用於由vwf前肽製備成熟vwf的方法

2023-05-27 16:04:11 2

專利名稱：：用於由vwf前肽製備成熟vwf的方法
技術領域：
：本發明涉及用於由馮威勒布蘭特因子(VWF)前肽製備成熟馮威勒布蘭特因子的方法。
背景技術：
：在細胞內的蛋白質成熟過程中，待成熟的蛋白質經歷翻譯後修飾。這些修飾包括乙醯化、甲基化、糖基化以及蛋白水解裂解。這些修飾在許多情況中對蛋白質功能及活性是必需的，並且它們還會影響蛋白質尤其是酶的效力。前蛋白(或稱蛋白質前體)是無活性的蛋白質，其通過這些翻譯後修飾中的一個以上、尤其通過來自前蛋白的前肽的裂解而轉變為活性形式。前蛋白的例子包括，例如前體胰島素、凝血酶原等。活性化蛋白質的製備具有較高的臨床和診斷價值。例如，活性化或熟化蛋白質可用於控制凝血。活性蛋白質在活性有機體中的可用量通常很低。因此，它們的前蛋白和前體酶優選通過與活化酶(例如蛋白酶)接觸而在體外活性化。目前用於由前蛋白製備成熟蛋白質的方法要麼使用固定化蛋白酶，要麼在游離溶液中進行。這兩種方法均有缺點。其中，要求蛋白酶按如下工藝固定化。馮威勒布蘭特因子(VWF)是一種在血漿中循環的糖蛋白，是大小為約500-20,000kD的一系列多聚體。VWF的多聚體形式由通過二硫鍵連接在一起的250kD多肽亞基構成。VWF可調節初始血小板對受損血管壁的亞內皮的粘附性；人們認為僅僅較大的多聚體顯示出止血活性。具有大分子質量的多聚體被貯藏在內皮細胞的懷布爾—帕拉德(Weibel-Pallade)體中，並在刺激時釋放。然後，經釋放的VWF會被血漿蛋白酶進一步處理，從而得到低分子量形式的VWF。4VWF由內皮細胞和巨核細胞合成，其作為預前肽VWF("pp-VWF')，較大程度上由重複結構域構成。在信號肽裂解時，VWF前肽經由在其C端區的二硫鍵發生二聚體化。該二聚體用作用於多體化的原聚體，這受控於在自由端末端之間的二硫鍵。在組合成多聚體之後進行前肽的蛋白水解去除(Leyte等，Biochem.J.，274(1991)，257-261)。假定VWF前肽的生理學角色為在從VWF前肽分子中裂解之前或之後支配VWF多聚體的組合(Takagi等，JBC264(18)(1989)，10425-10430)。雖然在人體中前肽的去除幾乎是完全的，但在哺乳動物細胞系中的VWF的重組體高水平表達的情況中，該過程不是很有效。來自這種基因工程細胞系的細胞孵育上清液通常包括成熟VWF和VWF前體比如VWF前肽的混合物。因此，為獲得成熟VWF，需要將VWF前體，特別是VWF前肽轉變成成熟VWF。例如，在EP0775750A中，該熟化通過使用弗林蛋白酶(forin)來實現。特別地，在EP0775750A中建議重組法共表達ftirin和VWF，使得VWF的熟化可原位發生。在WO00/49047中，描述了一種使用凝血酶製備成熟VWF的方法，其中熟化在溶液中或通過使用結合在固體載體上的凝血酶進行。
發明內容本發明提供一種用於由VWF前肽製備成熟馮威勒布蘭特因子(VWF)的有效方法。本發明提供一種通過如下步驟製備成熟VWF的新穎方法將VWF前肽固定在離子交換樹脂上，接著用furin熟化被結合的VWF前肽，並從離子交換樹脂上洗脫出經熟化的VWF。本發明的方法特別適用於由VWF前肽在體外熟化VWF。該方法允許以較高的比活性和純度製備成熟VWF。本發明涉及一種用於由VWF前肽製備成熟VWF的方法，其包括如下步驟-將VWF前肽固定在離子交換樹脂上，-用包含fUrin的溶液孵育該固定化的VWF前肽以獲得固定化的成熟VWF，以及-通過洗脫從離子交換樹脂上分離成熟VWF。圖1所示為furin活性對Ca^的依賴性。圖2所示為熟化效力對VWF濃度的依賴性。5ml溶於再增溶緩衝液(100mM梓檬酸，lOOmMHEPES，pH=7.0)的VWF試樣摻入5單位forin/UVWF,並在37°C下孵育22h。通過SDS-PAGE在8。/。凝膠上分析試樣，並且通過銀染色法顯現分離的多肽。