蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑及製備方法

2023-06-20 15:06:56

專利名稱：：蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑及製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗腫瘤藥物，更具體涉及一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，同時還涉及蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑的製備方法。該蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑可廣泛應用於肺癌、口腔表皮癌、結腸癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤的治療。
背景技術：
：1.腫瘤已成為威脅人類健康的頭號殺手腫瘤是嚴重威脅人類生命的常見病和多發病之一，其發病率逐年增高。據世界衛生組織調査表明，全世界每年新發現癌症患者近1000萬人。每年因癌症死亡的人數近700萬人。最近統計資料表明，我國每年新發現癌症患者約2000萬人，近150萬人死於癌症。癌症的死亡人數佔總死亡數的1/5。因此防癌、治癌己成為一項迫在眉睫的艱苦任務。2.當前治療腫瘤的方法與相關藥品很多，但都存在一定的局限性治療腫瘤的傳統方法有手術切除、放療和化療。但對於許多病人，在被確診為腫瘤時，就已經失去了手術切除的機會；而放療則存在局限性和對正常組織的損傷性；化療普遍存在細胞毒性作用，特別對肝、腎、骨髓和消化系統的毒副作用非常嚴重，因此，大大制約了它們在臨床上的應用。新興的介入治療對原發灶有一定的作用，但難以對付不斷散發的轉移灶；基因治療給腫瘤患者帶來曙光，但其載體構建、載體與彈頭的交聯及其在機體分布、代謝過程中的變化等諸多問題還在探討之中。3.多糖蛋白複合物的抗腫瘤活性多糖蛋白複合物(Polysaccharide-proteinComplex)廣泛存在於動植物體內，其生理功能除了粘附和支持作用外，在細胞識別、信號傳導、調控機體免疫功能以及控制細胞的遷移、增殖、分化、代謝等方面都有十分重要的作用。近年來，從植物、動物中提取的多糖蛋白複合物類藥物的抗腫瘤活性引起了人們的廣泛關注，通過對其作用機理的研究發現多糖蛋白複合物的抗腫瘤作用主要在於其能增強機體的體液免疫和細胞免疫功能，有的能直接殺傷腫瘤細胞(F.Liuetal.,.ImmunomodulationandAnti-CancerActivityofPolysaccharide-ProteinComplexes,CurrentMedicinalChemistry,2000，7(7),715-729)。已有研究表明一些新型結構的多糖蛋白複合物在增強機體免疫和控制腫瘤細胞增殖方面具有顯著作用①從寧夏枸杞中(Zjdw"6ar&n/w)提取得到的多糖蛋白複合物(LBP)具有具有增強機體免疫功能、抗癌抑瘤的作用及抗氧化抗衰老等作用(LuGanetal.，Immunomodulationandantitumoractivitybyapolysaccharide-proteincomplexfromLyciumbarbarum.2004;4(4):563-9.)，且經研究發現其抗腫瘤作用機理是抑制原癌基因c-myc的表達(趙榮國.冬蟲夏草的藥理研究進展[J].新疆中醫藥，1992，(4):46-49);②從擔子菌綱雲芝菌絲體中提取得到的分子量在50200KD左右的雲芝多糖蛋白複合物(Polysaccharide-proteirvcomplexesofCoriolusversicolor,PSK)作為一種具有增強免疫作用的生物調節劑，在日本已被廣泛用於臨床。實驗表明，PSK不僅可以通過增強腫瘤抗原的免疫原性而促使機體對腫瘤細胞的識別和殺滅，而且體外、體內給藥均可顯著增強小鼠脾淋巴細胞的轉化和功能，並促進其分泌IL-2和IFN-Y等免疫活性因子，並能增強荷瘤小鼠和正常小鼠脾淋巴細胞產生抗體的能力(JianCuietal.,polysaccharide-proteincomplexofCoriolusversicolor:physiologicalactivity,uses,andproduction.2003;21(2):109-22.)