色素合成kit配體及其應用的製作方法

2023-05-27 11:12:41

專利名稱：色素合成kit配體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及色素合成KIT配體及其應用。具體而言，本發明涉及引起色素沉著疾 病的色素合成KIT配體的突變物及其在製備治療色素沉著疾病用的藥物中的應用。
背景技術：
家族性進行性色素沉著又名瀰漫性色素沉著(FPH)，是一種罕見的先天性遺傳 病，Chernosky最早報導了一個有兩代四個人的FPH家系(Chernosky，M. E.，Anderson, D. E. , Chang, J. P. , Shaw, M. ff., 禾口 Romsdahl, M. M. (1971). Familial progressive hyperp i gmentat i on. Arch Dermatol 103, 581-591 passim.)。色素沉著出現在一出 生或嬰兒發育早期，不規則的色素斑隨著年齡的增長而出現大小，數量的增加與融匯 (Rebora，A.禾口 Parodi，A. (1989). Universal inheritedmelanodyschromatosis :a case of melanosis universalis hereditaria ？ Arch Dermatol 125，1442-1443)。這一過禾呈 在兒童期進展很快而在青年期相對較慢，最終導致位於臉部，頸部，軀幹，四肢，唇，口腔粘 膜及手足相連的密集的色素沉著(Ling, D.B.和Lo，T. (1991) Familial progressive hyperpigmentation -.a family study inChina. Br J Dermatol 125，607)。隨著 1989 年 Rebora報導了一個義大利色素沉著家系與1991年林等報導了一個中國FPH家系，FPH被 確定為常染色體顯性遺傳病(Rebora等，和Ling，D. B.等，同上)。第一個色素沉著疾病 位點於2006年被定位於染色體19pl3. 1-pter界於D19S593與pter之間約45. 58cM的區 域(Zhang, C. , Deng, Y. , Chen, X. , ffu, X. , Jin, ff. , Li, H. , Yu, C. , Xiong, Y. , Zhou, L.禾口 Chen, Y. (2006). Linkage of a locus determining familial progressivehyperpigmen tation (FPH)to chromosome 19p 13. 1-pter in a Chinese family. Eur JDermatol 16, 246-250.)。然而，色素沉著致病基因與發病機理仍不清楚。KITLG，也口L| steel factor、stem cell factor 禾口 mast cell growth factor，它 可以結合併激活KIT受體，對於皮膚中黑色素細胞袓系的發育和維持起著非常重要的作用 (Grichnik，J. M.、Burch，J. A.、Burchette，J.禾口 Shea，C. R. (1998). TheSCF/KIT pathway plays a critical role in the control of normal human melanocytehomeostasis. J Invest Dermatol 111，233-238 ；Anderson，D. M.、Lyman, S. D.、Baird，A.、Wignall, J. M.、 Eisenman, J.、Rauch，C. ^March, C. J.、Boswell，H. S.、Gimpel，S.D.、Cosman，D.等，(1990). Molecular cloning of mast cell growth factor， ahematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms. Cell 63，235—243 ;Copeland，N. G.、Gilbert， D. J.、Cho，B. C.、Donovan, P. J.、Jenkins，N. A.、Cosman，D.、Anderson，D.、Lyman, S. D.禾口 Williams, D. E. (1990). Mast cell growthfactor maps near the steel locus on mouse chromosome 10 and is deleted in anumber of steel alleles.Cell 63，175—183 ; Russell, E. S. (1979). Hereditary anemiasof the mouse :a review for geneticists. Adv Genet 20，357-459 ；禾口 Manova，K.、Bachvarova, R. F.、Huang，E. J.、Sanchez, S.、 Pronovost，S. M.、Velazquez, E.、McGuire，B.禾口 Besmer，P. (1992). c_kit receptor andligand expression in postnataldevelopment of the mouse cerebellum suggests a function for c-kit in inhibitoryinterneurons. J Neurosci 12,4663-4676)。KITLG存 在兩種不同剪切轉錄本，區別在於是否含有外顯子6。其中小轉錄本不包含6號外顯子，編 碼膜結合形式的 KITLG(mKITLG) (Huang, E. J.、Nocka，K. H. .Buck, J.和 Besmer，P. (1992). Differential expression and processing of two cell associated forms of the kit-ligand :KL-1 and KL-2. Mol Biol Cell 3,349-362)。而大轉錄本因為含有 6 號外顯 子，從而在其膜外部分出現一個蛋白酶切割位點，該位點即可被細胞表面蛋白酶切割從而 產生可溶性的分泌蛋白 KITLG(sKITLG) (Flanagan, J. G.、Chan, D. C.和 Leder，P. (1991). Transmembrane form of the kit ligand growth factor isdetermined by alternative splicing and is missing in the Sid mutant. Cell 64，1025_1035)。兩種形式的 KITLG mRNAs翻譯出來的未成熟蛋白質N端都包含一個25胺基酸的信號肽，但在成熟的KITLG蛋 白中信號肽會被切掉(Anderson等，同上)。在魚、蠑螈、鳥類以及哺乳動物中，許多研究都表明KIT和KITLG基因對黑色素細 胞的發育和色素的生成都起著至關重要的作用，雖然不同物種中KIT和KITLG的表達情況 都不一樣。此外，黑色素細胞的存活或增值對KIT/KITLG信號通路的依賴程度也是具有種 屬特異性的(Huang 等，同上；Hultman,K. A.、Bahary，N.、Zon，L. I.和 Johnson，S. L. (2007). Gene Duplication ofthe zebrafish kit ligand and partitioning of melanocyte development functions to kitligand a. PLoS Genet 3, el7 ；Parichy, D. M. > Stigson, M.禾口 Voss, S. R. (1999). Genetic analysis of steel and the PG-M/versican-encoding gene AxPG ascandidates for the white(d)pigmentation mutant in the salamander Ambystomamexicanum. Dev Genes Evol 209,349-356 ；ffehrle-Haller, B. > Meller, M.禾口 Weston, J. A. (2001).Analysis of melanocyte precursors in Nf1 mutants reveals thatMGF/KIT signaling promotes directed cell migration independent of its function incell survival. Dev Biol 232,471-483)。