具有制瘤素m活性的新的蛋白質及其製備方法

2023-05-27 02:25:56

專利名稱：具有制瘤素m活性的新的蛋白質及其製備方法
技術領域：
本發明是關於制瘤素M突變體和具有制瘤素M生物活性的類似物，包括缺失、取代、嵌入和加工突變體。本發明的制瘤素M突變體可用於引出制瘤素M誘導的生物反應，其程度高於或低於天然的制瘤素M。本發明藉助於若干實施例加以說明，在這些實施例中製備了多種制瘤素M突變體並描述了它們的特徵。
制瘤素M最初是由於它對於人的腫瘤細胞系的抑制作用而被鑑別出來，它最早是從佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)誘發的人的組織細胞淋巴瘤細胞(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839739-9743)以及從活化的T淋巴細胞(Brown et al.，1987，J.Immunol.1392977-2983)中分離出來。該分子是由單一多肽鏈Mr＝28000組成的、對熱和酸穩定的蛋白質。象其它天然存在的生長調節劑一樣，制瘤素M顯示出多種生物活性。對於某些(不是全部)人的腫瘤細胞系，觀察到生長抑制作用。與此相反，將某些正常的成纖維細胞如人的包皮纖維細胞或WI-38細胞暴露於制瘤素M，促進了這些細胞的生長(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839739-9743)。
制瘤素M的基因已被克隆和序列化，一種活化形式的重組體制瘤素M最近已被表達在哺乳動物細胞中(見1988年1月15日共同申請待批的美國專利申請No.144574，在此引證這一文獻供部分地是建立在闡明基本的制瘤素M官能區域結構及下述發現的基礎上某些基因突變不僅保留了而且在某些情況下顯著地增強了生物活性。本發明通過一些實施例來加以說明，在這些實施例中，採用重組體DNA誘變和表達方法製備各種缺失、加工、嵌入和取代突變體制瘤素M多肽並描述它們的特徵。
在一個具體實施方案中，製備了制瘤素M缺失突變體，其中，天然制瘤素的部分或全部C末端42胺基酸已被除去。在制瘤素M的結構(見附

圖1)中，可以刪除從(包括)處於186位的殘基到(包括)227位的C末端的殘基的任何胺基酸以獲得生物活性的制瘤素M突變體。這些制瘤素M缺失突變體不僅保持了生物活性，而且有幾種的活性還顯著地高於天然制瘤素M。
在另一實施方案中，製備了制瘤素M取代突變體，其中天然制瘤素M的至少一個半胱氨酸殘基不是被半胱氨酸而是被胺基酸(特別是絲氨酸)取代。本申請人對取代突變體所作的研究揭示出，在天然制瘤素M二級結構中存在的二個二硫鍵中，只有在半胱氨酸殘基49和167之間的那一個對於制瘤素M生物活性是所需要的。因此，既然消除在6位和127位殘基的半胱氨酸之間的二硫鍵不會使之喪失官能，那麼，不能形成該二硫鍵的制瘤素M突變體仍然是生物活性和官能的生長調節多肽。如同下文的實施例更充分地描述的那樣，通過取代參與該「非必要的」二硫鍵的任意一個或全部二個半胱氨酸殘基可以製備這種生物活性的制瘤素M取代突變體。此外，在80位的半胱氨酸殘基也可以被取代而不犧牲生物活性。本發明的制瘤素M取代突變體在製備、配製成藥物組合物、和/或影響所需要的生物反應的能力等方面優於天然制瘤素M。例如，這種制瘤素M取代突變體可以設參考)。成熟形式的制瘤素M是含有228種胺基酸的糖蛋白，其中有5種是半胱氨酸殘基。這種蛋白質具有極端親水的C末端區域結構。雖然從結構上說制瘤素M與其它已知的細胞素沒有關係，但它的mRNA在其3′未轉譯端含有一個富有腺苷和尿苷的區域。在制瘤素M信息中的這一區域與許多細胞素、淋巴細胞活素以及其它生長調節分子的區域是同源的，這意味著一種共同的調節基因表達的方式。在許多種哺乳動物細胞上已發現了制瘤素M的細胞受體。主要的制瘤素M受體分子是Mr＝15000-16000的特定蛋白質(Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.2646528-6532)。
本發明是關於由制瘤素M的缺失、加工、嵌入和/或取代突變體構成的新的組合物及其衍生物和片斷。本發明還涉及制瘤素M突變體在重組系統中的表達。此外，還提供了具有制瘤素M結合區的二級結構的組合物，所述結合區能夠專門結合到制瘤素M受體上。制瘤素M突變體可按下述方法製備用包含為所要求的制瘤素M突變體多肽編碼的DNA序列的表達病媒轉化宿主細胞，培育上述轉化的宿主細胞以表達外源DNA序列，從細胞溶解產物中或是從條件培養基中分離出所產生的制瘤素M突變體多肽。與天然的制瘤素M相比，這種制瘤素M突變體多肽可具有改變了的生物活性，特別是生長抑制活性。除其它用途外，本發明的組合物可特別用於調節瘤細胞增殖。
附圖1是制瘤素M的胺基酸序列和官能區域的示意說明。胺基酸用標準的一個字母代碼標示。
附圖2說明C末端缺失的制瘤素M突變體的生長抑制活性。
附圖3表明半胱氨酸至絲氨酸制瘤素M突變體的生長抑制活性。
本發明是關於保持制瘤素M生物活性的制瘤素M突變體。本發明計成使二硫鍵混亂和所產生的任何二級結構畸變的可能性減小到最低程度或將其完全消除。
本發明的上述及其它實施方案藉助於下文中的實施例予以說明，這些實施例是本發明人對於本發明的制瘤素M突變體的製備和應用所作的研究和發現的典型代表。這些研究和發現的一個結果是，查明了為維持官能完整性而必須或應當保留的制瘤素M結構的各個方面，在製備本發明的制瘤素M突變體時應考慮到這些方面。在這方面，官能上重要的序列存在遍及於制瘤素M多肽中而不限於單一區域結構。例如，對缺失和嵌入誘變的掃描驗明，胺基酸殘基22-36和44-77是生物活性所必需的。另外，至186位的C末端殘基缺失不會破壞生物活性，但缺少胺基酸185-182的突變體不具有活性。對於制瘤素M生長抑制活性和受體結合活性十分重要的其它序列包括殘基118-121和178-181，這些序列對於制瘤素M和制瘤素M突變體的正確的加工和/或分泌來說可能是必不可少的，這是因為缺少這些序列的制瘤素M突變體是不能檢測到的。與此類似，保留處在71位的天冬醯胺殘基對於完全的生物活性和/或從哺乳動物細胞中分泌來說可能是非常必要的。將二個甘氨酸殘基插入到三個預測的α螺旋區域結構中看來對生物活性沒有明顯的影響作用。甘氨酸殘基預計以低的頻率發生在α螺旋結構中，這意味著，附加的甘氨酸不破壞生物活性結構或者這種破壞處在可以容許的官能水平上。
強烈兩親的區域發生處於C167和R196處的肽分裂位置之間的制瘤素MC末端。用甘氨酸取代176位和184位的苯丙氨酸破壞活性，而用甘氨酸取代171位、174位和178位的組氨酸不影響生物官能。以甘氨酸取代苯丙氨酸所引起的活性喪失不可解釋為完全是由於該區域的兩親特性的改變而引起的。假如該區域結構應具有螺旋結構，那麼甘氨酸本身的取代可能破壞在這些位置的螺旋結構。
如同在某些(不是全部)C末端缺失突變體中N末端抗原決定部位的阻斷所暗示的那樣，C末端與N末端可能存在著緊密的物理聯繫。
本發明的制瘤素M突變體及其類似物可採用下述各種方法製備變換天然制瘤素M多肽本身、重組體DNA方法、或化學合成法例如固相肽合成。
