藥物的眼部遞送的製作方法

2023-05-27 11:15:21 2

本發明涉及用於藥物的眼部遞送的新系統。
背景技術：
：局部眼用製劑通常用於治療影響眼前部的疾病，包括但不限於青光眼、虹膜炎、結膜炎眼感染和乾眼症候群(des)。des是指具有多種病因學的一系列眼表面疾病，其特徵是，由眼淚產生和排出的不適當平衡或眼淚組成的異常而引起的角膜和結膜的慢性眼乾燥。此外，經常發生眼表面炎症。t淋巴細胞介導的炎症應答已被認為是des的可能原因。因此，近年來出現了將環孢菌素(csa)和他克莫司(tac)作為局部免疫抑制劑用於治療des。這樣的治療已顯示出降低免疫應答並且還表明其增加眼淚產生。由於csa和tac的疏水性和低水溶性，通常使用油性載體來配製它們，所述油性載體與生物利用度的局限性、穩定性和眼耐受性問題有關。基於乳劑的製劑，例如市售的在淚液產生方面已顯示出提供顯著的改善。然而，已知並非最佳的，並且該製劑存在眼生物利用度低的問題。已報導基於蓖麻油的乳劑例如具有雙峰液滴尺寸分布的特徵。因此，這些組合物易發生微滴聚結，這限制了它們的保質期。由於蓖麻油乳劑微滴有限的角膜前停留時間，以及csa對油微滴的更大的親和性，需要每日給藥兩次以在眼組織中保持藥物水平在其治療水平之上(50-300ng/g)。已建議使用帶正電荷的乳劑以延長在角膜表面的停留時間。假定微滴上的正電荷將增加微滴與帶負電的角膜細胞表面的相互作用。在這方面，與相比，帶正電荷的乳劑已顯示出在單劑量之後在家兔角膜中更高的最大濃度(p.daull，etal；distributionofcyclosporineainoculartissuesaftertopicaladministrationofcyclosporineacationicemulsionstopigmentedrabbits，cornea，32(2013)345-354)。kuwano等人在pharmaceuticalresearch，19(2002)108-111中製備了包含聚乙二醇40硬脂酸酯的csa水分散體。所述包含聚乙二醇40硬脂酸酯的csa水分散體與csa的蓖麻油溶液和csa的蓖麻油水包油(o/w)乳劑相比均具有更高的生物利用度。作者提出，csa的生物利用度受到它從載體釋放到分散介質的速率的影響。在這方面，csa從油性載體(蓖麻油乳劑或溶液)的釋放受到csa在油相中的高分配係數的限制。包含聚乙二醇40硬脂酸酯的組合物不會受到這樣的妨礙，因為它是水基的(沒有油)。此外，聚乙二醇40硬脂酸酯形成200nm的膠束，這比乳劑微滴小得多，因此可釋放更多的csa。calvo等人在internationaljournalofpharmaceutics，103(1994)283-291中報導了使用ε-己內酯納米粒改善了csa的眼滲透。作者證明了這些納米粒實現了比csa油性溶液高5倍的csa角膜水平。作者提出，這種增強歸因於納米粒在給藥位點的停留時間延長。wo2004/026912記載了用於使疏水藥物增溶的多糖。所述多糖是兩親性的並且通常選自以下物質的任何衍生物：殼聚糖、葡聚糖、海藻酸、澱粉、葡聚糖和瓜爾膠。在該專利申請的實施例中，棕櫚醯乙二醇殼聚糖季銨鹽(gcpq)和十六烷基乙二醇殼聚糖季銨鹽(gchq)被用作增溶多糖。wo2008/017839記載了從兩親性碳水化合物聚合物形成的膠束簇以及它們用於配製疏水藥物的用途。作為兩親性碳水化合物聚合物，特別地舉例說明了gcpq。特別提及了潑尼松龍作為免疫抑制劑的用途。儘管目前被用於治療des，仍然需要替代性製劑以治療這一問題。理想的製劑應當具有至少與相當的穩定性和眼耐受性，同時改善藥物的生物利用度。