從血液製品和/或其衍生物中濃縮和檢測致病微生物的裝置和方法
2023-05-27 16:10:06 4
專利名稱：從血液製品和/或其衍生物中濃縮和檢測致病微生物的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及一種濃縮血液製品或其衍生物中可能存在的致病微生物以及檢測濃縮的所述微生物以監測所述血液製品的致病性的方法。
術語「血液製品」是指全血以及從所述全血的級分中產生的任何製品，任選地包含細胞成分，以下列出了血液製品的實例濃縮的紅細胞或血小板，但也包括血漿或血清製品。
檢測由不同的致病微生物如細菌，病毒，黴菌，酵母及其它微生物對血液製品及其衍生物的汙染，是公共衛生機構以及輸血行業面臨的主要問題。
目前存在一些檢測試驗，但不能常規使用。
檢測一群或一亞群血液細胞中這些致病微生物的大多數試驗存在的主要問題包括這樣的事實，即設想用於選擇性提取所述致病微生物的大多數處理同時導致這些微生物被消除。
這種消除幾乎系統地導致所測試的血液製品中所述微生物的存在不可測得，從而增加了對健康的危及。
因此本申請人設計可一種新的快速靈敏的方法，以檢測血液製品或其衍生物中致病微生物的汙染情況。
本發明的方法值得注意之處是其直接對從採自研究對象的血液製品中獲得的樣品進行檢測，不用預先處理或稀釋。
本申請人揭示的檢測致病微生物的方法基本由以下步驟組成選擇性濃縮所述致病微生物，然後一旦其被濃縮則通過本領域熟知的方法檢測。
選擇性濃縮致病微生物通過相繼或同時消除血液製品樣品中存在的不同血細胞群而進行。
本發明濃縮致病微生物的方法包括第一步濃縮致病微生物，即通過選擇性聚集血細胞群而減少這些細胞，隨後進行過濾步驟以收集濾液中未聚集的濃縮的致病微生物，而血細胞聚集物保留在過濾器上。
本發明中所用術語「聚集(aggregation)」是指導致細胞聚集物形成的任何作用。術語「細胞聚集物」是指包含兩個以上細胞的任何細胞群體，其大小大於一個獨立的細胞。在本發明中，聚集物可以通過聚集獲得，如血小板激活後聚集，聚集物也可通過凝集(agglutination)獲得，如獲得的紅細胞當存在特定分子時會凝集，或者聚集物可以通過改變細胞膜的靜電電荷或其它粘附機制誘導的細胞群聚而獲得，或者聚集物可以通過引起兩個以上的細胞群聚的細胞群聚而獲得。
根據本發明的優選實施方案，不同血細胞群的聚集可以通過誘導血小板聚集的化合物或者通過誘導紅細胞特異性凝集的化合物而進行。
例如已知在存在一些化合物的情況下，血小板具有彼此聚集的能力。這些聚集物可易於通過過濾與致病微生物分離。
紅細胞也存在一些凝集性質。
本發明濃縮致病微生物的方法任選包括第二個步驟降低血液中主要細胞群即血小板和紅細胞的濃度，所述步驟包括裂解在第一步聚集步驟中分離的未聚集的細胞。
降低血細胞群濃度的該第二個步驟使得血小板的濃度降低4log(從109降至105個細胞/ml)，紅細胞濃度降低5log(從1010降至105)。
更精確而言，本發明的目的是提供一種濃縮可能存在於包含血細胞的血液製品中的汙染微生物的方法，所述方法特徵在於其包括以下步驟
a)將所述血液製品的樣品進行血細胞聚集處理，b)將步驟a)中形成的聚集物通過將處理的樣品經過第一個過濾器而消除，所述過濾器允許汙染微生物通過但不允許細胞聚集物通過，c)將步驟b)中獲得的濾液中的殘餘細胞選擇性裂解，d)通過將步驟c)的裂解物通過允許細胞碎片通過的第二個過濾器回收汙染微生物。
根據本發明的優選實施方案，本發明的方法包括一個補充步驟e)，即對第二個過濾器進行分析以檢測可能保留在其上的汙染微生物。
本發明的檢測方法優選包括在聚集步驟a)期間加入汙染微生物的標記試劑，或者在裂解步驟c)期間加入汙染微生物的標記試劑，或者在分析步驟e)期間直接在第二個過濾器上加入汙染微生物的標記試劑。
作為通過本發明方法可檢測的致病微生物的標記試劑的實例，我們可以列舉出一種標記溶液，其含有一種酯酶底物如ChemChrome V6。
因此，作為通過本發明方法可檢測的致病微生物的標記試劑，可以使用一種包含標記抗體或核酸標記的一種標記溶液。所述標記優選是螢光標記或者與螢光染料或能使底物降解而產生螢光的酶偶聯，所述螢光可以通過激發雷射而檢測。
本發明的檢測方法還包括加入汙染微生物的透化劑，透化劑可以加入所述方法的至少一個步驟中，在聚集步驟a)期間加入，或者在裂解步驟c)期間加入，或者在分析步驟e)期間直接加入在第二個過濾器上，或者在幾個這些步驟期間均加入。
作為汙染微生物的透化劑的實例，我們可以列舉出聚乙烯亞胺，氯己定二醋酸鹽(chlorhexidine diacetate)，氯己定二葡糖酸鹽，乙二胺四乙酸(EDTA)單獨或者與乳鏈菌肽組合，以及去汙劑如N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷，SDS，Tween，triton，Brij等。
根據本發明方法的一個特定實施方案，血液製品的血細胞是血小板或紅細胞或者是這兩種細胞的混合物。