根據本發明，提供了至少具有一種制瘤素M活性的新的DNA構成物和新的多肽組合物。其活性的絕對量可以高於或低於天然制瘤素M。具有制瘤素M活性的多肽包括至少基本上所有C末端區已被刪除的制瘤素M的缺失突變體蛋白質，以及具有與天然制瘤素M的結合部位相同的三級結構的突變體蛋白質。包含有為所要求的具有制瘤素M活性的多肽編碼的DNA序列的質粒構成物被用於轉化宿主細胞，該宿主細胞被培養以表達所需要的多肽。然後，培育已轉化的宿主細胞以表達插入的DNA序列。宿主細胞可以是真核細胞也可以是原核細胞。
人的制瘤素M具有下列胺基酸序列
這裡使用的是胺基酸的一個字母的縮寫，它們的含義如下A-丙氨酸、R-精氨酸、N-天冬醯胺、D-天冬氨酸、C-半胱氨酸、A-穀氨醯胺、E-穀氨酸、G-甘氨酸、H-組氨酸、I-異亮氨酸、L-亮氨酸、K-賴氨酸、M-甲硫氨酸、F-苯丙氨酸、P-脯氨酸、S-絲氨酸、T-蘇氨酸、W-色氨酸、Y-酪氨酸、V-纈氨酸。
制瘤素M的另外的特徵在於，分子量為32-36KD左右，這是採用聚丙烯醯胺凝膠電泳法在還原或非還原條件下測定的。分離的制瘤素M的活性製劑含有高甘露糖和複合的N連接低聚糖的組合物。但是，制瘤素M的未糖基化的製劑保持了細胞生長調節活性。
制瘤素M的特徵還在於它對於某些細胞株的活性。制瘤素M促進正常的人的成纖維細胞的增殖(WI38和WI26細胞可作為例證)，抑制腫瘤細胞如A375、HBT10、A549和SK-MEL28的增殖，並且可以促進由正常骨髓生長為群體形成細胞。但是，它缺少抗下列細胞的胞毒活性WI26和WI38人體成纖維細胞、對腫瘤壞死因子敏感的小鼠L929細胞、以及γ幹擾素敏感的人體腫瘤細胞系。制瘤素M不抑制正常人體T淋巴細胞的增殖，並且在最高達100GIA單位/毫升的濃度下不抑制由骨髓細胞向粒狀細胞/髓細胞群體的形成。此外，在500GIA單位/毫升的濃度下，它也不抑制在混合的白細胞培養反應(MLC)中的人的增殖的或細胞毒性的T細胞反應。制瘤素M對於中等的酸和鹼是穩定的，對於在56℃下熱處理也是穩定的。
本發明的多肽包括許多組多肽，每組都具有一個共同的特徵，其中，這些多肽的特徵是至少具有制瘤素M的一種特性。這些組包括以下共同特徵是制瘤素M或者具有與天然制瘤素M的結合區相同的二級結構的多肽的缺失突變體、加工突變體、或取代突變體。這些多肽還可以包含將許多取代、缺失、加工和/或嵌入突變結合起來的複合突變。本發明包括這樣的制瘤素M類似物、突變體及其官能部分。本發明的多肽將至少具有一個生物活性的序列，該序列例如是免疫反應性的或者能夠受體結合，這一序列就其生物特性來說堪與天然制瘤素M相匹敵。
下面是所使用的一些定義「缺失突變體」缺失全部或部分的制瘤素MC末端區;
「取代突變體」是制瘤素M突變體，其中，一種胺基酸已被另一種胺基酸所取代。特別有意義的是取代對於生物活性來說不必要的硫氫基基團。這些突變可包括半胱氨酸殘基被另一種不帶電的胺基酸例如絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸等所取代，這類胺基酸具有與半胱氨酸，特別是絲氨酸相似的荷電性能和空間填充特性;
「加工突變體」在這些突變體中，制瘤素M多肽中的蛋白水解的分裂位點已發生突變，從而使成熟多肽的加工被阻斷。這一變化可能導致產生具有改變的生物活性的分子。這樣的加工部位的例子包括胺基酸殘基195和196;
「嵌入突變體」在這些突變體中，為胺基酸序列甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸編碼的密碼子被置入認為是為具有重要官能意義的胺基酸編碼的DNA序列的區域中。具體例子包括置於5和6位胺基酸之間、76和77位的胺基酸之間、103和104位的胺基酸之間、以及139和140位的胺基酸之間的嵌入。
本發明的多肽還包括下述多肽，其中多肽的結合區的二級結構至少基本上與天然制瘤素M的結合區的二級結構相同。「結合區」指的是在天然制瘤素M的C末端的區域和在其N末端的區域，這些區通過二硫鍵C49-C167(見附圖1)而彼此接近，分子的這部分可以特定地以高的親和力結合到制瘤素M受體分子上。該結合區的特徵是，在C末端區域中，特別是在含有胺基酸168-195的區域中具有兩親的螺旋結構。這裡所說「兩親的螺旋結構」指的是在一端具有疏水的胺基酸殘基而在另一端具有親水的殘基的區域。這種螺旋結構一般包含有約30%-50%、特別是約40%的疏水的胺基酸，例如纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸等;約30%-50%、特別是約40%的親水的胺基酸，例如酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸等;約10%-40%、特別是20%的至少基本上不具有疏水性或親水性的胺基酸，例如絲氨酸、甘氨酸等。下述多肽也被包括在內，其中在C末端區中的多肽的一級結構可以在水溶液、特別是生理鹽水溶液中保持一個二級結構，在上述溶液中，這一二級結構在相似的條件下至少基本上與天然制瘤素M的二級結構相類似。
多肽的胺基酸序列可以與天然制瘤素M的胺基酸序列相同或不同，通常情況下是相似的。在該結構是不同的情況下，可以按以下方式完成取代用一種疏水胺基酸取代另一種疏水胺基酸和/或用一種親水胺基酸取代另一種親水胺基酸，特別是取代具有類似的荷電性能和空間填充特性的胺基酸，從而至少基本上保持二級結構和制瘤素M受體特定的結合能力。結合到制瘤素M受體上的多肽的活性不一定與天然制瘤素M的活性相同，它可以部分地或整體地是制瘤素M的拮抗劑活性或拮抗物活性。
「生物活性」旨在包括細胞生長調節活性、與天然存在的人的制瘤素M的免疫學交叉反應性、或高親和力制瘤素M受體結合。「細胞生長調節活性」指的是天然存在的制瘤素M的生物活性，它包括抑制瘤細胞生長，以及促進正常細胞生長，包括造血系統的細胞。這種細胞生長調節活性可以不同於天然存在的制瘤素M，通常有所降低。「生物活性序列」指構成直至全長多肽的胺基酸序列。「免疫學交叉反應性」的意思是由本發明的新的多肽誘發的抗體將特定地結合到完整的制瘤素M上，至少當制瘤素M處於天然狀態時是這樣;並且，結合到制瘤素M上的抗體將特別結合到新的肽上，在該肽中，制瘤素M和新的多肽有一個共同的抗原決定部位。
「制瘤素M受體」的意思是指一個以高的親和力特定地結合制瘤素M的細胞表面上的結合部位，所述的結合是可飽和的並且不被結構上無關的多肽抑制。「類似物」指至少一種生物活性與制瘤素M相符合，並且含有基本上與制瘤素M的至少一部分胺基酸序列相等的胺基酸序列的化合物。類似物可以含有比天然制瘤素M多一些或少一些的胺基酸。
可以使用天然存在的或重組體制瘤素M作為起始材料製備各種制瘤素M突變體及類似物。制瘤素M可由天然來源、特別是由加入了適當的誘導物如巨大戟二萜醇或佛波醇的培養基中獲得，並通過由人組織細胞淋巴瘤得到的細胞系(U937)(Sundstrom and Nilsson，1976，Int.J.Cancer 17565-577)或促細胞分裂劑如植物血球凝集素(PHA)進行調節，以及用正常的人外周血液淋巴細胞(PBL)進行調節。可以採用本專業中各種已知的純化方法把制瘤素M突變體及類似物純化，從而至少基本上不含細胞成分，上述純化方法包括(但不限於)溶劑萃取法、凝膠滲透色譜法、反相HPLC法、電泳法等。制瘤素M的C末端的缺失型突變體可按下述方法得到全長制瘤素M的蛋白水解分裂，然後按每次至少一個胺基酸截斷C末端，直至分子的所有C末端部分被從全長制瘤素M中刪除掉。「C末端」指胺基酸186-227(見附圖1)。