。③從螺旋藻中提取得到的多糖蛋白複合物(spirulinaplatensispolysaccharide-proteincomplex,SPP)可提高不同病期白血病患者NK細胞活性，但不影響正常人NK細胞活性。另外，體外研究表明，SPP能抑制B37乳癌細胞和K562白血病細胞；體內研究表明，SPP能抑制H22肝癌細胞、ECA腫瘤細胞以及S咖癌細胞，同時發現SPP能增加脾和胸腺的重量，提高活化的NK細胞的活性和數量以及激活荷瘤小鼠脾淋巴細胞產生IL-2，對化療導致的白細胞下降也有治療作用(曲顯俊，等.螺旋藻多糖抗癌作用的實驗研究[J].中國海洋藥物，2000，19(3):10-14)。④從海洋軟體動物和傳統中藥土鱉蟲中提取的多糖蛋白複合物均具有顯著的抗腫瘤活性(顧謙群等.扇貝糖蛋白的化學組成與抗腫瘤活性的研究[J].中國海洋藥物，1998(3):23—-26;韓雅莉，謝昆.土鱉蟲糖5蛋白的提取及抗腫瘤活性初步研究.汕頭大學學報(自然科學版)，2006(11)，21(4):46-50)。⑤此外，海綿體多糖蛋白複合物，4-硒硫酸酯多糖蛋白複合物(SE-CARRA)，人參多糖蛋白複合物(Ginsengpolysaccharide-proteincomplex,GP)也有抗腫瘤活性。戴氏蟲草多糖蛋白複合物(Cordycepstaiipolysaccharide-proteincomplex,CDP)能引起T、NK以及單核-巨嗜細胞的活化、增殖，同時對小鼠T淋巴細胞分泌IL-2和TNFP具有促進作用。鮑魚多糖(Abalonepolysaccharide-proteincomplex,AP)對裸鼠移植人鼻咽癌細胞具有明顯的抑制作用，能明顯抑制人鼻咽癌的生長，誘導腫瘤細胞凋亡和壞死。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種蜈蚣多糖蛋白複合物抗腫瘤膠囊劑。配方合理，用於惡性腫瘤的治療，具有給藥方便，抗腫瘤活性強，毒副作用小以及減毒增效等優點。本發明的另一個目的是在於提供了一種蜈蚣多糖蛋白複合物抗腫瘤膠囊劑的製備方法，方法易行，操作簡便，原料來源廣泛。本發明以蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)為有效成份加以藥學上可接受的輔料製成抗腫瘤膠囊劑，其中蜈蚣多糖蛋白複合物在膠囊中的重量百分比可以是0.130%，優選0.515%，最優選110%;其在每粒膠囊中的含量範圍是0.1lOOmg，優選l50mg,最優選530mg;可藥用輔料的重量百分比分別是7099.9%,優選7599.5%，最優選9097%，具體如下範圍蜈蚣多糖蛋白複合物0.1-30%，填充劑60-95%，抗氧化劑2-4%，崩解劑2-4°/。，潤滑劑1-2%優選範圍蜈蚣多糖蛋白複合物0.5-15%,填充劑70-92%，抗氧化劑2.5-3.5%，崩解劑2.5-3.5%，潤滑劑1.2-1.8%最優選範圍蜈蚣多糖蛋白複合物3-10%,填充劑80-90%,抗氧化劑2.8-3.2%,崩解劑2.8-3.2%，潤滑劑1.5-1.7%其製備步驟是①首先向蜈蚣多糖蛋白複合物中分別加入填充劑，崩解劑及抗氧化劑後加入溼潤劑混勻製成軟材；②再將混勻的軟材過50-200目尼龍篩制粒，7080°C烘乾30分鐘，過50-200目鐵篩整粒；③最後加入潤滑劑灌裝成膠囊。所述的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)是從節肢動物蜈蚣全蟲中提取、分離、純化得到的，其製備步驟為①以少棘蜈蚣作為原料母體，清洗35次，烘乾24小時，烘乾溫度控制在6080'C;②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過50200目篩得蜈蚣粉；③將第2步驟中的蜈蚣粉用5倍體積蒸餾水抽提l3小時，溫度控制在8090'C，紗布過濾(得一份提取液)，取殘渣再用4倍體積蒸餾水重複提取三次(得三份提取液)，合併以上四份提取液，2500r/min離心2030分鐘，獲取上清；④將第3歩驟中的上清減壓0.1Mpa後濃縮，溫度控制在在5070°C，加入5倍體積95%乙醇，於4"靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