泳道h1U/mlVWF+5而fUrin，0h泳道2:5U/mlVWF+5U/Uforin，0h泳道3:10U/mlVWF+5U/Uftirin，0h泳道4:1U/mlV曹+5而fiirin，6h泳道5:5U/mlVWF+5而fiirin，6h泳道6:10U/mlVWF+5而fiirin，6h泳道7:1U/mlVWF+5U/Ufiirin，24h泳道8:5U/mlVWF+5而fiirin，24h泳道9:10U/mlVWF+5而fiirin，24h。圖3所示為熟化效力對VWF濃度的依賴性。5ml溶於再增溶緩衝液(100mM檸檬酸，100mMHEPES，pH=7.0)的VWF試樣摻入0.5-4.0單位fiirin/UVWF，並在37°C下進行孵育。在TK)、20以及24小時處抽取試樣。通過SDS-PAGE在8。/。凝膠上分析試樣，並且通過銀染色法顯現分離的多肽。泳道l:VWF10U/ml泳道2:VWF+0.5腦fiirin，Oh泳道3:VWF+1U/Ufiirin，Oh泳道4:VWF+2U/Ufiirin,Oh泳道5:VWF+2.5U/UfUrin，Oh泳道6:VWF+4U/Ufbrin，Oh泳道7-ll:同上，20h泳道12-16:同上，24h。圖4所示為在柱上熟化後的TMAE洗脫液。經由包含VWF/VWF前肽的材料的MAB液流在熟化之前以約180-220單位VWFAg/ml樹脂和VWF前肽/VWF被泵抽到柱子上。1CR29-E1+E2(2.4Uflorin/UVWF;在37°C下3h;FUR24—04—UFK—02;梯度洗脫；2CR30-E1+E2(3.2Ufiirin/UVWF;在37°C下lh;FUR—UF06—01(克隆488-3);梯度洗脫3CR36-E，(7.8Ufiirin/UVWF;在4。C下4h;FUR—015(在TMAE上預純化)，分歩洗脫；4CR37-E，(5.8Ufiirin/UVWF;在4。C下8h;FUR—UF06—01(克隆488-3)，分批洗脫；65CR38-El+E2(4.8Ufurin/UVWF;在4。C下8h;FUR—018(在TMAE上預純化)；梯度洗脫。具體實施例方式本發明涉及一種用於由馮威勒布蘭特因子前肽製備成熟馮威勒布蘭特因子(VWF)的方法，其包括如下步驟-將VWF前肽固定在離子交換樹脂上，-用包含furin的溶液孵育該固定化的VWF前肽以獲得固定化的成熟VWF，以及-通過洗脫從離子交換樹脂上分離成熟VWF。本發明的方法特別適用於由其VWF前肽在體外熟化VWF。目前製備成熟VWF的傳統方法包括通過用液相中的蛋白酶孵育其前肽形式從而使本身熟化(即來自前蛋白的前肽的裂解)，以未結合態在游離溶液中發生；或者例如，如WO00/49047中所述，通過將蛋白酶固定在固體載體上從而與包含VWF前肽的製品接觸並進行孵育(例如，參見WO00/49047)。然而，這些方法相對於根據本發明的方法具有各種缺點。工業上，VWF，尤其是重組體VWF(rVWF)被與rFVIII—起在基因工程CHO細胞株中合成並表達。共表達rVWF的作用是在細胞孵育步驟中穩定rFVm。rVWF在作為前體形式的細胞中被合成，其包含大量的連結在N端上的前肽。在內質網狀物和高爾基氏體(Golgiapparatus)中熟化時，前肽因細胞蛋白酶forin的作用而裂解，從而作為由被表達蛋白質中的二聚體構成的、相同亞基的均聚體被分泌出來。然而，該熟化是不完全的，從而得到包含前肽和成熟VWF的混合物的產品。由於本發明的方法的高效力，在重組體合成期間表達的未熟化的VWF前肽基本上,部轉變成成熟VWF。通過該方法可獲得的製品可包含相對於其VWF前肽至少90。/。、更優選至少95%、進一步優選至少98%、更進一步優選至少99%的成熟VWF。在上述出版物中已經表明，VWF前肽可通過用furin或類forin的蛋白酶進行體外處理而轉變為成熟形式(SchlokatU.等(1996)，Biotechnol.Appl.Biochem.24:257-267;PreiningerA.