也可採用重組體DNA方法來製備制瘤素M的缺失型突變體、加工型突變體和取代型突變體。在分離制瘤素M時使用的方法在本專業領域中是已知的，它們包括合成、由基因組DNA中分離、由cDNA製備、或是它們的組合。各種DNA操作方法都是人們所熟知的，它們包括限制、消化、切除、結紮、活體外誘變、原始質修復、以及多重連接體(polylinkers)和接合體等，參見Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982)。一般地說，這種方法包括由合成制瘤素M的細胞例如組織細胞淋巴瘤細胞(U937)或PBL構成和篩選cDNA庫。可以採用下述方法用探針檢定編碼mRNA的制瘤素M，或者檢定製瘤素M的表達，然後用制瘤素M的抗體進行篩選以檢測交叉反應的肽片段等。
一旦鑑別出含制瘤素M編碼序列的cDNA，就可用幾種方法來完成在結構基因中所需要的誘發變異。這些誘發變異可能包括上文中所述的缺失、嵌入、它們的組合，以及取代。這些變化，例如缺失，可能涉及C末端區、特別是編碼胺基酸186至C末端的區域。
缺失可以採用多種本專業技術人員已知的方法來完成，包括酶切全長制瘤素McDNA、然後變換和結紮純化的片斷，或者通過定位突變、特別是Kramer等人所述的環出型(loop-out)突變(見Kramer et al.，Nucl.Acids Res.(1984)129441-9456)。
對於本發明的目的來說，可將各種不同的胺基酸分成許多小類脂族的中性的非極性的 GAPVLI極性的 STCMNQ酸性的 DE鹼性的 KR芳族的 FHYW「保守取代」的意思是，來自同一小類(例如中性脂族的、酸性脂族的、鹼性脂族的或芳族的)、特別是具有相同極性的胺基酸彼此相互取代。比較理想的情況是，2-4個碳原子或5～6個碳原子的胺基酸定義脂族小類中的單體定組。
將一個多肽片斷結合到大的免疫原多肽載體上，以提供免疫原性，用該方法可以製備較高分子量的多肽。這樣的蛋白質載體的例子有牛血清清蛋白、鑰孔 血藍蛋白(KLH)等。這些結合多肽可用於在適當的宿主生物中誘發抗體。該抗體可用來測定在體液中是否存在制瘤素M和/或它在體液中的濃度，它的存在可進一步用作檢測腫瘤細胞存在的手段，上述抗體還可用以結合到制瘤素M上、從而調整其活性，此外，上述抗體還可用於純化制瘤素M，例如用在親合型交換柱(affinity column)中。這樣得到的基因隨後可用多種本技術領域中已知的方法進行操作以提供表達。既可以用真核宿主，也可以用原核宿主。這些宿主包括細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如大腸桿菌、COS細胞、CHO細胞、猴腎細胞、以及家蠶細胞(sf9)。因此，在該基因要被表達在識別制瘤素M的野生型轉錄的和轉譯的調節區的宿主中的情況下，可將帶有野生型5′-和3′-調節區的完整基因引入適當的表達病媒中。有各種各樣的表達病媒，這些病媒使用來自哺乳動物病毒的複製系統，所述病毒例如有猿猴病毒40、腺病毒、牛乳頭狀病毒、牛痘病毒、昆蟲杆狀病毒等。研製出這些複製系統是為了提供供轉染子的選擇用的標記物以及提供可將基因植入其中的便利的限制部位。
如果要在不能識別天然存在的野生型轉錄的和轉譯的調節區的宿主中表達該基因，那麼需要進一步的操作。已經知道多種3′-轉錄調節區，可以將它們插入終止密碼子的下遊。結構基因上遊的非編碼5′-區可採用核酸內切酶限制法、Bal31切除術等予以去除。作為替代方法，在便利的限制位點存在於結構基因的5′-末端附近的情況下，可以限制該結構基因並使用結合體將該結構基因連接到啟動子區上，在該區中，結合體提供了結構基因的失去的核苷酸。
可以採用各種不同策略來提供表達暗盒，該暗盒在轉錄的5′-3′-方向上有一個轉錄調節區和一個轉譯起始區，該暗盒還可包含供誘發調節作用的調節序列、在起始區的轉錄和轉譯控制下的結構基因、以及轉譯和轉錄的終止區。這一表達暗盒可以附加含有來自提供表達產物穩定性的噬菌體或細菌基因的前導序列、提供表達產物的分泌物的分泌前導序列、以及標記基因。
起始區和終止區在宿主細胞中是官能的，它們可以是同種異體(由原始宿主得到的)或者是異種的(由外部來源得到的)或合成的DNA序列。因此，該表達暗盒可以全部地或部分地由天然來源得到，以及全部地或部分地由與宿主細胞同種異體的或異種的來源得到。本發明的各種DNA構成物(DNA序列、病媒、質粒、表達暗盒)經過了分離和/或純化、或者被合成，因而不是「天然存在的」。
業已發現，對於最佳的基因表達來說，在動物細胞中轉譯起始密碼子ATG周圍的核苷酸序列是至關重要的。例如，Kozak廣泛地研究這些區對多肽(例如胰島素)在COS細胞中表達的影響(見Kozak，Microbiol.Reviews(1983)471-45)。因此，可能有必要修改起始密碼子周圍的核苷酸序列。這可以通過定位誘變或者通過使外源基因融合到高度表達的基因的起始區上來實現。
用於示例說明的轉錄調節區或啟動子包括對於細菌-β-gal啟動子、λ左啟動子和右啟動子、trp和lac啟動子、trp-lac融合啟動子等;對於酵母-糖解酶啟動子如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ啟動子、GPK啟動子、以及PGI啟動子、TRP啟動子;對於哺乳細胞-SV40早啟動子和遲啟動子、腺病毒主遲啟動子等。
在轉錄調節區附帶包含有一些調節序列，這些調節序列使結構基因的表達可通過在培養基中含有或不含營養素或表達產物、溫度等加以調節的情況下，該調節序列可以含有噬菌體λPL啟動子以及噬菌體λOL操縱基因和CI857溫度敏感阻遏物，以提供該結構基因的溫度敏感的表達。啟動子的調節是通過在阻遏物和操縱基因之間的相互作用而實現的。
在真核細胞中，調節序列可以包括例如細胞巨化病毒強化因子序列，後者可以被融合到一個啟動子序列如SV40啟動子上、形成嵌合體的啟動子，或者被插入到表達暗盒中的其它地方、最好是就在緊靠啟動子序列的地方。結構基因的表達也可以被放大，例如，將顯性可放大遺傳標記物5′或3′的基因串聯綁紮到結構基因上，然後在選定條件下培養該宿主細胞。可放大基因的一個例子是二氫葉酸還原酶(dhfr)的基因，在變成抗氨甲蝶呤(mtx)-一種葉酸鹽拮抗物-的細胞中該基因的表達可以被增大。
特別有意義的是能表達下述制瘤素M的表達暗盒，它使用lac操縱基因-啟動子、tac啟動子、或λPL啟動子-OL操縱基因、以及溫度敏感的阻遏物，特別是與λ-Cro、lac或N基因核糖體結合部位結合在一起。結構基因被結合到該核糖體結合部位的下遊，從而處於轉錄調節區和轉譯調節區的調節控制之下。這在美國專利申請No.264098(申請日1988年10月28日)中已有描述，引證這篇文獻僅供參考。
通過提供含N末端胺基酸的融合蛋白質的合成可以獲得表達產物的穩定性，所述N末端胺基酸來自例如噬菌體λN基因或Cro基因、或者細菌鹼性磷酸酶基因。前導序列在譯讀密碼的上遊或內部帶有結構基因。有意義的前導序列包括來自原核基因的從約8-約35、特別是從約15-約25N末端胺基酸，所述原核基因例如是噬菌體λN基因或Cro基因、或者細菌鹼性磷酸酶(見美國專利申請No.264098，申請日1988年10月28日)。