之前的研究也表明 KITLG 基因的許 多突變對純合小鼠都是致死的，雜合小鼠則會出現不同程度的皮毛顏色稀釋(Rajaraman， S. > Davis, ff. S. > Mahakali-Zama, A. > Evans, H. K. > Russell, L. B.禾口 Bedell，M. A. (2002). An allelic series of mutations in the Kit ligand gene ofmice. II. Effects of ethylnitrosourea-induced Kitl point mutations on survival andperipheral blood cells of Kitl(Steel)mice. Genetics 162,341-353 ；Chui, D. H. > Loyer, B. V.禾口 Russell, E. S. (1976).Steel(Sl)mutation in mice identification ofmutant embryos early in development. Dev Biol 49,300-303 ；Poole, T. ff.禾口 Silvers，W. K. (1979) Capacity of adult steel(Sl/SId)and dominant spotting(ff/ffv)mouseskin to support melanogenesis. Dev Biol 72，398-400)。轉基因小鼠中，特異性地在表皮中表達KITLG能夠 挽救黑色素細胞的減少症狀，進而造成表皮過度色素化(Kimisada等，同上；Kimisada，T.、 Lu,S. Z.、Yoshida,H. >Nishikawa,S. >Nishikawa,S.、Mizoguchi,M. >Hayashi,S. >Tyrrell, L.、Williams, D. A.、Wang, X.等(1998). Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis inducedby keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J Exp Med 187，1565-1573)。在人皮膚中，表皮角質化細胞和內皮細胞都會表達KITLG(Hamann，K.、Haas, N.、Grabbe，J.禾口 Czarnetzki，B. M. (1995). Expression of stem cell factor incutaneous mastocytosis. Br J Dermatol 133，203-208 ；Morita，E.、Lee, D. G.、Sugiyama，M.禾口 Yamamoto，S. (1994). Expression of c_kit ligand in humankeratinocytes.Arch Dermatol Res 286,273-277 ；Miyamoto, T.、Sasaguri，Y.、Sasaguri，T.、Azakami，S.、 Yasukawa,H.、Kato，S.、Arima，N.、Sugama，K.禾口 Morimatsu，M. (1997). Expression of stem cell factor in human aortic endothelialand smooth muscle cells. Atherosclerosis 129，207-213)。KITLG以及其受體KIT的信號通路對黑色素細胞的增殖和色素的合成都很 重要(Halaban, R.、Tyrrell，L、Longley，J.、Yarden，Y.禾口 Rubin，J. (1993). Pigmentation and proliferation ofhuman melanocytes and the effects of melanocyte-stimulating hormone andultraviolet B light. Ann N Y Acad Sci 680，290—301 ；Funasaka，Y.、 Boulton，T.、Cobb, M.、Yarden，Y.、Fan，B.、Lyman, S. D.、Williams, D. E.、Anderson，D. M.、 Zakut，R.、Mishima，Y.等，(1992) c-Kit-kinase induces a cascade of proteintyrosine phosphorylation in normal human melanocytes in response to mast cellgrowth factor and stimulates mitogen-activated protein kinase but isdown-regulated in melanomas. Mol Biol Cell 3，197—209 ；Hemesath，T. J.、Price，E. R.、Takemoto，C.、 Badalian，T.禾口 Fisher，D. E. (1998). MAP kinase links thetranscription factor Microphthalmia to c_Kit signalling in melanocytes. Nature 391，298-301)。將人 類皮膚移植到裸鼠中，並在移植的人皮膚中注射可溶性的sKITLG會導致色素沉著，相反， 如果注射的是KIT或者KITLG的封閉抗體則會導致黑色素細胞的喪失(Grichnik等，同 上)。與此相似，接受KITLG治療的病人，在其注射KITLG的皮膚區域出現黑色素細胞的增 多以及色素沉著(Grichnik，J. M.、Crawford, J.、Jimenez, F.、Kurtzberg，J.、Buchanan， M.、Blackwell，S. ^ Clark, R. E.、禾口 Hitchcock，M. G. (1995). Human recombinant stem-cell factor induces melanocytic hyperplasia in susceptible patients. J AmAcad Dermatol 33，577-583 ；Bellet，J. S.、Obadiah，J. M.、Frothingham，B. M.、Kurtzberg, J.禾口 Grichnik，J. M. (2003). A patient with extensive stem cellfactor-induced hyperpigmentation. Cutis 71，149-152)。本發明人對Ling等報導的中國家系(Ling，D.B.等，同上)進行了全基因組掃描， 將致病位點定位於染色體12q21. 31-q23. 1的區域，隨後本發明人在這一區域鑑定了 KITLG 基因的一個錯義突變與FPH相關，由此完成本發明。

發明內容
一方面，本發明涉及一種分離的KITLG蛋白，選自(1)如SEQ ID NO 2所示的蛋白質；和(2)在SEQ ID N0 2所示的胺基酸序列中，經過取代、缺失或添加一個或幾個除第 36位胺基酸外的胺基酸且具有SEQ ID NO :2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋 白質。另一方面，本發明涉及編碼本發明分離的KITLG蛋白的多核苷酸序列。在一個優選實施例中，所述多核苷酸序列的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0:2所示 蛋白質的核苷酸序列。
