新的糖鏈連接的凝血調節蛋白樣肽的製作方法

2023-06-20 14:51:11 1

專利名稱：新的糖鏈連接的凝血調節蛋白樣肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有新糖鏈並具有凝血調節蛋白活性的一種新肽。更具體地講，本發明涉及含有3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖鏈(此後本文將其稱為3SAGGX鏈)並具有凝血調節蛋白活性的一種肽。
本發明還涉及特異性地結合到抗-人天然殺傷細胞-1抗體(此後本文將其稱為抗-HNK-1抗體)並具有凝血調節蛋白活性的一種肽。
本發明還涉及含有這種肽作為有效成分的藥用組合物或包括給予這種藥用組合物的治療血栓形成等疾病的方法。
本發明還涉及這種肽的純化方法和檢測方法。
本發明還涉及由這種肽釋放的和純化的所述3SAGGX鏈及其還原端修飾的產物。
一般來講，具有抗-血液凝固作用的抗凝血酶Ⅲ和肝素或具有溶栓作用的尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活物等物質用作由異常血液凝固能力引起的疾病的治療因子。然而，這些物質具有諸如出血傾向的副作用，並且對於或者抗血液凝固作用或者溶栓作用它們的作用具有不完全性。因而，人們非常關注具有發揮這兩種作用可能性的凝血調節蛋白以及基本上具有凝血調節蛋白活性的凝血調節蛋白樣物質在臨床上的應用，其中凝血調節蛋白樣物質對凝血酶具有親和力並增強對蛋白質C活化作用。
關於這種凝血調節蛋白或凝血調節蛋白樣物物的製備，迄今為止已經報導了以下實施例。在這方面，除非另外說明，否則分子量顯示為由在非還原性條件下通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(此後本文將其稱為SDS-PAGE)測得的值。
P.W.Maierus等已經從人胎盤中純化了凝血調節蛋白並報導了其分子量為75K(The Journal of Biological Chemistry,259,12246-12251,1984)。Maruyama等已經從人肺中純化了凝血調節蛋白，並報導了其特性與胎盤凝血調節蛋白的那些特性相同(Journal of ClinicalInvestigation,75,987-991,1985)。另外，Suzuki等從人血小板中部分地純化了凝血調節蛋白，確定其分子量為78K，並報導了基於其電泳行為、對凝血酶的親和力以及對蛋白質C的底物親和力，得自血小板、胎盤和肺內皮的凝血調節蛋白的製備物具有相互完全相同的特性(The Journal of Biochemistry,104,628-632,1988)。
關於通過採用基因工程技術進行的研究，Suzuki等已經克隆了得自人肺cDNA文庫的含有信號肽的人凝血調節蛋白前體基因，闡明了全部基因結構並由此揭示出其從18個胺基酸信號肽延續的575個胺基酸殘基的胺基酸序列(EMBO Journal,6,1891-1897,1987)。此後，Suzuki等報導了，通過基因工程方法製備的人凝血調節蛋白與從天然組織純化的人凝血調節蛋白具有相同的活性(The Journal ofBiological Chemistry,264,4872-4876,1989)，並且人凝血調節蛋白活性限於從氨基端計數的345-462位胺基酸殘基的序列，而甚至該部分的一部分缺失其活性也會喪失(The Journal of Biological Chemistry,264,10351-10353,1989；和論文摘要，the 12th Meeting of InternationalSociety on Thrombosis and Hemostasis，第334頁，Subject No.1039,1989)。
另外，關於具有凝血調節蛋白活性的凝血調節蛋白樣物質，有已知的天然類型諸如人尿可溶性凝血調節蛋白物質(JP-A-63-30423(本文所用的術語「JP-A」是指「未審查已公開的日本專利申請」)，舊-A-63-146898,JP-A-3-86900,JP-A-3-21 8399，和Yamamoto等，TheJournal of Biochemistry,113,433-440,1993)。
通過基因程技術方法獲得的這種物質的實例包括除去跨膜區域和胞質內區域的可溶性凝血調節蛋白製備物(JP-A-1-6219,JP-A-2-255699,JP-A-3-133380,JP-A-3-259084,JP-A-4-210700,JP-W-3-503757(本文所用的術語「JP-W」是指「未審查已公開的日本國際專利申請」)，JP-W-4-505554,EP 474273,WO91/04276,WO91/05803,WO91/155]4,WO92/00325,WO92/03149,WO93/15755，和Doi等，論文摘要No.3,the 113th Annual Meeting of Pharmaceutical Society ofJapan,Subject No.30EM14-1,1993)。