心IO分鐘，收集沉澱；⑤將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4'C緩慢加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟的操作，收集60%飽和度的沉澱物;⑥將第5步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解後，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸餾水平衡，用0.050.25mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-45-15°C，加熱溫度控制在2040'C，乾燥812小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品。且經實驗證明，蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑的有效成分，即所述的蜈蚣多糖蛋白複合物具有明顯的調節機體免疫功能、抑制腫瘤生長、與化療藥合用減輕其毒副作用和增強抑瘤效果的協同作用①蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和胸腺指數，恢復荷瘤小鼠低下的DTH反應，通過影響T細胞數量、增強NK細胞毒性和IL-2的活性，起到調節機體免疫功能的作用。②蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可劑量依賴性的抑制S咖肉瘤株，三個劑量組的抑瘤率分別為56.6%、49.6%、35.7%，對艾氏腹水癌小鼠的生存期有延長作用；同時與低於治療劑量的環磷醯胺合用時，可產生抑瘤的協同作用，提高抑瘤率。(D蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)對環磷醯胺造成的大鼠血小板減少和骨髓有核細胞數量減少具有保護作用，提示其與化療藥聯合應用，具有減毒作用。所述的填充劑可以是澱粉、糊精、糖粉、預膠化澱粉、乳糖、葡萄糖、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣或其他藥學上可接受的填充劑的其中一種或其任意混合物;所述的抗氧化劑可以是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、維生素E或其他藥學上可接受的抗氧化劑的其中一種或其任意混合物；所述的崩解劑可以是交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、羧甲基澱粉鈉、羥丙基澱粉、酸酐、碳酸鈉或其他藥學上可接受的崩解劑的其中一種或其任意混合物；所述的潤滑劑可以是硬脂酸鎂、滑石粉、苯甲酸鈉、微粉矽膠的其任意一種。本發明的優點1.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)抗腫瘤膠囊劑可通過增強巨噬細胞吞噬能力、影響T細胞數量、增強NK細胞毒性和IL-2的活性等作用提高機體的免疫功能。2.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)抗腫瘤膠囊劑可直接殺傷腫瘤細胞，產生抑瘤效應。3.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)抗腫瘤膠囊劑與化療藥物聯合應用具有減毒增效作用。4.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)抗腫瘤膠囊劑沒有化療和放療的劇烈毒副作用。5.本發明採用常規給藥劑型，技術成熟，生產工藝簡單易行。6.本發明採用常規給藥方式，給藥方便，無痛苦。具體實施方式下面將描述本發明的實施例，但本發明的內容完全不限於此。tableseeoriginaldocumentpage9其製備步驟是:①首先向蜈蚣多糖蛋白複合物中分別加入填充劑，崩解劑及抗氧化劑後加入溼潤劑混勻製成軟材；②再將混勻的軟材過50-200目尼龍篩制粒，7080°C烘乾30分鐘，過50-200目鐵篩整粒；③最後加入潤滑劑灌裝成膠囊。