技術實現要素：根據本發明的第一方面，提供一種水性組合物，其包含濃度低於2％w/v的大環內酯免疫抑制劑藥物和分子量範圍為1-50kda的兩親性碳水化合物，所述組合物通過局部施用於眼睛來治療眼部疾病，其中：所述兩親性碳水化合物以組合物的10％w/v以下的濃度存在並且為由以下通式表示的化合物或其鹽：其中，a+b+c+d＝1.000，並且a為0.00至0.84，b為0.01至0.40，c為0.10至0.94，且d為0.05至0.50；並且其中：x是疏水基團；r1、r2和r3獨立地選自取代的或未取代的烷基；r4、r5、r6和r10獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；r7可存在或不存在，並且當存在時，其為取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的醯氨基；r8和r9獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。根據本發明的第二方面，提供一種適合於眼部給藥的藥物組合物，其包含一種或更多種藥學上可接受的賦形劑和濃度低於2％w/v的大環內酯免疫抑制劑藥物和分子量範圍為1-50kda的兩親性碳水化合物，其中：所述兩親性碳水化合物以組合物的10％w/v以下的濃度存在並且為由以下通式表示的化合物或其鹽：其中，a+b+c+d＝1.000，並且a為0.00至0.84，b為0.01至0.40，c為0.10至0.94，且d為0.05至0.50；並且其中：x是疏水基團；r1、r2和r3獨立地選自取代的或未取代的烷基；r4、r5、r6和r10獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；r7可存在或不存在，並且當存在時，其為取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的醯氨基；r8和r9獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。根據本發明的第三方面，提供一種治療眼部疾病的方法，其中將本發明第一或第二方面的組合物局部施用於眼睛。所述兩親性碳水化合物能夠在水性介質中自組裝成納米粒。本發明的目的是提供具有良好穩定性、耐受性和生物利用度的眼用組合物。這通過使用能夠在水性介質中自組裝的帶正電荷的兩親性自組裝聚合物來實現。這些聚合物具有多功能性，這使它們適合於眼用組合物。所述聚合物形成以帶正電荷的納米粒藥物載體形式的粘性或非粘性水分散體，所述帶正電荷的納米粒藥物載體具有黏膜粘附性能。由於僅可使用一種賦形劑，所以可以保持製劑的簡單性。值得注意的是，不需要使用脂質或乳劑。聚合物分子的分子量是重要的，因為如果分子量低於1kda，通常聚合物分子將太小而無法包封充足水平的藥物，如果分子量高於50kda，則聚合物可導致產生粘性太大的組合物。適當的聚合物濃度也是重要的，並且應當在組合物的10％w/v以下以防止形成凝膠。此外，2％w/v以下的藥物濃度使得它們能夠完全納入聚合物分子內部。具體實施方式大環內酯藥物適合用作免疫抑制劑並且通常選自西羅莫司(sirolimus)、環孢菌素a、他克莫司和依維莫司(everolimus)，優選環孢菌素a(csa)。csa是有效的免疫抑制劑，已表明它可應用於眼科，用於治療角膜移植物排斥和多種眼部疾病，包括乾燥性角結膜炎和葡萄膜炎。由於csa的水溶性差，它目前被配製為眼用乳劑如上文詳細討論的。本發明的組合物可用於治療乾眼症候群(des)(也稱為乾燥性角結膜炎(kcs))、春季角結膜炎(vkc)、溼疹、特應性角結膜炎(akc)、症候群、術後屈光手術、角膜移植或隱形眼鏡不耐受。藥物通常被自組裝的帶正電荷的兩親性聚合物包封。優選將藥物遞送到表面的眼組織，例如角膜和結膜。所述兩親性化合物為殼聚糖衍生物。