已經報導了，血液或尿液中可溶性凝血調節蛋白的量在某些疾病和發病狀態中發生變化，因此表明其可用作這些疾病和發病狀態的標記。例如，已經報導了血液中凝血調節蛋白的量在彌散性血管內凝血綜合症(在下文稱為DIC)、系統性紅斑狼瘡、血栓形成性血小板減少性紫癜、風溼性關節炎、進行性硬皮病、糖尿病、腎病、成年呼吸窘迫綜合症、肺病諸如肺血栓栓塞(Rinsho Kensa(ClinicalInspection)，第33卷，第1643-1647頁，1989)、妊娠中毒(Ketsueki toMyakukan(Blood and Vessel)，第19卷，第490頁，1988)、肝病(Ketsuekito Myakukan，第20卷，第407頁，1989)、川崎病(Journal of JapaneseSociety on Thrombosis and Hemostasis，第3卷，第343頁，1992)、慢性腎小球腎炎Journal of Japanese Society on Thrombosis andHemostasis，第3卷，第349頁，1992)、定期血液透析後(Journal ofJapanese Society on Thrombosis and Hemostasis，第1卷，第395頁，1990)、衰老(Journal of The Japan Hematological Society，第54卷，第286頁，1991)等病例中增加。還報導了由於腎功能不全尿中凝血調節蛋白減少(Rinsho Ketsueki(Clinical Blood)，第31卷，第1191頁，1990)。
人們認為，根據其胺基酸序列，N-型糖鏈和O-型糖鏈可以連接到這些凝血調節蛋白或凝血調節蛋白樣物質上。然而，關於實際上連接到糖鏈的報導是極少的，僅僅包括由Niimi等報導的N-型糖鏈的信息(Iyakuhin Kenkyu(Medicament Research)，第28卷，第12期，第863-873頁，1997)。
關於對凝血調節蛋白的O-型糖鏈的極少數量的報導，WO91/04276公開了含有軟骨素和/或硫酸軟骨素的糖鏈的重組可溶性凝血調節蛋白，WO91/05803公開了用硫酸化糖胺聚糖修飾的重組可溶性凝血調節蛋白，而JP-A-4-210700公開了沒有連接硫酸糖胺聚糖的重組可溶性凝血調節蛋白。
在另一方面，Yamamoto等(The Journal of Biochemistry,113,433-440,1993)和Nakano等(Thrombosis andHaemostasis,79,331-337,1998)描述了硫酸軟骨素不存在於由人尿液製備的可溶性凝血調節蛋白中。然而，目前的情況是，對O-型糖鏈，特別是對其結構等的細節並沒有進行足夠的分析。
在另一方面，當糖胺聚糖鏈連接到肽上時，沒有3-O-硫酸化的葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖鏈已知作為連接區，但沒有報導正好由四種糖組成的糖鏈，其中葡糖醛酸的3-位被O-硫酸化。本發明的公開為了將凝血調節蛋白或凝血調節蛋白樣物質的血液凝固控制作用或血小板凝集控制作用應用到藥物中，人們非常關注提供可以被純化成較高純度並且在生物學樣品諸如已給予的患者的血液、尿液等中容易地檢測到的一種肽。
本發明的一個目的為提供具有凝血調節蛋白活性的肽，所述肽可以被純化成較高純度並且在生物學樣品諸如給予的患者的血液、尿液等中容易地檢測到，以及提供含有所述肽作為有效成分的藥用組合物。
本發明的另一目的為提供本發明剛才描述過的肽的純化方法、檢測方法和檢測試劑盒。
在對凝血調節蛋白樣物質深入地研究期間，本發明的發明人意外地發現了，有些凝血調節蛋白樣物質可以特異性地結合到抗-HNK-1抗體上，並且進一步地研究結果意外成功地分離到具有一條新糖鏈(命名為3SAGGX鏈)的一種新凝血調節蛋白樣肽，在所述鏈中其末端葡糖醛酸被O-硫酸化。我們還發現所述肽可用作為一種藥物。另外，我們發現了純化具有3SAGGX鏈的凝血調節蛋白樣物質至高純度的方法以及檢測所述物質的方法。基於這些發現本發明已經完成。
本發明的第一個實施方案為含有3SAGGX鏈並具有凝血調節蛋白活性的一種肽。關於所述肽，優選在水溶液中是可溶的肽，更優選在缺乏非離子型表面活性劑的的情況下在水溶液中是可溶的肽，而更優選具有SEQ ID No.1的1-494位胺基酸殘基的胺基酸序列、具有SEQ ID No.2的1-498位胺基酸殘基的胺基酸序列或具有通過在所述胺基酸序列應用一個或幾個胺基酸的取代、添加、插入和/或缺失而獲得的胺基酸序列的肽。
本發明的第二個實施方案為特異性地結合到抗-HNK-1抗體上並具有凝血調節蛋白活性的一種肽。關於所述肽，基本上不含有軟骨素和/或硫酸軟骨素與其連接的一段肽的肽為優選的。關於所述肽，優選在水溶液中是可溶的肽，更優選在缺乏非離子型表面活性劑的情況下在水溶液中是可溶的肽，而更優選具有SEQ ID No.1的1-494位胺基酸殘基的胺基酸序列、具有SEQ ID No.2的1-498位胺基酸殘基的胺基酸序列或具有通過在所述胺基酸序列應用一個或幾個胺基酸的取代、插入、添加和/或缺失而獲得的肽。
本發明的第三個實施方案為含有具有3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體上並具有凝血調節蛋白活性的肽作為有效成分的藥用組合物。所述肽優選的實施例與本發明的第一個或第二個實施方案中描述的相同。
本發明的第四個實施方案為具有3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體上並具有凝血調節蛋白活性的肽的純化方法，所述方法的特徵是用可以特異性地識別和結合到所述3SAGGX鏈的抗體的親和力的分離方法。優選的抗體為抗-HNK-1抗體，而更優選利用所述抗體連接到樹脂的抗體親和柱。
本發明的第五個實施方案為酶免疫測定(此後本文將其稱為EIA)方法和具有3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血調節蛋白活性的肽的檢測試劑盒，所述方法利用抗體可以特異性地識別和結合到3SAGGX鏈上的抗體。優選的抗體為抗-HNK-1抗體。
本發明的另一實施方案涉及通過從糖肽釋放和純化3SAGGX鏈獲得的糖鏈及其還原端修飾的形式。關於所述糖鏈，最好是絲氨酸連接到其還原端的糖醇或糖肽。實施本發明最佳方式以下描述本發明的細節。
本文所用的術語描述如下。