在另一優選實施例中，所示多核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。一方面，本發明涉及一種表達載體，該載體含有編碼本發明分離的KITLG蛋白的 多核苷酸序列。在一個優選實施例中，所述載體所含的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2所述的蛋白質。在另一優選實施例中，所述載體所含的多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。再一方面，本發明涉及本發明所述的分離的KITLG蛋白在製備治療色素沉著用的 藥物中的用途。在一個優選實施例中，所述用途包括使用本發明的分離的KITLG蛋白篩選治療色 素沉著用的候選藥物。又一方面，本發明涉及一種篩選治療色素沉著用的藥物的方法，所述方法包括(1)提供黑色素細胞，將其分為兩組；(2)用本發明所述的分離的KITLG蛋白處理其中一組細胞，作為對照組；(3)用本發明所述的分離的KITLG蛋白處理其中另一組細胞，同時加入待測物質 進行處理，作為測試組；和(4)測量並比較對照組和測試組中的色素含量，其中，使測試組的色素含量為對照 組的色素含量的70%以下的待測物質為治療色素沉著的候選藥物。在一個優選實施例中，所述黑色素細胞為人惡性黑色素腫瘤細胞系A375。在另一優選實施例中，測試組的色素含量為對照組的色素含量的50%以下的待測 物質為治療色素沉著的候選藥物。本發明還涉及人KITLG抗體在製備治療色素沉著用的藥物中的用途。本發明再一方面還涉及一種用於檢測和/或診斷色素沉著疾病的試劑盒，該試劑 盒含有用於檢測和/或診斷對象的KITLG基因的107位是否發生了突變的試劑，以及任選 地指導使用所述試劑進行檢測和/或診斷的說明書。在一個優選實施例中，所述KITLG基因如SEQ ID NO 5所示。在另一優選實施例中，所述試劑盒含有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示引物。本發明再一方面還涉及本發明所述的多核苷酸序列或本發明蛋白質在製備檢測 和/或診斷色素沉著疾病用的試劑盒中的用途。本發明還涉及一種用於檢測和/或診斷對象是否色素沉著疾病的試劑盒，該試劑 盒含有用於檢測和/或診斷對象的KITLG蛋白的試劑，以及任選地指導使用所述試劑進行 檢測和/或診斷的說明書，其中，如果所述KITLG蛋白的第36位胺基酸為S (絲氨酸)，則表 明該對象患有色素沉著疾病。所述試劑包括對KITLG蛋白進行表達、測序的試劑。


圖1顯示FPH疾病的一個六代家系。(A)顯示IV-1患者表現出典型的FPH臨床症 狀。患者手背(a)，手掌(b)，肢體(c)，頸部(d)，軀幹以及腳掌都表現為色素沉著。(B)顯 示樣本的組織學症狀。圖中所示為同齡的正常人的皮膚切片(a)和患者的色素沉著部位的 皮膚切片(b)。皮膚樣本切片用蘇木精和伊紅染色。放大倍數X10。色素沉著部位的皮 膚，黑色素細胞數量以及基底層角質化細胞色素含量明顯增加，同時伴隨著輕微的黑色素細胞大小增大。(C)顯示家系單體型圖。微衛星分子標記由上至下為著絲粒-D12S83-D12S 326-D12S1708-D12S1667-D12S81-D12S351-D12S101-D12S2081-D12S346-D12S78-端粒。黑 色豎條代表攜帶疾病基因單體型。打問號的表示基因型不能確定，方塊代表男性家族成員， 圓圈代表女性，黑色代表患者，空白的代表正常。方塊和圓圈中存在的斜線表示已故。圖2顯示對FPH家系人群中sKITLG的突變分析以及突變體sKITLG對色素合成 的影響。(A)顯示正常等位基因的測序圖，36位密碼子(AAT)編碼天冬醯胺。(B)顯示突 變等位基因測序圖，圖示雜合子c. 107A- > G，導致36位胺基酸由天冬醯胺突變成絲氨酸 (AGT) (p.N36S)。(C)顯示與野生型sKITLG相比，突變型sKITLGN36S會顯著增加A375細胞 色素合成含量。(D)顯示，A375中SKITLGN36S比sKITLG更能顯著提高細胞內酪氨酸酶的 活性。圖3A顯示考馬斯亮藍染色顯示純化的野生型和突變性KITLG都只有一條清晰明 亮的條帶。圖3B顯示免疫印跡也表明純化出來的蛋白質能被人KITLG抗體識別。
具體實施例方式本發明一方面涉及一種分離的突變KITLG蛋白，其序列如SEQ ID NO 2所示。本發明還包括術語所述突變KITLG蛋白的類似物。術語「類似物」指具有天然多 肽序列和結構，以及相對於天然分子的一個或多個(通常是幾個)胺基酸添加、取代(通常 性質保守)和/或缺失的化合物，只要修飾不破壞該突變KITLG蛋白的活性。當然，所述一 個或多個胺基酸添加、取代和/或缺失不包括本發明突變KITLG蛋白第36位上的胺基酸突 變。製備多肽和突變蛋白的方法是本領域已知的。特別優選的類似物包括性質上保守的取代，即這些取代發生在與它們的側鏈有 關的一類胺基酸中。具體而言，胺基酸一般被分成四類(1)酸性一天冬氨酸和穀氨酸； (2)鹼性一賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯 氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性一甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半 胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族胺基酸。例 如，有理由預測單獨用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用穀氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸 取代蘇氨酸，或者用結構上相關的胺基酸取代類似的保守的胺基酸，這樣的取代將不會對 生物活性有重要影響。例如，感興趣的多肽可包括多達約5-10個保守的或不保守的胺基酸 取代，甚至多達約15-25個保守的或不保守的胺基酸取代，或2-25之間任何整數，只要該 分子的所需功能仍維持完整。本領域的熟練技術人員可結合本領域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測定感興趣的分子中可耐受改變的區域。因此，本發明的蛋白質包括(1)如SEQ ID NO 2所示的蛋白質；和⑵在SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列中，經過取代、缺失或添加一個或幾個除第36位胺基酸外的胺基酸 且具有SEQ ID NO :2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。可採用各種方法製備本發明的蛋白質。通常用重組方法製備本發明的蛋白質。可 以用標準分子生物學方法製備編碼本發明蛋白質的多核苷酸。例如，用重組方法可以獲得 編碼上述分子的多核苷酸序列，例如通過從表達該基因的細胞篩選cDNA和基因組文庫，或 通過從已知的包括該基因的載體衍生該基因。也可合成而非克隆製備感興趣的基因。可用 適當的特定序列的密碼子消化該分子。然後將用標準方法製備的重疊的寡核苷酸裝配完整的序列，並裝配入完整的編碼序列中。參見如Edge (1981)Nature 292 :756 ;Nambair等 (1984)Science223 1299 ；和 Jay 等(1984) J. Biol. Chem. 259 :6311。因此，從攜帶所需序列的載體可獲得具體的核苷酸序列，或用本領域已知的各 種寡核苷酸合成方法，如定位誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)，完全或部分合成。參見如 Sambrook，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning :aLaboratory Manual)，第二版， 1989。具體說，獲得編碼所需序列的核苷酸序列的方法是用常規的自動多核苷酸合成儀制 備的退火補集的重疊的合成的寡核苷酸，然後用適當的DNA連接酶連接，並用PVR擴增連接 的核苷酸序列。參見如 Jayaraman 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088。另 外，在本發明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等，(1986)Nature 54:75-82)、先有 核苷酸區域的寡核苷酸定向誘變(Riechmann等，(1988)Nature 332 :323_327和Verhoeyen 等(1988) Science 239 1534-1536)和用T4DNA聚合酶進行的酶促補平帶缺口的寡核苷酸 合成(Queen 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 10029-10033)。一旦製備或分離了編碼序列，就可將這些序列克隆入任何合適的載體或複製子 中。對本領域技術人員而言，各種克隆載體是已知的，且適當的克隆載體的篩選只是選擇問 題。合適的載體包括(但並非限制於)質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體或當與適當的 控制元件結合時能複製的病毒。然後將克隆序列置於合適的控制元件的控制下，這取決於用於表達的系統。