根據本發明方法的另一個特定實施方案，血液製品的血細胞是血小板，步驟a)的聚集處理包括將樣品與一種聚集組合物接觸，所述組合物包含選自以下一組的至少一種聚集劑-一種血小板抗原的特異性抗體，-選自以下的一種血小板激活的強激動劑凝血酶，TRAP(凝血酶受體激活肽)，胰蛋白酶，膠原蛋白，血栓烷A2或者離子載體A23187，-選自以下的一種血小板聚集的弱激動劑ADP，腎上腺素(adrenalin)，花生四烯酸，Von Willebrand因子，5-羥色胺或腎上腺素(epinephrine)。
聚集組合物中血小板抗原的特異性CD9抗體的濃度有利地在0.5μg/ml至100μg/ml之間，優選在5μg/ml至40μg/ml之間。
聚集組合物中強激動劑的濃度有利地-對於凝血酶型激動劑，在0.5IU/ml至100IU/ml之間，優選在1IU/ml至20IU/ml之間；-對於TRAP型激動劑，在5μM至200μM之間，優選在10至100μM之間；-對於胰蛋白酶型激動劑，在1nM至500nM之間，優選在10nM至300nM之間；-對於膠原蛋白型激動劑，在0.05μg/ml至50μg/ml之間，優選在1μg/ml至20μg/ml之間；-對於血栓烷A2型激動劑，在0.01μg/ml至5μg/ml之間，優選在0.1至1μg/ml之間；-對於PAF型激動劑，在0.005mg/ml至1mg/ml之間，優選在0.05至0.5mg/ml之間；-對於離子載體A23187型激動劑，在0.1μM至100μM之間，優選在1μM至20μM之間。
聚集組合物中弱激動劑的濃度有利地-對於ADP、腎上腺素(adrenalin)或腎上腺素(epinephrine)型激動劑，在0.5μM至100μM之間，優選在1μM至20μM之間；-對於花生四烯酸型激動劑，在0.001mM至10mM之間，優選在0.01mM至5mM之間；-對於Von Willebrand因子型激動劑，在0.001mg/ml至1mg/ml之間，優選在0.01mg/ml至0.5mg/ml之間；-對於5-羥色胺型激動劑，在0.05μM至100μM之間，優選在0.01μM至50μM之間。
在一個完全優選的方式中，血小板抗原的特異性抗體選自抗-CD，CD32，抗-PTA1，CD42，抗-GpIIb/IIIa或抗-GpIV抗體。
根據本發明方法的另一個特定的實施方案，血液製品包含紅細胞，聚集處理步驟a)包括將樣品與一種凝集組合物接觸，所述凝集組合物包含選自凝集素，聚乙烯亞胺，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，凝膠，葡聚糖或聚乙二醇(PEG)的至少一種凝集劑。
所述凝集素優選呈紅細胞凝集素活性。
最優選地，所述凝集素選自Phaseolus vulgaris，Vicia sativa，Vicia faba或Erythrina corallodendron，Lens culinaris，PhytolaccaAmericana或Triticum vulgaris的凝集素。
凝集組合物中Phaseolus vulgaris型凝集素的濃度優選在10μg/ml至200μg/ml之間。
凝集組合物中聚乙烯亞胺的濃度優選在0.1％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
所述葡聚糖最優選選自Dextran 70，Dextran 100，Dextran 500等。
凝集組合物中葡聚糖的濃度優選在0.1％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
所述PEG化合物最優選選自PEG35，PEG等。
凝集組合物中PEG的濃度優選在0.05％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
凝集組合物中凝膠的濃度優選在0.5％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
所述PVP化合物最優選選自PVP-40，PVP-360等。
凝集組合物中PVP的濃度優選在0.05％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
細胞裂解步驟c)優選使用裂解溶液進行，所述裂解溶液包含一或多種選自以下一組的去汙劑皂苷，SDS，Tween 20，TritonX100，Brij 96，Polidocanol，N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷或碳酸鈉。
所述裂解溶液優選由皂苷，Triton X100和Tween 20的混合物組成，最優選所述裂解溶液包含濃以重量/體積％表示)在0.005％至0.5％之間的皂苷，濃度(以重量/體積％表示)在0.001％至0.5％之間的Triton X100，及濃度在0.01％至1％之間的Tween 20及濃度在0.1％and 0.5％之間的N-辛基β-D-吡喃葡糖苷。
細菌透化處理優選用包含一或多種選自以下一組的試劑的一種溶液進行氯己定(二葡糖酸鹽，二醋酸鹽)，聚乙烯亞胺，N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷，乳鏈菌肽單獨或與EDTA組合。