此外，通過給為分泌前導和加工信號編碼的結構基因提供一個5′-序列，可以製備融合的基因。用於示例說明的分泌前導包括下述的分泌先導青黴素酶、α-因子、免疫球蛋白、T細胞受體、外膜蛋白質、血清清蛋白、胰島素、消化道酶、β轉化生長因子等。通過在帶有結構基因的分泌先導的適當的譯讀密碼中融合，成熟制瘤素M或類似物可以被分泌到培養基中。例如，參見美國專利申請No.144574(申請日1988年1月15日)，引證該文獻僅供參考。
至少一個附加的胺基酸可以被插入到結構基因和前導序列之間，插入的胺基酸為融合蛋白質分裂提供了例如供酶的或化學的分裂部位。作為一種替代方案，含前導序列和結構基因產物的融合蛋白質可以不經過成熟多肽的分裂就使用。
表達暗盒可以被包含在一個用於適當的細胞宿主中保持游離基團的複製系統中，或者不帶有複製系統，在這裡它可被匯集成宿主基因組。可以按照已知的方法將DNA引入到宿主中，例如轉化、用磷酸鈣沉澱的DNA轉染、electroporation、用重組體病毒轉染、向細胞中微量注射DNA等。
一旦結構基因被引入適當的宿主中，就可以培養宿主來表達結構基因。該宿主細胞在適當的培養基中可培養到高密度。在啟動子是可以誘導的情況下，例如在原核系統中，那麼將使用許可的條件，例如溫度範圍、代謝產物或營養素的耗盡或過剩等。在可放大的基因與結構基因串聯使用的哺乳動物系統中，可以使用適宜的放大手段。
在提供分泌物的情況下，可用常規方法從培養基中分離出融合的或未融合的表達產物。在沒有提供分泌物的情況下，可按常規方法收集宿主細胞並將其溶解。然後用已知方法如色譜法、電泳法、溶劑萃取法等分離並提純所需要的產物。
重組體產物可以是糖基化的或未糖基化的，包括野生型或其它糖基化作用。這種糖基化作用與野生型糖基化作用的差別不超過約50%，通常是不超過約20%。糖基化的量部分地取決於具體的肽的序列以及在其中產生的它的生物。這種產物在大腸桿菌細胞中的表達將導致未糖基化的產物，與該產物在哺乳動物細胞中的表達相比，它在昆蟲細胞中的表達一般將產生較少的糖基化作用。
5.1.制瘤素M突變體和類似物的用途制瘤素M突變體和類似物多肽以及它們的組合物可以用來製造抗體，這些抗體可以在活體內或在活體外使用。這些抗體可按常規方法製備，使用本發明的多肽作為免疫原，將該多肽注射到哺乳動物宿主(如小鼠、牛、山羊、綿羊、兔等)中，最好是與佐劑一起注射，例如完全弗羅因德氏佐劑、氫氧化鋁凝膠等。然後吸除宿主，將血液用於分離多克隆抗體，如果宿主是小鼠，則可以用外周血淋巴細胞或脾淋巴細胞(B細胞)與適當的骨髓細胞融合，從而使專用於本發明化合物的抗體的單克隆表達的染色體不滅。可以製備單克隆抗體，也可以製備多克隆抗體。
制瘤素M突變體、類似物及它們的組合物可用作供檢測制瘤素M受體存在與否的配體。用這種方法，可根據制瘤素M受體的存在及其密度來辨別細胞，從而檢測各種化合物對這些受體的存在的影響以及測定給定的細胞對於特定製瘤素M突變體或類似物的影響的敏感程度。另外，據認為有類似制瘤素M生物活性的肽可按下述方法進行評定，即將它們結合到制瘤素M受體上的能力與天然存在的制瘤素M的相應能力作比較。一般地，所試驗的肽可按下述方式進行評定將試驗的肽與經過標記的制瘤素M或以高親和力結合到制瘤素M受體上的另一種肽或含制瘤素M受體的製劑一起保溫，觀察被標記的制瘤素M的結合的抑制量，這一方法在下文中的實施例中有詳盡描述。然後，按下文中實施例中所述，通過觀察它們對與制瘤素M有關的生物官能(如抑制腫瘤細胞生長)的影響，可以確定結合到受體上的試驗肽是制瘤素M拮抗劑還是拮抗物。
制瘤素M突變體、類似物及它們的組合物可用來治療多種腫瘤病，例如癌、肉瘤、黑瘤、淋巴瘤、白血病，它們可影響到許多器官，如血液、肺、乳房、前列腺、腸、肝、心臟、皮膚、胰腺、大腦等。它們可以通過注射(病灶內、腹膜、或皮下注射)或通過任何其它適當的給藥方法體內給藥。可以採用任何生理上可以接受的載體如殺菌水、磷酸鹽緩衝鹽水、鹽水、含水乙醇等進行給藥。本發明的化合物可以在活體外使用，用於消除供自體骨髓移植用的骨髓中的惡性細胞，或者用於在重新輸入之前抑制其它組織(如血液)中惡性細胞增殖乃至將其消除。此外，這些組合物還可用作制瘤素M誘發的卡波濟氏肉瘤的生長促進活性的拮抗物，或者用來促進DNA在ICS細胞中的複製，使它們變得對化療藥物更敏感。
制瘤素M突變體、類似物及它們的組合物還可用於治療造血系統的疾病，特別是在具有受抑制的骨髓官能的病人，例如患有再生障礙性貧血、先天或後天免疫缺損的病人或正在進行放療或化療的病人中作為促進造血的一種措施。
制瘤素M突變體、類似物及它們的組合物可用於治療各種損傷，包括幾乎全部皮膚損傷、角膜損傷以及人體的襯有皮膜的空腔器官的損傷。適於治療的損傷包括由於外傷如燒傷、擦傷、刀傷等所致的損傷以及由於外科手術如手術刀口和皮膚移植所致的損傷。適合於用本發明的組合物治療的其它病理狀況包括慢性病，如慢性潰瘍、糖尿病潰瘍、以及其它非治癒(營養的)的病理狀態。本發明的化合物可摻入到生理上可以允許的載體中，塗敷到損傷的表面上。載體的性質可以在寬的範圍內變動，並且取決於所要塗敷的部位。對於塗敷到皮膚上來說，通常優先選用乳劑和軟膏載體，適用的載體包括羊毛脂、磺胺嘧啶銀(Marion)(專用於治療燒傷)、Aguaphor(Duke實驗室生產，地址South Norwalk，Connecticut)等。如果需要的話，可將制瘤素M類似物或突變體組合物加到繃帶或其它的創傷包紮用品中，以使創傷部位持續地暴露於肽的作用下。此外，還可以採用氣溶膠塗敷。
在治療組合物中，多肽的濃度不是關鍵的。多肽的用量可為上皮細胞增殖誘導量。該組合物可局部地用於感染區，一般對眼睛為滴眼藥，對皮膚為乳劑、膏劑或洗劑。就眼睛而言，希望頻繁治療，通常給藥的間隔為4小時或更短。對皮膚而言，在治療過程中，希望在感染區連續地保留有治療組合物，治療組合物的給藥為每天二至四次或者更頻繁。
可用各種方法配製所說組合物，包括在脂質體腔中配製，尤其是當脂質體連接到以特定腫瘤細胞為靶器官的導向分子(例如抗體、非降解顆粒狀基質等)上時更是如此。在配方中還可加入的其它組分為緩衝劑、穩定劑、表面活性劑、生物殺傷劑等。在文獻中有大量有關這類組分的例子，在此不需詳細敘述。
在下述實施例中獲得的結果表明，某些突變制瘤素M多肽類保留有生物活性，並在某些情況下具有增強的生物活性。含有這些突變體的組合物既可在活體內又可在活體外用於細胞增殖的調節中，比如在培養、白細胞提取及在活體內的預防和治療中的應用等等。一種特定用途涉及使用生物活性的制瘤素M突變體多肽類，通過抑制在骨髓中腫瘤細胞的生長並同時促進菌落細胞的生成來處理細胞，以達到自體骨髓的移植。另一種特定用途涉及使用制瘤素M突變體來促進上皮細胞的生長，從而促進傷口癒合。此外，可把突變體多肽類用作免疫原以誘導抗體生成。誘導的抗體可用於滴定體內流體中存在的制瘤素M的含量和/或通過與因子結合來調節因子的活性。
雖然以實例方式對本發明進行了頗為詳細的描述，但是本領域的普通技術人員清楚地懂得，在不偏離所附權利要求的精神和範圍的情況下，可進行某些變化和改進。所提供的下述實施例只是為了進行解釋而不是為了限定。
