改進的植酸酶的製作方法

2023-06-21 00:28:01 2

專利名稱：改進的植酸酶的製作方法
植酸酶是一種將植酸鹽(肌醇六磷酸)水解為肌醇和無機磷酸的酶。已知其是一種有價值的飼料添加劑。
本發明涉及改進的植酸酶，即具有改良特性(如改良的活性特性)的植酸酶，其參照為例如其衍生源或已知的植酸酶。改良的活性特性是指在植酸酶活性的至少一個相關方面進行改良，例如(非-排它列舉)pH穩定性，溫度穩定性，pH範圍，溫度範圍，比活性(特別是相關於pH和溫度的)，底物特異性，底物裂解模式，底物結合，位點特異性，磷酸從穀物中釋放的速度和水平，反應速度，植酸鹽降解速率)，釋放的磷酸所達到的終水平。
改良的活性特性的例子為改良的比活性(如增加，如在pH3，4，5，或6時增加)；改良的pH或溫度範圍；和/或改良(如增加)的熱穩定性，例如當使用差示掃描量熱(DSC)測量時增加的解鏈溫度。
本發明還涉及一種製備修飾型蛋白的方法，其中第一步是通過下述步驟a)，b)和c)從多個高度同源序列中測定出一個共有序列a)通過本領域已知的任何標準比對程序對至少3個，優選至少4個胺基酸序列進行比對；b)在胺基酸序列比對的每一位點，評價胺基酸的進化相似性，而共有殘基通過本領域公知的標準程序選擇，其中為了預測(calculation)共有殘基，至少應保證在某指定殘基僅出現在比對序列中的兩個序列上時，所述程序能確定一個共有殘基。然而，如果在所比對的胺基酸序列中有一亞組序列，其彼此間的相似性遠高於與其它序列之間的相似性，則僅當其共有序列可以相同於EP 897985所述的方式而確定時，或給該亞組中每一序列分配一個由1除以該亞組序列數所得的權重時，該亞組可用所述預測表示；c)如果該程序未能在指定位置鑑定出共有序列，則可選擇任何胺基酸，優選在此位置出現頻率最高的胺基酸。
在本發明第二方面，使一個同源序列與該共有序列比對，並使該同源序列中一或多個非共有殘基被相應共有殘基取代。
優選的，該同源胺基酸序列僅在所述程序於中度嚴謹條件下可明確定義共有殘基的位置上進行胺基酸殘基的取代，而在未能於中度嚴謹條件下確定優選的共有胺基酸的所有位置上，該同源蛋白的胺基酸保持不變。
在發明第三方面，測定了目的蛋白的活性中心，包括共有序列中以及同源蛋白的序列中參與形成活性中心的所有胺基酸殘基；隨後，將同源蛋白的部分或全部趨異胺基酸殘基插入共有序列的骨架中。
在此方法的一個實施方案中，用於比對特定位置之胺基酸的進化相似性的程序為程序″PRETTY″。
蛋白質活性中心可利用蛋白質三維結構分析測定。
同源蛋白如酶家族，限定的蛋白家族的實例為植酸酶家族，例如真菌來源的。
例如，植酸酶的胺基酸序列可通過引入至少一個選自下列的突變或取代被改變E58AF54YD69KI73VD197N K94AT214L R101AE222T N153KE267D V158IR291I A203GR329H S205GS364T V217AA379K A227VG404A V234LP238AQ277EA287HA292QV366IA396SE415QG437A
R451E為了解釋這些縮寫，舉一個例子，突變E58A被解釋如下當從該數字減去26，可以得到在如


圖1所示共有植酸酶序列或另一被比對的植酸酶序列中的位置或殘基號(對應於在
圖1所示序列中加入一段26個胺基酸的信號序列)。例如，在E58A中，數字58是指位置號32(58-26＝32)。該數字前的字母，即E，代表該植酸酶中被修飾的胺基酸，其被所述數字之後的胺基酸，即A，取代。
上述胺基酸取代，單獨和/或聯合，對胺基酸的穩定性有積極影響。
下組突變(即含有選自下組的至少一個突變的植酸酶)也是興趣所在E58A，D69K，D197N，T214L，E222T，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A；F54Y，I73V，K94A，R101A，N153K，V158I，A203G，S205G，V217A，A227V，V234L，P238A，Q277E，A287H，A292Q，V366I，A396S，E415Q，G437A，R451E；E58A，D69K，D197N，F54Y，I73V，K94A；T214L，E222T，E267DR101A，N153K，V158I；R291I，R329H，S364TA203G，S205G，V217A；A379K，G404AA227V，V234L，P238A，Q277E；A287H，A292Q，V366I，A396S，E415Q，G437A，R451E；T214L，E222T，S364T，V158I，A203G，G404A，A227V，P238A，A396S，G437A，R451E。
宿主細胞的實例為植物細胞，動物細胞，和微生物細胞，例如原核或真核細胞，如細菌，真菌或酵母細胞。真菌宿主的實例為麴黴屬菌株，酵母宿主的實例為糖酵母屬菌株，漢遜氏酵母屬(Hansenula)菌株。
本發明也涉及通過上述任一方法可獲得的或已獲得的修飾蛋白。
本發明也涉及植酸酶例如(但不限於)共有植酸酶-1的變體或突變蛋白，其中，在圖2的胺基酸序列中，已進行至少一個下述取代Q50L，Q50T，Q50G，Q50T-Y51N，Q50L-Y51N或Q50T-K91A。
在上述第三方面，如上所述從同源序列中確定一個共有序列；第二步，在所述共有序列及單個同源蛋白的序列中，測定蛋白活性中心，其包含參與形成活性中心的所有胺基酸殘基。所述單個同源蛋白可具有優選的特性如高比活性或酶活性的不同pH依賴性。第三步，將參與形成該同源蛋白活性中心的部分或全部胺基酸殘基插入所述共有序列的骨架中。結果產生嵌合蛋白，其具有來自單個蛋白的活性中心以及共有序列的骨架。
蛋白的活性中心可通過例如任何的蛋白三維結構分析來檢測，例如通過基於已知蛋白的已知3D-結構的同源模擬。
本發明也提供了通過此方法可獲得的或已獲得的共有蛋白，特別是含有至少一個示於圖2-6，10或21的胺基酸序列的蛋白，或其變體或突變蛋白。此類變體的實例見圖7-9。
此類變體或突變蛋白可如歐洲專利申請EP0897010所述定義並製備，例如Q50L，Q50T，Q50G，Q50L-Y51N，或Q50T-Y51N。這些突變如上述定義，或參見圖2。當參見圖2時，不要求減去所述26個胺基酸的信號肽(例如，在圖2中胺基酸序列第50位的「Q50L，」中，胺基酸Q被胺基酸L取代)。
含有本發明植酸酶的食品，飼料，或藥物組合物是本發明的另一方面。
在此上下文及本發明的方法中，「此類指定蛋白質家族的至少3個，優選至少4個胺基酸序列」是指3，4，5，6至12，20，50個，或甚至更多的序列可用於比對和比較以產生共有蛋白的胺基酸序列。″指定的蛋白家族的序列″是指被摺疊成三維結構的序列，其中α-螺旋，β-摺疊和β-轉角在同樣的位置，使此結構被本領域技術人員稱作可高度重疊。此外，這些序列定性了顯示同類生物學活性的蛋白質，例如，特定酶類如植酸酶。這類蛋白的三維結構足以允許模擬此家族其它同源蛋白的結構。實施例1舉例說明如何操作。本發明中「進化相似性」指根據結構相似性對胺基酸分類的方案，其允許一個胺基酸被另一個胺基酸取代且對整個結構影響最小，這可通過本領域公知的程序如「PRETTY」程序來進行。短語「此程序提供的相似程度…被設置到較小的嚴謹數」在本發明中指，可將確定本發明所用程序中相似性程度的參數值設定為，使該程序能針對完整胺基酸序列的最多數位置確定一個共有胺基酸，例如在程序PRETTY中，可將THRESHOLD的值選為2或3，PLURALITY的值為2。此外，「1除以這些序列的數目所得的權重」在本發明中指，能限定與用於確定共有序列之其它序列具有較高相似程度的一組序列的序列僅為所述確定提供一個係數，該係數等於1除以該組所有序列的數目。
如上所述，如果所述程序無法選出共有胺基酸，則將最常出現的胺基酸選為共有胺基酸；如果後一種情況不可能，本領域技術人員將從用於比較的所有序列中選出本領域已知其特性可改進目標蛋白熱穩定性的胺基酸，方式如Janecek，S.(1993)，生物化學方法(Process Biochem.)28，435-445；Fersht，A.R.和Serrano，L.(1993)，結構生物學最新觀點(Curr.Opin.Struct.Biol.)3，75-83；Alber，T.(1989)，生物化學年鑑58，765-798；Matthews，B.W.(1987)，生物化學26，6885-6888；或Matthews，B.W.(1991)，結構生物學最新觀點1，17-21。
酶的穩定性與多種工業應用相關。因此，已有大量成功或不太成功的嘗試，其通過合理或隨機的方法用來改進酶的穩定性，優選熱穩定性。
在此我們提供了另一種改進蛋白熱穩定性的方式。
本發明提供了一種製備共有蛋白的方法，包括對所謂共有蛋白的幾乎所有位置的胺基酸殘基進行預測的方法，以及從該序列合成能在原核或真核表達系統中表達的完整基因的方法。
本發明的DNA序列可從編碼目的蛋白如植酸酶的基因組或cDNA序列開始構建。例如，可通過體外誘變構建[見，例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約]。廣泛使用的「定點誘變」最初由Hurchinson和Edgell[病毒學雜誌8，181(1971)]所述，其包括使攜有所需核苷酸取代的合成寡核苷酸與單鏈DNA序列中待導入突變的靶區域退火[見Smith，遺傳學年鑑19，423(1985)，改良方法見Stanssen等，核酸研究17，4441-4454(1989)中文獻2-6。對指定DNA序列的誘變還可通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行。DNA作為起始材料可通過本領域公知的如Sambrook等(分子克隆)所述的方法從各個菌株中分離。
菌株信息參見如EP684313或下述任何保藏單位。黑麴黴(Aspergillusniger)[ATCC 9142]，嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)[ATCC 48102]，嗜熱踝節菌(Talaromyces thermophilus)[ATCC 20186]與煙麴黴(Aspergillusfumigatus)[ATCC 34625]已根據布達佩斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號分別為ATCC74337，ATCC74340，ATCC74338和ATCC74339。但應理解，編碼本發明共有蛋白的DNA可以如EP747483或EP897985，或實施例所述，通過本領域公知的方法合成。
序列信息參見如EP684313，或序列資料庫如Genbank(Intelligenetics，加利福尼亞，美國)，歐洲生物信息協會(European Bioinformatics Institute)(HinstonHall，劍橋，英國)，NBRF(Georgetown大學，醫療中心，華盛頓特區，美國)和Vecbase(威斯康星大學，生物技術中心，Madison，威斯康星，美國)。
本發明的方法可例如用於改進植酸酶的熱穩定性。