所述透化劑優選使用濃度(重量/體積)在0.0001％(重量/體積)至0.1％(重量/體積)的氯己定，濃度在5μg/ml至120μg/ml之間的聚乙烯亞胺，濃度在0.1％(重量/體積)至0.5％(重量/體積)之間的N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷，及濃度在0.1μg/mL至0.5μg/mL之間的乳鏈菌肽單獨或者與濃度在1mM至10mM之間的EDTA組合。
本發明的方法可用於濃縮並檢測血液製品的眾多汙染微生物，其中可以列舉出的有需氧菌和厭氧菌，黴菌，酵母，活和/或死細菌孢子。
本發明方法中採用的第一個過濾器的孔徑優選在2μm至20μm之間。
本發明方法中採用的第二個過濾器的孔徑優選在0.2μm至2μm之間。
本發明方法的檢測汙染微生物的步驟e)優選在一個密閉的裝置中進行。
最優選地，能根據本發明方法濃縮的汙染微生物選自需氧菌和厭氧菌，黴菌，酵母及活和/或死細菌孢子，第一個過濾器的孔徑在2μm至20μm之間，第二個過濾器的孔徑在0.2μm至2μm之間。
本發明還涉及能用於本發明檢測致病微生物的方法中的一種裝置，以濃縮及標記可能存在於包含血細胞的血液製品中的汙染微生物，所述裝置包括-第一個不透水的無菌罐(1)，其含有至少一種血細胞聚集劑，還可含有至少一種用於標記致病微生物的試劑；-第二個不透水的無菌罐(2)，其含有至少一種血細胞裂解劑，還可含有至少一種用於標記致病微生物的試劑；-第一個過濾器(3)，置於第一個和第二個罐之間並能保留在所述第一個罐中形成的聚集物；-第二個過濾器(4)，置於第二個罐的下遊並能保留可能的汙染的致病微生物；-不透水的無菌連接裝置(5)，置於第一個罐(1)和第一個過濾器(3)之間，第一個過濾器(3)和第二個罐(2)之間，及第二個罐(2)和第二個過濾器(4)之間。
根據優選的實施方案，本發明的裝置包括不透水的無菌連接裝置(6)以將含有血液製品的袋子與第一個無菌罐(1)連接。
將含有血液製品的袋子與第一個無菌罐連接的不透水的無菌連接裝置(6)優選裝備一個止回閥(7)。
根據另一個優選的實施方案，本發明的裝置包括將一定體積的血液製品直接從所述製品的貯存袋中取樣入所述第一個罐(1)中的裝置。
本發明的第一個不透水的無菌罐(1)優選裝備一個樣品抽吸系統(8)，所述抽吸系統優選是一個活塞(piston)。
根據另一個優選的實施方案，本發明裝置的第二個過濾器(4)封裝於一個由兩部分組成的膜支持物中，所述兩部分可以分開以取出所述過濾器。
本發明的裝置優選是密閉的及無菌的。
本發明的其它優勢和特徵通過以下實施例及附圖將更顯而易見，其中-
圖1示出在將血小板濃縮物與不同濃度的凝血酶接觸之後的血小板計數；-圖2示出兩個血小板樣品在存在ADP的情況下聚集後的血小板計數；-圖3示出在存在CD9抗體(克隆SN4)的情況下4個血小板樣品的血小板計數；-圖4示出在3ml血小板濃縮物中使用增加劑量的抗體CD9(克隆6B1)的血小板計數結果；-圖5示出在存在增加濃度的抗體CD9(克隆SN4)的情況下獲得的劑量應答曲線；-圖6示出對3個紅細胞濃縮物樣品使用濃度為200μg/ml的Phaseolus vulgaris凝集素後的紅細胞凝集情況；-圖7示出裂解溶液對從純培養物中回收的不同致病微生物的作用；-圖8示出裂解溶液對兩個血小板的血小板數的作用；-圖9示出裂解對紅細胞濃縮物的兩個不同樣品的紅細胞計數的作用；-圖10示出使用聚乙烯亞胺(PEI)作為透化劑以提高標記通透性，在血小板樣品內大腸桿菌的計數；-圖11示出裂解溶液中N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷的濃度對純細菌培養物的作用；
-圖12示出本發明的用於濃縮致病微生物的裝置的一個特定實施方案，包括-第一個不透水的無菌罐(1)；-第二個不透水的無菌罐(2)；-置於第一個罐(1)和第二個罐(2)之間的第一個無菌過濾器(3)；-置於第二個罐(2)下遊的第二個無菌過濾器(4)；-不透水的無菌連接裝置(5)，它們置於第一個罐(1)和第一個過濾器(3)之間，第一個過濾器(3)和第二個罐(2)之間，及第二個罐(2)和第二個過濾器(4)之間；-用於將含有血液製品的袋子與第一個罐(1)連接的不透水的無菌連接裝置(6)；-置於將含有血液製品的袋子與第一個罐(1)連接的連接裝置(6)中的止回閥(7)；-樣品抽吸系統(8)。
實驗結果I.通過聚集步驟濃縮致病微生物I.1血小板聚集實施例1.用強激動劑凝血酶聚集凝血酶是一種血小板聚集的強激動劑。
在由本申請人在完成本發明所進行的研究中，製備如下一些凝血酶溶液(參考T8885 Sigma)當以10IU/試驗的比率使用時，濃度為100IU/ml，當以1IU/試驗的比率使用時，是稀釋溶液形式(100μl凝血酶母液加入900μl的PBS緩衝液)。
通過凝血酶介導的血小板聚集包括以下步驟-向試管中160μl的血小板濃縮物中加入20μl的PBS緩衝液和20μl凝血酶；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-向所述試管中加入800μl的PBS緩衝液；-將試管內容物在孔徑為11μm的過濾器上過濾；
-從濾液中產生1/20至1/10系列稀釋液；-將100ml的每一濾液稀釋液在CB04膜上過濾；-進行酯酶標記；-計數可能保留在所述膜上的血小板。
