala Pro Asn Phe Asn
1 5 10
43
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
43
Ser Leu Leu Ile Phe Arg Ser Trp Ala Asn Phe Asn
1 5 10
44
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
44
Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr
1 5 10
45
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
45
Ser Leu Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Phe Asn
1 5 10
46
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
46
Lys Lys Ser Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Val
1 5 10
47
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
47
Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly
1 5 10
48
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
48
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg
1 5 10
49
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
49
Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val
1 5 10
50
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
50
Gly Gly Ser Gly Gln Arg Gly Arg Lys Ala Leu Glu
1 5 10
51
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
51
Ser Leu Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Phe Asn
1 5 10
52
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
52
Ser Leu Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Phe Asn
1 5 10
53
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
53
Ser Leu Leu Gly Ile Ala Val Pro Gly Asn Phe Asn
1 5 10
54
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
54
Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro
1 5 10
55
227
PRT
智人
55
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
56
69
DNA
人工序列
合成多肽序列
56
accatggaca tgagggtccc cgctcagctc ctggggctcc tgctactctg gctccgaggt 60
gccagatgt 69
57
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
57
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
58
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
58
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
59
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
59
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
60
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
60
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
61
373
PRT
人工序列
合成多肽序列
61
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
260 265 270
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
275 280 285
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
290 295 300
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
305 310 315 320
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
325 330 335
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
340 345 350
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
355 360 365
Asp Cys His Cys Ile
370
62
239
PRT
人工序列
合成多肽序列
62
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
63
373
PRT
人工序列
合成多肽序列
63
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
260 265 270
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
275 280 285
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
290 295 300
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
305 310 315 320
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
325 330 335
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
340 345 350
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
355 360 365
Asp Cys His Cys Ile
370
64
239
PRT
人工序列
合成多肽序列
64
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
65
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
65
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
66
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
66
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
67
380
PRT
人工序列
合成多肽序列
67
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
275 280 285
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
290 295 300
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
305 310 315 320
Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
325 330 335
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
340 345 350
Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
355 360 365
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
68
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
68
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
69
373
PRT
人工序列
合成多肽序列
69
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
260 265 270
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
275 280 285
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
290 295 300
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
305 310 315 320
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
325 330 335
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
340 345 350
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
355 360 365
Asp Cys His Cys Ile
370
70
239
PRT
人工序列
合成多肽序列
70
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
71
370
PRT
人工序列
合成多肽序列
71
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
260 265 270
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
275 280 285
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
290 295 300
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
305 310 315 320
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
325 330 335
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
340 345 350
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
355 360 365
Cys Ile
370
72
239
PRT
人工序列
合成多肽序列
72
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
65 70 75 80
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
73
376
PRT
人工序列
合成多肽序列
73
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn Gly Thr His Cys Pro
260 265 270
Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu
275 280 285
Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln
290 295 300
Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn
305 310 315 320
Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr
325 330 335
Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu
340 345 350
Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu
355 360 365
Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375
74
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
74
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
75
381
PRT
人工序列
合成多肽序列
75
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn
260 265 270
Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
275 280 285
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
290 295 300
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
305 310 315 320
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
325 330 335
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
340 345 350
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
355 360 365
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
76
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
76
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
77
386
PRT
人工序列
合成多肽序列
77
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Ala Arg Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
275 280 285
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
290 295 300
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
305 310 315 320
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
325 330 335
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
340 345 350
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
355 360 365
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
370 375 380
Cys Ile
385
78
369
PRT
人工序列
合成多肽序列
78
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys
260 265 270
Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp
275 280 285
Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr
305 310 315 320
Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val
325 330 335
Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly
340 345 350
Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys
355 360 365
Ile
79
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
79
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
80
384
PRT
人工序列
合成多肽序列
80
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
275 280 285
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
290 295 300
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
305 310 315 320
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
325 330 335
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
340 345 350
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
355 360 365
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
81
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
81
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
82
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
82
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Asn Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
83
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
83
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
84
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
84
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Asn Leu Thr Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
85
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
85
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
86
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
86
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Asn Arg Thr Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
87
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
87
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
88
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
88
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Asn Ala Thr Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
89
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
89
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
90
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
90
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Asn Thr Thr Thr Gly Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
91
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
91
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
92
383
PRT
人工序列
合成多肽序列
92
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
275 280 285
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
290 295 300
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
340 345 350
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser
355 360 365
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
370 375 380
93
249
PRT
人工序列
合成多肽序列
93
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
35 40 45
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
50 55 60
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
100 105 110
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
165 170 175
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
210 215 220
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
225 230 235 240
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
94
31
PRT
人工序列
合成多肽序列
94
His Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met
1 5 10 15
Gly Arg Gly His Ala Arg Leu Val His Val Glu Glu Pro His Thr
20 25 30
95
6
PRT
人工序列
合成多肽序列
95
Ala Arg Asn Gly Asp His
1 5
96
8
PRT
人工序列
合成多肽序列
96
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
97
8
PRT
人工序列
合成多肽序列
97
Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro
1 5
98
8
PRT
人工序列
合成多肽序列
98
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
99
8
PRT
人工序列
合成多肽序列
99
Ala Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro
1 5
100
15
PRT
人工序列
合成多肽序列
100
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
101
13
PRT
人工序列
合成多肽序列
101
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
102
12
PRT
人工序列
合成多肽序列
102
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
103
11
PRT
人工序列
合成多肽序列
103
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
104
10
PRT
人工序列
合成多肽序列
104
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
105
9
PRT
人工序列
合成多肽序列
105
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
106
8
PRT
人工序列
合成多肽序列
106
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
107
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
107
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
108
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
108
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
109
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
109
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Asn Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
110
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
110
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Asn Ala Thr Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
111
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
111
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Asn Leu Thr Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
112
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
112
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Asn Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
113
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
113
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
114
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
114
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Asn Thr Thr Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
115
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
115
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
116
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
116
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Lys Thr Asp Thr Asn Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
117
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
117
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Asn Leu Thr Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
118
134
PRT
人工序列
合成多肽序列
118
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
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130
119
17
PRT
人工序列
合成多肽序列
119
Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His
1 5 10 15
Thr
120
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
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120
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
121
5
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人工序列
合成多肽序列
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(5)..(5)
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121
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
122
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
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(5)..(5)
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122
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
123
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
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(2)..(2)
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123
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
124
4
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
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(4)..(4)
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124
Gly Gly Gly Ser
1
125
4
PRT
人工序列
合成多肽序列
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(1)..(4)
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125
Gly Gly Gly Ser
1
126
5
PRT
人工序列
合成多肽序列
MISC_FEATURE
(1)..(5)
此段胺基酸可重複達50次
126
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
127
227
PRT
人工序列
合成多肽序列
127
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
128
112
PRT
人工序列
合成多肽序列
128
Ala Arg Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
129
110
PRT
人工序列
合成多肽序列
129
Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His
1 5 10 15
Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu
20 25 30
Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser
35 40 45
Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His
50 55 60
Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
130
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
130
Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
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50 55 60
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Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
131
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
131
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
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132
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
132
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
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133
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
133
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134
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PRT
人工序列
合成多肽序列
134
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1 5 10 15
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135
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
135
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136
109
PRT
人工序列
合成多肽序列
136
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