一種納米凝血酶及其製備方法

2023-05-27 00:52:26

專利名稱：一種納米凝血酶及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種止血藥物凝血酶新劑型及其製備，具體涉及一種納米凝血酶及其製備方法。
背景技術：
凝血酶(thrombin)又稱凝血因子IIa,是一種專一'丨生很強的絲氨酸蛋白酶,是機體凝血系統的一種關鍵酶。它一方面可直接作用於纖維蛋白原，使之轉變為纖維蛋白，最後導致纖維蛋白凝膠的生成，另一方面則通過受體介導途徑誘導血小板活化，活化的血小板發生粘附、釋放和聚集反應，最終導致血小板血栓的形成。因此，凝血酶可作用於凝血過程的最後環節，在不需要其它眾多凝血因子參與的情況下，使血液快速凝固、填塞出血點而達到止血的目的。由於其止血快，無副作用等優點，目前其乾粉或生理鹽水溶液已作為一種止血藥廣泛應用於創傷和臨床手術創面以及消化道黏膜等部位的出血與滲血，止血效果好，療效確切。但在臨床應用中存在一些問題，例如一是凝血酶必須在10°C以下保存，室溫保存其生理活性易丟失，穩定性較差；其次，凝血酶的本質是蛋白質，進入體內很容易被降解，尤其是治療上消化道出血時，需多次口服給藥；三是由於其強的促凝活性，不適於靜脈注射，應用範圍有限；四是稍大劑量應用時，具有神經毒性。為了克服凝血酶直接使用時的上述問題，目前開發出一些包載凝血酶藥物，但有的包載凝血酶的載體需溶於有機溶劑中來製備包載凝血酶，有的包載凝血酶的載體溶液呈酸性，有的包載凝血酶需在高溫下製備，而有機溶劑、酸性溶液、高溫對凝血酶的活性均有較大影響，從而降低製得的包載凝血酶的藥效。因此，目前很有必要開發一種對所包載的凝血酶的活性無較大影響，穩定性好、安全高效、使用範圍廣泛 的凝血酶新劑型。

發明內容
本發明的目的是為了克服現有包載凝血酶藥物的藥效較低的缺陷，提供一種新的納米凝血酶及其製備方法。本發明的發明人在研究中意外發現，核殼結構的納米凝血酶，核為凝血酶，殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子，對凝血酶的活性無較大影響，且穩定性好、安全高效、使用範圍廣泛。因此，為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種納米凝血酶，其特徵在於，所述納米凝血酶為核殼結構，所述核為凝血酶，所述殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子。優選地,所述納米粒子的粒徑為150_210nm。優選地，所述納米凝血酶的包封率為50-78%。另一方面，本發明還提供了一種納米凝血酶的製備方法，所述方法包括:(I)將季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液接觸得到混合溶液，季銨化殼聚糖水溶液和凝血酶水溶液的用量為，每9mg的季銨化殼聚糖對應2-10U的凝血酶；(2)在18_25°C持續攪拌狀態下，向所述混合溶液中勻速滴加水溶性聚陰離子水溶液，水溶性聚陰離子水溶液以聚陰離子計，混合溶液以季銨化殼聚糖計，水溶性聚陰離子水溶液與混合溶液的質量比為1: 3-10 ；(3)加入水溶性聚陰離子水溶液後在18-25°C下繼續攪拌25_35min，得到納米凝
血酶懸液。優選地,所述方法還包括步驟(4):將所述納米凝血酶懸液以10000-15000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。本發明提供的納米凝血酶，由於採用核殼結構，核為凝血酶，殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子，即將凝血酶包載在由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子中，水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子是通過分子間或分子內交聯反應而形成納米粒子，是一種靜電作用，不涉及熱交聯過程中的高溫及化學交聯過程中的共價鍵形成，對所包載的凝血酶的活性無較大影響；季銨化殼聚糖和水溶性聚陰離子均是水溶性的，且季銨化殼聚糖的水溶液和水溶性聚陰離子的水溶液均為中性或弱鹼性，對所包載的凝血酶的活性也無較大影響。因此，本發明提供的納米凝血酶保持了凝血酶的生物活性。本發明提供的納米凝血酶，由於凝血酶被包載在水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯成的納米粒子中，因此可在室溫下穩定保存；活性穩定；具有緩釋功能，適於靜脈注射；藥物作用時間長，生物利用度高；進入體內不容易被降解，降低了用藥劑量；季銨化殼聚糖材料經濟、無毒、生物兼容性好，使本發明提供的納米凝血酶經濟安全；通過對納米粒子表面修飾可製備靶向藥物製劑，本發明提供的納米凝血酶具有良好的藥物開發潛力，具有較高的醫用價值和廣闊的應用前景。本發明的其他特徵和優點將在`隨後的具體實施方式