等(1999)，Cytotechnology30:1-15)。Furin屬於前蛋白轉化酶(convertases)的家族並且依賴於Ca唚。該酶可特異性地切斷包含位置-1和-4處精氨酸的特定序列內的精氨酸中的C端肽鍵。該序列可在許多人源蛋白質中被發現，這表明forin在許多人源前肽蛋白質的熟化中舉足輕重。用於本發明的方法的&rin優選為重組體來源。優選使用重組產生的蛋白酶，這是因為可以以較高的產量製備它們。與傳統方法相反，VWF前肽以如下方式固定在固體載體(即離子交換樹脂)上成熟蛋白質在其熟化反應之後將保持固定在所述載體上。這相對於本領域已知的方法具有一些優點。本發明的方法組合使用提純步驟、優選色譜提純步驟和VWF前肽的熟化反應。因此，不需要使用分離工序以除去前肽或蛋白酶。此外，相反地，本領域己知的方法始終需要從蛋白質/蛋白酶/前肽混合物或從蛋白質/前肽混合物中進一步提純成熟蛋白質。本發明的方法中的VWF前^C優選被包含在流經固體載體的液流中或通過至少一個洗滌步驟從固體載體中除去，而成熟蛋白質則在該處理中始終保持結合在固體載體上。因此，與現有技術中的方法相比，本發明的方法提高了工藝經濟性並且便於由其前肽製備成熟蛋白質。根據本發明的方法的另一優點是，fiirin可以從分泌所述蛋白酶的細胞系的細胞的粗的培養上清液或細胞提取物中獲得。因此，不需要純化或僅需要部分純化前蛋白轉化酶(convertase)，就可熟化結合在離子交換樹脂上的前蛋白。在將VWF前肽熟化為成熟VWF之後，可以洗滌固定在離子交換樹脂上的成冉蛋白質從而從樹脂中除去不希望有的分子。這些分子包括vwf前肽或在孵育期間添加到戶;f述樹脂中的其他蛋白質和化合物。當成熟VWF蛋白質從離子交換樹脂中洗脫時，本發明的方法結束。這是特別有益的，因為其允許在離子交換樹脂上純化成熟VWF而不需要額外的工序。例如，其也允許在洗脫之前增加洗滌步驟以除去VWF前肽。因此，本發明方法中的洗脫可以使用具有予頁期性能的洗脫緩衝液進行，而不使用需要活化VWF前肽的緩衝液或溶液。因為VWF前肽可通過重組法大量製備，故其是本發明方法中的VWF前肽的優選來源。然而，用於本發明的VWF前肽不僅限於重組獲得的VWF前肽。本發明的方法可以使用從包括，但不限於，血漿、血槳部分以及由此衍生的溶液的任何來源所獲得的VWF前月太。根據本發明的待熟化的VWF前肽可以來自各種來源，藉此可提供純化的、部分純化的或甚至未純化形式的VWF。如果提供部分純化或未純化形式的VWF前肽，那麼必須考慮一些組分(雜質)會抑制或部分抑制熟化處理。由於在本發明的方法中優選使用重組體來源的VWF前肽，故包含溶液的VWF前肽可以是由重組細胞培養物製備的培養上清液。當然，本發明的VWF前肽的來源可以包括可用於熟化的部分純化的、重組製備的VWF前肽。根據本發明的優選實施方式，離子交換樹脂包括三甲基氨基乙基基團(TMAE)。本領域已知的可結合VWF前肽的其他離子交換樹脂也是適合的。為了便於熟化處理以及提供以增加的濃度固定在樹脂上的VWF前肽，在本發明的一個實施方式中，將色譜樹脂裝進色譜柱中。由於VWF前肽的濃度在其體外熟化過程中會影響熟化效率，故將色譜樹脂裝入色譜柱中是有益的。此外，色譜柱的使用允許以可再現性更高的方式來有效地控制熟化參數，從而更簡單地在體外進行VWF的熟化。如果VWF前肽被固定在陰離子交換樹脂上並用顯示VWF前肽轉化酶活性的溶液孵育，那麼在25。C處測得的電導率在本發明的一個實施方式中低於25mS/cm，在本發明的另一實施方式中低於20mS/cm，並且在本發明的另一實施方式中低於16mS/cm。VWF前肽以及VWF在這些電導率水平上可有效地固定在陰離子交換樹脂上。於是，用於本發明方法中的緩衝液必須相適應地使用。在25。C下測定的如下電導率下，從陰離子交換樹脂中洗脫出成熟VWF:在本發明的一個實施方式中為至少40mS/cm，在本發明的另一實施方式中為至少60mS/cm，以及在本發明的另一實施方式中為至少80mS/cm。當然，可以在從陰離子交換樹脂中洗脫出成熟VWF之前，另外實施洗滌步驟。