所述兩親性碳水化合物為由下式表示的化合物或其鹽：其中，a+b+c+d＝1.000，並且a為0.00至0.84，b為0.01至0.40，c為0.10至0.94，且d為0.05至0.50；並且其中：x是疏水基團；r1、r2和r3獨立地選自取代的或未取代的烷基；r4、r5、r6和r10獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；r7可存在或不存在，並且當存在時，其為取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的醯氨基；r8和r9獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。在以上通式中，a、b、c和d單元可以以任何次序排列，並且可以是按順序的、部分按順序的或隨機的。式中的＊用於表示連續的聚合物鏈。在優選的實施方案中，d單元的摩爾比例在0.08-0.25的範圍。優選地，b單元的摩爾比例為0.02至0.4。從上式中可看出，a和c單元可任選地不存在。d單元提供衍生出疏水基團的單體單元的第一部分，b單元提供衍生出四價氮基團的單體單元的第二部分。當a存在時，其提供單體單元的第三部分，其中氨基以與第一組或第二組不同的方式被衍生化。當c單元存在時，其提供單體單元的第四部分，其中氨基未被衍生化。在本發明中，疏水基團x優選選自取代的或未取代的基團，其為烷基，例如c4-30烷基；烯基，例如c4-30烯基；炔基，例如c4-30炔基；芳基，例如c5-20芳基；具有多於一個c4-c8環結構的多環疏水基團，例如固醇(例如膽固醇)；具有多於一個c4-c8雜原子環結構的多環疏水基團；多氧c1-c4亞烷基，例如多氧亞丁基聚合物；或疏水聚合取代基，例如聚(乳酸)基、聚(丙交酯-共-乙交酯)基或聚(羥乙酸)基。x基團可以是直鏈的、支鏈的或環狀基團。任何x基團可直接連接至d單元(即在單體單元的c2處)，或通過官能團例如氨基、醯基或醯氨基連接，從而形成可表示為x』-環、x』-nh-、x』-co-環、x』conh-環的連接鍵，其中x』為如上文所定義的疏水基團。x基團的優選實例包括由式ch3(ch2)n-co-nh-或ch3(ch2)n-nh-或烯酸ch3(ch2)p-ch＝ch-(ch2)q-co-nh-代表的那些基團，其中n為4至30，更優選6至20，p和q可以相同或不同並且為4至16，更優選4至14。特別優選的x取代基的類型經由醯氨基連接至殼聚糖單體單元，例如由式ch3(ch2)nco-nh-所表示的，其中n為2至28。醯氨基的實例可通過將羧酸與殼聚糖的氨基偶聯來產生。優選的實例為脂肪酸衍生物ch3(ch2)ncooh，例如基於癸酸(n＝8)、月桂酸(n＝10)、豆蔻酸(n＝12)、棕櫚酸(n＝14)、硬脂酸(n＝16)或花生酸(n＝18)的那些衍生物。在上式中，r1、r2和r3優選獨立地選自取代的或未取代的烷基，例如c1-10烷基。r1、r2和/或r3可為直鏈的或支鏈的。優選地，r1、r2和r3獨立地選自甲基、乙基或丙基。在上式中，r8和r9優選獨立地選自氫和取代的或未取代的烷基，例如c1-10烷基。r8和/或r9可為直鏈的或支鏈的。優選地，r8和r9獨立地選自甲基、乙基或丙基。在上式中，存在於c6或糖基上的r4、r5、r6和r10獨立地選自氫、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。優選地，r4、r5、r6和r10被一個或更多個羥基或被另一個非離子親水取代基取代。r4、r5、r6和r10基團的實例由式-(ch2)p-oh表示，其中p為1至10，優選為2至4；或由-(ch2)p-ch(ch2-oh)2表示，其中p為1至10；或由-(ch2)p-c(ch2-oh)r表示，其中p為1至10且r為3；或由-(ch2ch2oh)p表示，其中p為1至300。r7基團可存在或不存在於通式中。當r7不存在時，其提供直接連接到殼聚糖骨架的單體單元上的季銨官能團。當r7基團存在時，其可以是未取代的或取代的烷基(例如c1-10烷基)，例如由式-(ch2)n-表示的烷基、由式-nh-(ch2)n-表示的氨基、或由式-nh-co-(ch2)n-表示的醯氨基，其中n為1至10，優選1至4。