一旦獲得本發明的全長DNA序列，可通過本領域公知以及Sambrook等(同上(s.a.))所述的方法將它們整合至載體，從而在適當宿主系統中過表達所編碼的多肽。但本領域技術人員公知，DNA序列本身可用於轉化本發明的適當宿主系統以獲得所編碼多肽的過表達。適當宿主系統有真菌，如黑麴黴[ATCC9142]或無花果麴黴(Aspergillus ficuum)[NRRL3135]等麴黴屬或如Trichoderma reesei等木黴屬；或酵母，如釀酒酵母等糖酵母屬，或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等畢赤酵母屬，或多形漢遜氏酵母(DSM5215)等漢遜氏酵母多形體；或植物，如Pen等，生物/技術11，811-814(1994)所述。本領域技術人員公知此類微生物可來自保藏機構，如美國典型培養物保藏中心(ATCC)，真菌菌株保藏中心(CBS)或德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSM)或「Industrial Property」[(1991)1，29-40頁]所列的任何其它保藏機構。可使用的細菌有大腸桿菌；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等芽孢桿菌屬；或變青鏈黴菌(Streptomyces lividans)等鏈黴菌屬(參見如，Anne和Mallaert，FEMS微生物通訊114，121(1993)。優選大腸桿菌菌株，如大腸桿菌K12菌株，如M15[Villarejo，細菌學雜誌120，466-474(1974)所述DZ 291]，HB 101[ATCC 33694]或大腸桿菌SG13009[Gottesman等，細菌學148，265-273(1981)]。
可用於真菌中表達的載體是本領域公知的且述於EP420358，或Cullen等[生物/技術5，369-376(1987)]，Ward[分子工業真菌學，絲狀真菌的系統和應用，Marcel Dekker，紐約(1991)]，Upshall等[生物/技術5，1301-1304(1987)]，Gwynne等[生物/技術5，71-79(1987)]，或Punt等[生物技術雜誌17，19-34(1991)]；用於酵母中表達的載體見Sreekrishna等[基礎微生物學雜誌28，265-278(1988)，生物化學28，4117-4125(1989)]，Hitzemann等[自然293，717-722(1981)]或EP183070，EP183071，EP248227，或EP263311。用於大腸桿菌中表達的合適載體見Sambrook等[同上]，Fiers等[第8次國際生物技術專題討論會論文集，法國微生物協會(Soc.Franc.deMicrobiol.)，巴黎(Durand等編)，680-697頁(1988)]，Bujard等[酶學方法155，416-433(1987)]，或Stuber等[免疫學方法，Lefkovits和Pemis編，AcademicPress，Inc.，卷IV，121-152(1990)]。用於芽孢桿菌中表達的載體是本領域公知的且述於如EP207459，EP405370，美國國家科學院院報，81，439(1984)或Yansura和Henner，酶學方法185，199-228(1990)。用於多形漢遜氏酵母中表達的載體是本領域公知的且述於如Gellissen等，生物技術9，291-295(1991)。
已攜有調控元件如啟動子的載體，或本發明的DNA序列可通過改造而含有這種元件。可使用的合適啟動子元件是本領域公知的，例如Trichoderma reesei的cbhl-啟動子[Haarki等，生物技術7，596-600(1989)]或pkil-啟動子[Schindler等，基因130，271-275(1993)]；用於米麴黴的amy-啟動子[Christensen等，Abstr.19th Lunteren Lectures on Molecular GeneticsF23(1987)，Christensen等，生物/技術6，1419-1422(1988)，Tada等，分子普通遺傳學229，301(1991)]；用於黑麴黴的glaA-啟動子[Cullen等，生物/技術5，369-376(1987)，Gwyrme等，生物/技術5，713-719(1987)，Ward，分子工業真菌學，絲狀真菌的系統和應用，Marcel Dekker，紐約，83-106(1991)]，alcA-啟動子[Gwynne等，生物技術5，718-719(1987)]，sucl-啟動子[Boddy等，現代遺傳學24，60-66(1993)]，aphA-啟動子[MacRae等，基因71，339-348(1988)，MacRae等，基因132，193-198(1993)]，tpiA-啟動子[McKnight等，細胞46，143-147(1986)，Upshall等，生物/技術5，1301-1304(1987)]，gpdA-啟動子[Punt等，基因69，49-57(1988)，Punt等，生物技術雜誌17，19-37(1991)]以及pkiA-啟動子[de Graaff等，現代遺傳學22，21-27(1992)]。可用於酵母中表達的適當啟動子是本領域已知的，例如pho5-啟動子[Vogel等，分子細胞生物學，2050-2057(1989)；Rudolf和Hinnen，美國國家科學院院報(Proc.Nati.Acad.Sci.)84，1340-1344(1987)]或用於釀酒酵母中表達的gap-啟動子；用於在巴斯德畢赤氏酵母中表達的aoxl-啟動子[Koutz等，酵母5，167-177(1989)；Sreekrishna等，基礎微生物學雜誌28，265-278(1988)]；或用於在多形漢遜氏酵母中表達的FMD啟動子[Hollenberg等，EPA0299108]或MOX-啟動子[Ledeboer等，核酸研究13，3063-3082(1985)]。
因此含有本發明DNA序列的載體，優選使所述DNA序列在細菌或真菌或酵母中表達的載體，以及所述轉化的細菌或真菌或酵母，均是本發明的一部分。
本發明還提供一種允許蛋白，尤其本發明植酸酶，高表達的系統，例如重組漢遜氏酵母菌株。為此，可根據用於表達的生物如本案中的酵母(見實施例1)的密碼子頻率表來選擇此類蛋白的密碼子。隨意地，信號序列的密碼子可如實施例1中具體案例所述選擇；這意味著密碼子頻率表是依據編碼指定蛋白家族的胺基酸序列的DNA序列中所用的密碼子來製備。然後從用於表達的宿主細胞的密碼子頻率表中選擇用於信號序列之DNA序列的密碼子，其中利用了在兩個表中出現頻率相當的密碼子。
一旦這些DNA序列被適當培養基中的適當宿主細胞表達後，所編碼的蛋白可通過本領域公知的蛋白純化方法或就植酸酶而言EP420358中的方法，在被分泌到培養基中的情況下從培養基中分離，或在蛋白存在於胞內的情況下從宿主細胞中分離。因此，本發明多肽的製備方法，所述方法產生的多肽，或由本發明DNA序列編碼的多肽，都是本發明的一部分，其中所述方法包括將上述轉化的細菌或宿主細胞在適當條件下培養，和從中回收所述多肽。
本發明的多肽一經獲得，可通過本領域公知的任何試驗，按其具有農業用途的特性進行鑑定。
通常，本發明的多肽可用於任何具體領域，例如植酸酶可用於將肌醇聚磷酸如植酸鹽轉化為肌醇和無機磷酸。
此外，本發明的多肽可在藥用組合物或複合食品或飼料的製備方法中使用，其中將所述組合物的成分與至少一種本發明的多肽混合。因此，含有至少一種本發明多肽的複合食品或飼料或藥用組合物也是本發明的一部分。本領域技術人員熟知其製備方法。這類藥用組合物或複合食品或飼料可進一步含有通常用於此目的且本領域公知的添加劑或成分。
本發明進一步提供了減少動物肥料中植酸鹽水平的方法，其中給動物餵食所述飼料組合物，其量可將飼料中所含植酸鹽有效轉化為低級肌醇磷酸和/或肌醇，和無機磷酸。
在上下文中，植酸酶是一種具有植酸酶活性的酶或多肽。植酸酶可為例如肌醇六磷酸的磷酸水解酶，例如(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)與(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。
在一個實施方案中，通過SDS-PAGE評估，植酸酶被純化，即純度至少85％，優選至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％。將植酸酶分離。植酸酶活性可通過本領域公知的任何植酸酶試驗來測定，例如下述試驗(見實施例9)。試驗溫度可以是真實(actual)植酸酶的最適溫度，試驗pH可以是真實植酸酶的最適pH。
試驗溫度可在例如20-90℃，或30-80℃，或35-75℃的範圍內選擇，例如37℃，50℃，60℃，或70℃。
試驗pH可在例如pH2-9，或3-8，或3-6的範圍內選擇，例如試驗的pH值可選擇3，4，5，6，或7。
測定胺基酸序列的同源性(或多肽或胺基酸同源性)作為兩個序列相同的程度。這可通過本領域已知的預測機程序適當測定，例如GCG軟體包所提供的GAP程序[威斯康星軟體包程序手冊，遺傳學預測機組，575 ScienceDrive，Madison，威斯康星53711，美國]，也參見Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學雜誌，48，443-453]。在9.1版本中，為了進行多肽序列對比，將長度權重設為0，缺口權重設為3.0。
兩個DNA(核酸)序列之間的同一性或同源性的程度可通過本領域已知的預測機程序測定，例如GCG軟體包所提供的GAP程序[威斯康星軟體包程序手冊，遺傳學預測機組，575 Science Drive，Madison，威斯康星53711，美國]來測定，也參見Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學雜誌，48，443-453]。在9.1版本中，為了進行DNA序列對比，使用GAP並使用下列設置缺口產生罰分為50，缺口延伸罰分為3。
用於測定指定DNA或RNA序列是否與特定核苷酸和寡核苷酸探針雜交的適當實驗條件包括，將含有所述DNA或RNA片段、用於檢測雜交的膜在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉；(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約)中預浸漬10min，並使該膜在5×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/ml超聲處理的變性鮭精DNA(Sambrook等1989)中預雜交，然後在含10ng/ml隨機-引發的32P-dCTP-標記探針(比活性＞1×109cpm/μg)的相同溶液中於約45℃雜交12小時(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)生物化學年鑑1326-13)。
然後將此膜在2×SSC，0.5％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘，溫度為至少55℃(低嚴謹度)，至少60℃(中度嚴謹)，至少65℃(中/高嚴謹度)，至少70℃(高嚴謹度)，或至少75℃(非常高嚴謹度)。
在這些條件下與所述寡核苷酸探針雜交的分子可通過x-線膠片檢測。
具有改變的熱穩定性的植酸酶，或熱穩定植酸酶，均屬於本發明。「熱穩定」植酸酶是Tm(解鏈溫度)——經差示掃描量熱(DSC)對植酸酶蛋白質的測定——至少為65℃的一種植酸酶。DSC可使用恆定加熱率，例如10℃/min。在另外的實施方案中，Tm至少為66，67，68，69，70，71，72，73，74或75℃。或，Tm等於或低於150℃，或等於或低於145，140，135，130，125，120，115或110℃。因此，Tm間距的實例為65-150℃，66-150℃，-(等)-75-150℃；65-145℃，66-145℃，-(等)-75-145℃；65-140℃，-(等)-75-140℃；-(等)-65-110℃，66-110℃，-(等)-75-110℃。
Tm的具體範圍如下65-110℃；70-110℃；70-100℃；75-95℃，或80-90℃。
在以下實施例9和10中，描述了經DSC對Tm的測定，且顯示了多種植酸酶的Tm。
還顯示了最適pH，因為——作為另一種方式——熱穩定的植酸酶可被定義為一種具有至少60℃的最適溫度的植酸酶。優選該最適溫度在pH5.0或5.5時的底物植酸鹽或植酸上測定。實施例9描述了一例植酸酶試驗，其包括對單位的定義。