下表1示出獲得的結果並示出使用兩種不同濃度的凝血酶獲得的血小板聚集物數目。圖1以圖形形式例證了這些結果。
表1
實施例2在存在致病微生物的情況下使用凝血酶的血小板聚集情況進行本實驗研究以評估存在凝血酶的情況下致病微生物的聚集情況，包括以下步驟-將大腸桿菌的低溫珠(cryobead)導入含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；-向160μl血小板濃縮物中加入20μl所述大腸桿菌懸浮液和20μl凝血酶；-將該試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-加入800μl的PBS緩衝液；-通過11μm孔徑的過濾器過濾；-進行系列稀釋1/20及1/10及1/10；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
下表2示出存在大腸桿菌的情況下，使用凝血酶聚集血小板濃縮物的情況。
表2
在加入凝血酶後幾乎立即呈現凝聚。
實施例3在存在弱激動劑ADP的情況下的血小板聚集ADP(Sigma)以在蒸餾水中200μM濃度使用。
進行實驗性研究以評估在存在ADP的情況下血小板的聚集，所述研究包括以下步驟-將400μl血小板濃縮物導入一個試管中，向其中加入50μl的PBS緩衝液和50μl的ADP；-試管在周圍溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-以1/20和1/10和1/10進行連續稀釋；-將100μl的樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
圖1示出的結果示出在存在ADP的情況下，血小板的濃度降低大約50％-90％。
實施例4在致病微生物存在下使用ADP聚集血小板在存在ADP的情況下聚集血小板包括以下步驟-將Staphylococcus epidermidis的低溫珠導入具有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；
-向400μl血小板濃縮物中加入50μl的所述Staph.epidermidis懸浮液及50μl的ADP；-將試管在周圍溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；-以1/20和1/10和1/10進行連續稀釋；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
將致病微生物以高濃度接種以增加可能的誘捕作用。將ADP以濃度為10μM加入血小板中及細菌中。
表3
上表3示出的結果表明在聚集步驟後回收74％的細菌。
實施例5a在存在CD9抗體的情況下聚集血小板已知CD9抗體誘導血小板激活及隨後的聚集。使用兩個CD9克隆進行所述實驗，所述克隆即克隆SN4(Ancel，ref.156-020，濃度100μg/ml)和克隆6B1(Hemosystem)。
使用這些CD9抗體進行的選擇性聚集方法包括以下步驟-向400μl血小板濃縮物中加入50μl的PBS緩衝液和50μl的CD9抗體；-將試管在周圍溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；
-以1/20和1/10和及1/10進行連續稀釋；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
在存在血小板的情況下使用的CD9抗體(克隆SN4)終濃度為10μg/ml。
圖2示出了在存在CD9抗體(克隆SN4)的情況下獲得的血小板聚集。
建立劑量應答曲線以評估血小板凝集所需的抗體CD9最佳濃度。
方法-向置於一些試管中的400μl血小板濃縮物中加入不同稀釋度的抗體，使抗體CD9的終濃度為0-20μl/ml；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；-以1/10進行4次連續稀釋；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
圖3和5分別示出在存在增加劑量的抗體CD9(克隆SN4)的情況下聚集的血小板的計數結果及從中獲得的劑量應答曲線。
使用分析儀對殘餘的血小板進行計數。
聚集是劑量依賴性的。為增加聚集作用，將CD9的濃度儘可能地提高。然而，為檢測細菌加以折中，確定通過使用濃度為大約10μg/ml的抗體CD9可以使血小板濃度降低1-2log。
實施例5b建立劑量應答曲線以評估血小板聚集所需的抗體CD9(克隆6B 1)的最佳濃度。
方法-向置於一些試管中的3mL血小板濃縮物中加入不同稀釋度的抗體CD9，使之終濃度為2.5μg/mL-40μg/mL；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌15分鐘；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；-如上述進行血小板計數。
圖4示出在存在增加劑量的抗體CD9(克隆6B1)的情況下聚集的血小板的計數結果。