r7n+r1r2r3取代基的優選實例通過將內銨鹽(-ooc-ch2-n+-(ch3)3)與b單元的胺取代基偶聯而提供，從而提供醯氨基，例如在-nh-co-ch2-n+r1r2r3中。如所說明的，本文所述的一些取代基可以是未取代的或被一種或更多種本領域技術人員公知的其他取代基取代。常見取代基的實例包括滷素、羥基、醚(例如c1-7烷氧基)、甲醯基、醯基(例如c1-7烷基醯基、c5-20芳基醯基)、醯滷、羧基、酯、醯氧基、醯氨基、乙醯氨基、硫代醯氨基、四唑基、氨基、硝基、亞硝基、疊氮基、氰基、異氰基、氰氧基、異氰氧基、氰硫基、異氰硫基、巰基、硫醚(例如c1-7烷硫基)、磺酸、磺酸鹽、碸、磺醯氧基、亞磺醯氧基、磺氨基(sulfamino)、磺氨基(sulfonamino)、亞硫醯氨基(sulfinamino)、氨磺醯基(sulfamyl)、亞磺醯氨基(sulfonamido)、c1-7烷基(包括例如未取代的c1-7烷基、c1-7滷代烷基、c1-7羥基烷基、c1-7羧基烷基、c1-7氨基烷基、c5-20芳基-g1-7烷基)、c3-20雜環基和c5-20芳基(包括例如c5-20碳芳基、c5-20雜芳基、c1-7烷基-c5-20芳基和c5-20滷代芳基)基團。本文使用的術語「環結構」指由3至10個共價連接的原子、還更優選3至8個共價連接的原子、還更優選5至6個共價連接的原子構成的閉合環。環可以是脂環或芳環。本文使用的術語「脂環」指不是芳環的環。本文使用的術語「碳環」指所有環原子都是碳原子的環。本文使用的術語「碳芳環」指所有環原子都是碳原子的芳環。本文使用的術語「雜環」指其中至少一個環原子是多價環雜原子的環，所述雜原子例如氮、磷、矽、氧或硫，更通常為氮、氧或硫。優選地，所述雜環具有1至4個雜原子。以上環可以是「多環基團」的一部分。優選地，所述兩親性碳水化合物是棕櫚醯乙二醇殼聚糖季銨鹽(gcpq)。在這種情況下，棕櫚醯化水平優選為5-50％/單體。季銨化水平優選為1-40％/單體。在本發明的組合物中，藥物優選以0.001-1％w/v的濃度存在。當濃度表示為％w/v時，這意指在100ml組合物中所包含的以g為單位的固體的量。所述兩親性碳水化合物的分子量範圍是1-50kda。優選使用凝膠滲透色譜法-多角度光散射(gpc-malls)來測量分子量。所述兩親性碳水化合物在水性介質中能夠自組裝成顆粒，而不需要存在其他試劑例如三聚磷酸鹽。通常形成膠束。本發明的組合物可形成顆粒聚集物。這些聚集物可通過單個兩親性分子和親水藥物的聚集而形成，並且平均顆粒大小為10nm至20μm。優選地，所述兩親性碳水化合物形成可負載藥物的納米粒。可形成碳水化合物和藥物的分散體，其為澄清的或透明的。通常將所述兩親性化合物與藥物混合，並且通過對混合物進行渦旋和探針超聲處理或通過對混合物進行高壓均質化來製備分散體。通過使用顯微鏡或使用光子關聯光譜法可容易地測定平均顆粒大小，並且可在過濾之前於水分散體中便利地測定。更優選地，所述聚合的膠束聚集物的最小平均顆粒大小為至少10nm，更優選至少30nm，且最大平均顆粒大小優選為10μm或更小。通常，所述兩親性碳水化合物與藥物的比例在1∶1至50∶1的範圍內，更優選在1∶1至20∶1的範圍內。通常，所述兩親性碳水化合物/藥物/藥學上可接受的載體的比例可為約1-40mg∶1mg∶1g，例如1-5mg∶1mg∶1g。本發明的藥物組合物可為適於眼部給藥的液體形式或固體形式。通常製劑為澄清的或乳白色的液體製劑。根據年齡、體重、給藥時間等可確定適合的每日劑量。通常的眼用劑量為0.01-10mg/人/天，但每日劑量可隨患者的狀況和體重以及藥物性質而變化。