在另外的實施方案中，最適溫度為至少61，62，63，64，65，66，67，68，69或70℃。在一個具體實施方案中，最適溫度等於或低於140℃，或等於或低於135，130，125，120，115，110，105或100℃。因此，最適溫度的間距可以為60-140℃，61-140℃，-(等)-70-140℃；60-135℃，61-135℃，-(等)-70-135℃；60-130℃，-(等)-70-130℃；-(等)-60-100℃，61-100℃，-(等)-70-100℃。
在更具體地描述本發明之前，對所附圖表的簡單解釋如下。
圖1共有植酸酶-1序列的圖樣。字母表示胺基酸殘基的單字母代號。以下序列用於比對土麴黴(Aspergillus terreus)9A-1的phyA[Mitchell，D.B.，Vogel，K.，Weimann，B.J.，Pasamontes，L.van Loon，A.P.G.M.(1997)。組氨酸磷酸酶的植酸酶亞家族來自土麴黴和嗜熱毀絲黴的兩個新植酸酶的基因的分離，微生物學143，245-252]；始於胺基酸(aa)27；SEQ ID NO1]；土麴黴cbs116.46的phyA[EP897985]。一種在動物實驗中表現優良的煙麴黴耐熱植酸酶。植酸酶的優化和天然變異性。在植酸鹽和植酸酶的生物化學(Rasmussen，S.K；Raboy，V.；Dalb～ge，H.和Loewus，F編；KluwerAcademic Publishers)；始於aa27；SEQ ID NO2；黑麴黴泡盛變種的phyA(Piddington等(1993)基因133，55-62；始於aa27；SEQ ID NO3)；黑麴黴T213的phyA(EP897985)；始於aa27；SEQ ID NO4)；黑麴黴NRRL3135株的phyA[van Hartingsveldt，W.，van Zeijl，C.M.F.，Harteveld，G.M.，Gouka，R.J.，Suykerbuyk，M.E.G.，Luiten，R.G.M.，van Paridon，P.A.，Selten，G.C.M.，Veenstra，A.E.，van Gorcom，R.F.M.和van den Hondel，C.A.M.J.J.(1993)，黑麴黴植酸酶編碼基因(phyA)的克隆、鑑定和過表達。基因127，87-94；始於aa27；SEQ ID NO5]；煙麴黴ATCC 13073的phyA(Pasamontes，L.，Haiker，M.，Wyss，M.，Tessier，M.和van Loon，A.P.G.M.(1997)煙麴黴耐熱植酸酶的克隆、純化和鑑定，應用環境微生物學63，1696-1700；始於aa25；SEQ ID NO6)；煙麴黴ATCC32722的phyA(EP897985)；始於aa27；SEQ ID NO7)；煙麴黴ATCC58128的phyA(EP897985)；始於aa27；SEQ ID NO8)；煙麴黴ATCC26906的phyA(EP897985)；始於aa27；SEQ ID NO9)；煙麴黴ATCC32239的phyA(EP897985)；始於aa30；SEQ ID NO10；Emericella nidulans的phyA[Pasamontes，L.，Haiker，M.，HenriquezHuecas，M.，Mitchell，D.B.和vanLoon，A.P.G.M.(1997a).Emericella nidulans和嗜熱真菌嗜熱踝節菌的植酸酶的克隆，生物化學和生物物理學學報1353，217-223；始於aa25；SEQID NO11]；嗜熱踝節菌的phyA(Pasamontes等，1997a；始於aa24；SEQ IDNO12)；以及嗜熱毀絲黴的phyA(Mitchell等，1997；始於aa19；SEQ IDNO13)。比對利用程序PILEUP預測。缺口的位置經手工修正(refine)。比對中指定位置上的大寫胺基酸殘基屬於確立共有殘基的胺基酸的集合。最終構建的共有植酸酶(Fcp)的胺基酸序列(SEQ ID NO14)以粗體顯示在預測的共有序列的下方。所預測的共有序列中的缺口根據實施例1所述原則手工補齊。
圖2共有植酸酶-1基因(fcp)的DNA序列(SEQ ID NO15)和用於基因構建的引物序列。預測的胺基酸序列(
圖1，SEQ ID NO14)用程序BACKTRANSLATE[Devereux，J.，Haeberli，P. Smithies，O.(1984)，VAX序列分析程序組，核酸研究，12，387-395]轉化為DNA序列，還有高表達酵母基因的密碼子頻率表(GCG程序包，9.0)。土麴黴cbs116.46的植酸酶的信號肽被融合到N-末端。圖2所示胺基酸序列為SEQ ID NO16。粗體鹼基表示用於產生基因的寡核苷酸序列。各個寡核苷酸的名字被交替注釋在序列的上方或下方。加下劃線的鹼基代表基因的起始和終止密碼子。斜體字表示的鹼基代表被導入的兩個EcoRI位點。
圖3五種擔子菌植酸酶的比對和共有序列。字母表示胺基酸殘基的單字母代號。來自Paxillus involutus的植酸酶的胺基酸序列，phyA1(始於aa21；SEQ ID NO17)；以及phyA2(始於aa21，WO98/28409；SEQ ID NO18)；絨毛栓菌(始於aa24，WO98/28409；SEQ ID NO19)；平田頭菇(始於aa19，WO98/28409；SEQ ID NO20)；和Peniophora lycii(始於aa21，WO98/28409；SEQ ID NO21)，從圓括號中的胺基酸殘基開始，用於稱作「Basidio」的相應共有序列(實施例2；SEQ ID NO22)的比對和預測。比對用程序PILEPUP來進行，缺口的位置經手工修正。共有序列用程序PRETTY預測。當兩種P.involutus植酸酶的權重為0.5時，所有其它基因採用1.0的權重以便共有序列的預測。在所述程序不能測定共有殘基之處，Basidio序列含有一個破折號(dash)。比對中指定位置的大寫胺基酸殘基代表能確定共有殘基的胺基酸集和。
圖4共有植酸酶-10胺基酸序列的圖樣。將Thermomyces lanuginosus植酸酶的序列[Berka，R.M.，Rey，M.W.，Brown，K.M.，Byun，T.和Klotz，A.V.(1998)，嗜熱真菌Thermomyces lanuginosus的一個植酸酶基因的分子鑑定和表達，應用環境微生物學64，4423-4427；SEQ ID NO23]和五種擔子菌植酸酶的共有序列(SEQ ID NO22)添加至
圖1的比對中，由程序PRETTY預測出一個改進的共有序列。此外，略去黑麴黴T213的胺基酸序列，給剩餘兩種黑麴黴植酸酶序列分配權重0.5。詳見實施例2。
圖5共有植酸酶-10的DNA和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO25，和SEQ ID NO26)。胺基酸序列用單字母表示在相應DNA序列上方。用於裝配基因的寡核苷酸的序列用粗體字母表示。不同於共有植酸酶-1的寡核苷酸和胺基酸帶下劃線。fcp10基因用以下寡核苷酸裝配CP-1，CP-2，CP-3.10，CP-4.10，CP-5.10，CP-6，CP-7.10，CP-8.10，CP-9.10，CP-10.10，CP-11.10，CP-12.10，ap13.10，CP-14.10，CP-15.10，CP-16.10，CP-17.10，CP18.10，CP19.10，CP-20.10，CP-21.10，以及CP-22.10。新合成的寡核苷酸進一步用數字10標記。植酸酶相對於共有植酸酶-1含有以下32個取代Y54F，E58A，D69K，D70G，A94K，N134Q，I158V，S187A，Q188N，D197N，S204A，T214L，D220E，L234V，A238P，D246H，T251N，Y259N，E267D，E277Q，A283D，R291I，A320V，R329H，S364T，I366V，A379K，S396A，G404A，Q415E，A437G，A463E。帶下劃線的突變顯示了當作為共有植酸酶-1中的單突變被測試時對共有植酸酶-1的穩定效應。
圖6共有植酸酶-11(SEQ ID NO27)的比對。與共有植酸酶-10對照，設計共有植酸酶-11的胺基酸序列時，所有擔子菌植酸酶均作為獨立序列使用，每一序列分配一個0.2的權重。此外，黑麴黴T213的胺基酸序列再次用於該比對中。
圖7共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的DNA和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)。胺基酸序列用單字母代碼表示在DNA序列之上。被取代的胺基酸殘基(相對於共有植酸酶-1)帶下劃線。基因的終止密碼子用星號(*)標記。
圖8共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的DNA和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)。胺基酸序列用單字母代碼表示在DNA序列之上。被取代的胺基酸殘基(相對於共有植酸酶-10)帶下劃線。基因的終止密碼子用星號(*)標記。
圖9煙麴黴ATCC13073植酸酶α-突變體Q51T的DNA和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO32和SEQ ID NO33)。胺基酸序列用單字母代碼表示在DNA序列之上。被取代的胺基酸殘基(相對於煙麴黴ATCC13073的植酸酶)帶下劃線。基因的終止密碼子用星號(*)標記。
圖10共有植酸酶-7的DNA和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO34和SEQ ID NO35)。胺基酸序列用單字母代碼表示在DNA序列之上。用於裝配基因的寡核苷酸的序列用粗體字母表示。被取代的寡核苷酸和胺基酸(相對於共有植酸酶-1)帶下劃線，相應的三聯密碼用小寫字母表示。fcp7基因由下列寡核苷酸裝配CP-1，CP-2，CP-3，CP-4.7，CP5.7，CP-6，CP-7，CP-8.7，CP-9，CP-10.7，CP-11.7，CP-12.7，CP13.7，CP-14.7，CP-15.7，CP-16，CP-17.7，CP-18.7，CP-19.7，CP-20，CP-21，和CP-22。新合成的寡核苷酸進一步用數字7標記。與原始的共有植酸酶-1相比，共有植酸酶-7含有以下24個取代S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A，和A405S。
圖11共有植酸酶-1和共有植酸酶-10的差示掃描量熱(DSC)。將蛋白樣品濃縮至約50-60mg/ml，對10mM乙酸鈉，pH5.0強力透析。以10℃/min的恆定加熱速率加熱到95℃。共有植酸酶-10(上圖)的DSC產生85.4℃的解鏈溫度，其比共有植酸酶-1(78.1℃，下圖)的解鏈溫度高7.3℃。
圖12共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的差示掃描量熱(DSC)。將蛋白樣品濃縮至約50-60mg/ml，對10mM乙酸鈉，pH5.0強力透析。以10℃/min的恆定加熱速率加熱到95℃。共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T(上圖)的DSC產生88.6℃的解鏈溫度，而共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的解鏈溫度被測定為89.3℃。