因此， 可以將編碼序列置於啟動子、核糖體結合位點(用於細菌表達)和任選地操縱子的控制下， 從而由合適的轉化體將感興趣的DNA序列轉錄到RNA中。該編碼序列可以包含或不包含 信號肽或前導序列(隨後可由宿主在翻譯後加工除去)。參見如美國專利No. 4，431，739 ； 4，425，437 ；4，338，397。除了控制序列外，可以添加調節序列，從而可以相對於宿主細胞的生長調節序列 的表達。調節序列是本領域技術人員已知的，其實例包括那些能導致應答化學或物理刺激 (包括調節化合物的存在)啟動或關閉基因表達的調節序列。載體中還可存在其它類型的 調節元件。例如，可以使用增強子元件以增加構建物的表達水平。實例包括SV40早期基因 增強子(Dijkema等(1985) EMB0J. 4 :761)；從Rous肉瘤病毒的長末端重複序列(LTR)衍生 的增強子 / 啟動子(Gorman 等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 6777)；和從人 CMV 衍 生的元件(Boshart等，(1985) Cell 41 :521)，如CMV內含子A序列中包括的元件(美國專 利No. 5，688，688)。表達盒中還可包括在合適的宿主細胞中自主複製的複製起點、一種或多 種可選擇的標記物、一個或多個限制酶切位點、高拷貝數量的勢能和強啟動子。構建表達載體，使具體的編碼序列位於該具有適合調節序列的載體中，與控制序 列有關的編碼序列的位置和取向使編碼序列在控制序列的「控制」下轉錄(即，結合於控制 序列中DNA分子的RNA聚合酶轉錄該編碼序列)。可能需要對編碼感興趣分子的序列進行 修飾來實現此目的。例如，在一些情況中可能需要修飾該序列，從而使其連接於適合取向的 控制序列，即維持讀框。在插入到載體之前，控制序列和其它調節序列可能連接於編碼序 列。或者，可以將編碼序列直接克隆入已包含控制序列和合適的限制酶切位點的表達載體 中。通過缺失一部分編碼感興趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代該序列內 的一個或多個核苷酸，可以製備用於分析的本發明蛋白的突變體或類似物。修飾核苷酸序列的方法，如定向誘變等是本領域技術人員所熟知的。參見如Sambrook等， 上述；Kunkel，T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82 448 ；Geisselsoder 等 (1987)BioiTechniques 5 786 ；Zoller 禾口 Smith (1983)Methods Enzymol. 100 468 ； Dalbie-McFarland 等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409。這種分子可以在各種系統中表達，包括本領域熟知的昆蟲、哺乳動物、細菌、病毒 和酵母表達系統。例如，昆蟲細胞表達系統如杆狀病毒系統是本領域技術人員已知的，描述於如 Summers 禾口 Smith, Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo. 1555(1987)。 用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法都是可以試劑盒形式購得的，尤其是 Invitrogen, San Diego CA(" MaxBac"試劑盒)。類似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統 也是本領域熟知的，其描述見如Sambrook等，如上。酵母表達系統也是本領域熟知的，其描 述見如《酵母遺傳工程》(Yeast GeneticEngineering) (Barr 等編輯，1989) Butterworths， London。許多用於上述系統的適合的宿主細胞也是已知的。例如，哺乳動物細胞系是本 領域已知的，其包括可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖化的細胞系， 如(但並非限制於)中國倉鼠卵巢細胞(CH0)、Hela細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細 胞(COS)、人胚腎細胞、人肝細胞癌細胞(如H印G2)、Madin-Darby牛腎(〃 MDBK")細 胞等。類似地，在本發明的表達構建物中也可使用細菌宿主，如大腸桿菌、枯草桿菌和鏈 球菌。在本發明中還可用酵母宿主，特別包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形漢遜酵 母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯 維酵母(Kluyveromyceslactis)、季也蒙氏畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯 德畢赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖糖酵母(S chizosaccharomyces pombe)和 yarrowia lipolytic^。可與杆狀病毒表達系統一起使用的昆蟲細胞特別包括埃及伊蚊 (Aedes aegypti)、苜猜丫 紋夜蛾(Autographa californica)、家香(Bombyx mori)、黑
(Drosophila melanogaster) >(Spodoptera frugiperda)禾口D"!^*.
(Trichoplusia ni)。用本領域熟知的各種基因送遞的方法，可將包含感興趣的核苷酸序列的核酸分子 穩定地整合入宿主細胞基因組中或在合適的宿主細胞中的穩定的附加型元件上維持。參見 如美國專利No. 5，399，346。根據所選用的表達系統和宿主，在表達蛋白質的條件下，培養用如上所述的表達 載體轉化的宿主細胞製備該分子。然後從宿主細胞分離出表達的蛋白質並純化。如果表達 系統將蛋白質分泌到培養基中，則直接從培養基純化產物。如果不是分泌的，則從細胞裂解 液分離。適合的培養條件和回收方法的選擇都是在本領域技術人員能力之內。本發明另一方面涉及編碼本發明突變的KITLG蛋白的分離的核苷酸序列。在一個 具體實施例中，該編碼序列如SEQ ID N0:1所示。本發明還包括與SEQ ID NO :1基本上同源的核苷酸序列。「同源性」指兩條多核 苷酸或兩條多肽部分之間的相似性百分數。兩條DNA或兩條多肽序列在確定的分子長度 內，當序列顯示有至少約50%，優選至少約為75%、更佳至少約為80-85%、尤其佳至少約為90%、最佳至少約為95-98%序列相似性時，彼此「基本上同源」。如本文所述，基本同源 也指與特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。通常，「相同性」指兩條多核苷酸或多肽序列上準確的核苷酸對核苷酸或者胺基酸 對胺基酸對應。通過排列兩個分子的序列直接比較它們的序列信息，計算兩條排列的序列 間匹配的準確數量，將其除以最短序列的長度，然後乘以100，從而可得到相同性百分數。在同源性和相同性分析中可輔助使用易於獲得的電腦程式，如ALIGH、Dayhoff、 M. 0. (Atlas of Protein Sequence and Structure^ M. 0. Dayhoff 編 輯，5Suppl.，3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC)，它適用於 Smith 和 Waterman 分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl. Math.，2 =482-489,1981)。 可從 Wisconsin Sequence Analysis Package (第 8 版，從 Genetics Computer Group, Madison, WI獲得)獲得測定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程 序，這些程序也依賴於Smith和Waterman算法。使用製造者建議的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默認參數可容易地使用這些程序。例如，可使用Smith 和Warerman的同源性算法的默認計分表和6個核苷酸位置的間隔罰分(gap penalty)測 定的核苷酸序列與參比序列的同源性百分數。