實施例材料和方法聚合物如之前在us20100159014a1，i.f.uchegbu，a.g.schatzlein，x.hou，polymericmicellarclustersandtheirusesinformulatingdrugs中所描述的，合成並表徵n-棕櫚醯基-n-單甲基-n，n-二甲基-n，n，n-三甲基-6-o-乙二醇殼聚糖(gcpq)。用於實驗的gcpq含有20.51mol％棕櫚醯基/單體單元，11.93mol％季銨基/單體單元，分子量為9.13kda。csa組合物如下製備包含csa的組合物。向經稱重的聚合物樣品和經稱重的藥物樣品中加入磷酸鹽緩衝鹽水(ph＝7.4，20ml)。初始聚合物/藥物的重量比為7.5∶1，並且將藥物含量調整至0.05％、0.08％和0.1％w/v的濃度。將液體混合物渦旋2分鐘以確保完全混合，隨後在20,000psi下進行高壓均質化(avestinemulsiflex，gcttechnology，英國)，進行30個循環。csa製劑穩定性對於穩定性分析，將製劑的等分部分一式三份地貯存於冷藏溫度(2-3℃)、室溫(16-22℃)或較高溫度(40℃)下，並且在進行凍-融循環(-20℃下2天，5℃下2天，40℃下2天，重複3個循環)時進行監測。在多個時間間隔下，使用高效液相色譜法(hplc)測定來分析製劑的藥物含量。csa測定如之前在w.p.cheng，a.i.gray，l.tetley，t.l.b.hang，a.g.i.f.uchegbu，polyelectrolytenanoparticleswithhighdrugloadingenhancetheoraluptakeofhydrophobiccompounds.biomacromolecules，7(2006)1509-1520中所描述的，進行hplc測定。簡言之，將製劑的等分部分(100μl)採用等體積的甲醇稀釋，過濾(0.22μm)溶液並將濾液注入c18反相onyx整體柱(100×4.6mm)。流動相為乙腈、水(60∶40)，流速為1.2mlmin-1，注射體積為20μl，柱溫為70℃。hplc系統為agilent1200系列(agilenttechnologiesltd，英國)，並且通過agilentchemstation軟體來分析數據。體內實驗對於csa的局部眼部給藥，將包含gcpq的0.05％w/vcsa組合物施用於雄性紐西蘭家兔(n＝3，harlan，英國)，所述csa組合物按照上文的描述而製備，製備方法稍有改變。體內製劑將gcpq(gcpqlc2sep13-去質子化，mw＝13210da，mn＝12180da，摩爾％棕櫚醯化＝17％，摩爾％季銨基團＝12％)以0.75％w/v的濃度分散於含有3.1％w/v丙三醇的水溶液中。通過在定軌振蕩器上輕輕振蕩至少2小時而使聚合物分散。一旦聚合物完全分散，使用3.1μm注射器式濾器來過濾分散體。將上述聚合物分散體添加到經稱重的csa粉末中(加入目標量2倍的csa)。通過首先對混合物進行渦旋，隨後使用高壓均質器(avestinc5)在18000psi下處理30個循環，從而使csa粉末分散。高壓均質化之後，使用naoh(1m)將ph調節至7.4。將製劑貯存在5℃下至少24h，通過hplc進行分析，並最終採用含有0.75％w/vgcpq和3.1％w/v丙三醇的聚合物分散體(之前調節至ph7.4並使用3.1μm注射器式濾器來過濾)稀釋以使所述製劑達到所需的濃度。動物實驗實驗前使2.5至3kg的紐西蘭白化病雄性家兔(harlanlaboratories，英國)適應不少於5天。這些家兔在整個研究過程中可自由獲得水。將所述製劑施用於雙眼中。為了給予所述製劑，將下眼瞼從眼球處輕輕拉開，使用標有刻度的微量移液管將25μl製劑施用到下結膜穹窿中。給藥後，用手將上下眼瞼合在一起約5秒鐘以允許製劑與角膜接觸。隨後，記錄之後60秒內眨眼的次數。在預先安排的時間點(0.5、2、4、8、24小時)，從邊緣耳動脈取動脈血樣品。隨後，通過靜脈內(iv)過量注射戊巴比妥處死家兔。使用2μl毛細管收集眼淚樣品。