所述的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)是從節肢動物蜈蚣全蟲中提取、分離、純化得到的，其製備步驟為①以少棘蜈蚣作為原料母體，清洗35次，烘乾24小時，烘乾溫度控制在6080°C;②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過50200目篩得蜈蚣粉；③將第2步驟中的蜈蚣粉用5倍體積蒸餾水抽提l3小時，溫度控制在80或83或85或88或90°C,紗布過濾得一份提取液，取殘渣再用4倍體積蒸餾水重複提取三次得三份提取液，合併四份提取液，2500r/min離心2030分鐘，獲取上清；將第3步驟中的上清減壓濃縮，溫度控制在在50或52或55或61或64或67或70°C，加入5倍體積95%乙醇，於4'C靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心10分鐘，收集沉澱；⑤將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4。C緩慢加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟的操作，收集60%飽和度的沉澱物;⑥將第5步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解後，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸餾水平衡，用0.050.25mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮;⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-45或-42或-39或-36或-32或-28或-23或-19或-15°C，加熱溫度控制在20或25或30或36或40°C，乾燥8或9或10或11或12小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品。所述的填充劑可以是澱粉、糊精、糖粉、預膠化澱粉、乳糖、葡萄糖、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣或其他藥學上可接受的填充劑的其中一種或其任意混合物；所述的抗氧化劑可以是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、維生素E或其他藥學上可接受的抗氧化劑的其中一種或其任意混合物；所述的崩解劑可以是交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、羧甲基澱粉鈉、羥丙基澱粉、酸酐、碳酸鈉或其他藥學上可接受的崩解劑的其中一種或其任意混合物；所述的潤滑劑可以是硬脂酸鎂、滑石粉、苯甲酸鈉、微粉矽膠的其任意一種。藥效學實驗為了公開本發明的實質，本發明從免疫調節、抑瘤作用、減毒增效等三個方面對蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)抗腫瘤製劑進行藥效學研究(一)實驗材料1、藥品少棘蜈蚣(Sco/o/eWraSwZwp/m》^Mw"7a似Z.《oc/0成體由湖北當陽市養殖場提供，體重3g左右，由中國科學院武漢植物研究所江明喜研究員鑑定。呋喃氟脲嘧啶(FT207)由濟南製藥廠生產，批號031003;環磷醯胺由江西恆瑞醫藥股份有限公司生產，批號21156—21160;複方阿膠漿由山東阿膠股份有限公司生產，批號040672。2、動物昆明種小鼠、BALB/c小鼠、SD種大鼠，雌雄兼用，由武漢大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(鄂)2003—0004。Sw瘤株、艾氏腹水癌細胞，A549肺癌細胞、口腔表皮癌KB細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞株由中國醫科院藥物所引進、傳代；NK敏感細胞Yac-1株和IL-2依賴株CTLL細胞引自武漢大學典型生物保藏中心。