部分予以詳細說明。


圖1是本發明提供的納米凝血酶的電鏡照片。圖2是本發明提供的納米凝血酶的活性變化曲線。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。一方面，本發明提供了一種納米凝血酶，納米凝血酶為核殼結構，核為凝血酶，殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子。根據本發明，儘管納米凝血酶為核殼結構，核為凝血酶，殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子，即可實現本發明的目的，即保持凝血酶的生物活性，在室溫下穩定保存，具有緩釋功能，藥物作用時間長，進入體內不容易被降解，經濟安全。但優選情況下，納米粒子的粒徑為150-210nm，可更好地保持凝血酶的生物活性，進一步提高納米凝血酶的穩定性及緩釋功能。本發明中，為了更好地提高納米凝血酶的穩定性及緩釋功能，納米凝血酶的包封率優選為50.1-77.81%。本發明中，對於季銨化殼聚糖的分子量無特殊要求，只要能與水溶性聚陰離子交聯形成納米粒子即可，但為了更好地保證藥效並提高納米凝血酶的穩定性，季銨化殼聚糖的分子量優選在200kDa以上。分子量在200kDa以上的季銨化殼聚糖優選採用如下方法製得:將分子量360-400kDa以上的殼聚糖溶於水中配製成殼聚糖水溶液，然後加入縮水甘油三甲基氯化銨溶液，於75-85°C反應5-7h，反應產物經丙酮沉澱，沉澱後固液分離得到的固體經冷凍乾燥，即獲得分子量為200kD以上的季銨化殼聚糖。其中殼聚糖與縮水甘油三甲基氯化銨的摩爾比為1: 3-5，殼聚糖與丙酮的摩爾比為1: 8-10。本發明中，對於水溶性聚陰離子的種類無特殊要求，只要能與季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成納米粒子即可，例如可以為葡聚糖磺酸根離子、透明質酸根離子和海藻酸根離子中的任意一種。另一方面，本發明提供了一種納米凝血酶的製備方法，所述方法包括:(I)將季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液接觸得到混合溶液，季銨化殼聚糖水溶液和凝血酶水溶液的用量為，每9mg的季銨化殼聚糖對應2-10U的凝血酶；(2)在18_25°C持續攪拌狀態下，向所述混合溶液中勻速滴加水溶性聚陰離子水溶液，水溶性聚陰離子水溶液以聚陰離子計，混合溶液以季銨化殼聚糖計，水溶性聚陰離子水溶液與混合溶液的質量比為1: 3 -10 ；(3)加入水溶性聚陰離子水溶液後在18_25°C下繼續攪拌25_35min，得到納米凝
血酶懸液。本發明中，水溶性聚陰離子水溶液的滴加速度優選為20-40滴/min。為了進一步純化得到的納米凝血酶，優選地，所述方法還包括步驟(4):將納米凝血酶懸液以10000-15000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。對於步驟(I)中季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液接觸的方式無特殊要求，將季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液直接混合即可。為了更好地形成本發明的核殼結構，攪拌的速度優選為600-1000r/min ;季銨化殼聚糖水溶液的濃度優選為4-6mg/mL ;凝血酶水溶液的濃度優選為10_50U/mL ;水溶性聚陰離子水溶液的濃度優選為2-5mg/mL。對於季銨化殼聚糖的分子量以及水溶性聚陰離子的種類，前文已經進行了說明，在此不再贅述。本發明中，季銨化殼聚糖、凝血酶和水溶性聚陰離子鹽均可以通過商購獲得，季銨化殼聚糖也可以根據活性功能聚合物(React.Funct.Polym) (Viviane A等.2004,61, 347)所述的方法製備，即將殼聚糖與縮水甘油-三甲基-氯化銨於75-85°C反應5-7h，殼聚糖與縮水甘油-三甲基-氯化銨的摩爾比為1: 3-5，反應產物經丙酮沉澱，殼聚糖與丙酮的摩爾比為1: 8-10，沉澱後固液分離得到的固體經冷凍乾燥，即可獲得季銨化殼聚糖。