6.實施例制瘤素M突變體的表達和鑑定6.1材料和方法6.1.1細胞培養在Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)中添加10%胎兒牛血清(FBS)來培養A375黑素瘤、H2981和COS細胞。
6.1.2.生長抑制分析用染料結合分析法測定生長抑制活性(GIA)。在96個井式微量滴定盤內，在含有10%胎兒牛血清(FBS)的體積為0.1毫升的DMEM中接種A375黑素瘤細胞(3-4×103)。加入體積為0.1毫升的各種濃度的制瘤素M，並在37℃下連續培養72小時。除去培養基，用結晶紫將細胞染色，並通過在微滴定盤讀數器(Genetic Systems Corp.，Seattle，WA)上用590納米處的吸光度測定所結合的染料來對細胞的相對增殖定量。把在制瘤素M存在下的細胞增殖與未處理樣品的細胞增殖進行比較，並以對最大生長的抑制百分數來表示。對樣品以一式兩份或一式三份進行分析。制瘤素M的GIA單位從抑制曲線上確定，並定義為在標準分析中抑制50%A375細胞的生長所需要的蛋白質的量。當以GIA單位對蛋白質濃度校正時，校正值的誤差係數一般＜20%。
6.1.3.放射性受體測定在用制瘤素M處理之前16-24小時，把H2981細胞在48個井式塑料盤中按1-3×105/釐米2的密度進行接種。可用125I-制瘤素M(20納克/毫升，0.7納摩爾)在逐漸增加制瘤素M或突變制瘤素M含量的條件下在體積為0.1毫升的接合緩衝劑(Linsley et al.，1986，Biochemistry 252978-2986)中培養單層。接合反應在23℃下進行2-4小時。非特定接合在過量50倍至100倍的未標記制瘤素M存在下測定。從總接合中減去在過量未標記制瘤素M存在下接合的放射活性來計算特定的接合百分數，該數值一般為總接合的70%-95%。重複測定的誤差一般小於10%。可從按逐漸增加未標記制瘤素M的量的條件下所獲得的抑制曲線上測定放射性受體測定單位(RRA單位)。一個RRA單位可定義為在標準分析中125I-制瘤素M的接合達50%抑制所需要的制瘤素M的量。
以GIA或RRA(單位/毫克)計算的比活性值在不同實驗間的誤差高達兩倍。在一次實驗內，比活性誤差範圍為15%至30%，這大部分是由於對在培養基中免疫活性蛋白質進行定量時產生的誤差造成的。相對比活性值表示突變體的比活性相對於重組體「野生型」制瘤素M的比活性的百分數。按均方根計算，所獲的相對比活性的誤差係數的範圍為22%至45%。相對比活性值小於10%重組體「野生型」制瘤素M的突變體M被認為是失去了生物活性。
6.1.4.放射免疫測定把無血清培養基在DMEM中稀釋，加入二硫蘇糖醇使濃度達10毫摩爾，並經煮沸使蛋白質改性。這種處理增加了隨後的制瘤素M的免疫活性。然後把處理的培養基的逐次稀釋物經一狹縫印跡裝置(Millipore)塗在硝化纖維薄膜上。然後對薄膜進行免疫印跡測定。如在(Linsley et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82356-360)中所描述的那樣，其中使用抗6-19抗血清(下面第6.1.5節)和125I-蛋白質A進行檢測。使用以假性轉染細胞在無血清培養基中稀釋的純化制瘤素M來繪製標準曲線。使用掃描密度分析法來測量放射自顯影圖上的譜帶強度，存在於轉染細胞培養基中的制瘤素M的量可通過與標準曲線比較而定量。在大多數情況下，按標準曲線的線性部分的譜帶強度來測定培養基中幾種稀釋物的制瘤素M的含量，然後取其平均值;這些測量的誤差係數一般＜10%。
6.1.5.抗血清用固相技術合成相應於胺基酸6-19和206-218的制瘤素M(圖1)的肽類。把肽類連接到牛的免疫球蛋白(肽6-19)或鑰孔
血藍蛋白(肽206-218)上，並按(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.73418-3427;Linsley et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82356-360)描述的方法使兔子免疫。對於抗6-19，使用來自兩隻免疫兔子的血清的1∶1混合物。
6.1.6.COS細胞的轉染如在(Malik，et al.，1989，Mol.Cell.Biol.92847-2853)中描述的那樣，用制瘤素M突變體編碼質粒對COS細胞進行轉染。轉染之後24小時，加入無血清培養基，並將細胞在37℃下再培養48小時。收集並測定經調整的培養基。
6.2.表達質粒的製作在Malik，et al.，1989 Mol.Cell.Biol.92847-2853中描述了制瘤素M cDNA表達質粒(即pSPOM)。在Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.2644282-89中描述了一種表達質粒，其中用制瘤素M信號序列編碼的序列被用猴TGF-β1信號肽(這裡指Pβ-OM)編碼的序列取代。
6.2.1.缺失突變體結構通過用終止密碼子和克隆位置編碼的3′低聚核苷酸原始質的PCR放大作用來建立制瘤素M缺失突變體(終止密碼子嵌入突變體)△182-227、△183-227、△184-227、△186-227、△187-227、△188-227、△189-227、△190-227、△195-227和△196-227。通過來自製瘤素M編碼區的3′末端的有限核酸外切酶浸取(Henikoff，1984 Gene 28351-359)來建立突變體△191和△185。簡單地說，把制瘤素McDNA亞克隆成質粒pSP64(Promega)，並在靠近cDNA的3′末端線性化，以及用核酸外切酶Ⅲ進行有限浸取。然後用DNA聚合酶I的Klenow片斷削去浸取出的cDNA的3′末端。最後，把截頭cDNA從在加固HindⅢ位置37基5′處的pSP64至轉移開始位置切開，並用合成低聚核苷酸連接體TAGGTGAATGATCAC和TCGAGTGATCATTCACCTA克隆成Hind Ⅲ-Xhol解離的πH3MPY(Stamenkovic，1989，EMBO J.)，所說連接體為終止密碼子在每一閱讀框架中編碼並具有一附加在Xho Ⅰ限制位置之上的上懸末端。用DNA序列分析來識別具有在位置183和190(△183-227和△190-227)上引入的終止密碼子的各個克隆上。其它缺失突變體可用類似方法製備。
使用環出缺失方法(Kramer et al.，supra)可建立幾種另外的制瘤素M缺失突變體(△44-47、△87-90、△118-121、△152-155和△178-181)。突變體結構被亞克隆到pH3MPY的HindⅢ-Xho Ⅰ位置上，用限制分析來篩選並以整個編碼區排序來驗證。
6.2.2.處理突變體結構使用商品幼獸(Amersham)藉助控制低聚核苷酸的誘變劑來建立突變體克隆G195和G196。合成可以引起在位置195或196上的精氨酸殘基向甘氨酸轉化的非匹配的低聚核苷酸類，並按供應商的說明用於建立突變體克隆。用DNA序列分析證實克隆G195和G196的突變區的序列。