4、試劑MTT(Sigma);IL-2由中國軍事醫學科學院提供，效價400IU/Amp;CD4(L3T4抗體)和CD8(Lyt-2抗體)試劑盒，由北京醫科大學免疫教研室提供；5、儀器450型酶標儀由美國BioRad生產；ZT-N型多頭細胞收集器由浙江東浦醫療器械廠生產；EG2101型液體閃爍計數器，國產；螢光顯微鏡(Olimpus)。(二)實驗方法與結果1.免疫試驗(1)ConA/LPS刺激荷瘤小鼠脾淋巴細胞體外增殖實驗分別製備NS組和50mg.kg"、lOOmg.kg-1、200mg.kg"SPPC給藥組的荷瘤小鼠脾淋巴細胞。頸椎脫臼處死以上各實驗組荷瘤小鼠(每組5隻)，75%乙醇浸泡l-2分鐘，在無菌操作臺內迅速取出脾臟，置於盛有5-10ml冷Hanks液的平皿內，平皿內預先放置一塊略大於平皿的孔徑為400目的尼龍篩網。用無菌針芯輕捻脾組織，使單個脾細胞濾過篩網進入平皿內。吸取冷Hanks衝洗篩網，將細胞懸液吸入離心管。4。C離心(1500r/min,5min),棄上清，加入適量的Tris-NH4Cl(0.16mol丄'1，pH7.2)以溶解紅細胞，吹打均勻，靜置l-2分鐘。再次離心並用冷Hanks液懸浮並離心洗滌細胞2次，棄上清，用完全RPMI-1640培養基懸浮細胞，作細胞計數，調細胞濃度至1Xl(^mL'1。取96孔平底細胞培養板，每組每孔加入IX106個荷瘤小鼠脾淋巴細胞及終濃度為2.5嗎.ml"的ConA或5嗎.ml"的LPS共孵育，各組處理均作6個平行孔。在5%02、37°C水蒸氣飽和的二氧化碳培養箱內培養68小時，培養結束後用MTT法檢測細胞增殖。表l.SPPC對荷瘤小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響(5±s,/7=10)組別齊懂(mg/kg)淋巴細胞增殖(A57。)正常對照組一0.43±0.01荷瘤對照組—12.50±0.17AASPPC低劑量組5SPPC中劑量組10SPPC高劑量組20與正常對照組比較，AAP<0.01;與荷瘤對照組比較，''P<0.01由表l結果可見，荷瘤對照組的脾淋巴細胞體外增殖明顯低於正常對照組，表明荷瘤組小鼠的脾淋巴細胞功能低下，而SPPC大、中、小三個劑量組的淋巴細胞增殖均明顯高於荷瘤對照組，說明SPPC可明顯刺激荷瘤小鼠的脾淋巴細胞體外增殖。(2)對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響取體重2024g健康小鼠，參照文獻《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》方法進行實驗，計算巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數，結果見表2。由表2結果可見，荷瘤對照組的腹腔巨噬細胞吞噬率與吞噬指數均明顯低於正常對照組，表明荷瘤組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能低下，而SPPC大、中、小三個劑量組的上述指標均明顯高於荷瘤對照組，說明SPPC可明顯提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能。表2.蜈蚣SPPC對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響^±5,77=10)tableseeoriginaldocumentpage12與正常對照組比較，AAP<0.01;與荷瘤對照組比較，"P<0.01吞噬百分率=[吞噬CRBC的吞噬細胞數/200個巨噬細胞數(吞與未吞)]X100%吞噬指數=被吞噬的CRBC數/200個巨噬細胞(3)對荷瘤小鼠遲發性變態反應的影響18.94±2.2222.81±1.9326.93±2.26取體重1921g健康小鼠，參照文獻《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》第135頁方法進行實驗，結果見表3。表3結果顯示，荷瘤對照組的DTH值明顯低於正常對照組，與未致敏的荷瘤空白組基本相同；而SPPC三個劑量組的DTH值則明顯高於荷瘤對照組，與正常對照組比較無顯著性差異；表明SPPC可提高荷瘤小鼠的DTH反應，使其受損的免疫功能恢復正常。