圖13共有植酸酶-1、共有植酸酶-10和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T的最適溫度比較。為了測定最適溫度，在37-86℃之間的一系列溫度下進行實施例9的植酸酶標準試驗。用釀酒酵母的稀釋上清進行檢測。上清的其它組份對最適溫度的測定沒有影響△，共有植酸酶-1；◇，共有植酸酶-10；■，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T。
圖14共有植酸酶-10及其突變體thermo[3]-Q50T和thermo[3]-Q50T-K91A的依賴pH的活性圖譜和底物特異性。植酸酶活性通過在適當緩衝液中不同pH的標準試驗測定(見實施例9)。圖a)顯示了共有植酸酶-10(□)，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T(●)和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A(△)的依賴pH的活性圖譜，圖b)顯示了通過在標準試驗中用所述化合物置換植酸測得的相應底物特異性；空白欄，共有植酸酶-10；灰色欄，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T；黑色欄，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A。數字對應下列底物1.植酸；2.對硝基苯磷酸；3.苯基磷酸；4.果糖-1，6-二磷酸；5.果糖-6-磷酸；6.葡萄糖-6-磷酸；7.核糖-5-磷酸；8.DL-甘油-3-磷酸；9.甘油-2-磷酸；10.3-磷酸甘油酸；11.磷酸烯醇丙酮酸；12.AMP；13.ADP；14.ATP。
圖15共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T和共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的依賴pH的活性圖譜和底物特異性。植酸酶活性通過在適當緩衝液中不同pH的標準試驗測定(見實施例9)。圖a)顯示了Q50T變體(■)和Q50T-K91A變體(●)的依賴pH的活性圖譜，圖b)顯示了通過在標準試驗中用所述化合物置換植酸測得的相應底物特異性(空白欄，共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T；實心欄，共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A)。底物列在
圖14的圖說明中。
圖16共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T和共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的差示掃描量熱(DSC)。將蛋白樣品濃縮至約50-60mg/ml，對10mM乙酸鈉，pH5.0強力透析。以10℃/min的恆定加熱速率加熱到95℃。共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T(上圖)的DSC產生84.7℃的解鏈溫度，而共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的解鏈溫度被測定為85.7℃。
圖17共有植酸酶-1，共有植酸酶-1和共有植酸酶-1-thermo-[3]和共有植酸酶-1-thermo[8]的最適溫度的比較。為了測定最適溫度，在37-86℃之間的一系列溫度下進行植酸酶標準試驗。用來自轉化的釀酒酵母菌株的純化蛋白進行檢測。○，共有植酸酶-1；□，共有植酸酶-1-thermo[3]；▲，共有植酸酶1-thermo[8]。
圖18共有植酸酶-1，共有植酸酶-7，和黑麴黴NRRL3135植酸酶的依賴pH的活性和底物特異性的比較。植酸酶活性通過在適當緩衝液中不同pH的標準試驗測定(見實施例9)。圖a)顯示了植酸酶-1(■)，黑麴黴NRRL3135植酸酶(○)，和共有植酸酶-7(▲)的依賴pH的活性圖譜，圖表b)顯示了通過在標準試驗中用所述化合物置換植酸測得的相應底物特異性(黑色欄，黑麴黴NRRL 3135植酸酶；空白欄，共有植酸酶-1；灰色欄，共有植酸酶-7)。底物列在
圖14的圖說明中。
圖19煙麴黴ATCC 13073的植酸酶及其含有胺基酸置換(F55Y，V100I，F114Y，A243L，S265P，和N294D)的穩定型α-突變體的差示掃描量熱(DSC)。
將蛋白樣品濃縮至約50-60mg/ml，對10mM乙酸鈉，pH5.0強力透析。以10℃/min的恆定加熱速率加熱到95℃。煙麴黴ATCC 13073植酸酶(上圖)的DSC顯示為62.5℃的解鏈溫度，而所述α-突變體的解鏈溫度被測定為67.0℃。
圖20煙麴黴13073的野生型植酸酶，其α-突變體，以及其進一步穩定的α-突變體(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)的最適溫度比較。為了測定最適溫度，在37-75℃之間的一系列溫度下進行植酸酶標準試驗。用轉化的釀酒酵母菌株的稀釋上清進行檢測。上清的其它組份對最適溫度的測得沒有影響。○，煙麴黴ATCC 13073植酸酶；▲，煙麴黴ATCC 13073α-突變體；□，煙麴黴ATCC 13073植酸酶α-突變體-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)；■，煙麴黴ATCC 13073α-突變體(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q51T-K92A。Q51T和K92A分別對應於共有植酸酶-1的取代Q50T和K91A。
圖21共有植酸酶-12的胺基酸序列(consphyl2；SEQ ID NO36)，其含有從″basidio″共有序列轉移到共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的多個活性位點殘基(加下劃線)。
圖22共有植酸酶-3-thermo[11]-Q50T的DNA和胺基酸序列。胺基酸用單字母代碼表示在相應DNA序列之下。
圖23共有植酸酶-3-thermo[11]-Q50T-K91A的DNA和胺基酸序列。胺基酸用單字母代碼表示在相應DNA序列之下。
圖24共有植酸酶-10-thermo[5]-Q50T的DNA和胺基酸序列。胺基酸用單字母代碼表示在相應DNA序列之下。
圖25共有植酸酶-10-thermo[5]-Q50T-K91A的DNA和胺基酸序列。胺基酸用單字母代碼表示在相應DNA序列之下。
本文所述的生產植酸酶的微生物菌株，即Paxillus involutus CBS100231；Peniophora lycii CBS 686.96；平田頭菇CBS900.96；以及絨毛栓菌CBS100232分別分離於來自丹麥；丹麥；丹麥；和瑞典的天然樣品(Uppsala保藏中心。分別於1992年11月；1993年10月；1995年6月；和1995年11月保藏。
實施例1 共有植酸酶-1共有植酸酶-1(真菌共有植酸酶，fcp)的胺基酸序列如EP897985中實施例1和2所述設計並預測。下表1顯示了用於設計共有植酸酶-1的植酸酶胺基酸序列的起點和權重。進一步將共有植酸酶-1序列如EP897985的實施例3所述轉化為DNA序列，並如EP897985的實施例4所述構建和克隆共有植酸酶-1基因。
表1 植酸酶胺基酸序列的起點和權重土麴黴9A-1的phyA，aa27，權重0.5(Mitchell等，1997)
土麴黴cbs116.46 phyA，aa27，權重0.5(EP897985)黑麴黴泡盛變種phyA，aa27，權重0.33[Piddington，C.S.，Houston，C.S.，Paloheimo M.，Cantrell，M.，Miettinen-Oinonen，A.，Nevalainen，H.， Rambosek，J.(1993)，編碼黑麴黴泡盛變種的植酸酶(phy)和pH2.5最適型酸性磷酸酶(aph)的基因的克隆和測序，基因133，55-62)黑麴黴T213 phyA(EP897985)，aa27，權重0.33黑麴黴NRRL3135株phyA，aa27，權重0.33(van Hartingsveldt等，1993)煙麴黴ATCC13073 phyA，aa26，權重0.2(Pasamontes等，1997)煙麴黴ATCC32722 phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC58128 phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC26906 phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC32239 phyA，aa30，權重0.2(EP897985)Emericella nidulans phyA，aa25，權重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜熱踝節菌ATCC20186 phyA，aa24，權重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜熱毀絲黴phyA，aa19，權重1.0(Mitchell等，1997)實施例2一種改進型共有植酸酶(共有植酸酶-10)胺基酸序列的設計用於設計共有植酸酶-10的比對通過使用GCG序列分析軟體包9.0版本(Devereux等，1984)的程序PILEUP以標準參數(缺口產生罰分12，缺口延伸罰分4)進行預測。缺口的定位使用文本編輯器(text editor)修正。
用以下序列對始於表2所述胺基酸(aa)的擔子菌植酸酶進行比對表25種擔子菌植酸酶用於預測相應共有胺基酸序列(basidio)的起點和權重Paxillus involutus CBS 100231 phyA1，aa21，權重0.5(WO98/28409)Paxillus involutus CBS 100231 phyA2，aa21，權重0.5(WO98/28409)絨毛栓菌CBS 100232 phyA，aa24，權重1.0(WO98/28409)平田頭菇CBS 900.96 phyA，aa19，權重1.0(WO98/28409)Peniophora lycii CBS 686.96 phyA，aa21，權重1.0(WO98/28409)該比對顯示在圖3中。
表3中列出了用於最終比對的基因。該比對中所用序列的第一胺基酸(aa)述於生物命名之後。
表3 用於設計共有植酸酶-10的植酸酶序列的起點和權重土麴黴9A-1 phyA，aa27，權重0.5(Mitchell等，1997)土麴黴cbs116.46phyA，aa27，權重0.5(EP897985)黑麴黴泡盛變種phyA，aa27，權重0.5(Piddington等，1993)黑麴黴NRRL3135株phyA，aa27，權重0.5(van Hartingsveldt等，1993)煙麴黴ATCC 13073 phyA，aa26，權重0.2(Pasamontes等，1997)煙麴黴ATCC 32722phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC 58128 phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC 26906 phyA，aa26，權重0.2(EP897985)煙麴黴ATCC 32239 phyA，aa30，權重0.2(EP897985)Emericella nidulans phyA，aa25，權重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜熱踝節菌ATCC 20186 phyA，aa24，權重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜熱毀絲黴phyA，aa19，權重1.0(Mitchell等，1997)Thermomyces lanuginosus phyA，aa36，權重1.0(Berka等，1998)五種擔子菌植酸酶的共有序列，權重1.0(Basidio，圖3)相應比對顯示於圖4。