本發明建立同源性百分數的另一方法是使用版權屬於愛丁堡大學、由JohnF. Collins 禾口 Shane S. Sturrok 開發、由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)發行 的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在這套程序包中使用，其中，在計分表中使用默 認參數(例如，間隔開放罰分=12，間隔延伸罰分=1，間隔=6)。從這批數據產生的「匹 配」值反映出「序列同源性」。計算序列間的相同性百分數或相似性百分數的其它合適的 程序在本領域中一般都是已知的，例如，另一種排列程序是BLAST，使用默認參數。例如，可 使用下述默認參數的BLASTN和BLASTP 基因編碼=標準；過濾=無；鏈=兩；截留=60 ； 期望值=10 ；矩陣=BL0SUM62 ；描述=50個序列；排序=HIGH SCORE ；資料庫=無冗餘， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 翻譯 +Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。在 http://www. ncbi. nim. gov/cgi-bin/BLAST網址上可查到這些程序的詳細描述。或者，在同源區域之間形成穩定的雙鏈的條件下進行多核苷酸雜交，接著用單鏈 特異性核酸酶消化，然後測定消化的片段的大小，從而測出同源性。在如(對具體的體系所 定義的)嚴格條件下進行的Southern雜交試驗中，可鑑別基本同源的DNA序列。確定適當 的雜交條件在本領域熟練技術人員所掌握的知識之內。例如，參見Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic AcidHybridization,同上。當涉及一種多肽時，「分離」意味著所述的分子從發現該分子天然存在的整個生物 體中分離和分開，或基本不存在其它相同類型的生物大分子。術語「分離」對於核酸是一 種核酸分子，它完全或部分缺乏與其天然結合的序列；或一個序列，因為它天然存在，但具 有與其結合的異源序列；或從染色體分離的分子。本發明又一方面涉及本發明蛋白質的抗體。「抗體」指通過化學或物理方法與感 興趣的多肽專一性結合的分子。因此，本發明的抗體是一種與本發明蛋白特異性結合的分 子。本文所用的術語「抗體」包括從多克隆和單克隆製備物獲得的抗體，及以下雜交(嵌 合)抗體分子(參見如 Winter 等(1991) Nature349 293~299 ；和美國專利 No. 4，816，567)； F(ab' )2和F(ab)片段；Fv分子(非共價異二聚體，參見如Inbar等(1972)Proc. Natl.Acad. Sci. USA69 :2659_2662 ；和 Ehrlich 等(1980)Biochem 19 4091-4096)；單鏈 Fv 分 子(sFv)(參見如 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883) ； 二聚和 三聚抗體片段構建物；小抗體(參見如Pack等(1992)Biochem 31 1579-1584 ；Cumber 等(1992)JImmunology 149B 120-126)；人源化抗體分子(參見如 Riechmann 等(1988) Nature 332 :323_327 ;Verhoeyan 等(1988) Science 239 1534-1536 ；和英國專利申請 No.GB 2，276，169，1994年9月21日出版)；和從這些分子獲得的任何功能性片段，其中這 些片段維持親本抗體分子的免疫結合性質。本文所用的術語「單克隆抗體」指具有同源抗體群的抗體組合物。術語不限於抗 體種類或來源，也不受其製備方式的限制。因此，該術語包括從小鼠雜交瘤獲得的抗體，及 用人而不是小鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見如Cote等，《單克隆抗體和癌症的治療》 (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R. Liss，1985，第 77 頁。本發明再一方面包括篩選或預測治療色素沉著的藥物的方法，該方法包括使用本 發明的蛋白質處理黑色素細胞，同時加入待測化合物，作為測試組，並以未加入待測化合物 而僅加入本發明化合物的試驗作為對照組，然後檢測兩組中的色素含量，其中，能使測試組 中的色素含量明顯低於對照組中的色素含量的化合物可作為候選的藥物。所述「明顯低 於」通常指測試組中的色素含量是對照組的70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30% 以下甚至更低。黑色素細胞可以是本領域常用的任何細胞系，例如惡性黑色素腫瘤細胞系 A375。待篩選的化合物可以是抗體，也可以是各種化學物質。本發明另一方面還涉及本發明蛋白質、多核苷酸序列以及抗體在製備治療色素沉 著用的藥物中的應用。因此，本發明包括本發明蛋白質和多核苷酸序列在尋找治療色素沉 著用的藥物中的應用。本發明還涉及人KITLG抗體治療色素沉著用的藥物中的用途。所述 抗體可以是已知的人KITLG抗體，既可以是野生型KITLG的抗體，也可以是本發明突變型 KITLG的抗體。本發明還包括含有本發明蛋白質和/或核苷酸的試劑盒。任選地，該試劑盒還包 括如何使用該蛋白質和/或核苷酸的說明書。本發明還包括用於檢測和/或診斷色素沉著疾病的試劑盒，該試劑盒含有用於檢 測和/或診斷對象的KITLG基因的107位是否發生了突變的試劑，以及任選地指導使用所 述試劑進行檢測和/或診斷的說明書。所述試劑通常包括擴增KITLG和對擴增產物進行測 序的試劑，包括各種合適的PCR用試劑以及引物。本發明還包括本發明KITLG基因的如下用途設計用於檢測以確定其107位鹼基 是否發生了突變的特異性引物或探針。針對已知鹼基序列設計特異性探針或引物的方法是 本領域周知的。例如可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(上冊P607-610)。因此，用於檢測KITLG基因107位是否發生突變的引物和探針也在本發明範圍之 內。所述引物例如SEQ ID NO :3和4所示。在本發明中，色素沉著包括家族性進行性色素沉著(FPH)。本發明還包括含有本發明蛋白質、核苷酸、或所述蛋白質的特異性抗體的組合物。 組合物中還可以含有藥學上可接受的載體。如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發明的組合物含有安全有效量的KITLG蛋白的特異性抗體以及藥學上可接受 的載體。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通 常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理 鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物組合物宜在無 菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物製劑還可製成緩釋製劑。含有本發明核苷酸的表達載體、以及含有所述表達載體的細胞也在本發明範圍之 內。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。此外，雖然本發明以各個具體實施例的方式進行描述，但是應理解，將各具體實施 例中的各具體特徵組合起來所得的技術方案也是在本發明的範圍之內。實施例1本發明研究對象為山東省農村一個具有典型家族性進行性(FPH)色素沉著症狀 的六代家系。本發明人獲得完整的系譜圖，鑑定了 18個患病的病人(9個男性9個女性)。 臨床檢查發現所有家系病人均表現為單純的色素沉著無伴發症狀(圖1)。例如家系圖中 IV-1的患者，53歲男性，色素沉著發於面部，頸部，軀幹與足底相連的部位。無一患者有皮 膚癌，疾病的家系傳遞方式為常染色體顯性。本研究經過倫理委員會審批。在家系中共有 25人參與了研究，但僅對17人的有效數據進行了連鎖分析。外周血採血經過家系成員的同 意後進行。DNA抽提用QIAmp血液DNA抽提試劑盒(Qiagen，德國)進行。採用了覆蓋22條染色體平均密度10cM的382個螢光標記微衛星標記引物(連鎖 分型試劑盒，version 2,Perkin Elmer)對該色素沉著家系進行了全基因組掃描。PCR擴增 在10iU體系中按照標準程序(具體如下文所示)進行，使用的儀器是PTC-225DNA擴增儀 (MJ Rearch公司，美國)。PCR產物在ABI377XL DNA測序儀上進行5%變性聚丙烯醯胺凝膠 電泳。等位片段大小由每個泳道分子大小內標確定(GeneScan 400HD R0X，Perkin Elmer), 電泳結果用 GeneScan 3. 0 與 Genotyper 2. 1 軟體分析(Perkin Elmer)。基因組DNA突變的鑑定如下使用QIAmp DNA Blood Mini Kit提取待測人血樣基因組DNA，電泳檢測質量。使 用以下的引物正向TGAGCATAGCTTGAATGCGT(SEQID NO 3)反向AGCAGTGGTGTGCAACTAGC(SEQ ID NO 4)以基因組DNA為模板使用ABI公司的TaqGold高溫聚合酶進行PCR擴增，PCR熱 循環條件是高溫聚合酶熱啟動，模板變性95°C 10分鐘第一輪熱循環95V 30 秒