實施例6在細菌存在下使用CD9抗體的血小板聚集方法-將Staphylococcus epidermidis的低溫珠導入含有胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；-向置於試管中的400μl血小板濃縮物加入50μl的所述Staphylococcus epidermidis懸浮液及50μl的CD9；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；-以1/10進行四次連續稀釋；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
下表4示出在細菌存在下使用CD9聚集血小板的情況。
表4
這些結果示出Staphylococcus epidermidis被顯著回收。大腸桿菌計數降低36％。
I.2紅細胞的凝集凝集素是非免疫起源的糖蛋白，其凝集細胞和/或沉澱碳水化合物複合物。這些分子易於與特異性碳水化合物結合在本發明這些實驗研究中使用兩種凝集素-Phaseolus vulgaris PHA-E-Vicia sativa實施例1凝集素對紅細胞的凝集作用使用Phaseolus vulgaris PHA-E凝集素(Sigma)，濃度為於PBS中2mg/ml。
Vicia sativa凝集素(Sigma)使用濃度為1mg/ml。
對這兩種凝集素的快速評估表明Vicia sativa無紅細胞凝集作用。相反，Phaseolus vulgaris誘導快速有效的凝集。
方法-將400μl紅細胞置於試管中，向其中加入50μl的PBS及50μl的Phaseolus vulgaris；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾；
-以1/10進行四次連續稀釋；-用抗血型糖蛋白PE抗體進行標記；-進行檢測。
圖6示出在Phaseolus vulgaris存在下獲得的紅細胞凝集情況。
在這個實驗中使用的Phaseolus vulgaris濃度為200μg/ml。
我們可以見到在存在Phaseolus vulgaris情況下，紅細胞的濃度可重複地降低兩個log。
實施例2在細菌存在下紅細胞的凝集初步測試示出Phaseolus凝集素和細菌之間無相互作用。
方法-將大腸桿菌的低溫珠導入含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；-將400μl的PBS，50μl的大腸桿菌(純培養物)和50μl的Phaseolus vulgaris在試管中混合；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-加入500μl的PBS緩衝液；-在5-μm過濾器上進行過濾；-以1/10進行四次連續稀釋；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶進行標記；-進行檢測。
使用濃度為200μg/ml的Phaseolus vulgaris獲得的結果示於下表5。
表5
這些結果示出在凝集步驟之後檢測到大約91％的細菌，而且在此凝集步驟之後，紅細胞濃度降低兩個log，而大腸桿菌仍以顯著被回收。
II.通過裂解步驟濃縮致病微生物在本發明中，本申請人對不同的能消除血細胞而不影響可能存在於分析樣品中的細菌濃度的選擇性裂解方法進行了評估。
在幾次初步研究之後，本申請人觀測到某些細菌對去汙劑如Triton X100有抗性，並確定了細菌回收百分率最佳所對應的去汙劑最佳濃度。
實施例1裂解溶液的配方對純細菌培養物的作用方法-將菌株保存在含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；-在PBS中連續稀釋(1/10)直至10-5；-將1ml的最後的稀釋液用9ml裂解溶液處理15分鐘，所述裂解溶液具有0.01％(重量/體積)的皂苷，0.1％(重量/體積)的Tween和0.001％(重量/體積)的Triton X 100；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-根據附件1所示用酯酶進行標記；-進行檢測。
這些不同試驗的結果示於下表6，其中表示了獲得的不同細菌回收百分率。
表6
這些結果示圖7。
大多數菌株不受裂解溶液的影響回收百分率與預先確定的預測結果一致，除了Ps.Aeruginosa和Bacillus cereus之外回收百分率均在85-115％之間。
實施例2a裂解溶液配方對接種於血小板中的細菌的作用將兩個菌株在血小板濃縮物中適應生長，以模擬汙染。
方法-將菌株Bacillus cereus和Staph.Aureus接種於50ml試管中的血小板中，濃度為106個細胞/20ml血小板；-將這些50-ml試管在22℃在血小板溫箱中保持幾天；-將1ml接種的血小板用9ml裂解溶液稀釋；-在周圍環境溫度裂解15分鐘；-將100μl的樣品在CB047膜上過濾；-將細菌如附件1所示用硬脂酸底物標記；-將膜用分析儀掃描。
在裂解後細菌計數結果示於下表7。
表7
將細菌以初始濃度為5×103個細胞/ml接種，並在幾天後檢測濃度為106-109個細胞/ml.