所述3SAGGX鏈為3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3(±唾液酸α2-6)半乳糖β1-4木糖鏈，它包括在糖鏈中唾液酸通過cα2-6鍵連接到距末端的第三個半乳糖上和在糖鏈中沒有連接唾液酸這兩種情況。由於所謂的糖胺聚糖鏈沒有連接到葡糖醛酸上，所以它具有僅有4個糖的結構。認為木糖部分與SEQ ID No.1表示的胺基酸序列的472-位和/或474-位絲氨酸的羥基形成O-糖苷鍵，所述胺基酸序列為具有凝血調節蛋白活性的肽的胺基酸序列。
所述凝血調節蛋白活性是指結合到凝血酶並由此增強凝血酶活化蛋白質C的作用。其結合到凝血酶可以例如通過其對用凝血酶作配體的親和柱的吸附作用而被證實。可以用公開於例如JP-A-3-218399中的方法，用合成的底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA，在凝血酶存在下，測量蛋白質C的活化能力，來證實凝血調節蛋白增強凝血酶對蛋白質C的活化作用。另外，具有凝血調節蛋白活性的肽統稱為凝血調節蛋白樣肽，其中凝血調節蛋白自身也包括在內。
用可以特異性地識別和結合到所述3SAGGX鏈的抗體的酶免疫測定方法(此後本文有時將其稱為EIA)，是指用通過將過氧化物酶、半乳糖苷酶等酶化學結合到可以特異性地識別和結合到所述3SAGGX鏈的抗體上製備的抗體，檢測具有所述3SAGGX鏈的肽，特異性地識別作為抗原的3-位-O-硫酸化葡糖醛酸並與其結合的抗體(例如，抗-HNK-1抗體)可以舉例作為一種優選的抗體，但可以用任何其它抗體，前提是它可以特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合。通過加入酶反應顯色的底物，根據著色程度來測量目的抗原的存在和數量。可以用任何物質，前提是它顯示依賴酶濃度和依賴反應時間的著色強度而對測量系統不產生影響。必要時，可以通過將其另一個EIA結合，用比所述3SAGGX鏈更高準確度來進行測量，其中另一個EIA使用識別作為抗原的本發明肽的另一部分並與其結合的抗體。
所述抗-HNK-1抗體為特異性地識別人天然殺傷細胞、CD57的抗原並與其結合的抗體，並且它特異性地識別和結合到3-位被O-硫酸化的葡糖醛酸上。所述抗-HNK-1抗體可以作為市售的多克隆或單克隆抗體購買到(例如，抗-NK細胞克隆亞類(小鼠)IgM，由CosmoBio生產和供應，Code No.IT-0289)或按照常規方法製備。
具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的本發明的肽可以或者是天然來源的肽或者是作為重組肽獲得的產物，前提是它具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性，但天然來源的肽為更優選的。假如為所述天然來源的肽，則它可以或者是人源肽或者是動物源肽，但人源肽為更優選的。適用於藥物中的實施例為可溶性凝血調節蛋白，例如，具有SEQ IDNo.1的1-494位的胺基酸序列的肽、具有SEQID No.2的1-498位的胺基酸序列的肽或通過在所述肽中應用一個或幾個胺基酸的取、缺失、添加和/或插入所獲得的肽為優選的。由於所述N-端具有異質性，因此還具有Phe-Pro-的肽也是優選的。假如為所述重組形式，通過在SEQ ID No.2的1-498位的胺基酸殘基上應用一個或幾個胺基酸的取代、缺失、添加和/或插入，其修飾範圍使得所述修飾作用沒有對所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性產生影響，則具有如此獲得的胺基酸序列的肽也包括在本發明中。
本發明也為具有凝血調節蛋活性的肽，所述肽可以通過利用可以特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體純化或檢測到。
特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血調節蛋白活性的本發明的所述肽可以或者是天然源肽或者是作為重組肽獲得的產物，前提是它特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血調節蛋白活性，但天然源肽為更優選的。假如為所述天然源肽，則它可以或者是人源肽或者是動物源肽，但人源肽為更優選的。適用於藥物的實施例為可溶性凝血調節蛋白，例如，具有SEQ ID No.1的1-494位胺基酸序列的肽或SEQ ID No 2的1-498位胺基酸序列的肽為優選的。由於所述N-端具有異質性，因此還具有Phe-Pro-的肽也是優選的。假如為所述重組形式，通過在SEQ ID No.2的1-498位胺基酸殘基上應用一個或幾個胺基酸的取代、缺失、添加和/或插入其修飾範圍使得所述修飾作用沒有對所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性產生影響，則具有如此獲得的胺基酸序列的肽也包括在本發明中。基本上不含有軟骨素和/或硫酸軟骨素與其連接的一段肽的一種肽也是優選的。
具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的本發明的所述肽，可以用能夠特異性地識別和結合到所述3SAGGX鏈上的抗體的親和力的分離方法得到。雖然原材料沒有特別地限制，但是最好是，在按照常規方法用陰離子交換層析、用凝血酶作配體的親和層析或凝膠過濾層析等方法從人源或動物源天然源(諸如人肺、人胎盤、人尿液或人血液等)純化的凝血調節蛋白或可溶性凝血調節蛋白上，或在通過基因工程技術的方法製備的重組凝血調節蛋白或重組可溶性凝血調節蛋白上，應用利用所述親和力的另一分離步驟，但它也可以作為所述常規純化方法的起始步驟或中間步驟進行，或必要時它也可以重複幾次。如果需要，它也可以與陽離子交換層析、疏水層析或羥基磷灰石層析等方法相結合進行。假如通過基因工程技術方法製備，則以常規的途徑，用可以表達具有凝血調節蛋白活性的肽的載體轉化宿主細胞。用可以表達具有凝血調節蛋白活性的肽的載體與可以表達具有葡糖醛酸基轉移酶活性的肽的載體和/或可以表達具有磺基轉移酶活性(例如HNK-1磺基轉移酶)的肽的載體一起同時轉染(共轉染)到宿主細胞也是一種期望的方法。宿主細胞的轉化也可以用可以表達具有凝血調節蛋白活性的肽和具有葡糖醛酸基轉移酶活性的肽和/或具有磺基轉移酶活性(例如HNK-1磺基轉移酶)的肽的載體進行。