解剖各組織，採用0.9％nacl溶液衝洗，在濾紙上乾燥並貯存，用於隨後的分析。按照以下順序收集眼組織以使汙染最小：(1)房水、(2)結膜、(3)玻璃狀液、(4)晶狀體、(5)角膜和(6)鞏膜。將來自雙眼的組織貯存在相同的容器中。首先(解剖後2-5小時)將樣品貯存在冰中(解剖後2-5小時)，隨後將樣品貯存在-80℃直到進行分析。組織分析使用液相色譜-質譜(lc-ms/ms)來測定組織中csa的濃度。標準品的製備在玻璃小瓶中製備濃度為1mgml-1的csa於甲醇中的儲備溶液(用於lc-ms，sigma-aldrich)。通過在甲醇中連續稀釋csa儲備溶液來製備工作標準品(ws)，以獲得濃度範圍為約50至1000000ngml-1的工作標準品(表1)。表1：csa工作標準溶液的製備稀釋劑：甲醇將csa-d12(recipe，德國)用作內標。製備內標(is)於乙腈中的濃度為6.25μgml-1的儲備溶液。通過採用甲醇稀釋is儲備溶液來新鮮製備is標準溶液(is-ppt)以產生濃度為5ngml-1的is。將組織解凍(用剪刀將固體組織剪成小片)、稱重(99.0±1.0mg，或者對液態組織而言為99μl)並放置在1.5ml聚丙烯微量離心管中。向各管中加入一定體積的工作標準品ws0-ws14(表2)。然後將加入了標準品的(spiked)樣品渦旋10分鐘。表2：csa校準標準品的製備然後通過添加400μl的is-ppt並在室溫下渦旋4小時來提取加入了標準品的樣品。隨後從渦旋中取出樣品並放置在5℃下30分鐘，然後離心(5000g×10分鐘)。將上清液轉移到hplc小瓶中並使用lc-ms進行分析。樣品製備將組織解凍(用剪刀將固體組織剪成小片)、稱重(100.0±1.0mg，或者對於液態組織而言為100μl)並放置在1.5ml聚丙烯微量離心管中。然後通過添加400μl的is-ppt並在室溫下渦旋4小時來提取樣品。隨後從渦旋中取出樣品並放置在5℃下30分鐘，然後離心(5000g×10分鐘)。將上清液轉移到hplc小瓶中並使用lc-ms進行分析。lc-ms/ms儀器在agilent6400系列三重四極杆lc/ms系統(agilenttechnologies，berkshire，英國)上分析樣品，該系統包括脫氣裝置(hip脫氣裝置1260/g4225a)、二元泵(hip1260二元泵/g1312b)、自動進樣器(hip進樣器1260/g1367e)、柱溫箱(g1316a)和三重四極質譜儀(g6460a)。agilentmasshunterworkstation軟體用於系統控制、數據採集和數據處理。色譜條件在agilentzorbaxextend-c18(50×2.1mm柱，孔徑＝3.5μm)上對樣品(注入體積＝5μl)進行色譜分析，所述agilentzorbaxextend-c18配備了cartridgegemini(c184×2.0mm)保護柱並且柱溫為60℃，流動相的流速為600μlmin-1。流動相梯度如表3所示，其中溶液a＝0.02％w/v乙酸水溶液，溶液b＝含有0.02％w/v乙酸的甲醇。在上述色譜條件下獲得的兩種分析物的典型保留時間報告於表4中。表3：lc-ms/ms分析的梯度法表4：lc-ms/ms保留時間分析物時間(分鐘)csa2.14csa-d122.14質譜儀條件離子源為agilentjetstream(ajs)，其以氮作為源，掃描模式為多重反應監測(mrm)，極性為陽離子模式，噴霧器壓力為30psi，氣體流速設置為5lmin-1，氣體溫度為340℃，毛細管電壓設置為5000v，套管氣加熱器設置為400℃，套管氣體流速設置為11lmin-1，錐孔電壓(vcharging)設置為1500v。表5報告了用於對兩種分析物中的每一種進行定量的質譜儀條件。表5：設置用幹lc-ms/ms分析的離子通道檢測器定量使用如表2中所描述的方法而製備的標準品來構建csa和csa-d12的校正曲線。