為了獲得分子量在200kDa以上的季銨化殼聚糖，殼聚糖的分子量優選在360kDa以上。另外，本領域技術人員能夠想到的是，通過對本發明提供的納米凝血酶的納米粒子表面進行修飾，可以製備各種靶向藥物製劑。以上結合附圖詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。實施例以下的實施例將對本發明作進一步的說明，但並不因此限制本發明。在下述實施例中:季銨化殼聚糖米用如下方法製得:將9.3mmol殼聚糖(分子量360kDa,購自賽默飛世爾生物化學製品有限公司)溶於水中配製成殼聚糖水溶液，然後加入縮水甘油三甲基氯化銨溶液(購自基諾生物醫藥技術有限公司)，其中，縮水甘油三甲基氯化銨為37.2mmol,在80°C下反應6h,反應產物經83.7mmol丙酮沉澱,沉澱後固液分離得到的固體經冷凍乾燥，即獲得分子量為 230kDa的季銨化殼聚糖。季銨化殼聚糖水溶液、凝血酶水溶液和水溶性聚陰離子水溶液均採用去離子水配製。納米凝血酶包封率的測定方法:抽取健康志願者全血，以A⑶(2.5重量％檸檬酸三鈉，2.0重量％ D-葡萄糖，1.5重量％檸檬酸)作為抗凝劑，離心分離富含血小板血漿(PRP)。用去離子水、凝血酶(購自中生華美科技有限公司)配製與實施例中納米凝血酶懸液的凝血酶濃度一樣的自由凝血酶溶液，利用血小板聚集儀檢測不同體積自由凝血酶溶液誘導血小板聚集的能力，得到可以使血小板聚集率達到接近100%水平的凝血酶體積數。將實施例中得到的納米凝血酶懸液高速離心後，測定上清中相同體積下游離凝血酶誘導血小板聚集的能力，根據血小板的聚集率計算納米凝血酶的包封率:納米凝血酶包封率=1-(上清凝血酶誘導的血小板聚集率/自由凝血酶誘導的血小板最大聚集率)X 100 %。採用雷射粒度儀對納米粒子進行粒徑及分散度(PDI)的測定。實施例1用去離子水和製得的季銨化殼聚糖配製成5mg/mL的季銨化殼聚糖水溶液，用去離子水和葡聚糖磺酸鈉(購自基諾生物醫藥技術有限公司)配製成5mg/mL的葡聚糖磺酸鈉水溶液，將200 μ L(50U/mL)凝血酶(購自中生華美科技有限公司)加入1.8mL季銨化殼聚糖水溶液中得到混合溶液，然後在22°C條件下，在800r/min的持續磁力攪拌作用下將
0.3mL的葡聚糖磺酸鈉水溶液以30滴/min的速度勻速加入混合溶液中，可見藍色乳光，力口入後在22°C下繼續攪拌30min，得到納米凝血酶懸液。將製得的納米凝血酶懸液以13000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。測定製得的納米凝血酶的包封率為77.81%，平均粒徑為205nm，PDI為0.154。將製得的納米凝血酶在電鏡下觀察，電鏡照片如圖1所示。實施例2用去離子水和製得的季銨化殼聚糖配製成5mg/mL的季銨化殼聚糖水溶液，用去離子水和透明質酸鈉(購自基諾生物醫藥技術有限公司)配製成3mg/mL的透明質酸鈉水溶液，將200μ L(10U/mL)凝血酶(購自中生華美科技有限公司)加入1.8mL季銨化殼聚糖水溶液中得到混合溶液，然後在18°C下，在800r/min的持續磁力攪拌作用下將0.5mL的透明質酸鈉水溶液以20滴/min的速度勻速加入混合溶液中,可見藍色乳光,加入後在18°C下繼續攪拌25min,得到納米凝血酶懸液。將製得的納米凝血酶懸液以13000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。測定製得的納米凝血酶的包封率為65.32%，平均粒徑為 150nm, PDI 為 0.172。實施例3用去離子水和製得的季銨化殼聚糖配製成5mg/mL的季銨化殼聚糖水溶液，用去離子水和海藻酸鈉(購自基諾生物醫藥技術有限公司)配製成2mg/mL的海藻酸鈉水溶液，將200 μ L(25U/mL)凝血酶(購自中生華美科技有限公司)加入2.0mL季銨化殼聚糖水溶液中得到混合溶液，然後在25°C下，在800r/min的持續磁力攪拌作用下將0.5mL的海藻酸鈉水溶液以40滴/min的速度勻速加入混合溶液中，可見藍色乳光，加入後在25°C下繼續攪拌35min，得到納米凝血酶懸液。將製得的納米凝血酶懸液以13000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。測定製得的納米凝血酶的包封率為50.1%，平均粒徑為176nm, PDI 為 0.137。