表3.SPPC對荷瘤小鼠DTH反應的影響(3f±S,/7=10)tableseeoriginaldocumentpage13與正常對照組比較，AAP<0.01;與荷瘤對照組比較，'P<0.05，''P<0.01(4)對荷瘤小鼠免疫器官重量的影響取lS22g昆明種小鼠，無菌條件下抽取傳代7天的S18Q肉瘤細胞混懸液，用生理鹽水稀釋(約相當於1Xl(^個瘤細胞/ml)，與小鼠右腋皮膚碘酒消毒後，皮下注入瘤細胞稀釋懸液0.2ml/只；24小時後隨機分為模型對照組、FT207陽性對照組(0.15g/kg)和SPPC大、中、小(20、10、5mg/kg)三個劑量組，除模型對照組灌胃生理鹽水外，其餘各組動物每日灌胃給藥一次，連續9天(灌胃體積均為0.25ml/10g)，於末次給藥後2日，脫頸椎處死小鼠，取胸腺、脾臟，稱重，計算胸腺指數與脾指數，結果見表4。表4結果表明，化療藥FT207可使荷瘤小鼠的胸腺和脾指數明顯降低，而蜈蚣PSPC則可明顯提高荷瘤小鼠的胸腺和脾指數。表4.SPPC對荷瘤小鼠免疫器官重量的影響tableseeoriginaldocumentpage14(5)對荷瘤小鼠IL-2活性的影響結果見表5。SPPC可使荷瘤小鼠的IL-2水平明顯升高，對調節荷瘤小鼠機體免疫功能，抑制腫瘤有積極的作用。表5.SPPC對荷瘤小鼠IL-2水平的影響tableseeoriginaldocumentpage14與空白對照組比較，AP<0.05;與荷瘤對照組比較，''P<0.01(6)對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響結果見表6。荷瘤對照組的NK細胞活性明顯低於正常對照組，而SPPC大、中、小三個劑量組的上述指標均明顯高於荷瘤對照組，NK細胞活性的增強，表明對抑制腫瘤生長發揮了積極作用。表6.SPPC對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響(5±S)組別劑量動物數(只)NK細胞活性(mg/kg)開始結束(%)空白對照組一101024.58±4.85荷瘤對照組101015.66±4.39厶FT207組0.15101032.68±10.55SPPC低劑量組510946.75土11.28'"SPPC中劑量組1010952.69±9.88''SPPC高劑量組2010964.79±10.78"與空白對照組比較，AP<0.05;與荷瘤對照組比較，''P<0.01(7)對荷瘤小鼠T細胞亞群的影響在T淋巴細胞靜活化期，其細胞膜表面出現的抗原性不同的糖蛋白分子，其作用也不同。存在於小鼠成熟的殺傷(TC)/抑制(TS)T細胞表面的Lyt-2抗原，稱為CDs分子，它能增強抗原識別受體(TCR)對外來抗原和自身MHCI類抗原的結合，以增強識別；存在於小鼠成熟的殺傷/抑制T細胞表面的L3T4分子稱為CD4分子，它能增強抗原識別受體(TCR)對外來抗原和自身MHCII類抗原的結合。檢測T細胞亞群中的CD4、CDs表面分子的表達與比例關係，有助於了解藥物的抗腫瘤活性與免疫功能之間的關係，因此，我們進行了SPPC對純系荷瘤小鼠(S^)的T細胞亞群影響的試驗，結果見表710。表7結果顯示，各荷瘤組小鼠CD4亞群和CD8亞群與正常組比較均有顯著性差異，說明接種腫瘤後，對動物的輔助性T細胞是有影響的。SPPC各給藥組對CD4的變化影響不大，而SPPC各劑量組與荷瘤對照組比較，CDs有顯著性差異，說明SPPC對荷瘤動物的細胞毒性T細胞CD8亞群有明顯影響；由於荷瘤小鼠體內受到瘤細胞的侵蝕，其正常的T細胞亞群比例因受到多方面因素的影響而失去平衡，而給藥後CD4/CDs恢復較明顯，SPPC大、中、小劑量組與荷瘤對照組比較均有顯著性差異。15表7.SPPC對T細胞亞群CD4.CD8、CD4/CD8的影響U±&"=10)tableseeoriginaldocumentpage16與空白對照組比較，##P<0.01;與荷瘤對照組比較，*P<0.05，**P<0.01上述試驗結果顯示，SPPC具有較好的機體免疫調節作用；通過增強荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、調節機體免疫功能、影響T細胞亞群的活性、提高NK細胞活性及誘導IL-2活性的增強，對抑制腫瘤生長發揮了積極的作用。2.