共有植酸酶-10的胺基酸序列的預測為了改進比對，我們增加了來自4種不同擔子菌之5種植酸酶的最初共有序列(稱為Basidio；仍含有未確定的序列位置；見圖3)，用於該最初共有植酸酶序列之預測的幾乎所有植酸酶序列和一種新的來自子囊菌綱Thermomyces lanuginosus的植酸酶序列，以便進行更大的比對。
我們設置複數性(plurality)為2.0和閾值為3。所用權重列於表3。比對及相應共有序列見表4。新的共有植酸酶序列和最初的共有植酸酶-1相比具有32個不同的胺基酸。程序PRETTY不能預測共有胺基酸殘基之處按實施例1所述規則補齊。該程序所提示的殘基無一被取代。
此外，在另一預測中，我們將所有擔子菌植酸酶分別作為個胺基酸序列配以權重0.2來進行預測。相應的比對示於圖6。預測得到的共有胺基酸序列(共有植酸酶-11)與共有植酸酶-10的序列有以下差異。字母X指該程序不能預測共有胺基酸；圓括號中的胺基酸對應於最終包括在共有植酸酶-10內的胺基酸。
D35X(第一個字母是共有植酸酶-10的，最後一個字母是共有植酸酶-11的)，X(K)69K，X(E)100E，A101R，Q134N，X(K)153N，X(H)190H，X(A)204S，X(E)220D，E222T，V227A，X(R)271R，H287A，X(D)288D，X(K)379K，X(I)389I，E390X，X(E)415E，X(A)416A，X(R)446L，E463A.編號如圖5。
我們也檢查了改進型共有序列10和11所示單個胺基酸取代對最初共有植酸酶之穩定性的影響。該方法見實施例3。
共有植酸酶-10的胺基酸序列到DNA序列的轉換用土麴黴cbs116.46植酸酶的最初26個胺基酸殘基作為信號肽，將其融合至共有植酸酶-10的N-末端。所用方法進一步描述在實施例1中。
所得fcp10基因的序列見圖5。
共有植酸酶-10(fcp10)基因的構建和克隆任選用正義鏈和反義鏈將預測的fcp10DNA序列分為85bp的寡核苷酸。每一寡核苷酸與相對鏈的前、後寡核苷酸重疊20bp。所有購自Microsynth，Balgach(瑞士)的PAGE-純化型引物參見圖5。
PCR-反應在三個PCR反應中，將合成寡核苷酸被編入完整基因中。用來自Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)的HighFidelity試劑盒和來自AMS生物技術(歐洲)有限公司(Lugano，瑞士)的熱循環儀「The ProtokolTM」實施PCR。所用以下寡核苷酸濃度為0.2pMol/ml。
Mix1.10CP-1，CP-2，CP-3.10，CP-4.10，CP-5.10，CP-6，CP-7.10，CP-8.10，CP-9.10，CP-10.10Mix2.10CP-9.10，Cp-11.10，CP-12.10，CP-13.10，Cp-14.10，CP-15.10，CP-16.10，CP-17.10，CP18.10，CP-19.10，CP-20.10，CP-21.10，CP-22.10新合成的寡核苷酸用數字10標記。共有植酸酶-10與最初的共有植酸酶-1相比含有下面的32個取代，其在圖5中被加下劃線Y54F，E58A，D69K，D70G，A94K，N134Q，I158V，S187A，Q188N，D197N，S204A，T214L，D220E，L234V，A238P，D246H，T251N，Y259N，E267D，E277Q，A283D，R291I，A320V，R329H，S364T，I366V，A379K，S396A，G404A，Q415E，A437G，A463E。
4個短PCR引物用於寡核苷酸的合成CP-aEcoRI
5′-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3′SEQ ID NO37)CP-b5′-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTTC-3′(SEQ ID NO38)CP-c.105′-TCTTCGAAAGCAGTACACAAAC-3′(SEQ ID NO39)CP-eEcoRI5′-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3′(SEQ ID NO40)PCR反應a10μl Mix1.10(每一寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每一寡核苷酸10mM)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-c.10(10pmol/ml)10.0μl PCR緩衝液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反應b10μl Mix2.10(每一寡核苷2.0pmol)2μl核苷酸(每一核苷酸10mM)2μl引物CP-b(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR緩衝液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反應a和b的反應條件步驟1 2min-45℃步驟2 30sec-72℃步驟3 30sec-94℃步驟4 30sec-52℃步驟5 1min-72℃將步驟3到5重複40次。
PCR產物(670和905bp)經瓊脂糖凝膠電泳(0.9％瓊脂糖)，然後經凝膠提取(QIAEX II凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)純化。用純化的DNA片段進行PCR反應c。
PCR反應c6μl PCR反應a的產物≈50ng)6μl PCR反應b的產物≈50ng)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR緩衝液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反應c的反應條件步驟1 2min-94℃步驟2 30sec-94℃步驟3 30sec-55℃步驟4 1min-55℃將步驟2到4重複31次。
所得PCR產物(1.4kb)如上述純化，用EcoRI降解，並連接至EcoRI-消化並去磷酸化的pBsk(-)-載體(Stratagene，La Jolla，CA，美國)。用1μl連接混合物轉化大腸桿菌XL-1感受態細胞(Stratagene，La Jolla，CA，美國)。所有標準方法如Sambrook等(1987)所述。所構建的基因(fcp10)的DNA序列通過本領域公知的測序方法檢查。
實施例3 通過導入共有植酸酶-10和共有植酸酶-11的胺基酸序列所顯示的單個突變增加共有植酸酶-1的熱穩定性為了增加同源基因的熱穩定性，也可檢驗目的蛋白與預測的共有序列之間每一差異胺基酸殘基的穩定性效應，並將所有穩定突變組合至目的蛋白中。我們利用共有植酸酶-1作為目的蛋白，測試以單位點定點突變區別於共有植酸酶-10和/或-11的34個胺基酸殘基的蛋白穩定性效應。
為構建在黑麴黴，釀酒酵母，或多形漢遜氏酵母中表達的突變蛋白，用含有共有植酸酶-1基因的相應表達質粒作為模板進行定點誘變(見實施例6-8)。突變用Stratagene(La Jolla，CA，美國)的″快速交換(quick exchange)TM定點誘變試劑盒″按說明書指示並使用相應引物來導入。所有獲得的突變及相應引物概述於表4。攜有所需突變的質粒用本領域公知的DNA序列分析來鑑定。
表4 用於共有植酸酶-1定點誘變的引物所取代的鹼基用粗體來突出。導入的限制性位點在序列上方標出。當限制性位點被寫在圓括號中時，所述位點通過導入突變而破壞。突變引物系列Kpn IQ50T 5′-CACTTGTGGGGTACCTACTCTCCATACTTCTC-3′(SEQ ID NO41)5′-GAGAAGTATGGAGAGTAGGTACCCCACAAGTG-3′Y54F 5′-GGTCAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAAG-3′(SEQ ID NO42)5′-CTTCCAAAGAGAAGAATGGAGAGTATTGACC-3′E58A 5′-CATACTTCTCTTTGGCAGACGAATCTGC-3′(SEQ ID NO43)5′-GCAGATTCGTCTGCCAAAGAGAAGTATG-3′Aat IID69K 5′-CTCCAGACGTCCCAAAGGACTGTAGAGTTAC-3′(SEQ ID NO44)5′-GTAACTCTACAGTCCTTTGGGACGTCTGGAG-3′Aat IID70G 5′-CTCCAGACGTCCCAGACGGCTGTAGAGTTAC-3′(SEQ ID NO45)5′-GTAACTCTACAGCCGTCTGGGACGTCTGGAG-3′K91A 5′-GATACCCAACTTCTTCTGCGTCTAAGGCTTACTCTG-3′(SEQ ID NO46)5′-CAGAGTAAGCCTTAGACGCAGAAGAAGTTGGGTATC-3′Sca IA94K 5′-CTTCTAAGTCTAAGAAGTACTCTGCTTTG-3′(SEQ ID NO47)5′ -CAAAGCAGAGTACTTCTTAGACTTAGAAG-3 ′A101R 5′-GCTTACTCTGCTTTGATTGAACGGATTCAAAAGAACGCTAC-3′(SEQ ID NO48)5′-GTAGCGTTCTTTTGAATCCGTTCAATCAAAGCAGAGTAAGC-3′N134Q 5′-CCATTCGGTGAACAGCAAATGGTTAACTC-3′(SEQ ID NO49)5′-GAGTTAACCATTTGCTGTTCACCGAATGG-3′