根據本發明的實施方式，ftirin還包括濃度為0.01-10mM的CaCl2;根據另一實施方式，包括濃度為0.1-5mM的CaCl2;以及根據另一實施方式，包括濃度為0.2-2mM的CaCl2。為了它們的蛋白水解活性，許多蛋白酶需要輔因子比如二價金屬離子。^ifin要求其活性鈣離子。因此，如果forin用於在體外活性化VWF，那麼鈣鹽被使用。最優選的鈣鹽是氯化鈣。forin對於固定化VWF前肽的孵育時間可根據所用體系而改變。此外，其他因素比如溫度、緩衝液等會影響熟化處理的效率。然而，本領域技術人員能夠識別和選擇最合適的孵育時間。通常，該熟化處理在少於48小時內結束，並且僅熟化1分鐘以下就足以由VWF前體製備出成熟VWF。由於forin的高特異性，故即使在延長的孵育時間之後，也不會發生VWF的"過度活性化"(進一步的蛋白水解降解)。根據本發明的實施方式，孵育進行少於1分鐘至48小時；在另一實施方式中進行10分鐘至42小時；在另一實施方式中進行20分鐘至36小時；以及在另一實施方式中進行30分鐘至24小時。該熟化處理還取決於在孵育過程中所選用的溫度。forin的優選酶活性隨溫度而改變。根據本發明的一個實施方式中，孵育在2-40。C的溫度下進行;在另一實施方式中，在4-37。C下進行。Furin在低溫比如2。C下已具有有效的活性。應當仔細選擇最高溫度，從而不出現或基本上不出現非特異性的蛋白質降解。這通常在如下情況下實現在本發明的一個實施方式中，採用的最高溫度低於50。C;在另一實施方式中，最高溫度低於45。C。此外，本發明的另一方面涉及通過根據本發明的方法可由VWF前肽獲得的VWF製品。本發明的方法提供了VWF，其由於較高的處理效率而基本上不含VWF前肽。本發明的另一方面涉及一種包含根據本發明的VWF製品的藥物製劑。該藥物製劑可特別地用於治療凝血病，並且可與其他活性成分比如其他凝血因子組合使用。此外，該製劑還可包含藥學可接受的賦形劑、載體和稀釋劑。本發明的另一方面涉及根據本發明的VWF製品用於製造治療馮威勒布蘭特病(VWD)的藥劑的用途。實施例實施例l:ftirin對鈣的依賴型對furin的酶催化研究(MolloyS.E.等，(1992)，J.Biol.Chem.267:16396-16402)表明，其活性依賴於Ca2+，並且晶體結構的評估(Than等，(2005)，ActaCrystD61:505-512)表明，其分子具有兩個用於Ca2+的結合位置。Cameron等(CameronA等，(2000)，J.Biol.Chem.，275:36741-367499)描述了flirin要求至少1mM的鈣濃度以便獲得完全的活性，該活性與Ca2+濃度增加到50mM時的活性沒有差別。在第一組試驗中，發明人研發的重組體furin對鈣的依賴性被測試和定量。由試驗用CHO克隆CHO257/1638-25的furin被表達並且作為在C端處包含組氨酸標記(His-Tag)的可溶酶而被分泌入細胞孵育基中。通過Ni螯合物色譜法預純化的forin製品使用作為底物的合成肽Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC進行活性測定。VWF前肽熟化反應在包含0-40mM的Ca^的測定緩衝液中進行。圖1所示的結果確認如下數據由CHO細胞系表達的重組的可溶性forin顯示出明顯的對鈣的依賴性，其最大活性在Ca^濃度為0.5-1mM處被發現，而且在鈣濃度高於5mM處，其活性受到明顯地抑制。當rVWF的來源材料包含大量Ca+時，必須考慮鈣的這種抑制可能。實施例2:對VWF濃度的依賴性作為由經典酶動力學得出的結論，人們認為底物濃度越高，導致酶的轉化率越高，從而允許以降低的forin消耗或降低的熟化時間進行VWF熟化。於是，VWF熟化實驗在如下條件下進行在標準化孵育體積中使用5單位fUrin/UVWFAg，在1、5和10單位/ml的VWF濃度處進行。通過SDS-PAGE分析在37°C處孵育0、6和24小時時間點處抽取的試樣。