從這些實驗中可以看出在血小板中生長的細菌不受裂解溶液的影響。
實施例2b裂解溶液的配方對純細菌培養物的作用方法-將菌株保存於含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時；
-在通過酯酶標記確定細菌數後，將3000個細菌接種於3ml的PBS中；-將一些所述3ml溶液用裂解溶液(NOG 0.25％-2％)處理20分鐘；-將全部樣品在CB04膜上過濾；-在固相細胞計數儀中進行計數。
所得結果示於圖11。
實施例3裂解組合物的配方對紅細胞的作用方法-將1ml紅細胞在9ml裂解溶液或者9ml的PBS(對照)中稀釋；-在周圍環境溫度裂解15分鐘；-使用細胞計數儀分析裂解的或未裂解的樣品。
圖9示出裂解的紅細胞製品與未裂解的紅細胞製品對比的結果。
實施例4裂解組合物的配方對血小板的作用測試所述裂解溶液效力的可重複性。裂解並分析不同的血小板樣品。
方法-將1ml血小板在9ml的裂解溶液中稀釋；-在周圍環境溫度進行裂解15分鐘；-在PBS緩衝液中連續稀釋(1/10)直至10-5；-將100μl樣品在CB04膜上過濾；-將微生物用酯酶底物標記；-用分析儀掃描該膜。
圖8示出了用不同的血小板樣品獲得的裂解結果。
III.利用兩個聚集和裂解步驟濃縮致病微生物通過在兩個步驟中濃縮致病微生物而製備樣品包括1)特異性聚集或凝集血液製品的細胞，2)特異性裂解血液製品的細胞。
實施例1特異性分離血小板方法-將大腸桿菌的低溫珠導入含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，並在37℃溫育18-24小時；如下進行第一個聚集步驟-將1ml的血小板濃縮物，50μl的大腸桿菌(純培養物)和100μl的CD9在試管中混合；-將試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘。
然後進行第二個裂解步驟-在聚集後將900μl的裂解緩衝液加入100μl的濾液中；-將該混合物在周圍環境溫度保持15分鐘；-1/10連續稀釋四次；-將100μl所得樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶底物進行細菌和血小板標記(附件1)；-用分析儀計數細菌和血小板。
進行兩個步驟濃縮細菌的方法獲得的結果示於下表8。
表8
實施例2特異性分離紅細胞方法-將大腸桿菌的低溫珠導入含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中，在37℃溫育18-24小時。
如下進行凝集步驟-將1ml紅細胞，50μl的大腸桿菌(純培養物)和125μl的凝集素在試管中混合；-將該試管在周圍環境溫度手工攪拌5分鐘；-在孔徑5μm的過濾器上進行過濾。
然後進行第二個裂解步驟-在凝集後將900μl裂解緩衝液加入100μl濾液中；-將該混合物在周圍環境溫度保持15分鐘；-1/10連續稀釋四次；-將100μl所得樣品在CB04膜上過濾；-用酯酶底物標記細菌及用抗血型糖蛋白PE抗體標記紅細胞(附件2)；-用分析儀計數細菌和紅細胞。
下表9示出在用凝集素凝集紅細胞及隨後的裂解步驟之後，進行細菌計數獲得的結果。
表9
在凝集後，紅細胞濃度降低1.5log。
在這兩個步驟後，68％的細菌被回收。
IV.標記試劑實施例1.酯酶底物ChemChrome V6標記溶液根據如下方案可以從酯酶底物中製備並用於本發明的檢測方法中a)製備-10μl酯酶底物ChemChrome V6/ml ChemSol B16緩衝液(500μl標記溶液/膜)；-將這一溶液在4℃避光貯存最多4小時。
b)使用-將一種標記緩衝液導入直徑33-mm的培養皿中；-將500μl標記溶液分散於該緩衝液中；-將CB04膜置於過濾梯度上。過濾100μl待分析的樣品；-將該膜置於緩衝液；-在37℃溫育15分鐘。
實施例2標記的抗體因此，包含標記的抗體的一種標記溶液根據以下方案可用於本發明檢測方法中-收集90μl的樣品稀釋液；-加入10μl的抗血型糖蛋白PE抗體；
-在周圍環境溫度旋動避光溫育15分鐘；-加入900μl的PBS緩衝液；-將CB04膜置於過濾梯度；-真空過濾100μl待分析的溶液；-在分析儀中分析膜，將分析儀的第一和第三個電纜顛倒(inversant les cables primaire et tertiaire de l＇Analyseur)。
實施例3評價加入細菌透化劑對標記通透性的改良方法-將菌株保存於含有9ml胰化蛋白腖大豆肉湯的試管中並在37℃溫育18-24小時；-在通過酯酶標記確定細胞計數後，將3000個細菌接種於3ml的血小板濃縮物中；-將該3ml溶液用1ml的聚集溶液(CD9克隆6B130μg/ml，Picogreen 1/2000，PEI 40μg/mL於80μg/mL)處理40分鐘；-將樣品通過孔徑5μm的過濾器過濾；-將樣品在裂解溶液中(氯己定5×10-3％，NOG 0.5％，乳鏈菌肽0.2μg/ml，EDTA 5mM)溫育20分鐘；-將全部樣品在CB04膜上過濾；-利用血細胞計數儀在固相進行計數。
V.結論達到製備致病微生物的最佳條件的技術選項通過這些實驗研究而限定。
關於血小板濃縮物，這些技術選項包括1)使用例如血小板激活物抗體如CD9的聚集步驟；2)使用去汙劑的組合如皂苷，Tween 20和Triton X 100的細胞裂解步驟。
關於紅細胞濃縮物，這些技術選項包括1)使用凝集素例如Phaseolus vulgaris的聚集步驟；