Nru IK153N 5′-GATACAAGGCTCTCGCGAGAAACATTGTTC -3′(SEQ ID NO50)5′-GGAACAATGTTTCTCGCGAGAGCCTTGTATC-3′Bss HII158V 5′-GATTGTTCCATTCGTGCGCGCTTCTGGTTC-3′(SEQ ID NO51)5′-GAACCAGAAGCGCGCACGAATGGAACAATC-3′Apa IS187A 5′-GGCTGACCCAGGGGCCCAACCACACCAAGC-3′(SEQ ID NO53)5′-GCTTGGTGTGGTTGGGCCCCTGGGTCAGCC-3′Bcl ID197N 5′-CTCCAGTTATTAACGTGATCATTCCAGAAGG-3′(SEQ ID NO52)5′-CCTTCTGGAATGATCACGTTAATAACTGGAG-3′Nco IT214L 5′-CACTTTGGACCATGGTCTTTGTACTGCTTTCG-3′(SEQ ID NO54)5′-CGAAAGCAGTACAAAGACCATGGTCCAAAGTG-3′Avr IIE222T 5′-GCTTTCGAAGACTCTACCCTAGGTGACGACGTTG-3′(SEQ ID NO55)5′-CAACGTCGTCACCTAGGGTAGAGTCTTCGAAAGC-3′V227A 5′-GGTGACGACGCTGAAGCTAACTTCAC-3′(SEQ ID NO56)5′-GTGAAGTTAGCTTCAGCGTCGTCACC-3′Sac IIL234V 5′-CTAACTTCACCGCGGTGTTCGCTCCAG-3′(SEQ ID NO57)5′-CTGGAGCGAACACCGCGGTGAAGTTAG-3′A238P 5′-GCTTTGTTCGCTCCACCTATTAGAGCTAGATTGG-3′(SEQ ID NO58)5′-CCAATCTAGCTCTAATAGGTGGAGCGAACAAAGC-3′Hpa IT251N 5′-GCCAGGTGTTAACTTGACTGACGAAG-3′(SEQ ID NO59)5′-TTCGTCAGTCAAGTTAACACCTGGC-3′Aat IIY259N 5′-GACGAAGACGTCGTTAACTTGATGGAC-3′(SEQ ID NO60)5′-GTCCATCAAGTTAACGACGTCTTCGTC-3′Asp IE267D 5′-GTCCATTCGACACTGTCGCTAGAACTTC-3′(SEQ ID NO61)5′-GAAGTTCTAGCGACAGTGTCGAATGGAC-3′E277Q 5′-CTGACGCTACTCAGCTGTCTCCATTC-3′(SEQ ID NO62)5′-GAATGGAGACAGCTGAGTAGCGTCAG-3′A283D 5′-GTCTCCATTCTGTGATTTGTTCACTCAC-3′(SEQ ID NO63)5′-GTGAGTGAACAAATCACAGAATGGAGAC-3′Ksp IH287A 5′-GCTTTGTTCACCGCGGACGAATGGAG-3′(SEQ ID NO64)5′-CTCCATTCGTCCGCGGTGAACAAAGC-3′Ban HIR291I 5′-CACGACGAATGGATCCAATACGACTAC-3′(SEQ ID NO65)5′-GTAGTCGTATTGGATCCATTCGTCGTG-3′Bsi WIQ292A 5′-GACGAATGGAGAGCGTACGACTACTTG-3′(SEQ ID NO66)5′-CAAGTAGTCGTACGCTCTCCATTCGTC-3′Hpa IA320V 5′-GGTGTTGGTTTCGTTAACGAATTGATTGC-3′(SEQ ID NO67)5′-GCAATCAATTCGTTAACGAAACCAACACC-3′(Bgl II)R329H 5′-GCTAGATTGACTCACTCTCCAGTTCAAG-3′(SEQ ID NO68)5′-CTTGAACTGGAGAGTGAGTCAATCTAGC-3′Eco RVS364T 5′-CTCACGACAACACTATGATATCTATTTTCTTC-3′(SEQ ID NO69)5′-GAAGAAAATAGATATCATAGTGTTGTCGTGAG- 3 ′Nco II366V 5′-CGACAACTCCATGGTTTCTATTTTCTTCGC-3′(SEQ ID NO70)5′-GCGAAGAAAATAGAAACCATGGAGTTGTCG-3′Kpn IA379K 5′-GTACAACGGTACCAAGCCATTGTCTAC-3′(SEQ ID NO71)5′-GTAGACAATGGCTTGGTACCGTTGTAC-3′S396A 5′-CTGACGGTTACGCTGCTTCTTGGAC-3′(SEQ ID NO72)5′-GTCCAAGAAGCAGCGTAACCGTCAG-3′G404A 5′-CTGTTCCATTCGCTGCTAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO73)5′-GTAAGCTCTAGCAGCGAATGGAACAG-3′Q415E 5′-GATGCAATGTGAAGCTGAAAAGGAACC-3′(SEQ ID NO74)5′-GGTTCCTTTTCAGCTTCACATTGCATC-3′
Sal IA437G 5′-CACGGTTGTGGTGTCGACAAGTTGGG-3′(SEQ ID NO75)5′-CCCAACTTGTCGACACCACAACCGTG-3′Mun IA463E 5′-GATCTGGTGGCAATTGGGAGGAATGTTTCG-3′(SEQ ID NO76)5′-CGAAACATTCCTCCCAATTGCCACCAGATC-3′以及，相應地，可用於其它突變。
如實施例9所述測定於釀酒酵母中表達的純化植酸酶(實施例7)的最適溫度。表5顯示所導入的每一突變對共有植酸酶-1穩定性的影響。
表5 單獨胺基酸在共有植酸酶-1中的取代對穩定性的影響+或-分別指蛋白穩定性變動最多1℃的正效應或負效應，++和--是指蛋白穩定性變動1℃至3℃的正效應或負效應；圓括號中的10或11指提示胺基酸取代的共有植酸酶序列。
穩定 中性 不穩定
本實施例用上述引物和技術將8種正突變(E58A，D197N，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A)組合在共有植酸酶-1-thermo[8]中。此外，導入主要影響植酸酶催化特性的突變Q50T和/或K91A(見專利申請EP897010和EP897985，以及實施例9)。所得植酸酶(共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A)的DNA和胺基酸序列示於圖7。該共有植酸酶的最適溫度和解鏈溫度通過這種方式增加了7℃(
圖15，16，17)。
在另一個共有蛋白中，我們在共有植酸酶-1-thermo[11]中組合了11個正突變(E58A，D69K，D197N，T214L，E222T，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A)。此外，導入突變Q50T和/或K91A。通過這種方式使解鏈溫度比共有植酸酶-1-thermo[8]又增加3-4℃。
利用表5的結果，我們通過回復突變K94A，V158I，和A396S進一步改善了共有植酸酶-10的熱穩定性，(A94K，I158V，和S396A)的回覆顯示對共有植酸酶-1的穩定性的強烈負效應，所得蛋白稱為共有植酸酶-10-thermo[3]。SEQ ID NO26加上3個突變K94A，V158I，和A396S。此外，我們導入了主要影響共有植酸酶催化特性的突變Q50T和K91A(參見專利申請EP897010和EP897985，以及實施例9和
圖14和15)。所得DNA和胺基酸序列見圖8。所優化的植酸酶顯示出比共有植酸酶-10高4℃的最適溫度和解鏈溫度(
圖12和13)。此外該植酸酶液在pH5.5對250U/mg植酸底物的比活性大大增加(
圖14)。
在另一種共有蛋白中，兩個另外的突變被導入到產生共有植酸酶-10thermo[5]的共有植酸酶-10thermo[3](E222T，G437A)中。此外，導入突變Q50T和/或K91A。通過這種方式使解鏈溫度比共有植酸酶-10thermo[3]又增加了1-2℃。
實施例4煙麴黴ATCC 13073的植酸酶通過將其胺基酸殘基用共有植酸酶-1和/或共有植酸酶-10的相關殘基取代而穩定在
圖1的比對中的6個胺基酸序列位置上，僅有或幾乎僅有煙麴黴13073植酸酶不含有相應的共有植酸酶胺基酸殘基，將這些非共有胺基酸殘基用共有殘基取代。以下胺基酸在煙麴黴13073植酸酶中被取代，另含有Q51(24)T取代(其影響催化特性且對應於共有植酸酶中的Q50T取代)和土麴黴cbs116.46植酸酶的信號序列(參見歐洲專利申請0897010，和圖9)F55(28)Y，V100(73)I，F114(87)Y，A243(220)L，S265(242)P，N294(282)D。圓括號中的數字指
圖1中的編號。
在第二輪中，進一步將在共有植酸酶-10中鑑定並檢驗為共有植酸酶-1(表5)中單一突變的11個穩定胺基酸取代中的4個(E58A，R329H，S364T，G404A)導入煙麴黴α-突變體中。此外，還導入胺基酸取代S154N，其顯示植酸酶的蛋白酶敏感性降低。
如實施例3所述導入突變(見表6)，如實施例6-8所述使之表達。產生的煙麴黴13073植酸酶變體被稱為α突變體(例如帶有Q24T，F28Y，V73I，F87Y，A220L，S242P，N282D取代的煙麴黴ATCC 13073植酸酶)以及″優化的″α-突變體(例如進一步具有E59A-S1S4N-R329H-S364T-G404A取代的煙麴黴α-突變體)。K92A是一個額外的優選突變。
煙麴黴13073α-突變體的植酸酶的最適溫度(60℃，圖20)和解鏈溫度(67.0℃，圖9)比野生型植酸酶的(最適溫度55℃，Tm60℃)提高5-7℃。另5個胺基酸取代進一步使最適溫度提高3℃(圖20).
表6用於穩定煙麴黴ATCC13073植酸酶的誘變引物突變引物F55Y5′-CACGTACTCGCCATACTTTTCGCTCGAG-3′(SEQ ID NO77)5′-CTCGAGCGAAAAGTATGGCGAGTACGTG-3′(Xho I)E58A5′-CCATACTTTTCGCTCGCGGACGAGCTGTCCGTG-3′(SEQ ID NO78)5′-CACGGACAGCTCGTCCGCGAGCGAAAAGTAGG-3′V100I 5′-GTATAAGAAGCTTATTACGGCGATCCAGGCC-3′(SEQ ID NO79)5′-GGCCTGGATCGCCGTAATAAGCTTCTTATAC-3′F114Y 5′-CTTCAAGGGCAAGTACGCCTTTTTGAAGACG-3′(SEQ ID NO80)5′-CGTCTTCAAAAAGGCGTACTTGCCCTTGAAG-3′A243L 5′-CATCCGAGCTCGCCTCGAGAAGCATCTTC-3′ (SEQ ID NO81)5′-GAAGATGCTTCTCGAGGCGAGCTCGGATG-3′S265P 5′-CTAATGGA TGTGTCCGTTTGATACGGTAG-3′(SEQ ID NO82)5′-CTACCGTATCAAACGGACACATGTCCATTAG-3′N294D 5′-GTGGAAGAAGTACGACTACCTTCAGTC-3′ (SEQ ID NO83)5′-GACTGAAGGTAGTCGTACTTCTTCCAC-3′
(Mlu I)R329H 5′-GCCCGGTTGACGCATTCGCCAGTGCAGG-3′(SEQ ID NO84)5′-CCTGCACTGGCGAATGCGTCAACCGGGC-3′Nco IS364T 5′-CACACGACAACACCATGGTTTCCATCTTC-3′(SEQ ID NO85)5′-GAAGATGGAAACCATGGTGTTGTCGTGTG-3′(Bss HI)G404A 5′-GTGGTGCCTTTCGCCGCGCGAGCCTACTTC-3′(SEQ ID NO86)5′-GAAGTAGGCTCGCGCGGCGAAAGGCACCAC-3′實施例5將黑麴黴NRRL3135植酸酶的活性位點胺基酸殘基導入共有植酸酶-1我們使用黑麴黴NRRL3135植酸酶的晶體結構來限定所有活性位點胺基酸殘基(見實施例1和EP897010)。根據
圖1的比對，我們將共有植酸酶-1的下述活性位點殘基以及不相同的鄰近殘基用黑麴黴植酸酶的那些取代S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A，和A405S。
如實施例1所述將新的共有植酸酶-7蛋白序列反譯為DNA序列(
圖10)。相應的基因(fcp7)如實施例1所述用下述寡核苷酸混合物來產生Mix1.7CP-1，CP-2，CP-3，CP-4.7，CP-5.7，CP-6，CP-7，CP8.7，CP-9，CP-10.7Mix2.7CP-9，CP-10.7，CP-11.7，CP-12.7，CP-13.7，CP-14.7，CP-15.7，CP-16，CP-17.7，CP-18.7，CP-19.7，CP-20，CP-21，CP-22.