10圖2所示的結果表明，VWF濃度越高，VWF熟化進行地越快，從而允許用於該酶催化步驟的孵育時間減少。同樣地，使用濃縮的VWF製品並在37°C下用0.5-4.0單位forin/單位VWFAg進行熟化反應，結果表明>95%的VWF熟化等級可用低於5單位furin/單位VWFAg在24小時的孵育時間內實現(參見圖3)。如該實施例所示，當底物VWF前肽在柱子上的局部濃度很高時，本發明進一步提高了furin熟化效率。結果還表明更高濃度的VWF前肽可增加熟化速度。實施例3:VWF熟化在該實施例中，使用fUrin的VWF前肽熟化被顯示。Furin與結合在色譜柱上的VWF前肽接觸。在TMAE陰離子交換樹脂上進行色譜法步驟。使用表2所示的緩衝液配方進行TMAE純化步驟的具體說明如表1中所列舉。就實施該方案來說，用於在柱上熟化結合的VWF前肽的不同步驟被研究；包括furin的循環泵入或向下泵出，同時改變如下參數溫度、接觸時間、NaCl含量以及特定的ftirin含量。通過SDS-PAGE以及VWF前肽/VWF比值的目測，研究在洗脫液池中發現的VWF,進行熟化分級(例如，參見圖4)。影響熟化效率的另一參數是forin試劑的品質。furin來源於具有較低表達水平的表達組氨酸標記的ftirin的克隆株(試驗用CHO257/1638-25)和/或具有較高表達水平的表達沒有標記的可溶性forin的克隆株的細胞培養上清液。表3所示的結果表明，用結合於柱子上的低至2.4單位forin/單位VWFAg的特定furin含量可實現在37°C(1小時接觸時間)處高效率的熟化。在2-8。C處，用3.3單位fbrin/單位VWFAg的特定furin含量，經4小時接觸時間可獲得>95%的熟化。通過使未結合到離子交換樹脂上的forirt處於這些狀況，150mMNaCl的離子強度處的柱上熟化總效率高於90mMNaCl下的熟化總效率。表4a和表4b中顯示了洗脫液池中的用於CHO蛋白質的雜質分布以及ftirin蛋白酶活性與在TMAE上的VWF熟化步驟所用參數的關係。結果表明，在熟化期間泵到色譜柱上的具有最高含量的附加的CHO細胞培養上清液的來自"組氨酸標記"試驗用克隆株(較低的表達水平)的forin濃縮物導致了最高的CHO雜質水平。使用來自GMP克隆株的ftirin的熟化步驟所獲得的數據導致在洗脫液池中相對較低的CHO汙染水平，並且泵抽到色譜柱上的附加CHO細胞培養物的體積低於在VWF製品加載期間加載在色譜柱上的體積的2%。VWF前肽熟化需要較低的ftirin細胞培養物體積表明，洗脫液池中的CHO雜質水平受forin試劑的影響不明顯，其主要由VWF來源導致。對於類似於"CHO雜質"的forin蛋白酶活性能夠進行類似的汙染分布檢測。表l:TMAE俘獲/熟化步驟的詳細說明tableseeoriginaldocumentpage12表2:用於TMAE俘獲/熟化步驟的緩衝液tableseeoriginaldocumentpage13在色譜柱上試驗期間，可以觀察到該步驟的性能隨著對一個色譜柱上所做批次數的增加而明顯降低。確定的原因是色譜柱由於不充分的色譜柱再生步驟導致的汙染，該再生步驟包括5CV的0.5MNaOH和5CV的2MNaCl。該步驟猶如保持原樣，但鹼在30-400C下被預熱，用於改善清潔效果。檢測結果發現足以抑制色譜柱汙染以及在工藝步驟中性能的下降。表3:用於在TMAE上熟化VWF前肽的條件tableseeoriginaldocumentpage14加載在色譜柱上的VWF始終在160-180抗原單位/ml樹脂的範圍內。在根據表1加載並洗滌後，緊接著使用表中所示的參數進行ftarinVWF前肽熟化。最後一欄列舉了經由色譜柱泵抽的經稀釋的ftirin中的NaCl含量。表4a:VWF前肽在色譜柱上的熟化；洗脫液池中的CHO和Furin分布。