68 °C 45 秒每一次循環降低一度72 °C 2 分 30 秒循環12次第二輪熱循環95V 30 秒56 °C 45 秒72V 30 秒循環35次72 V 10 分鐘反應結束PCR產物經1. 2%瓊脂糖電泳檢測，用蝦鹼性磷酸酶(SAP)購自BI0ASA公司)及 核酸外切酶I (EX0I)購自EPERCENTER公司純化後用ABI公司的BigDye terminal試劑及 3100全自動測序儀測序，測序引物為正向TGAGCATAGCTTGAATGCGT(SEQID NO 3)反向AGCAGTGGTGTGCAACTAGC(SEQ ID NO 4)測序反應條件如下模板變性98 °C 2分96°C20 秒51°C20 秒60°C4 分循環25次電泳分析結果用LINKAGE V5. 0軟體包進行連鎖分析(Lathrop，G. M.和Lalouel， J. M. (1984). Easy calculations of lod scores and genetic risks on smallcomputers. Am J Hum Genet 36，460-465，本文以引用的方式將其內容納入本文)，設定條件為常染色 體顯性，疾病等位頻率0. 0001，等位頻率平均分布，完全顯性，無性別差異。家系圖繪製與單 體型構建由Cyrillic v2. 0軟體(Cyrillic軟體，UK)完成。全基因組掃描將致病基因的候選區域定位於12q，在D12S81位點0 = 0.00時兩 點分析L0D值為4. 35(表1)。精細定位分析了附近的其他微衛星標記(D12S83，D12S326， D12S1708, D12S1667, D12S351, D12S101, D12S2081, D 12S346, D12S78，表 1)進一步確定了 該定位區域。同時，其他染色體位點的掃描結果都顯示與色素沉著無關。表1如下所示。表1 :12q21. 31-q23. 1區域10個微衛星位點與疾病基因兩點連鎖分析L0D值表 家系單體型分析(家系圖繪製與單體型構建由Cyrillic v2. 0軟體(Cyrillic 軟體，UK)完成)發現了三個交換位點，第一個是患者IV-1在D 12S 1667和D12S81之 間有一次交換；第二個是患者V-12在D12S1708和D12S1667之間有一次交換；第三個是 V-3在D12S101和D12S2081之間有一次交換。以上結果顯示FPH致病基因定位於染色體 12q21. 31-q23. 1 區域，界於 D12S1667 和 D12S2081 之間，約 9. 09cM。在以上物理距離內包含有81個已經鑑定的基因，KITLG(GeneID 4254)因為定位 於此且有相關功能研究的暗示，候選基因分析針對該基因展開。本發明人先選擇V-5患者 進行該基因的突變掃描。在對所有外顯子與相鄰區域的測序中，本發明人發現了外顯子2 中的一個c. 107A — G雜合變化，在家系正常人中是不存在的，這一變化導致了 KITLG基因 編碼蛋白36位胺基酸由天冬氨酸轉變成了絲氨酸。在正常人基因組中兩條姐妹染色體的 等位基因的AATAATGTAAA下劃線處均為A，故測序圖譜顯示一個單峰，而在家族性進性行色 素沉著病人的基因組中有一個等位基因的A突變為G，測序圖譜顯示一個A/G雜合峰(圖 2A和2B)。這一變化直接導致其編碼產物由天冬醯胺(N)突變成絲氨酸(S)，導致病人發生 進性行色素沉著。該變化與所有家系患者共分離，而正常人卻不攜帶，本發明人確定了在NCBI SNP 資料庫中(dbSNP)c. 107A —G這一多態是不存在的。進一步的大規模正常人群驗證，在296 例中國健康人中未檢測到該多態。證實了 KITLGN36S為一突變(見SEQ ID N0:5，野生型 KITLG的核苷酸序列；和SEQ ID NO :6，野生型KITLG蛋白的胺基酸序列)。實施例2FPH病人色素沉著區域的組織取樣顯示錶皮處過度色素化以及基底層色素含量的增加，但是沒有發現黑色素細胞的增多(Rebora，A.和Parodi，A. (1989). Universal inherited melanodyschromatosis -.a case of melanosis universalishereditaria ？ Arch Dermatol 125,1442-1443 ；Ling, D. B.禾口 Lo， T. (1991) Familialprogressive hyperpigmentation -.a family study in China. Br J Dermatol 125,607 ；Zhang, C. >Deng, Y.、Chen，X.、Wu，X.、Jin，W.、Li，H.、Yu，C.、Xiong，Y.、Zhou，L.和 Chen，Y. (2006) Linkage of a locus determining familial progressivehyperpigmentation(FPH)to chromosome 19p 13.1-pter in a Chinese family. Eur JDermatol 16,246-250 ；Zanardo, L. > Stolz, ff. 、Schmitz，G. 、Kaminski，W. 、Vikkula，M. 、Landthaler，M.禾口Vogt，T. (2004). Progressive hyperpigmentation andgeneralized lentiginosis without associated systemic symptoms -.a rare hereditarypigmentation disorder in south-east Germany. Acta Derm Venereol 84，57_60)。為了研究KITLG中p. N36S的突變對色素合成的影響，本發明 人在大腸桿菌中表達並純化可溶性形式存在的野生型sKITLG和突變體SKITLGN36S。考馬 斯亮藍染色顯示純化的野生型和突變性KITLG都只有一條清晰明亮的條帶(圖3A)，並且免 疫印跡也表明純化出來的蛋白質能被人KITLG抗體識別(圖3B)。實施例3用野生型和突變型SKITLGN36S分別刺激人惡性黑色素腫瘤細胞系A375，然後測 定細胞中色素合成含量。具體而言，A375細胞分別用100ng/ml野生型sKITLG和突變型sKITLGN36S刺激 24h，收集細胞，細胞沉澱用含10% DMS0的1N妝011溶解，801孵育211，12，000\8離心10 分鐘，上清溶液用TECAN Saf ire2 (USA)測定420nm光吸收值。重組黑色素(sigma)標準品 做標準曲線。統計學差異用two-sided Student' s t檢驗分析。該結果得到4次實驗驗 證。結果顯示野生型和突變型都可以引起A375單個細胞合成的色素含量增加，單細 胞合成黑色素的含量從16. 2pg(野生型sKITLG)增加到33. 9pg(突變型sKITLGN36S)。與 野生型sKITLG相比，突變型SKITLGN36S非常顯著地增加了單細胞合成色素的含量，高達 209%。這表明突變型SKITLGN36S比野生型sKITLG具有更強的刺激色素合成的作用(圖 2C)。許多報告證明酪氨酸酶是色素合成的關鍵因素(Luo，D.、Chen，H. ,Searles,G.和 Jimbow, K. (1995). Coordinated mRNA expression of c-Kit with tyrosinaseand TRP-1 in melanin pigmentation of normal and malignant human melanocytesand transient activation of tyrosinase by Kit/SCF-R. Melanoma Res 5,303-309 ；Sriwiriyanont,P. > Ohuchi, A.