突變體克隆G195用改變低聚核苷酸產生突變的步驟來建立。在有缺口的M13噬菌體DNA再聚合併絡合之後，使用Tac聚合酶鏈式反應(Perkin Elmer Cetus)並用M13普通正向和逆向原始質來放大制瘤素McDNA。然後把放大的cDNA亞克隆到HindⅢ-Xho Ⅰ解離的pH3MPY上，並用有限分析和/或DNA程序化識別突變體克隆。然後用序列分析來證實突變編碼區。G195的序列分析結果表明，由於在產生突變時引入的二次突變，制瘤素M的仲氨酸(氨基丙酸)已變為纈氨酸。採用首先進行反向色譜步驟並隨後按粒度分級分離這兩個步驟組成的兩步程序，進行兩次操作來純化G196。
6.2.3.取代突變體結構採用上面第6.2.2.節中所述的低聚核苷酸誘變劑來建立突變體克隆，S5、S49、S80、S127、S167和S6/S167。合成可誘導在6、49、80、127、167和6+167位置上的半胱氨酸轉化的非匹配低聚核苷酸，並將其用於建立突變體克隆。突變體結構被亞克隆到pH3MPY的HindⅢ-Xho Ⅰ位置上。用DNA序列分析證實所獲克隆的突變編碼區。
6.2.4.嵌入突變體結構採用在上面第6.2.2.節中所述的低聚核苷酸活體外誘變劑來建立突變體克隆GAG6、GAG77、GAG14和GAG140。突變體結構被亞克隆到PH3PY的HindⅢ-XhoⅠ位置上。用DNA序列分析證實突變的編碼區。
6.3.制瘤素M突變體的生物活性6.3.1.缺失和加工突變體用免疫印跡分析法對被處理突變體G195和G196(上面第6.2.2.節)和缺失突變體△195和△190(上面第6.2.1.節)編碼的質粒所轉染的COS細胞無血清培養基進行分析。
用被這些突變體編碼結構感染的細胞製備能與抗6-19血清反應的蛋白質。用G195和G196製備的免疫活性蛋白質與來自pSPOM轉染細胞(下面第7節)的Mr36，000蛋白質一起遷移，而用△195和△190製備的蛋白質遷移到離Mr32，000蛋白質更近的地方。當把抗208-219血清用於分析時，觀察到來自G195和G196轉染的細胞的Mr36，000形式，但用△195和△190製備的蛋白質沒有發生反應。從而，在推定的處理位置上引入點突變防止了Mr32，000形式的積聚，同時就在該位置上遊的缺失突變防止了Mr36，000形式的制瘤素M的積聚。這些結果表明，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的差別是由於從位置193處開始的胰蛋白酶狀的位置上或靠近該位置處的分解蛋白處理過程引起的。
把抗加工突變體形式的制瘤素M(G195和G196)的生物活性與一種和Mr32，000形式的制瘤素M(△190和△182)在粒度上幾乎相同的突變蛋白質的生物活性進行對比。對於該實驗，如第6.1.2.節和第6.1.3節所描述的那樣，測定來自轉染細胞的未處理無血清調整的培養基的GIA和RRA的活性。用在第6.1.4.節中所描述的放射免疫測定法來確定製瘤素M的濃度。如表Ⅰ所示，對△190和△195來說，它們的GIA活性對RRA活性之比值要比G195和G196的相應活性比值高10-20倍。來自被突變體△182轉染的細胞的培養基在任一分析中均沒有給出有意義的活性，這一事實表明，來自殘基182-190的C-末端區對生長抑制活性和接合活性均是關鍵的。來自pSPOM(下面第7節)轉染細胞的培養基具有中等活性比率，這與存在於該樣品中具有不同活性的兩種形式的制瘤素M是一致的。這些觀察結果表明，突變體未加工形式的制瘤素M(G195和G196)具有比截頭Mr32，000形式(△182和△190)更小的GIA活性。
表Ⅰ制瘤素M的突變體形式具有不同的相對生長抑制活性和接合活性樣品 GIA活性1RRA活性1比率2pSPOM 11.7(27.2) 2.6(6.1) 4.5△195-227 61.7(74.3) 3.2(3.8) 19.5△190-227 20.0(21.7) 0.9(1.0) 22.5△182-227 0.02(0.06) ＜0.02(＜0.06) N/AG196 6.6(8.0) 11.2(13.5) 0.6G195 5.0(8.8) 5.3(9.3) 0.9如實施例1所示，測定來自以所示質粒轉染的COS細胞的未處理無血清培養基所具有的生長抑制活性(GIA)和放射性受體活性(RRA)。如實施例1所示，用放射免疫測定法來確定製瘤素M的濃度，測得的濃度範圍為0.4-1微克/毫升。N/A不適用。
1單位/毫升(×103);括號中的數字表示比活性。
2GIA活性與RRA活性的比率。
為了證實G196突變體的降低的GIA活性，將該蛋白質純化到均勻程度並與來自pSPOM轉染細胞(下面第7節)的Mr32，000形式的制瘤素M進行比較。純化的Mr32，000形式的制瘤素M比G196具有更高的GIA活性(最大活性的半值分別在6和130pM處)。在三個獨立的實驗中，在這些純化的蛋白質之間的生長抑制活性的差別為9倍、22倍和5倍(平均±標準偏差(12±9倍))。與此相反，這兩種純化的蛋白質的RRA活性是難以區分的(最大活性的半值大約在100pM處)。就RRA而言，三個獨立的實驗結果表明，G196的RRA活性約相當於Mr32，000形式的制瘤素M的RRA活性的1.1，1.1和2倍(1.3±0.3倍)。因此，純化的G196(Mr36，000形式)與Mr32，000形式一樣好地接合到制瘤素M受體上，但前者具有較小的GIA活性。
制瘤素M缺失突變體的生長抑制活性的比較示於圖2。△181、△182和△183具有很小的生長抑制活性(＜1單位/納克)。相對於原生制瘤素M而言，在△195-227、△190-227、△188-227和△187-227制瘤素M突變體中觀察到升高了的生長抑制活性。相對於原生制瘤素M(～8單位/納克)，突變體△187-227具有最高的活性(＞14單位/納克)。因此，除去大部分C-末端區可增加制瘤素M的生長抑制活性。
表Ⅱ給出了幾種制瘤素M缺失突變體的相對生長抑制比活性和受體接合比活性。這些數據證實，除去大部分C-末端區可增加制瘤素M的生長抑制活性。
表Ⅱ由C-末端的突變所產生的相對生長抑制活性和受體接合活性相對比活性(%)突變體 GIA RRA n△196-227 171 73△191-227 90±30 26±13 3△190-227 99 68△189-227 197±57 42±1 2△188-227 135 54△187-227 66±31 21±5 2△186-227 60±30 20±4 2△185-227 17 2△184-227 2 ＜1△183-227 ＜2 ＜1 2△182-227 ＜3 ＜1 2對來自被所示制瘤素M突變體轉染的COS細胞的無血清培養基的生長抑制活性(GIA)和放射性受體活性(RRA)進行測定。用定量免疫印跡法確定製瘤素M的濃度，所獲濃度的範圍為0.2-1.0微克/毫升。這些數據示出了突變體相對於在同一試驗中測試的野生型重組體制瘤素M的比活性的百分數，並用突變體的比活性/野生型制瘤素M的比活性X100來計算。實驗次數用「n」表示。
6.3.2.取代突變體測試以上面6.2.3.節中所述的方法製備的突變體克隆的生長抑制活性。圖3中所示的結果表明，在位置49和167處的關胱氨酸類對生物活性是關鍵的，這是因為所有缺少這些殘基(S49、S167和S6/167)的突變體的生物活性很小或者沒有。取代突變體S6、S80和S127的生物活性等於或大於原生制瘤素M的活性，這些結果表明，在位置6、80和127處的半胱氨酸類對制瘤素M的GIA不是關鍵的。事實上，把位置80上的半胱氨酸改變為絲氨酸會使生物活性發生數值較小但意義較大的增加。