納米凝血酶活性穩定性分析:分別將實施例1-3中製備的納米凝血酶用去離子水溶解，以凝血酶的濃度計，分別配製成50U/mL的納米凝血酶水溶液，同時配製凝血酶濃度相同的自由凝血酶水溶液，均在110rpm/37°C的保存條件下保存，在不同時間點測定殘存酶誘導PRP中血小板聚集的能力，如圖2所示(圖中示出了實施例1的納米凝血酶和自由凝血酶的活性變化曲線，實施例2和3的納米凝血酶的活性變化曲線圖與實施例1類似，圖中未示出)，納米凝血酶活性變化類似於藥物釋放曲線，在5h時左右發生藥物突釋，在72h時左右，酶活性達到最大，之後開始緩慢下降，而自由酶則是一個活性衰減的過程。從上述實施例可以 看出，本發明提供的納米凝血酶，保持了凝血酶的生物活性，活性穩定，具有緩釋功能，藥物作用時間長。本發明提供的納米凝血酶，保持了凝血酶的生物活性；在室溫下穩定保存；活性穩定；具有緩釋功能，適於靜脈注射；藥物作用時間長，生物利用度高；進入體內不容易被降解，降低了用藥劑量；季銨化殼聚糖材料經濟、無毒、生物兼容性好，使本發明提供的納米凝血酶經濟安全；通過對納米粒子表面修飾可製備靶向藥物製劑，本發明提供的納米凝血酶具有良好的藥物開發潛力，具有較高的醫用價值和廣闊的應用前景。
權利要求
1.一種納米凝血酶，其特徵在於，所述納米凝血酶為核殼結構，所述核為凝血酶，所述殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子。
2.根據權利要求1所述的納米凝血酶，其中，所述納米粒子的粒徑為150-210nm。
3.根據權利要求1或2所述的納米凝血酶，其中，所述納米凝血酶的包封率為50-78%。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的納米凝血酶，其中，所述季銨化殼聚糖的分子量在200kDa以上。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的納米凝血酶，其中，所述水溶性聚陰離子為葡聚糖磺酸根離子、透明質酸根離子和海藻酸根離子中的任意一種。
6.—種納米凝血酶的製備方法，所述方法包括: (1)將季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液接觸得到混合溶液，季銨化殼聚糖水溶液和凝血酶水溶液的用量為，每9mg的季銨化殼聚糖對應2-10U的凝血酶； (2)在18-25°C持續攪拌狀態下，向所述混合溶液中勻速滴加水溶性聚陰離子水溶液，水溶性聚陰離子水溶液以聚陰離子計，混合溶液以季銨化殼聚糖計，水溶性聚陰離子水溶液與混合溶液的質量比為1: 3-10 ； (3)加入水溶性聚陰離子水溶液後在18-25°C下繼續攪拌25-35min，得到納米凝血酶懸液。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述方法還包括步驟(4):將所述納米凝血酶懸液以10000-15000r/min的速度離心，離心後得到的固體即為納米凝血酶。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中，所述季銨化殼聚糖水溶液的濃度為4-6mg/mLo
9.根據權利要求6-8中任意一項所述的方法，其中，所述季銨化殼聚糖的分子量在200kDa 以上。
10.根據權利要求6-9中任意一項所述的方法，其中，所述凝血酶水溶液的濃度為10-50U/mL。
11.根據權利要求6-10中任意一項所述的方法，其中，所述水溶性聚陰離子水溶液的濃度為2-5mg/mL。
12.根據權利要求6-11中任意一項所述的方法，其中，所述水溶性聚陰離子為葡聚糖磺酸根離子、透明質酸根離子和海藻酸根離子中的任意一種。
全文摘要
本發明提供了一種納米凝血酶，其特徵在於，所述納米凝血酶為核殼結構，所述核為凝血酶，所述殼為由水溶性聚陰離子和季銨化殼聚糖的陽離子交聯形成的納米粒子。本發明還提供了一種納米凝血酶的製備方法，包括(1)將季銨化殼聚糖水溶液與凝血酶水溶液接觸得到混合溶液；(2)在18-25℃持續攪拌狀態下，向所述混合溶液中勻速滴加水溶性聚陰離子水溶液；(3)加入水溶性聚陰離子水溶液後在18-25℃下繼續攪拌25-35min，得到納米凝血酶懸液。本發明提供的納米凝血酶，保持了凝血酶的生物活性；活性穩定；具有緩釋功能；藥物作用時間長；進入體內不容易被降解；經濟安全，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K38/48GK103169957SQ20111043630
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者聶廣軍, 李素萍, 吳雁, 張嘉坤, 趙穎 申請人:國家納米科學中心