上述寡核苷酸的DNA序列見
圖10。新合成的寡核苷酸另用數字7標記。用如實施例1所述的相同PCR引物合成寡核苷酸後，實施例6-8所述將該基因克隆至表達載體中。
在多形漢遜氏酵母中表達和純化後，所檢測的該酶的pH-譜非常相似於黑麴黴植酸酶的(見
圖18)。
實施例6 共有植酸酶基因在多形漢遜氏酵母中的表達用於轉化多形漢遜氏酵母RB11的植酸酶表達載體[Gellissen，G.，Hollenberg，C.P.，Janowicz，Z.A.(1994)，甲基營養型酵母中的基因表達，在Smith，A.(編)，重組微生物中的基因表達。Dekker，紐約，pp395-439]通過將pBsk-fcp或其變體的Eco RI片段插入多形漢遜氏酵母表達載體pFPMT121的多克隆位點中而構建，其中pFPMT121基於釀酒酵母的ura3選擇標記，多形漢遜氏酵母的甲酸脫氫酶(FMD)啟動子元件和甲醇氧化酶(MO)終止子元件。將Fcp基因的5｀末端融合至FMD啟動子，3｀末端融合至MOX終止子(Gellissen等，應用微生物學生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)46，46-54，1996；EP299108)。所產生的表達載體命名為pFPMTfcp，pFPMTfcp10，和pFPMTfcp7。
使所構建的質粒在大腸桿菌中增殖。質粒DNA用現有技術中的常規方法純化。利用如Gellissen等(1996)所述的感受態細胞製備方法和酵母轉化方法將所述表達質粒轉化至乳清苷-5｀-磷酸脫羧酶(ura3)缺陷型多形漢遜氏酵母菌株RB11中。將每一種轉化混合物塗布於含有2％葡萄糖和1.8％瓊脂的YNB培養基(0.14％w/v Difco YNB和0.5％硫酸銨)上，37℃培養。4-5天後挑出單個轉化菌落，如上述在液體培養基中37℃培養2天。隨後，將此培養物的等分試樣接種到裝有含2％葡萄糖之YNB培養基的新鮮小瓶中。在選擇培養基上進一步傳7代後，所述表達載體以多聚體形式整合到酵母基因組中。然後，通過兩個另外的在3ml非選擇性液體培養基(YPD，2％葡萄糖，10g/l酵母提取物，和20g/l蛋白腖)中另兩步培養，獲得有絲分裂穩定型轉化子。為了獲得遺傳同源性重組菌株，將最終的穩定培養物的等分試樣塗布於選擇平皿中。分離單菌落，分析在含有2％甘油(其阻遏FMD啟動子)而非葡萄糖的YNB中表達的植酸酶。共有植酸酶的純化如實施7所述。
實施例7在釀酒酵母中表達共有植酸酶基因並從培養物上清中純化植酸酶共有植酸酶基因從相應藍斑(Bluescript)-質粒(pBsk-fcp，pBSK-fcp10，pBskfcp7)中分離，將其連接至釀酒酵母表達載體pYES2(Invitrogen，SanDiego，CA，美國)的表達盒的Eco RI位點，或亞克隆至縮短的GAPFL(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子和pho5終止子之間，如Janes等，現代遺傳學18，97-103所述。基因的正確方向通過PCR核對。釀酒酵母菌株，例如INVScl(Invitrogen，San Diego，CA，USA)如Hinnen等，美國國家科學院院報75，1929-1933(1978)所述進行轉化。挑出攜有受控於GAPFL啟動子之植酸酶基因的單菌落，在5ml選擇培養基[SD-尿嘧啶；Sherman，J.P.，Finck，G.R.和Hicks，J.B.(1986)，酵母遺傳學方法實驗室手冊.冷泉港大學]中30℃強烈振蕩(250rpm)培養一天。再將預培養物加到500ml YPD培養基(Sherman等，1986)中並在相同的條件下培養。按說明書對gall啟動子進行誘導。培養4天後，離心細胞培養物(7000rpm，GS3轉頭，15mm，5℃)以除去細胞，上清通過Amicon 8400 cell(PM3O膜；Grace AG，Wallizeller，瑞士)和ultrafree-15離心過濾裝置(Biomax-30K，Millipore，Bedford，MA，美國)超濾濃縮。濃縮液(10ml)上樣至40ml Sephadex G25 Superfine柱(PharmaciaBiotech，Freiburg，德國)，用10mM乙酸鈉，pH5.0洗脫以脫鹽。將脫鹽樣品加至2M(NH4)2SO4中，直接上樣至1ml丁基Sepharose凝膠4Fast Flow疏水作用層析柱(Pharmacia Biotech，Feiburg，德國)，用在10mM乙酸鈉，pH5.0中從2M到0M(NH4)2SO4的線性梯度洗脫。植酸酶在臨界點洗脫，濃縮並上樣至120ml Sephacryl S-300凝膠滲透層析柱(Pharmacia Biotech，Freiburg，德國)。共有植酸酶-1，-7和-10以均一對稱峰形式洗脫，經SDS-PAGE證實純度約95％。
實施例8 共有植酸酶基因在黑麴黴中的表達以藍斑質粒pBsk-fcp，pBsk-fcp10，和pBskfcp7為模板，在基因的起始密碼子上遊導入Bsp HI-位點，終止密碼子下遊導入Eco RV-位點。使用ExpandTM高保真PCR試劑盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)及以下引物引物Asp-1BspHI5｀-TATATCATGAGCGTGTTCGTCGTGCTACTGTTC-3｀(SEQ ID NO87)用於克隆fcp和fcp7的引物Asp-2EcoRV3｀-ACCCGACTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5｀(SEQ ID NO88)用於克隆fcp10的引物Asp-3EcoRV3｀-ACCCTTCTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5｀(SEQ ID NO89)反應按廠家所述進行。經PCR-擴增的fcp-基因在起始密碼子處有一個新的Bsp HI位點，其通過引物Asp-1導入，導致第二個胺基酸殘基甘氨酸被絲氨酸取代。隨後，將該DNA-片段用Bsp HI和Eco RV消化並連接至黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子(glaA)下遊的Nco I位點和構巢麴黴(Aspergillusnidulans)色氨酸C終止子(trpC)上遊的Eco RV位點(Mullaney等，1985)。在此克隆步驟後，對該基因測序以檢測可能由PCR導入的錯誤。所得表達質粒(基本對應於EP684313之實施例9所述PGLAC載體)含粗糙脈孢黴(Neurospora crassa)的乳清苷-5｀-磷酸脫羧酶基因(pyr4)作為篩選標記。黑麴黴的轉化和共有植酸酶基因的表達如EP684313所述。共有植酸酶如實施例7所述被純化。
實施例9 植酸酶活性和最適溫度及pH的檢測此實施例涉及植酸酶活性和最適溫度的檢測。各種植酸酶都被檢測。
如EP420358以及van Hartingsveldt等(基因127，87-94，1993)所述製備黑麴黴NRRL 3135的植酸酶。
煙麴黴ATCC13073，土麴黴9A-1，土麴黴cbs116.46，Emericellanidulans，嗜熱毀絲黴，及嗜熱踝節菌的植酸酶如EP-0897985及其引用文獻所述製備。
所測的其它植酸酶如本文所述製備。
共有植酸酶-1-thermo(8)是共有植酸酶-1的一個變體，其進一步包括8個突變，如圖5中下劃線所示。共有植酸酶-1的無信號肽形式示於
圖1(SEQID NO14)，有信號肽形式示於圖2(SEQ ID NO16)。
植酸酶活性的測定基本上如Mitchell等(1997)所述。在含有0.5％植酸(≈5mM)的200mM乙酸鈉，pH5.0的試驗混合物中進行活性測定。37℃培養15min後，通過加入等體積的15％三氯乙酸來終止反應。所釋放的無機磷酸根通過使100μl試驗混合物與900μl H2O和1ml 0.6M H2SO4，2％抗壞血酸和0.5％鉬酸銨混合而定量測定。用磷酸鉀的標準溶液作參照。1個酶活單位定義為37℃時每分鐘釋放1μmol磷酸根的酶量。蛋白濃度通過如Pace等人所述計算的280nm處酶消光係數來測定[Pace N.C.，Vajdos，F.，Fee，L.，Grimsley，G.和Gray，T.(1995)，如何測量和預測蛋白質的摩爾吸收係數，蛋白質科學，4，2411-2423)280nm處的1吸收單位(1OD)相當於1.101mg/ml共有植酸酶-1，1.068mg/ml共有植酸酶-7，以及1.039mg/ml共有植酸酶-10。
在pH-最適曲線中，純化的酶用10mM乙酸鈉，pH5.0稀釋。將稀釋蛋白質的試樣與等體積的1％植酸(約10mM)在一系列的不同緩衝液中混合以進行培養0.4M甘氨酸/HCl，pH2.5；0.4M乙酸鹽/NaOH，pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5；0.4M咪唑/HCl，pH6.0，6.5；0.4M Tris/HCl pH7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。對照試驗表明pH僅受混合步驟的影響。如上所述37℃培養15分鐘。
為了測定植酸酶的底物特異性，將試驗混合物中的植酸用5mM濃度的各種磷酸鹽化合物代替。此外，活性的測試如上所述。
為了測定最適溫度，將酶(100μl)和底物溶液(100μl)在指定溫度下預溫5min。通過將酶加入底物溶液中開始反應。保溫15分鐘後，用三氯乙酸終止反應，檢測磷酸根的釋放量。
共有植酸酶-1的最適pH在pH6.0-6.5(70U/mg)左右。導入Q50T突變使得最適pH漸變為pH6.0(130U/mg)。導入K91A突變進一步使最適pH漸變至更酸性範圍。Q50T和K91A突變對共有植酸酶-10和進一步穩定的共有植酸酶變體也有相當的效應(
圖14和15)。
共有植酸酶-7(其構建為使黑麴黴NRRL3135植酸酶的催化特性轉移至共有植酸酶-1)具有與黑麴黴NRRL3135植酸酶(見
圖18)非常相似的pH-譜。其底物特異性與黑麴黴NRRL3135植酸酶的相似程度更甚於共有植酸酶-1的。
共有植酸酶-1的最適溫度(71℃)比用來預測共有序列的野生型植酸酶的(45-55℃，表7)高16-26℃。改進型共有植酸酶-10顯示出其最適溫度進一步增加到80℃(
圖13)。
當使用釀酒酵母菌株過度生產的上清時，發現共有植酸酶-1-thermo[8]的最適溫度在相同的範圍(78℃)。經測定共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A具有最高的最適溫度為82℃。
表7 共有植酸酶以及來自煙麴黴，黑麴黴，E.nidulans，和嗜熱毀絲黴的植酸酶的最適溫度和Tm-值。
最適溫度的測定如實施例9所述。Tm-值通過實施例10所述差示掃描量熱來測定。
實施例10通過差示掃描量熱(DSC)測定解鏈溫度為了測定植酸酶的伸展溫度，如Brugger等，1997[Brugger，R.，Mascarello，F.，Augem，S.，van Loon，A.P.G.M.和Wyss，M.(1997)，通過差示掃描量熱研究植酸酶和pH2.5酸性植酸酶的熱變性。植酸和植酸酶的生物化學(Rasmussen，S.K.；Raboy，V；Dalboge，H.和Loewus，F.編；Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，荷蘭]所述使用差示掃描量熱法。用50-60mg/ml植酸酶均一溶液進行檢驗。以10℃/min的恆定加熱速率加熱到90-95℃。
所測的解鏈點證實了最適溫度檢測結果(表7)。迄今最穩定的共有植酸酶是共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A，其在所選條件下顯示出解鏈溫度89.3℃。這比所用的野生型植酸酶的解鏈溫度高26.0到33.6℃。
實施例11將擔子菌植酸酶活性位點轉移到植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A如上所述(實施例5)，將衍生自擔子菌植酸酶活性位點的突變導入共有植酸酶-10中。製備下述a)-e)的5個構建體a)稱作共有植酸酶-12的構建物，其含有擔子菌共有序列中選定數目的活性位點殘基。其胺基酸序列被顯示於圖21(前26個胺基酸組成信號肽；不同於共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的位置帶下劃線)；b)將一簇突變(第II簇)轉移到共有植酸酶-1和-10的序列中，即S80Q，Y86F，S90G，K91A，S92A，K93T，A94R，Y95Ic)以類似的方式轉移另一簇突變(第III簇)，即T129V，E133A，Q134N，M136S，V137S，N138Q，S139A；d)以類似的方式轉移另一簇突變(第IV簇)，即A168D，E171T，K172N，F173W；e)最後，轉移另一簇突變(第V簇)被，即Q297G，S298D，G300D，Y305T。
這些構建物如實施例6到8所述被表達。
實施例12 利用GAP進行植酸酶比對使本文所述植酸酶—即胺基酸序列及相應DNA序列—相互比對。此外，對其它植酸酶也進行相應比對，它們是-EP897985所述的共有植酸酶-1；-EP420358所述的黑麴黴(ficuum)NRRL3135(黑麴黴NRRL3135)的植酸酶；-EP897010所述的煙麴黴ATCC13073(煙麴黴13073)；煙麴黴ATCC32239(煙麴黴32239)；土麴黴cbs116.46(土麴黴cbs)；Emericella nidulans(E.nidulans)；和嗜熱踝節菌(T.thermophilus)的植酸酶；-EP684313所述的嗜熱毀絲黴和土麴黴9-Al的植酸酶；-WO9735017(PCT/US97/04559)所述的Thermomyces lanuginosus(T.lanuginosus)的植酸酶；
-WO98/28409所述的平田頭菇，Paxillus involutus1和2(P.involutusphyA1和phyA2)；以及絨毛栓菌的植酸酶；-WO98/28408所述的Peniophora lycii(P.lycii)的植酸酶。
用GAP程序及如上所述設置進行比對。
在多肽比對中，除了與共有植酸酶-11比對外，還包括信號肽。
胺基酸序列比對的結果被顯示於下面表8中。每一小格的第一個數字是胺基酸的相似性，第二個數字是胺基酸的同源性。
在DNA序列比對中，也總是包括信號肽。結果示於下表9。
本發明包括以外實施方案(A)-(J)。
在這些實施方案中，當測定另一種植酸酶在胺基酸水平的％同一性或％相似性時，使用上述GAP等比對程序將其胺基酸序列與參照序列(例如在實施方案(A)中的共有植酸酶-10胺基酸序列)相比對。同一性百分比和相似性百分比均通過此程序計算。其它植酸酶的胺基酸序列可包括或不包括信號肽。
當測定另一種編碼植酸酶的DNA在DNA水平的％同一性時，使用上述GAP等比對程序將該DNA序列與參照序列[例如在實施方案(A)中的SEQ ID NO25至核苷酸12-1412(如圖5所示的共有植酸酶-10(Fcp10)的DNA序列]相比對。同一性百分比通過此程序計算。編碼另一種植酸酶的DNA序列可以是包含內含子的基因組DNA序列，或cDNA序列。其可以包括或不包括信號肽編碼部分。
當測定雜交時，所用探針是特異性DNA序列[例如在實施方案(A)中SEQID NO25的核苷酸12-1412(如圖5所示的共有植酸酶-10(Fcp10)的DNA序列]。編碼另一種植酸酶的DNA序列可以是含有植酸酶DNA序列的基因組DNA；純化的基因組DNA序列(就植酸酶DNA序列而言為純化的)；或其可以是編碼植酸酶的cDNA序列，優選純化型或擴增型，例如PCR-擴增型。編碼植酸酶的DNA，無論什麼類型，可包括或不包括信號肽編碼部分。合適的雜交條件如上所述。
術語″DNA序列″包括在此例示的DNA序列的片段或部分，只要其能夠編碼活性酶(例如植酸酶)。
術語″胺基酸序列″包括在此例示的胺基酸序列，只要其具有酶活性(例如表現植酸酶活性)。