抑瘤試驗(1)對多種癌細胞系的體外抑制作用用SPPC50、100、200mg.kg"處理小鼠，製備含藥血清；用0.25%胰酶消化、傳代細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度至2X104.ml'1，96孔培養板每孔加入100nl，37°C，5XC02孵育24h，棄培養液，加入10%過濾除菌的含藥血清，37°C,5XC02共孵育18h，釆用MTT法檢測細胞增殖，結果見表8。表8.SPPC對不同癌細胞株細胞生長的影響(3f±&"=10)tableseeoriginaldocumentpage16與空白對照組比較，**P<0.01結果，與空白對照組比較，SPPC大、中、小三個劑量組對人A549肺癌細胞、口腔表皮癌KB細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞的生長均有明顯的抑制作用，且存在一定的量效關係(表8)。(2)對S180肉瘤株的抑制作用取腫瘤細胞(荷瘤小鼠腹腔S18肉瘤細胞2X106接種於雄性健康BALB/c裸鼠腋下，隨機分組。於接種後第2天開始灌胃給藥，1次/天,劑量分別為5mg.kg"、lOmg.kg—1、20mg.kg"SPPC，對照給予相應體積的生理鹽水，連續灌胃10天，於試驗結束時，摘眼球取血，摘瘤、稱瘤重。結果見表9。與荷瘤對照組比較，SPPC大、中劑量組對S咖瘤體生長均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為56.6%和49.6%;結果表明，SPPC對小鼠S咖瘤體生長有明顯的抑制作用，且存在一定的量效關係。表9.蜈蚣SPPC對S咖荷瘤小鼠瘤體生長的影響(i±s)tableseeoriginaldocumentpage17(3)對艾氏腹水癌小鼠生存期的影響表10結果表明SPPC大、中劑量組均延長艾氏腹水癌小鼠存活期，與荷瘤組比較有顯著性差異；SPPC小劑量組的作用不明顯。三次試驗結果均表明SPPC具有延長荷瘤小鼠生存期的作用。表10SPPC對艾氏腹水癌小鼠生存期的影響組別動物數(只)劑量(mg/kg)體重變化(g)生存時間(天)(3f±>)T/C生理鹽水組10—3.8214.5±0.9.—tableseeoriginaldocumentpage183.減毒增效試驗(1)減毒試驗檢驗結果見表]113。表ll結果表明，大鼠注射環磷醯胺後，可使骨髓有核細胞數下降48.9%，而SPPC大、中劑量給藥組可明顯改善環磷醯胺引起的大鼠骨髓有核細胞數降低。說明大、中劑量的SPPC對骨髓有核細胞具有保護作用，對化療藥造成的骨髓造血功能抑制具有一定的減毒效果。表11SPPC對環磷醯胺大鼠骨髓有核細胞數的影響(3f±a/7=10)tableseeoriginaldocumentpage18與正常對照組比較，△P<0.05;與模型對照組比較，*P<0.05表12結果表明，大鼠注射環磷醯胺後使白細胞和血小板數顯著下降；蜈蚣SPPC大、中、小劑量組的血小板數降低幅度均顯著減小，其檢測值明顯高於模型對照組。提示SPPC大、中、小劑量對環磷醯胺造成的血小板減少均有較好的對抗作用，可以在一定程度上減輕化療藥的毒副作用。表12環磷醯胺大鼠試驗後血液學指標檢測值(3f±&/7=10)組別劑量WBCHbRBCPLC(mg/kg)(X109/L)(g/L)(X1012/L)(X109/L)正常對照組—10.39±5.31134.60±5.108.40±3.33617.20±47.53模型對照組_4.13±2.02AA121,20±8,127.00±0.72289.60土52.14AASPPC組4.98±2.6118.50±6,347.33±0.55537.80±104.19''104.43±1.37126.20±6.487.10±0.51589.00±96.72''204.11±2.42122.80±7.277.12±0.78608.60±123.39''與正常對照組比，AAP<0.01;與模型對照組比，**P<0.01(2)增效試驗結果見表13。單獨用藥組環磷醯胺(25mg/kg)、SPPC(5mg/kg)的抑瘤率分別為37.4%禾口46.6%,而聯合用藥組(環磷醯胺25mg/kg+SPPC5mg/kg)的抑瘤率則為77.9%，與單獨用藥組比較，抑瘤率均有所提高；從上述試驗結果可以看出SPPC與小劑量的化療藥合用，不僅可減輕化療藥的毒副作用，同時還可提高抑瘤率，顯示了聯合用藥的優勢。