藥代動力學分析使用microsoftexcelprofessionalplus2010來計算藥代動力學參數。使用ibmspssstatistics用於統計分析。低於定量限度(blq)的值視為計算值為0。繞計分析使用ibmspssstatistics用於統計分析。低於定量限度(blq)的值視為計算值為0。首先進行雙因素方差分析，然後進行事後檢驗(tukey′shsd)以檢測在整套時間點中3種製劑之間的差異。當在三種製劑中出現統計上顯著的差異時，採用單因素方差分析，隨後進行事後檢驗(分別為tukey′shsd，或等方差或不等方差games-howell)來評估各時間點內的統計學顯著差異。結果表6報告了澄清液體製劑的物理化學特徵。滲透壓和ph在眼用製劑的範圍內。表6：組合物的物理化學性質nd：未測定當在上述條件下進行熱穩定性研究時，所述製劑在藥物含量方面是穩定的(表7-10)。表7：進行熱穩定性研究時，包含csa0.050％w/v和gcpq0.375％w/v的組合物的藥物含量表8：進行熱穩定性研究時，包含csa0.080％w/v和gcpq0.600％w/v的組合物的藥物含量表9：進行熱穩定性研究時，包含csa0.100％w/v和gcpq0.750％w/v的組合物的藥物含量表10：進行凍-融循環時，包含csa0.100％w/v和gcpq0.750％w/v的組合物的藥物含量貯存天數[csa]±sd(μg/ml)貯存溫度0782.26±88.21不適用1-2724.85±26.31-20℃3-4906.99±107.784℃5-6724.31±70.2740℃7-8863.16±113.29-20℃9-10820.26±68.064℃11-12773.26±57.7140℃13-14786.46±107.28-20℃15-16696.72±163.894℃17-18834.18±67.3340℃當製劑處於加速的貯存溫度(40℃)時，其呈現為乳白色液體並且可逆地變為更加不透明的，當暴露於較低的溫度(室溫)時，其恢復乳白色的外觀，當貯存在較低溫度(室溫和冷藏)時，其保持乳白色的外觀；貯存在40℃時這種外觀的改變是由於環孢菌素a固有的溶解度的改變，因為隨著溫度從冷藏溫度升至人體生理溫度，藥物溶解度變低(5℃下溶解度＝101.5μgml-1，25℃下溶解度＝19.9μgml-1，37℃下溶解度＝3.7μgml-1)。在貯存期間，如通過目視觀察所確定的，未觀察到藥物沉澱。在所有三個製劑的貯存條件下，藥物含量在30天中保持不變(表7-9)(對數據進行方差分析檢驗，原始製劑和貯存的製劑之間沒有顯著差異)。當進行熱循環時，目視宏觀分析表明，在3個循環結束時製劑看起來略微渾濁，但是沒有任何藥物沉澱，如通過目視觀察所確定的。此外，藥物含量在熱循環期間是穩定的(表10)(如通過對結果進行方差分析檢驗所確定的)。表11中報告了在包含csa0.050％w/v和gcpq0.75％w/v的組合物的局部眼部給藥之後，各組織中的csa濃度。作為對照製劑給藥。blq_p：低於血漿中的定量限(1.6ng/ml)；blq_a：低於房水中的定量限(0.5ng/ml)體內局部眼部給藥實驗表明，包含gcpq的組合物的生物利用度比市售組合物更高(表11)。特別地，當在所有時間點(除最終的24小時時間點以外)與restasis進行比較時，gcpq組合物在角膜和結膜中的藥物水平在統計上顯著地更高(p＜0.05)。此外，當在4和8小時的時間點與進行比較時，gcpq組合物在鞏膜中的藥物水平在統計上顯著地更高(p＜0.05)。結果表明，在房水、玻璃狀液和血漿中，兩種組合物之間在藥物水平上沒有差異。這些結果總體上表明，gcpq組合物更有效地將csa遞送到眼組織(角膜和結膜)中，其為des的主要靶點。值得注意的是，血漿中的csa濃度低於血漿中的定量限(1.6ng/ml)，因此表明所述製劑不誘導全身性副作用。當前第1頁12