、Hachiya, A.、Visscher, M. 0.禾口 Boissy, R. E. (2006). Interaction between stem cell factor and endothelin—l :effects on melanogenesis inhuman skin xenografts. Lab Invest 86,1115-1125 ；Cook, A. L.、Chen, ff.、Thurber, A. E.、Smit, D. J.、 Smith, A. G.、Bladen, T. G.、Brown, D. L.、Duffy, D. L.、Pastorino, L.、Bianchi-Scarra, G.等，(2008). Analysis of Cultured Human Melanocytes Basedon Polymorphisms within the SLC45A2/MATP, SLC24A5/NCKX5, and 0CA2/PLoci. J Invest Dermatol 24， 24 ；Tsuchiya, T.、Yamada, K.、Minoura, K.、Miyamoto, K.、Usami, Y.、Kobayashi, T.、 Hamada-Sato, N. 、 Imada, C.禾口 Tsujibo, H. (2008).Purification and determinationof the chemical structure of the tyrosinase inhibitorproduced by Trichoderma viride strain H l-7from a marine environment. BiolPharm Bull 31,1618-1620 ； Huang, Y. H. 、Lee, T. H. 、Chan, K. J. 、Hsu, F. L. 、ffu, Y. C.禾口 Lee，M. H. (2008). Anemonin is a natural bioactive compound that canregulate tyrosinase-related proteins and mRNA in human melanocytes. J DermatolSci 49，115_123)。於是本發明人測定了野生型 sKITLG和突變型sKITLGN36S分別刺激A375細胞後酪氨酸酶活性的變化。具體而言，用與測定黑色素含量相同的方法刺激A375細胞，蛋白濃度用Lowry法 (Protein measurement with the Folin phenol reagent,L0WRY OH,R0SEBR0UGH NJ,FARR AL, RANDALL RJ. J Biol Chem. 1951Nov ； 193(1) :265_75，本文將其全文以引用的方式參考 結合於此)測定，BSA(牛血清白蛋白)作為標準品。每1ml磷酸鈉緩衝液(pH7.4，0. 1% L-dopa)中加入40iig蛋白，37°C孵育2h，用TECAN Safire2 (USA)測定475nm吸收光值。統 計學差異用two-sided Student' s t檢驗分析。重複兩次實驗得到相同結果。與之前的結果相符，突變型SKITLGN36S刺激A375細胞後酪氨酸酶活性明顯高於 野生型sKITLG刺激的細胞(圖2D)。所有這些數據表明突變型SKITLGN36S蛋白具有增強 色素合成的能力。這個結果也與FPH病人的組織樣本顯示的基底層色素增加相符合(圖 1B)。然而，野生型和突變型的sKITLG刺激的A375細胞都沒有引起增殖方面的差異(數據 未顯不)。實施例4本實施例闡述了採用本發明蛋白質進行的藥物篩選。測試組用候選化合物處理的加了本發明突變型SKITLGN36S蛋白的人惡性黑色 素腫瘤細胞系A375培養物；對照組不用候選物質處理的加了本發明突變型SKITLGN36S蛋白的人惡性黑色 素腫瘤細胞系A375培養物。在處理後適當時間，採用常規方法測定所述細胞的色素含量。如果與對照組相比， 測試組中的色素含量為對照組的色素含量的70%以下，則說明該候選物質是潛在的治療色 素沉著的物質。討論FPH很可能是一種異質性疾病(heterogenous disease)，因為C. Zhang等對一 個FPH的3代家系進行了全基因組掃描，將相關基因定位在染色體19pl3. 1-pter界於 D19S593與pter之間約45. 58cM的區域，但是沒有定位到具體的致病基因。在本發明中， 本發明人將FPH致病基因定位在染色體12q21. 31-q23. 1區域，候選基因分析揭示突變型 KITLGN36S是該6代FPH家系的關鍵致病基因。蛋白質功能分析進一步確證了這個觀點。總而言之，本發明證實了 KITLG中p. N36S的突變是遺傳性FPH的致病基因。結果 顯示對於色素合成，可溶性突變型sKITLG產生了獲得性功能突變，從而導致患者出現色素 沉著。這個結論為今後了解FPH疾病中色素沉著的分子機制提供了很好的線索，也為發展 有效地幹預策略提供理論幫助。序列表中國科學院上海生命科學研究院色素合成KIT配體及其應用0132]<130)092106
0133]6
0134]PatentIn version 3. 3
0135]1
0136]822
0137]DNA
0138] 智人(Homo sapiens)
0139]1
0140]atgaagaagacacaaacttggattctcacttgcatttatcttcagctgctcctatttaat600141]cctctcgtcaaaactgaagggatctgcaggaatcgtgtgactaatagtgtaaaagacgtc1200142]actaaattggtggcaaatcttccaaaagactacatgataaccctcaaatatgtccccggg1800143]atggatgttttgccaagtcattgttggataagcgagatggtagtacaattgtcagacagc2400144]ttgactgatcttctggacaagttttcaaatatttctgaaggcttgagtaattattccatc3000145]atagacaaacttgtgaatatagtggatgaccttgtggagtgcgtgaaagaaaactcatct3600146]aaggatctaaaaaaatcattcaagagcccagaacccaggctctttactcctgaagaattc4200147]tttagaatttttaatagatccattgatgccttcaaggactttgtagtggcatctgaaact4800148]agtgattgtgtggtttcttcaacattaagtcctgagaaagattccagagtcagtgtcaca5400149]aaaccatttatgttaccccctgttgcagccagctcccttaggaatgacagcagtagcagt6000150]aataggaaggccaaaaatccccctggagactccagcctacactgggcagccatggcattg6600151]ccagcattgttttctcttataattggctttgcttttggagccttatactggaagaagaga7200152]cagccaagtcttacaagggcagttgaaaatatacaaattaatgaagaggataatgagata7800153]agtatgttgcaagagaaagagagagagtttcaagaagtgtaa822
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2
273
PRT
智人(Homo
2
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Leu Val Ala Asn Leu Pro 45
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Leu Asp Lys 85
Pro Gly Met Asp Val Leu 60