2)使用去汙劑組合如皂苷、Tween 20和Triton X 100的細胞裂解步驟。
致病微生物的標記和透化可以根據所需在聚集步驟，裂解步驟期間進行，或者在分析之前對最後的過濾器上的濃縮的微生物直接進行。
權利要求
1.濃縮可能存在於包含血細胞的血液製品中的汙染微生物的方法，其特徵在於包括以下步驟a)將所述血液製品的樣品進行血細胞聚集處理，b)將步驟a)中形成的聚集物通過將處理的樣品經過第一個過濾器而除去，所述第一個過濾器允許汙染微生物通過而不允許細胞聚集物通過，c)將步驟b)中獲得的濾液中的殘餘細胞選擇性裂解，d)通過將步驟c)的裂解物經過允許細胞碎片通過的第二個過濾器而回收汙染微生物。
2.檢測可能存在於包含血細胞的血液製品中汙染微生物的方法，其特徵在於根據權利要求1的方法的步驟a)至d)在過濾器上濃縮所述微生物，然後e)分析第二個過濾器以檢測可能保留的汙染微生物。
3.權利要求2的檢測方法，其特徵在於在聚集步驟a)或裂解步驟c)期間加入所述汙染微生物的標記試劑，或者在分析步驟e)期間直接將所述汙染微生物的標記試劑加至第二個過濾器上。
4.權利要求2或3的方法，其特徵在於包括在步驟a)，c)或e)中至少一個步驟中加入汙染微生物的透化劑。
5.權利要求4的方法，其特徵在於所述透化劑選自聚乙烯亞胺，氯己定二醋酸鹽，氯己定二葡糖酸鹽，乙二胺四乙酸(EDTA)單獨或者與乳鏈菌肽組合，去汙劑或者這些物質的混合物。
6.權利要求5的方法，其特徵在於所述去汙劑選自N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷，SDS，Tween，triton，Brij或者這些物質的混合物。
7.權利要求3-6任一項的方法，其特徵在於致病微生物的標記試劑是選自酯酶底物如ChemChrome V6，標記的抗體或者核酸標記的一種標記溶液。
8.權利要求3-7任一項的方法，其特徵在於所述標記試劑包含螢光標記或者與螢光染料或能降解底物從而產生螢光的酶偶聯的試劑。
9.權利要求8的方法，其特徵在於所述螢光通過激發雷射檢測。
10.權利要求1-9任一項的方法，其特徵在於血液製品的血細胞是血小板或紅細胞或其混合物。
11.權利要求1-10任一項的方法，其特徵在於所述血液製品包含血小板，且聚集處理步驟a)包括將所述樣品與一種聚集組合物接觸，所述聚集組合物包含選自以下一組的至少一種聚集劑-血小板抗原的特異性抗體，-血小板激活的強激動劑，選自凝血酶，TRAP(凝血酶受體激活肽)，胰蛋白酶，膠原蛋白，血栓烷A2，PAF(血小板激活因子)，離子載體A23187，免疫複合物和補體因子，-血小板激活的弱激動劑，選自ADP，腎上腺素(adrenalin)，花生四烯酸，Von Willebrand因子，5-羥色胺或腎上腺素(epinephrine)。
12.權利要求11的方法，其特徵在於聚集組合物中CD9的濃度在0.5μg/ml-50μg/ml之間，優選在5μg/ml-40μg/ml之間。
13.權利要求11的方法，其特徵在於聚集組合物中強激動劑的濃度如下-針對凝血酶型激動劑，在0.5IU/ml-100IU/ml之間，優選在1IU/ml-20IU/ml之間；-針對TRAP型激動劑，在5μM-200μM之間，優選在10μM-100μM之間；-針對胰蛋白酶型激動劑，在1nM-500nM之間，優選在10nM-300nM之間；-針對膠原蛋白型激動劑，在0.05μg/ml-50μg/ml之間，優選在1μg/ml-20μg/ml之間；-針對血栓烷A2型激動劑，在0.01μg/ml-5μg/ml之間，優選在0.1-1μg/ml之間；-針對PAF型激動劑，在0.005mg/ml-1mg/ml之間，優選在0.05-0.5mg/ml之間；-針對離子載體A23187型激動劑，在0.1μM-100μM之間，優選在1μM-20μM之間。
14.權利要求11的方法，其特徵在於聚集組合物中弱激動劑的濃度如下-針對ADP，腎上腺素(adrenalin)或腎上腺素(epinephrine)型激動劑，在0.5μM-100μM之間，優選在1μM-20μM之間；-針對花生四烯酸型激動劑，在0.001mM-10mM之間，優選在0.01mM-5mM之間；-針對Von Willebrand因子型激動劑，在0.001mg/ml-1mg/ml之間，優選在0.01mg/ml-0.5mg/ml之間；或者-針對5-羥色胺型激動劑，在0.05μM-100μM之間，優選在0.01μM-50μM之間。
15.權利要求11的方法，其特徵在於所述抗體選自抗CD，抗CD32，抗PTA1，抗D42，抗GpIIb/IIIa或抗GpIV抗體。
16.權利要求1-15任一項的方法，其特徵在於所述血液製品包括紅細胞，且聚集處理步驟a)包括將所述樣品與一種凝集組合物接觸，所述凝集組合物包含選自以下的至少一種凝集劑凝集素，聚乙烯亞胺，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，凝膠，葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。
17.權利要求16的方法，其特徵在於所述凝集素呈現紅細胞凝集活性。
18.權利要求16或17的方法，其特徵在於所述凝集素選自Phaseolus vulgaris，Vicia sativa，Vicia faba，Erythrina corallodendron，Lens culinaris，Phytolacca Americana或Triticum vulgaris的凝集素。