6.3.3.包含胺基酸的缺失和嵌入的制瘤素M突變分別按節6.2.1.節和第6.2.4.節中描述的方法來製備掃描用的缺失和嵌入突變體，並測試它們的生長抑制活性和放射性受體活性(表Ⅲ)。缺失突變體△22-36和△44-47失去了所有GIA和RRA活性，而突變體△87-90卻具有比野生型制瘤素M更大的相對比活性。缺失突變體△152-155具有中等的相對比活性。在胺基酸位置5和6、103和104、以及139和140之間嵌入Gly-Ala-Gly對生物活性不會產生任何有意義的損失。當在胺基酸位置76和77之間嵌入Gly-Ala-Gly序列時，GIA和RRA相對比活性大大地降低了，從胺基酸位置75開始為推斷N連接糖基化的識別序列。
表Ⅲ由掃描缺失和嵌入突變產生的相對生長抑制比活性和受體接合比活性相對比活性(%)突變體 GIA RRA△22-36 ＜1 ＜5△44-47 ＜1 ＜3△87-90 320 260△152-155 39 48GAG6 58 37GAG77 8 24GAG104 125 196GAG140 79 40對來自以所說制瘤素M突變體結構(包括那些以標有「△」的數字表示的殘基的缺失，以及Gly-Ala-Gly殘基在所示位置上的嵌入皆以「GAG」表示)轉染的COS細胞的無血清培養基的生長抑制活性(GIA)和放射性受體活性(RRA)進行測試。用定量免疫印跡法確定製瘤素M的濃度，其範圍為0.14至1.8微克/毫升。數值表示突變體相對於在同一試驗中測試的野生型重組體制瘤素M的比活性的百分數，並用突變體的比活性/野生型制瘤素M的比活性×100來計算。
7.實施例在COS細胞中制瘤素M的表達產生兩種分子形式7.1.COS轉染如(Malik，et al.，1989 Mol.Cell.Biol.92847-2853)所述，把COS細胞以pSPOM或pβOM轉染。轉染後24小時，加入無血清培養基並把細胞在37℃下再培養48小時。收集調節的培養基，並立即測定或加入乙酸酸化使其達到1N，接著將其濃縮以用於提純。來自以pSPOM轉染的細胞的培養基含有兩種蛋白質(Mr36，000和Mr32，000)，這兩種蛋白質在免疫方面與用u937細胞製備的原生制瘤素M有關但粒度不相等。當COS細胞以由制瘤素M編碼的結構轉染時，也觀察到與上述相同的蛋白質，所說的制瘤素M具有被來自猴TGF-β1(pβOM)N-末端胺基酸的信號肽所取代的信號序列，而所說的胺基酸決定了與原生制瘤素M相同的N-末端序列的Mr36，000和Mr32，000的編序，這一事實表明這些蛋白質的差別不是N-末端序列不均勻性的結果。
7.2.Mr32，000形式的制瘤素M的提純基本上用上面(Linsley，et al.，and Malik，et al.，)描述的方法，從以pSPOM轉染的COS細胞的酸化並且濃縮的無血清培養基中來提純Mr32，000形式的制瘤素M。從按粒度分級分離的培養基中收集生長抑制活性的峰值級分並用反相色譜法進行最終提純。所獲製劑主要含有Mr32，000形式的制瘤素M。在某些試驗中，從能產生過量重組體制瘤素M(Oncogen;Seattle，WA)的CHO細胞的無血清培養基中，以相同的方法來製備在放射性免疫測定法中用作125I放射性標記的或用於標準曲線的制瘤素M。從這種提純的原料得到的制瘤素M沒有顯示出對於抗206-218抗血清的免疫反應活性，並且具有與來自COS細胞的Mr32，000形式的制瘤素M相同的性質。
7.3.Mr36，000形式把來自與pSPOM轉染細胞的Mr36，000形式的制瘤素M用三步驟程序進行部分地提純。在一個於40%乙腈、0.1%三氟乙酸中操作的TSK3000SW交換柱上把無血清培養基酸化並按粒度分級分離。採用抗6-9血清的免疫印跡分析法來識別主要地含有Mr36，000形式的制瘤素M的級分，之後收集、濃縮並在同一交換柱上再處理。收集含有免疫化學純的Mr36，000形式(即具有不能檢測出Mr36，000的形式)的級分並用於後續實驗中。用胺基酸分析法確定提純的蛋白質的濃度，胺基酸分析由Dr.Gary Hathaway(Biotechnology Instrumentation Center，University of California，Riverside)完成。
7.4.電泳使用Laemmli體系(Laemmli，U.K.，Nature(1970)227680-685)進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠的電泳(SDS-PAGE)。使用帶有5%丙烯醯胺積層凝膠的線性丙烯醯胺梯度凝膠。樣品在還原氣氛下進行試驗。把凝膠用銀試劑(BioRAD)或考馬斯藍染色、脫色並加以乾燥後再進行照相。按照與前面Malik，et al.，所描述的標準比較的方法來計算不同形式的制瘤素M的表觀分子量。
7.5.Mr36，000制瘤素M的胰蛋白酶處理把Mr36，000形式的制瘤素M按粒度分離法來部分地提純並用反相色譜法進行一步提純。所得製劑純度用SDS-PAGE判斷為～80%。把含有～150納克制瘤素M(用RRA估計)的等分試樣在37℃下用6納克TPCK處理過的胰蛋白酶(Worthington)在30微升50毫摩爾Tris乙酸鹽中於pH7.9下處理。樣品在37℃下培養的時間不斷增加，加入濃的電泳樣品緩衝劑來使反應終止，並使用抗6-19血清的免疫印跡法來識別不同形式的制瘤素M。
7.6.低聚糖類的除去推斷的制瘤素M先質序列含有兩個可能的N-連接糖基化位置。為了確定在這些位置上不同的糖基化是否是由於Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的不同造成的，因此用酶N-聚糖酶處理存在於來自pSPOM轉染的COS細胞的無血清調整的培養基中的蛋白質並且分析特定位置的抗血清與制瘤素M(抗6-19)的免疫反應活性，所說酶N-聚糖酶已除去N-連接低聚糖類。經過這種處理後，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M的遷移率均增加了，結果產生了新物種Mr～34，000和Mr30，000。兩種片段的遷移率由於從每一種形式的制瘤素M中除去一個N-連接低聚糖基團(Mr～2，000)而增加。由於兩種形式的遷移率同步增加，因此不同的N-連接糖基化不大可能是由於這些片段的粒度不同而造成的。
7.7.定位的抗血清表明Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M具有不同的C-末端水療法分析(Keski-Oji，J.et al.，J.Cell.Biochem.Suppl.(1987)11A60)表明制瘤素M的C-末端(胺基酸～190-227)是強親水性的。在這一區域，鹼式胺基酸類(R、K或H)含有38個殘基中的24個63%)，有五對能表示可能的分解蛋白解離位置的二元殘基。為了證實C-末端不均勻性是否是由於Mr36，000和Mr32，000形式之間的不同造成的，抗血清被培養成相應於成熟制瘤素M的N-末端(上述的Malik，et al.，and Zarling，J.M.et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.839739-9743)和由cDNA序列推斷的C-末端之間的區域的肽類。然後把這些抗血清用於由pSPOM轉染細胞和原生U937細胞所衍生的制瘤素M的無血清調整的培養基免疫印跡試驗中。雖然抗6-19血清既能與來自pSPOM轉染細胞的Mr36，000和Mr32，000形式反應，又能與來自U937細胞的Mr28，000原生制瘤素M反應，但是抗206-218血清只能與Mr36，000形式的制瘤素M反應。兩種抗血清的特性均用同族肽類抑制其反應活性的能力來表示。這些結果表明，Mr36，000和Mr32，000形式的制瘤素M之間的不同至少部分地是由於C-末端的不均勻性造成的，而C-末端的不均勻性主要地是由於親水性C-末端區內分解蛋白加工所引起的。