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Asn Tyr Ser lie lie Asp Lys Leu Val Asn lie Val Asp Asp Leu Val100105110Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys115120125Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg lie Phe130135140Asn Arg Ser lie Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr145150155160Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg165170175Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser180185190Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro195200205Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe210215220Ser Leu lie lie Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg225230235240Gin Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn lie Gin lie Asn Glu Glu245250255Asp Asn Glu lie Ser Met Leu Gin Glu Lys Glu Arg Glu Phe Gin Glu260265270Val320DNA人工序列misc_feature 引物3tgagcatagcttgaatgcgt20420DNA人工序列 misc_feature引物 4
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DNA
智人(Homo sapiens) 5atgaagaagacacaaacttggattctcacttgcatttatcttcagctgctcctatttaat60
cctctcgtcaaaactgaagggatctgcaggaatcgtgtgactaataatgtaaaagacgtc120
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ttgactgatcttctggacaagttttcaaatatttctgaaggcttgagtaattattccatc300
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tttagaatttttaatagatccattgatgccttcaaggactttgtagtggcatctgaaact480
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ccagcattgttttctcttataattggctttgcttttggagccttatactggaagaagaga720
cagccaagtcttacaagggcagttgaaaatatacaaattaatgaagaggataatgagata780
agtatgttgcaagagaaagagagagagtttcaagaagtgtaa822
6
273
PRT
智人(Homo sapiens) 6
Met Lys Lys Thr
1
Leu
Leu Phe
Asn 20 Asn
Gin Thr Trp 5
Pro Leu Val Val Lys Asp
Val Thr Asn 35
Lys Asp Tyr Met lie Thr 50
Pro Ser His Cys Trp lie 6570
Leu Thr Asp Leu Leu Asp
lie Leu Thr Cys lie Tyr 10
Lys Thr Glu Gly lie Cys 25
Val Thr Lys
4045
Lys Tyr Val
Leu Gin Leu 15
Arg Asn Arg 30
Leu Val Ala Asn Leu Pro
Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu 5560
Ser Glu Met Val Val Gin Leu Ser Asp Ser
7580
Lys Phe Ser Asn lie Ser Glu Gly Leu Ser
859095
AsnTyrSerlielieAspLysLeuValAsnlieValAspAspLeuVal
100105110
GluCysValLysGluAsnSerSerLysAspLeuLysLysSerPheLys
115120125
SerProGluProArgLeuPheThrProGluGluPhePheArgliePhe
130135140
AsnArgSerlieAspAlaPheLysAspPheValValAlaSerGluThr
145150155160
SerAspCysValValSerSerThrLeuSerProGluLysAspSerArg
165170175
ValSerValThrLysProPheMetLeuProProValAlaAlaSerSer
180185190
LeuArgAsnAspSerSerSerSerAsnArgLysAlaLysAsnProPro
195200205
GlyAspSerSerLeuHisTrpAla AlaMetAlaLeuProAlaLeuPhe
210215220
SerLeulielie GlyPheAla Phe GlyAlaLeuTyr Trp LysLysArg
225230235240
GinProSerLeuThrArg Ala Val GluAsnlieGinlieAsnGluGlu
245250255
AspAsnGlulieSerMetLeuGinGluLys Glu Arg Glu PheGinGlu
260265270
Val
權利要求
一種分離的KITLG蛋白，選自(1)如SEQ ID NO2所示的蛋白質；和(2)在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中，經過取代、缺失或添加一個或幾個除第36位胺基酸外的胺基酸且具有SEQ ID NO2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的分離的KITLG蛋白的多核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的多核苷酸序列，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。
4.一種表達載體，其特徵在於，所述載體含有如權利要求2所述的多核苷酸序列。
5.如權利要求4所述的表達載體，其特徵在於，所述多核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。
6.權利要求1所述的分離的KITLG蛋白在製備治療色素沉著用的藥物中的用途。
7.一種篩選治療色素沉著用的藥物的方法，其特徵在於，所述方法包括(1)提供黑色素細胞，將其分為兩組；(2)用本發明權利要求1所述的分離的KITLG蛋白處理其中一組細胞，作為對照組；(3)用本發明權利要求1所述的分離的KITLG蛋白處理其中另一組細胞，同時加入待測 物質進行處理，作為測試組；和(4)測量並比較對照組和測試組中的色素含量，其中，使測試組的色素含量為對照組的 色素含量的70%以下的待測物質為治療色素沉著的候選藥物。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述黑色素細胞為人惡性黑色素腫瘤細胞 系 A375。
9.一種用於檢測和/或診斷色素沉著疾病的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有用於 檢測和/或診斷對象的KITLG基因的107位是否發生了突變的試劑，以及任選地指導使用 所述試劑進行檢測和/或診斷的說明書。
10.權利要求2所述的多核苷酸序列或權利要求1所述的蛋白質在製備檢測和/或診 斷色素沉著疾病用的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明涉及引起色素沉著疾病的色素合成KIT配體的突變物、其編碼序列、含有所述編碼序列的表達載體及其在製備治療色素沉著疾病用的藥物中的應用。本發明還涉及利用本發明色素合成KIT配體篩選治療色素沉著用的藥物的方法。
文檔編號C12N15/63GK101863972SQ200910049248
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月14日 優先權日2009年4月14日
發明者孔祥銀, 林得寶, 王志強 申請人:中國科學院上海生命科學研究院