雖然沒有特別地限制，但是特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體最好是抗-HNK-1抗體，其中更優選的是單克隆抗體。另外，在使用可以特異性地識別3SAGGX鏈並與其結合的抗體的親和力的分離方法中，所述抗體可以結合到載體諸如瓊脂糖、纖維素或葡聚糖等上，並且分離可以通過柱或分批等方法進行，其中柱方法為特別可取的。
當通過柱方法進行時，在柱中所述抗體用溴化氰連接到載體上並填充柱，而樣品溶液通過所述柱去進行具有3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽的吸附。此後，通過將洗脫液通過柱來洗脫所述肽，其洗脫條件使得由此吸附的肽對抗體的親和力減弱了。必要時，它可以與凝血酶親和層析或凝膠過濾層析相結合。
本發明這樣獲得的肽通過於60±2℃處理10小時滅活病毒或用中空纖維膜除去病毒，製成作為藥物更合適的狀態。
本發明所述肽的作用和特性顯示如下。試驗實施例1本發明實施例1的所述肽的結構分析(1)末端胺基酸序列按照C.H.W.Hirs等的方法(Methods in Enzymology(CH.W.Hirs著)，第11卷，199-203,Academic Press，紐約，1967)，得自本發明實施例1中的所述肽進行還原性羧甲基化，然後脫鹽用作胺基酸序列分析的樣品。
N-端胺基酸序列分析用氣相胺基酸序列自動分析儀(470型，Applied Biosystems製造)進行，羧基端(此後本文將其稱為C-端)胺基酸通過肼解方法測定，而C-端胺基酸序列分析通過用羧肽酶Y處理樣品進行，然後用高效液相層析通過胺基酸分析儀(JASCO製造)定量分析這樣釋放的胺基酸。
本發明實施例1的本發明肽的N-端側和C-端側胺基酸序列的分析結果顯示如下。N端Ala-Pro-Ala-G1u-Pro-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Gln-Cys-Val-Glu-His-Asp-Cys-Phe-Ala-Leu-Tyr-Pro-Gly-Pro-Ala-Thr-Phe-Leu-C-端-Val-Gly-Leu從這些結果可證實，得自本發明實施例1中的肽的N-端胺基酸序列與迄今為止已表明的人凝血調節蛋白的報導完全相一致，但所述C-端側胺基酸序列對應於所述492-494位胺基酸殘基的部分。即認為本發明實施例1的肽為具有對應於人凝血調節蛋白l-494位胺基酸殘基的胺基酸序列的肽。(2)糖鏈分析按照N.Kuraya和S.Hase的方法(The Journal of Biochemistry,112,122-126,1992)，得自本發明實施例1中的肽進行肼解(60℃,50小時)以釋放糖鏈，然後對所述糖鏈進行N-乙醯化作用和吡啶基氨基化作用，用作糖鏈分析的樣品(吡啶基氨基化糖鏈；此後本文將其稱為PA-糖鏈)。在還原端側含有木糖的PA-糖鏈(結合到胺基酸的一側)通過凝膠過濾層析和反相層析純化，然後通過基於結合外切糖苷酶消化(β-葡糖醛酸糖苷酶和β-半乳糖苷酶的依序使用)(Methods in Enzymology(Ginsburg,V.著)，第230卷，225-237,Academic Press，紐約，1994)、甲基化作用分析、質譜分析法和NMR分析的S.Hase的雙相糖鏈圖譜方法的分析方法，分析這些結構。
連接到本發明實施例1的所述發明的肽的含有木糖的糖鏈的分析的結果顯示如下。在這種情況下，每個單糖縮寫如下。
SO4-3GlcA:3-位-O-硫酸化葡糖醛酸Gal半乳糖Sia唾液酸Xyl木糖SO4-3GlcA β1-3Gal β1-3(±Sia α2-6)Gal β1-4 Xyl基於這些結果，它們連接到所述肽並且具有葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖的僅4個糖結構的結果來看，發現連接到得自本發明實施例1中的肽的糖鏈的含有木糖的糖鏈結構為新的發現，並且在O-硫酸基連接到葡糖醛酸的3-位方面這些為迄今為止沒有報導過的新糖鏈。
另外，當按照J.Suzuki等的方法(Agricultural and BiologicalChemistry,55,283-284,1991)，將得自本發明實施例1中的肽在4M三氟乙酸中於100℃加熱3小時，然後將這樣釋放的單糖進行吡啶基氨基化並根據離子交換HPLC測定時，每1mol所述肽檢測到1mol木糖。基於這些結果，由於除了所述3SAGGX鏈外沒有發現含有木糖的糖鏈，因此證實1mol所述3SAGGX鏈是連接到1mol所述肽上。(3)軟骨素酶處理通過軟骨素酶處理，經SDS-PAGE測量的分子量和凝血調節蛋白活性沒有變化。因此，再次證實軟骨素和/或硫酸軟骨素沒有連接到本發明實施例1的所述肽上。試驗實施例2得自本發明實施例1中的所述肽的活性在凝血酶和抗-血液凝固活性存在時，通過JP-A-3-218399中描述的方法測量對凝血酶的親和力(抗-凝血酶作用)、蛋白質C活化能力。