tableseeoriginaldocumentpage15表4b:VWF前肽在色譜柱上的熟化；在洗脫液池中的CHO和Furin分布洗脫液池tableseeoriginaldocumentpage16在表4a和4b中，色譜柱上的熟化試驗的具體條件被顯示，包括VWF/VWF前肽的體積(MAB流)、furin濃度以及相應當量的施加在色譜柱上的細胞培養上清液。洗脫液池中的CHO蛋白質中的雜質分布以及forin蛋白酶活性被顯示。試驗CR24-29使用組氨酸標記的試驗克隆株的fbrin濃度(中試規模製造)；CR30-CR33使用GMP克隆的fiirin濃縮物(以IO升發酵器規模製造)；CR23和CR35-CR38分別使用來自試驗克隆和GMP克隆的預純化furiiu考慮到因瓊脂糖凝膠電泳導致的附加的蛋白水解降解，還研究了洗脫液池的VWF品質。附加的蛋白水解降解可通過在2.5%凝膠上的瓊脂糖凝膠電泳而很好地顯現，其中VWF多聚體結構的主條帶側翼為弱的稱為"衛星"條帶的附加條帶。幾個批次的免疫印記(WesternBlot)結果表明，在柱上熟化之後，在VWFTMAE洗脫液池上沒有形成明顯的衛星條帶，這與所用條件無關。分析在洗脫液池中發現的成熟VWF的N端序列，從而檢測ftirin在柱上熟化條件下是否使用了正確的斷裂位點。來自批次CR33、CR35和CR36的VWF被編序並且被發現的N端序列符合用於成熟VWF的預期的天然序列(N端SLSCRPPVM...),從而進一步確認體外處理步驟的品質。實施例4:柱上熟化-中試規模實施使用forin的VWF前肽的柱上熟化以中試規模在如下條件下實施具有30cm直徑的9升柱子，每批次施加約16gVWF的總加載量。該處理在2-8。C下進行，ftirin熟化時間為8小時，符合實驗室規模的試驗CR35。用於中試規模的設計的TMAE俘獲/熟化步驟如表5所示。為進行熟化和洗滌步驟2，在加載之後、但在洗脫之前進行活化和洗滌步驟3。對於成熟VWF的洗脫，實施分步洗脫。表5:以中試規模進行TMAE俘獲/熟化步驟tableseeoriginaldocumentpage18用於以中試規模進行13個俘獲/柱上熟化步驟的數據如表6所示。表6:以中試車間規模(2100升加載體積/批次)在151FractogelEMDTMAE650柱上的柱上熟化tableseeoriginaldocumentpage19*未考慮用於統計分析的試驗根據本發明，包括rVWF前肽的rVWF用rftirin處理，雖然非rftorin(非重組的flirin)也起作用，同時rVWF被吸附在離子交換樹脂上，這可避免在rforin處理之前需要通過其他方式濃縮rVWF。在合適的稀釋之後，將起始材料施加到其上吸附了rVWF的離子交換樹脂上。過多的(^++離子通過平衡步驟除去，並且將rftirin泵到柱子上，使其停留一定量的時間。未結合的rfurin、VWF前肽以及過量的CHO蛋白質通過洗滌步驟除去，並且通過增加離子強度將rVWF從柱子中洗脫。表6中的數據表明，柱上的furin熟化是有效的，並且VWF前肽含量可以從在加載材料中的平均55.4%VWF前肽抗原降低到在洗脫液池中的總VWFAg的平均1.3%VWF前肽抗原。在表中所示的條件下，使用加載在柱上的平均0.9單位forin/單位VWF抗原的ftxrin用量，可實現在平均98.7。/。成熟VWFAg/總VWFAg的洗脫液池中VWF產品熟化水平。在極低濃度的rfurin(0.1單位/單位rVWF)下，熟化處理得到較高含量的剩餘VWF前肽。權利要求1.一種用於由馮威勒布蘭特因子前肽製備成熟馮威勒布蘭特因子(VWF)的方法，其包括如下步驟-將VWF前肽固定在離子交換樹脂上，-用furin孵育固定化的VWF前肽以獲得固定化的成熟VWF，以及-通過洗脫從離子交換樹脂上分離成熟VWF。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述VWF前肽是重組體來源。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述離子交換樹脂包括三甲基氨基乙基基團(TMAE)。4.