19.權利要求18的方法，其特徵在於凝集組合物中Phaseolusvulgaris凝集素的濃度在10μg/ml-800μg/ml之間。
20.權利要求16的方法，其特徵在於凝集組合物中聚乙烯亞胺的濃度在0.1％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間，優選在20％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
21.權利要求16的方法，其特徵在於聚乙烯吡咯烷酮(PVP)選自PVP-40或PVP-360，優選使用濃度在0.1％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間，最優選在4％(重量/體積)至20％(重量/體積)之間。
22.權利要求16的方法，其特徵在於凝集組合物中凝膠的優選使用濃度在0.5％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間，最優選在4％(重量/體積)至20％(重量/體積)之間。
23.權利要求16的方法，其特徵在於凝集組合物中葡聚糖選自Dextran 70，Dextran 100或Dextran 500，優選使用濃度在0.1％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間，最優選在4％(重量/體積)至20％(重量/體積)之間。
24.權利要求16的方法，其特徵在於聚乙二醇選自PEG8，PEG17或PEG35，優選使用濃度在0.05％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間，最優選在20％(重量/體積)至40％(重量/體積)之間。
25.前述任一權利要求的方法，其特徵在於裂解細胞步驟c)用一種裂解溶液進行，所述裂解溶液包含選自以下的一或多種去汙劑皂苷，SDS，Tween 20，Triton X100，Brij 96，Polidocanol，N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷或碳酸鈉。
26.前述任一權利要求的方法，其特徵在於所述汙染微生物是需氧菌或厭氧菌，黴菌，酵母或者活和/或死細菌孢子。
27.前述任一權利要求的方法，其特徵在於第一個過濾器的孔徑在2μm-20μm之間。
28.前述任一權利要求的方法，特徵在第二個過濾器的孔徑在0.2μm-2μm之間。
29.前述任一權利要求的方法，其特徵在於所述汙染微生物是需氧菌或厭氧菌，黴菌，酵母或者活和/或死細菌孢子，第一個過濾器的孔徑在2μm-20μm之間， 第二個過濾器的孔徑在0.2μm-2μm之間。
30.權利要求2-29任一項的方法，其特徵在於使用一種密閉的裝置進行檢測汙染微生物的步驟e)。
31.能用於權利要求1-30任一項的方法中的濃縮可能存在於包含血細胞的血液製品中汙染微生物的裝置，其特徵在於其包括-第一個不透水的無菌罐(1)，其含有至少一種血細胞聚集劑，還可含有至少一種標記致病微生物的試劑；-第二個不透水的無菌罐(2)，其含有至少一種血細胞裂解劑，還可含有至少一種標記致病微生物的試劑；-第一個過濾器(3)，其置於第一個和第二個罐之間，能保留在所述第一個罐中形成的聚集物；-第二個過濾器(4)，其置於第二個罐的下遊，能保留可能的汙染致病微生物；-不透水的無菌連接裝置(5)，置於第一個罐和第一個過濾器之間，第一個過濾器和第二個罐之間，及第二個罐和第二個過濾器之間。
32.權利要求31的裝置，其特徵在於其包括一個不透水的無菌連接裝置(6)，以將含有血液製品的袋子與第一個無菌罐連接。
33.權利要求32的裝置，其特徵在於將含有血液製品的袋子與第一個無菌罐連接的所述不透水的無菌連接裝置裝備一個止回閥(7)。
34.權利要求31或33的裝置，其特徵在於其包括直接從血液製品的貯存袋中取樣一定體積的血液製品至所述第一個罐中的裝置。
35.權利要求32或34的裝置，其特徵在於第一個無菌罐安裝了一個樣品抽吸系統(8)。
36.權利要求35的裝置，其特徵在於所述抽吸系統是一個活塞。
37.權利要求31-36任一項的裝置，其特徵在於第二個過濾器密閉在一個由兩部分組成的膜支持物中，所述兩部分可被分開以取出所述過濾器。
38.權利要求31-37任一項的裝置，其特徵在於是密閉及無菌的。
全文摘要
本發明涉及一種濃縮血液製品或其衍生物中可能存在的致病微生物以及檢測濃縮的所述微生物的方法。所述方法包括如下步驟(a)將所述血液製品的樣品進行血細胞聚集處理，(b)將步驟(a)中形成的聚集物通過將處理的樣品經過第一個過濾器而消除，所述過濾器允許汙染微生物通過但不允許細胞聚集物通過，(c)將步驟(b)中獲得的濾液中的殘餘細胞選擇性裂解，(d)通過將步驟(c)的裂解物通過第二個過濾器回收汙染微生物，從而檢測可能被捕獲的汙染微生物。
文檔編號G01N33/554GK1555418SQ02818041
公開日2004年12月15日 申請日期2002年9月13日 優先權日2001年9月13日
發明者讓－皮埃爾·埃爾梅, 伊莎貝爾·貝松－福爾, 塞巴斯蒂安·裡博, 揚·戈德弗蘭, 安妮·莫諾·德·安格萊斯, 爾 貝松-福爾, 德弗蘭, 莫諾 德 安格萊斯, 蒂安 裡博, 讓-皮埃爾 埃爾梅 申請人:海默系統公司