表13SPPC與環磷醯胺合用對S180瘤株生長的影響(3f±&;=10)組別劑量(mg/kg)瘤體重(g)抑瘤率(％)生理鹽水組一1.31±0.21—環磷醯胺組250.82土0.44"37.4SPPC組100.83±0,49"36.6SPPC+環磷醯胺組10+250.29土0.2廣77.9與生理鹽水組比較，'？<0.0權利要求1、一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，它由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物0.1-30％，填充劑60-95％，抗氧化劑2-4％，崩解劑2-4％，潤滑劑1-2％；所述的填充劑為澱粉、糊精、糖粉、預膠化澱粉、乳糖、葡萄糖、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣或其他藥學上可接受的填充劑的其中一種或其任意混合物；所述的抗氧化劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、維生素E或其他藥學上可接受的抗氧化劑的其中一種或其任意混合物；所述的崩解劑為交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、羧甲基澱粉鈉、羥丙基澱粉、酸酐、碳酸鈉或其他藥學上可接受的崩解劑的其中一種或其任意混合物；所述的潤滑劑為硬脂酸鎂、滑石粉、苯甲酸鈉、微粉矽膠或其他藥學上可接受的潤滑劑和助流劑的其中一種或其任意混合物。2、根據權利要求1所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物0.5-15%，填充劑70-92%,抗氧化劑2.5-3.5%,崩解劑2.5-3.5%，潤滑劑1.2-1.8%。3、根據權利要求1所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物3-10%，填充劑80-90%,抗氧化劑2.8-3.2%，崩解劑2.8-3.2%，潤滑劑1.5-1.7%。4、根據權利要求1所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物1%，澱粉94%，抗壞血酸2%，羥丙基澱粉2%，硬脂酸鎂1%。5、根據權利要求1所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物18%,糊精74%,維生素E4%，羧甲基澱粉鈉3%，滑石粉1%。6、根據權利要求l所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物25%，澱粉70%，維生素E2%，羥丙基澱粉2%，硬脂酸鎂1%。7、根據權利要求l所描述的一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑，其特徵在於由下述原料重量百分比製成蜈蚣多糖蛋白複合物30%，糊精61%，維生素E4%，碳酸氫鈉3%，滑石粉2%。8、一種實現要求1所述的蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑的製備方法，包括以下步驟①首先向蜈蚣多糖蛋白複合物中分別加入填充劑，崩解劑及抗氧化劑後加入溼潤劑混勻製成軟材；②再將混勻的軟材過50-200目尼龍篩制粒，7080°C烘乾30分鐘，過50-200目鐵篩整粒；③最後加入潤滑劑灌裝成膠囊。全文摘要本發明公開了一種蜈蚣多糖蛋白抗腫瘤膠囊劑及製備方法。該膠囊劑由蜈蚣多糖蛋白複合物(ScolopendraPolysaccharide-ProteinComplex，簡稱SPPC)、填充劑、抗氧化劑、崩解劑、溼潤劑及潤滑劑按一定比例構成。其製備步驟是①首先向蜈蚣多糖蛋白複合物中分別加入填充劑、崩解劑及抗氧化劑後加入溼潤劑混勻製成軟材；②再將混勻的軟材過50-200目尼龍篩制粒，70～80℃烘乾30分鐘，過50-200目鐵篩整粒；③最後加入潤滑劑灌裝成膠囊。所得的藥用組合物能有效殺傷腫瘤細胞和提高機體免疫力，療效顯著，且製備方法易行，操作簡便，原料來源廣泛。文檔編號A61K35/56GK101164552SQ20071005358公開日2008年4月23日申請日期2007年10月18日優先權日2007年10月18日發明者江樂,洋劉,倩周,英敖,朱玲新,穎李,靜楊,剛陳申請人:武漢大學