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述離子交換樹脂被裝入色譜柱中。5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述VWF前肽被固定在所述離子交換樹脂上，並且在25°C處測定的電導率低於25mS/cm下用forin孵育。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述電導率低於20mS/cm。7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述電導率低於16mS/cm。8.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，在25°C處測定的電導率為至少40mS/cm下，從所述離子交換樹脂中洗脫出所述VWF。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述電導率為至少60mS/cm。10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述電導率為至少80mS/cm。11.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述forin被包括在進一步包含0.01-10mM濃度的CaCl2的溶液中。12.如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述CaCl2的濃度為0.1-5mM。13.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述CaCl2的濃度為0.2-2mM。14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述孵育進行1分鐘至48小時。15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述孵育進行10分鐘至42小時。16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述孵育進行20分鐘至36小時。17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述孵育進行30分鐘至24小時。18.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述孵育在2-40。C的溫度下進行。19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述孵育在4-37。C的溫度下進行。20.根據權利要求1所述的方法製備的成熟馮威勒布-蘭特因子(VWF)用於製造治療馮威勒布蘭特病(VWD)的藥劑的用途。21.用於治療哺乳動物中的馮威勒布蘭特病的方法，包括對所述哺乳動物給藥根據權利要求1所述的方法製備的成熟馮威勒布蘭特因子(VWF)。22.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述ftirin是重組體來源。全文摘要本發明涉及一種用於由馮威勒布蘭特因子前肽製備成熟馮威勒布蘭特因子(VWF)的方法，其包括如下步驟-將VWF前肽固定在離子交換樹脂上；-用furin孵育固定化的VWF前肽以獲得固定化的成熟VWF，以及-通過洗脫從離子交換樹脂上分離成熟VWF。文檔編號C07K14/435GK101679496SQ200880016374公開日2010年3月24日申請日期2008年5月16日優先權日2007年5月18日發明者克麗斯塔·邁爾,沃爾夫岡·蒙特,邁因哈特·哈斯拉赫爾,阿圖爾·米特雷爾申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司