結果，本發明的所述肽顯示結合到凝血酶的作用並由此強烈地抑制其凝固活性。本發明的所述肽還顯示在凝血酶存在時很強的活化蛋白質C的能力。本發明的所述肽還顯示延長血液凝固時間的強作用。試驗實施例3小鼠中的急性毒性將得自本發明實施例1或本發明實施例2中的所述肽通過靜脈注射給予到五隻ddY雄性小鼠，然後一直觀察所述動物7天，但用藥學上有效劑量沒有發現顯著性毒性和死亡率。試驗實施例4溶解性於室溫下得自本發明實施例1或本發明實施例2中的所述肽溶解於蒸餾水中至少到濃度30mg/ml。
根據前面所述的描述和試驗的結果，顯然本發明的所述肽具有凝血調節蛋白活性並顯示低毒性，因此預期該肽對預防和治療涉及血液凝固加劇的疾病是有效的，所述疾病諸如DIC、血栓形成、外周血管梗阻、心肌梗死、大腦梗死、一過性大腦缺血發作、妊娠中毒、肝功能不全和腎功能不全。本發明的所述肽與那些已知的天然或重組凝血調節蛋白樣肽有相同的活性。
可以用藥物中一般所用的合適的載體或介質，諸如無菌水、生理鹽水、植物油或無毒有機溶劑等，必要時與填充劑、著色劑、乳化劑、懸浮劑、穩定劑、防腐劑等添加劑相結合，將本發明的所述肽製成藥用製劑，最好是適合於有效地給予患者的注射劑。當本發明的所述肽用作注射劑時，所述製劑通過每天分1-6個劑量、以一份或連續地給予每個患者。關於本發明的所述肽，但日用量0.01-500mg，最好是0.05-10mg，雖然依每個患者的年齡、體重和症狀等日用量可以可選地變化。
另外，本發明的所述肽可以用交聯劑等結合或吸附到人造血管、人造器官、導管等醫療裝置的表面。通過這樣的應用，可以預防醫療裝置表面的血液凝固。它也可以用作所述體外血液循環的凝固抑制劑。
使所述已濃縮的尿液通過預先用含有O.068M NaCl的pH6.5、0.05M磷酸鹽緩衝液處理的300ml DEAE纖維素柱(Whatman製造)，以吸附所述活性部分，所述柱用750ml與在所述處理中所用的相同的緩衝液洗滌，然後用含有0.05M NaCl的pH4.0乙酸鹽緩衝液洗脫所述活性部分。
所述洗出物用標稱截留分子量為30,000的超濾膜濃縮，用2MNaOH調pH到7.5，然後通過預先用含有0.1M NaCl、1mM鹽酸苯甲脒和0.5mM CaCl2的pH7.5、0.02M Tris-HCl緩衝液處理的2.5mlDIP-凝血酶-瓊脂糖柱，由此吸附活性部分。接下來，用25ml在所述處理中所用的相同緩衝液洗滌所述柱，用含有1M NaCl、1mM鹽酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl洗脫，而所述洗出物用在所述處理中相同的緩衝液透析，然後在如上所描述的相同的條件下通過DIP-凝血酶-瓊脂糖層析再次純化。在第二次DIP-凝血酶-瓊脂糖層析中，使用相同的柱體積並用在所述處理下所用的10ml緩衝液洗滌，然後用10ml含有0.8M NaCl、1mM鹽酸苯甲脒和0.5mM CaCl2的pH7.5、0.02M Tris-HCl緩衝液洗滌，然後所述活性部分用含有1M NaCl、1mM鹽酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl緩衝液洗脫。
所述洗出物用標稱截留分子量為30,000的超濾膜濃縮，並通過預先用含有0.14M NaCl的pH7.0、0.01M磷酸鹽緩衝液處理的2.5ml抗-HNK-1抗體-瓊脂糖柱，以吸附含有本發明所述肽的活性部分。凝血調節蛋白部分也得自通過柱的部分。此後，所述柱用25ml在所述處理中所用的相同的緩衝液洗滌，用含有1M NaCl、1mM鹽酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl緩衝液進行洗脫，然後所述洗出物對在所述處理中所用的相同的緩衝液透析以得到含有本發明所述肽的活性部分。
通過上述生產方法最終得到的含有本發明所述肽的活性部分分離為在SDS-PAGE中顯示為一條單帶的肽。本發明實施例2特異性地結合到抗-HNK-1抗原的重組可溶性凝血調節蛋白的生產按照WO92/00325的方法生產重組可溶性凝血調節蛋白。即從得自人胎盤cDNA文庫的DNA，製備可以表達由498個胺基酸殘基組成的具有Ala-Pro-Ala-胺基酸序列作為其氨基端(此後本文將其稱為N-端)的可溶性凝血調節蛋白的載體，並將該載體轉染到CHO細胞，然後通過基因擴增得到高表達菌株。該將高表達菌株的培養物肉湯應用到DIP-凝血酶-瓊脂糖柱層析和凝膠過濾。使用本發明實施例1中描述的所述抗-HNK-1抗體-瓊脂糖柱，以相同的方式收集含有本發明所述肽的活性部分。從通過所述抗-HNK-1抗體-瓊脂糖柱的部分也得到凝血調節蛋白活性部分。本發明實施例3使用抗-HNK-1抗體的EIA將抗-HNK-1抗體(Cosmo Bio Co.,Ltd.,Code No.IT-0289)溶解於碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中到濃度2μg/ml，將200μl該溶液加入市售EIA板中並進行包被。於4℃靜置3小時或3小時以上後，該板用200μl 3％牛血清白蛋白-磷酸緩衝鹽溶液包被並使該板於4℃靜置過夜進行封閉。在洗滌所述板後，加入100μl樣品和具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽的標準溶液，並使其於37℃反應2小時。洗滌後，加入100μl結合生物素的抗-HNK-1抗體，於37℃反應2小時。洗滌後，加入100μl抗生物素蛋白-過氧化物酶。洗滌後，加入100μl鄰苯二胺、0.024％過氧化氫溶液作為底物，於室溫下反應10分鐘，然後加入50μl 1N硫酸終止反應。使用微量培養板讀出器於492nm測量吸光度，並從標準曲線測定樣品中具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的所述肽。在含有本發明所述肽的本發明實施例1的所述活性部分中檢測所述肽，並在抗-HNK-1抗體親和層析之前和之後純化到每蛋白質大約4倍的水平。