7.8.以限制蛋白水解作用來使Mr36，000形式的制瘤素M向Mr32，000形式轉化為了證實Mr36，000形式的制瘤素M的蛋白水解處理會產生Mr32，000形式，使Mr36，000形式的部分提純的製劑進行有限的蛋白水解。反應產物用抗6-19血清檢測。隨著受胰蛋白酶作用的時間不斷增加，就會觀察到Mr36，000形式的制瘤素M的量逐漸減小，而Mr32，000形式的量相應地增加。在測試的最長時間點，可觀察到Mr32，000形式的量減少並觀察到另外的低分子量的免疫反應活性產物。因為Mr32，000產物與N-末端特定抗血清反應，所以它就表示已在C-末端加工過的制瘤素M。這一事實表明，在靠近Mr36，000形式的制瘤素M的C-末端的蛋白水解作用會產生一種與pSPOM轉染細胞製備的Mr32，000形式在粒度上相似的形式的制瘤素M。
7.9.制瘤素M(32K和36K形式)的生長抑制活性把來自pSPOM轉染細胞的無血清調整的培養基在BioGel P60上用色譜法進行分級分離。然後測試各個級分在A375黑素瘤的細胞上的GIA活性和與抗6-19的免疫反應活性。GIA活性的峰值級分在級分35和級分40之間洗脫，它遠遠地處於A280吸附物質的主體之後。在該試驗中不能確定GIA活性的精確的峰值級分，這是因為峰值級分所含的活性要高於在稀釋的試驗中所能精確測定的活性。
免疫印跡分析表明，Mr32，000形式的制瘤素M與含有GIA活性的主體的級分一起洗脫下來。可是，Mr36，000形式在GIA活性的主峰之前(級分33上的峰)已洗脫下來幾個級分。由於含有Mr36，000形式的級分染色更強烈，但是它比Mr32，000形式具有較低的GIA活性，因此Mr36，000形式的GIA比活性看來比Mr32，000形式的要小。
為了對Mr32，000和Mr36，000形式的生物活性進行定量比較，收集主要含有一種形式或另一種形式的按粒度分級分離的級分並比較其GIA和RRA活性。對於這種測定，使用了一種不同的柱子(TSK3000SW)，它能給出與BioGel P60相類似的定性結果，但它能使Mr36，000與Mr32，000形式獲得更好的分離。用免疫印跡法分析收集的級分以便證實沒有與其它形式的制瘤素M發生交叉汙染。按照SDS-PAGE的染色凝膠分析表明，每種形式的制瘤素M的純度對Mr36，000形式大約為20%，對Mr32，000形式大約為80%。如表Ⅳ所示，部分地提純的Mr36，000形式與Mr32，000形式相比，前者的GIA活性較小，但其RRA活性卻較大。這一差別是明顯的，Mr32，000形式的這些活性約相當於Mr36，000形式的這些活性的10倍。
表Ⅳ樣品 GIA活性1RRA活性1比率236K形式 104 43.5 2.432K形式 345 17.9 19.2收集含有Mr36，000或Mr32，000形式的級分，並測試等分試樣的生長抑制活性(GIA)和放射性受體活性(RRA)。
1單位/毫升(×10-3)2GIA活性與RRA活性的比率。
權利要求
1.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中從位置186(包括該位置)的殘基到位置227(包括該位置)的羧基未端殘基的胺基酸缺失1020 30A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-C-K-Q-T-D-L-M-Q-D-T-S-R-L-40 50L-D-P-Y-I-R-I-Q-G-L-D-V-P-K-E-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-60 70 80E-T-L-R-G-L-G-R-R-G-F-L-Q-T-L-N-A-T-L-G-C-V-L-H-R-L-A-D-L-E90 100 110-Q-R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K-L-Q-M-A-R-P-N-I120 130 140-L-G-L-R-N-N-I-Y-C-M-A-Q-L-L-D-N-S-D-T-A-E-P-T-K-A-G-R-G-A-150 160 170-S-Q-P-P-T-P-T-P-A-S-D-A-F-Q-R-K-L-E-G-C-R-F-L-H-G-Y-H-R-F180 190 200-M-H-S-V-G-R-V-F-S-K-W-G-E-S-P-N-R-S-R-R-H-S-P-H-Q-A-L-R-K210 220 227-G-V-R-R-T-R-P-S-R-K-G-K-R-L-M-T-R-G-Q-L-P-R
2.權利要求1的制瘤素M突變體，其中胺基酸186至227缺失。
3.權利要求1的制瘤素M突變體，其中胺基酸196至227缺失。
4.權利要求1的制瘤素M突變體，其中胺基酸189至227缺失。
5.權利要求1的制瘤素M突變體，其中胺基酸188至227缺失。
6.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中在位置6、80和127上的任何胺基酸被一種除了半胱氨酸之外的胺基酸所取代
7.權利要求6的制瘤素M突變體，其中被取代的胺基酸為絲氨酸。
8.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中胺基酸87至90缺失
9.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中胺基酸152至155缺失
10.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中在位置195和196上的任何胺基酸被一種除了精氨酸之外的胺基酸所取代
11.權利要求10的制瘤素M突變體，其中被取代的胺基酸為甘氨酸。
12.一種基本上含有下列胺基酸序列的制瘤素M突變體，其中胺基酸序列GAG插入在胺基酸103和104之間
全文摘要
本發明涉及細胞生長調節因子制瘤素M的生物突變形式。本發明的制瘤素M突變體包括缺失、取氏和嵌入突變體並可用重組體DNA、活體外導致突變和不均勻的表達技術來製備。制瘤素M突變體可用於引發制瘤素M生物響應，並因此可找到多種治療用途，包括在腫瘤治療方面的用途，但並不限於這種用途。
文檔編號C12N15/00GK1055389SQ9011012
公開日1991年10月16日 申請日期1990年12月8日 優先權日1989年12月8日
發明者彼得·S·林斯利, 傑弗裡·C·卡利斯塔德 申請人:翁科根公司