本發明實施例4用抗-HNK-1抗體的EIA本發明實施例1中純化的所述連接了3SAGGX鏈的凝血調節蛋白通過用0.6mg/kg劑量靜脈注射給予到雄性大鼠。在給予後1分鐘和60分鐘從尾靜脈收集血液樣品，分離血漿，然後按照本發明實施例3的方法通過EIA測量具有3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的所述肽。結果，在給予後1分鐘它的濃度為16μg/ml，而在給予後60分鐘它的濃度為4μg/ml。製劑實施例1本發明實施例1的肽10mg純化的明膠 50mg磷酸鈉 34.8mg氯化鈉 81.8mg甘露醇 25mg將以上組分溶解於注射用蒸餾水中，並將所述溶液調到總體積10ml，除菌過濾，將其以一份1.0ml分裝到無菌管形瓶中，然後冷凍乾燥製成凍幹組合物。製劑實施例2本發明實施例2的肽20mg白蛋白 20mg磷酸鈉 34.8mg氯化鈉 81.8mg甘露醇 25mg稱量每個以上組分，如製劑實施例1中所描述的相同的方式得到凍幹製劑。工業適用範圍根據具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的所述肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血蛋白活性的所述肽，抗-HNK-1抗體等抗體特異性地結合到這些肽的所述所述糖鏈上。因此，可以利用使用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體(諸如抗-HNK-1抗體)的親和力的分離方法，例如應用抗-HNK-1抗體親和柱，將它們純化成高純度，以使得到的不含汙染成分的肽適合製成藥物。它也適合於酶免疫測定試劑盒的標準物質，以利用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體，諸如抗-HNK-1抗體，檢測具有凝血調節蛋白活性的肽。
由於本發明的所述肽具有凝血調節蛋白活性並顯示低毒性，因此預期該肽對預防和治療涉及血液凝固加劇的疾病是有效的，所述疾病諸如DIC、血栓形成、外周血管梗阻、心肌梗死、大腦梗死、一過性大腦缺血發作、妊娠中毒、肝功能不全和腎功能不全。另外，本發明的所述肽可以通過交聯劑等結合或吸附到人造血管、人造器官、導管等醫療裝置的表面。通過這種應用，可以預防醫療裝置表面的血液凝固。它還可以用作所述體外血液循環中的凝固抑制劑。
此外，當例如在純化過程中，或在諸如在給予具有凝血調節蛋白活性的所述肽之後患者的血液和尿液的生物學樣品中必需監測具有凝血調節蛋白活性的肽的濃度時，通過使用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體(諸如抗-HNK-1抗體)的EIA，可以容易地和準確地檢測到所述肽，因此就該肽預防或減弱產生副作用並可經濟地使用的能力而論，該肽可用作藥物。
通過在硼氫化鈉或還原劑等存在時，用氫氧化鈉等鹼處理本發明的所述肽，所述3SAGGX鏈也可以作為糖醇釋放。或者，通過使本發明的所述肽還原性羧甲基化，然後用蛋白酶諸如肌動蛋白酶(Actinase) E(由Kaken Pharmaceutical生產和提供)消化它，它可以作為其中所述3SAGGX鏈連接到絲氨酸的糖肽釋放。這樣釋放的糖醇或糖肽可以通陰離子層析或使用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體(諸如抗-HNK-1抗體)的親和柱純化，並可以結合用凝膠過濾或醯胺柱進一步地純化。這樣純化的糖醇或糖肽可以用作酶免疫測定試劑盒的標準物質，用以利用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體(諸如抗-HNK-1抗體)檢測具有凝血調節蛋白活性的肽。
另外，利用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗-HNK-1抗體等抗體的親和力的分離方法，諸如用具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血調節蛋白活性的肽的抗-HNK-1抗體親和柱的純化方法，以及通過利用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗-HNK-1抗體等抗體的EIA，檢測具有所述3SAGGX鏈和凝血調節蛋白活性的肽或特異性地結合到抗-HNK-1抗體並具有凝血調節蛋白活性的肽的方法或檢測試劑盒，也是有用的。當利用特異性地識別所述3SAGGX鏈並與其結合的抗體(諸如抗-HNK-1抗體)的本發明的所述EIA，與利用識別凝血調節蛋白中所述3SAGGX鏈以外的另一部分(諸如從所述氨基-端計數的345-462位胺基酸殘基的序列)作為抗原並與其結合的抗體的EIA結合使用時，已經可能容易並準確地測定健康人與患者的血液、尿液等生物學樣品中本發明的所述肽、確實不具有所述3SAGGX鏈但具有凝血調節蛋白活性的肽和具有所述3SAGGX鏈但不具有凝血調節蛋白活性的肽。
序列表110Mochida Pharmaceutical Co.,Ltd120含有可溶性凝血調節蛋白的組合物130PCT1001411999-06-3016022101211494212PRT213人類223在455位置的Xaa為Val或Ala。4001Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp15 10 15Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln20 25 30Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val35 40 45Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly
50 55 60Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp65 70 75 80Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp85 90 95Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala100 105 110Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr115 120 125Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala130 135 140Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu145 150 155 160Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly165 170 175Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly180 185 190Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala195 200 205Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala210 215 220Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala225 230 235 240Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln245 250 255Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp
260 265 270Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr275 280 285Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg290 295 300Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln305 310 315 320Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn325 330 335Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe340 345 350Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr355 360 365Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His370 375 380Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp385 390 395 400Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp405 410 415Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe420 425 430Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys435 440 445Gly Pro Asp Ser Ala Leu Xaa Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser450 455 460Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro465 470 475 480Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu485 4902102211498212PRT213人類223在455位置的Xaa為Val或Ala。4002Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp15 10 15Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln20 25 30Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val35 40 45Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly50 55 60Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp65 70 75 80Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp85 90 95Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala100 105 110Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr115 120 125Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala130 135 140Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu145 150 155 160Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly165 170 175Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly180 185 190Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala195 200 205Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala210 215 220Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala225 230 235 240Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln245 250 255Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp260 265 270Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr275 280 285Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg290 295 300Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln305 310 315 320Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn325 330 335Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe340 345 350Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr355 360 365Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His370 375 380Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp385 390 395 400Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp405 410 415Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe420 425 430Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys435 440 445Gly Pro Asp Ser Ala Leu Xaa Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser450 455 460Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro465 470 475 480Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly485 490 49權利要求
1．含有3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖鏈並具有凝血調節蛋白活性的肽。
2．按照權利要求1的所述肽，其中其胺基酸序列具有SEQ ID No.2的1-498位胺基酸殘基的胺基酸序列或通過在所述胺基酸序列上應用用一個或幾個胺基酸的取代、添加、插入和/或缺失所獲得的胺基酸序列。
3．按照權利要求1或2的所述肽，其中其胺基酸序列具有SEQ IDNo.1的1-494位胺基酸殘基的胺基酸序列。
4．特異性地結合到抗-人天然殺傷細胞-1抗體並具有凝血調節蛋白活性的肽。
5．按照權利要求4的所述肽，其中它基本上不含有連接了軟骨素和/或硫酸軟骨素的肽。
6．按照權利要求1或5中的任一項的所述肽，其中所述肽為天然來源肽。
7．按照權利要求1或5中的任一項的所述肽，其中所述肽為重組肽。
8．含有描述於權利要求1-7中任一項的所述肽作為有效成分的藥用組合物。
9．用於純化具有凝血調節蛋白活性的肽的方法，所述方法利用特異性地識別3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖鏈並與其結合的抗體的親和力。
10．按照權利要求9的所述純化方法，其中所述抗體為抗-人天然殺傷細胞-1抗體。
11．用於檢測具有凝血調節蛋白活性的肽的酶免疫測定方法，所述方法利用特異性地識別3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖鏈並與其結合的抗體。
12．按照權利要求11的所述檢測方法，其中所述抗體為抗-人天然殺傷細胞-1抗體。
13．用於檢測具有凝血調節蛋白活性的肽的酶免疫測定試劑盒，所述試劑盒含有抗-人天然殺傷細胞-1抗體。
全文摘要
本發明提供:具有在3－位硫酸化的β1－3半乳糖β1－3半乳糖β1－4木糖葡糖醛酸鏈並表現出凝血調節蛋白活性的新肽;含有所述肽作為有效成分的藥用組合物;利用所述肽的治療方法;通過用抗－HNK－1抗體的親和層析分離上述肽的方法;以及用所述抗－HNK抗體的酶免疫測定方法。
文檔編號C07K14/435GK1314915SQ99810075
公開日2001年9月26日 申請日期1999年6月30日 優先權日1998年6月30日
發明者長谷純宏, 若林弘行 申請人:持田製藥株式會社