(A)與共有植酸酶-10(CP10，Fcp10)相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與圖5所示共有植酸酶-10(Fcp10)中1-467位的胺基酸序列有至少93.80％；或至少94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，含有與共有植酸酶-10中1-467位的胺基酸序列有至少95.09％或至少95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與圖5所示共有植酸酶-10(Fcp10)之DNA序列中核苷酸12-1412有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與圖5所示共有植酸酶-10(Fcp10)之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。合適的陰性對照是編碼共有植酸酶-1的DNA。合適的陽性對照是編碼CP10，CP10-thermo[3)-Q50T，K91A，CP1-thermo[8]，CP1-thermo[83]Q50T，K91A中任一個的DNA。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與圖5所示共有植酸酶-10(Fcp10)中1-467位的胺基酸序列有至少93.80％；或至少94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(B)與共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與圖8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少93.37％；或至少93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少94.66％；或至少95.0，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與圖8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸12-1412有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與圖8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。合適的陰性對照是編碼共有植酸酶-1的DNA。合適的陽性對照是編碼CP10，CP10-thermo[3)-Q50T-K91A，CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一種的DNA。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與圖8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少93.37％；或至少93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(C)與共有植酸酶-1-thermo[81相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與共有植酸酶-1-thermo[8](示於圖7；已添加回復突變T50Q和A91K)中1-467位的胺基酸序列有至少98.30％；或至少98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與共有植酸酶-1-thermo[8](示於圖7；已添加回復突變T50Q和A91K)中1-467位的胺基酸序列有至少98.51％；或至少99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與共有植酸酶-1-thermo[8](示於圖7；已添加回復突變T50Q和A91K)之DNA序列的核苷酸1-1407有至少98.73％；或至少99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與共有植酸酶-1-thermo[8](示於圖7；已添加回復突變T50Q和A91K)之DNA序列的核苷酸1-1407(i)有至少98.73％；或至少99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。合適的陰性對照是編碼共有植酸酶-1的DNA。合適的陽性對照是編碼CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一個的DNA。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與共有植酸酶-1-thermo[8](示於圖7；已添加回復突變T50Q和A91K)中1-467位的胺基酸序列有至少98.30％；或至少98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(D)與共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與圖7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少97.87％；或至少98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少98.08％；或至少98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與圖7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸1-1407有至少98.37％；或至少98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與圖7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸1-1407(i)至少98.37％；或至少98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。合適的陰性對照是編碼共有植酸酶-1的DNA。合適的陽性對照是編碼CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一種的DNA。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與圖7所示的共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的胺基酸序列有至少97.87％；或至少98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(E)與共有植酸酶-11相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與圖6所示共有植酸酶-11中1-482位的胺基酸序列有至少90.71％；或至少91，91.5，92，92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖6所示共有植酸酶-11中1-482位的胺基酸序列有至少92.07％；或至少92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與圖6所示共有植酸酶-11中1-482位的胺基酸序列有至少90.71％；或至少91，91.5，92，92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(F)與煙麴黴α-突變體相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與圖9所示煙麴黴α-突變體(植酸酶)中1-467位的胺基酸序列有至少97.17％；或至少97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖9所示煙麴黴α-突變體(植酸酶)中1-467位的胺基酸序列有至少97.82％；或至少98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與圖9所示煙麴黴ATCC 13073α-突變體(植酸酶)之DNA序列的核苷酸1-1401有至少96.13％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與圖9所示煙麴黴ATCC13073α-突變體(植酸酶)中1-467位的胺基酸序列有至少97.17％；或至少97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與圖9所示煙麴黴ATCC 13073α-突變體(植酸酶)之DNA序列的核苷酸1-1401(i)有至少96.13％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。合適的陰性對照是編碼煙麴黴13073的植酸酶的DNA。合適的陽性對照是編碼煙麴黴ATCC 13073α-突變體的植酸酶，或優化型α-突變體的DNA。
(G)與優化型煙麴黴α-突變體相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與優化型煙麴黴α-突變體的植酸酶序列至少96.08％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與優化型煙麴黴α-突變體的植酸酶序列有至少96.74％；或至少97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與編碼優化型煙麴黴α-突變體植酸酶的DNA序列中核苷酸1-1401有至少95.63％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種DNA序列，其編碼的植酸酶含有與優化型煙麴黴α-突變體植酸酶有至少96.08％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與編碼優化型煙麴黴α-突變體植酸酶的DNA序列中核苷酸1-1401(i)有至少95.63％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。
合適的陰性對照是編碼煙麴黴13073植酸酶的DNA。合適的陽性對照是編碼煙麴黴ATCC 13073α-突變體植酸酶或優化型α-突變體的DNA。
(H)與共有植酸酶-7相關的植酸酶及相應DNA序列一種植酸酶，其含有與
圖10所示共有植酸酶-7中1-467位的胺基酸序列有至少94.87％；或至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與
圖10所示共有植酸酶-7中1-467位的胺基酸序列有至少95.30％；或至少95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其由與
圖10所示共有植酸酶-7之DNA序列的核苷酸12-1412有至少96.38％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列編碼。
一種編碼植酸酶的DNA序列，其與
圖10所示共有植酸酶-7之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少96.38％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或極高度嚴謹條件下可雜交。
一種編碼植酸酶的DNA序列，所述酶含有與
圖10所示共有植酸酶-7中1-467位的胺基酸序列有至少94.87％；或至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
(I)與擔子菌共有植酸酶相關的植酸酶一種植酸酶，其含有與(i)圖3所示擔子菌共有植酸酶的胺基酸1-441，和(ii)圖5所示胺基酸1-26的組合序列(將序列(ii)加在序列(i)的N-末端)有76.23％；或至少77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖3所示擔子菌共有植酸酶中1-441位的胺基酸序列有至少79.50％；或至少80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
(J)與共有植酸酶-12相關的植酸酶一種植酸酶，其含有與圖21所示共有植酸酶-12的1-467位的胺基酸序列有至少70，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的胺基酸序列。
一種植酸酶，其含有與圖21所示共有植酸酶-12的1-467位的胺基酸序列有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的胺基酸序列。
表8植酸酶胺基酸序列的比較
表9編碼植酶酶的DNA序列的比較
權利要求
1.一種植酸酶，其包含與共有植酸酶-10(SEQ ID NO26)1-467位的胺基酸序列有至少93.80％同一性的胺基酸序列。
2.一種植酸酶，其由與共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)中12-1412位核苷酸有至少95.88％同一性的DNA序列編碼。
3.一種植酸酶，其含有選自(i)SEQ ID NO26，或其胺基酸1-438，或由(ii)SEQ ID NO25的核苷酸12-1412，或90-1412編碼的胺基酸序列。
4.一種植酸酶，其包含選自下組的胺基酸序列(i)共有植酸酶-10-thermo[3]，(ii)(i)的變體，進一步包含突變Q50T，K91A，或(Q50T+K91A)，後一變體示於圖8，(iii)序列(i)和(ii)之任一的胺基酸27-467，(iv)SEQ ID NO31，或其胺基酸1-441；或(v)由SEQ ID NO30的核苷酸1-1401，或79-1401編碼的胺基酸序列。
5.一種植酸酶，其包含選自下組的胺基酸序列(i)共有植酸酶-1-thermo[8]，(ii)(i)的變體，進一步含有突變Q50T，K91A，或(Q50T+K91A)，後一變體示於圖7，(iii)序列(i)和(ii)之任一的胺基酸27-467，或(iv)SEQ ID NO29，或其胺基酸1-441；或(v)由SEQ ID NO28的核苷酸1-1407，或79-1407編碼的胺基酸序列。
6.一種植酸酶，其含有共有植酸酶-11(SEQ ID NO27)的胺基酸序列。
7.一種DNA序列，其含有編碼權利要求1-6之任一植酸酶的DNA序列。
8.一種含有編碼植酸酶之DNA序列的DNA序列，所述編碼植酸酶的DNA序列與共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)中核苷酸12-1412是(i)至少95.88％一致，或(ii)可在高度嚴謹條件下雜交。
9.一種含有編碼植酸酶之DNA序列的DNA序列，所述植酸酶含有與共有植酸酶-10(SEQ ID NO26)之胺基酸1-467至少93.80％一致性的胺基酸序列。
10.一種含有編碼植酸酶之DNA序列的DNA序列，其中所述編碼植酸酶的DNA序列含有(i)共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)的核苷酸12-1412，或90-1412；(ii)共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的DNA序列(SEQ ID NO30)的核苷酸1-1401，或79-1401；或(iii)共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的DNA序列(SEQ ID NO28)的核苷酸1-1401，或79-1401。
11.一種載體，其含有權利要求7-10之任一的DNA序列。
12.一種微生物宿主細胞，其含有權利要求7-10之任一的DNA序列，或權利要求11的載體。
13.一種生產植酸酶的方法，該方法包括在允許植酸酶產生的條件下培養權利要求12的宿主細胞，並從培養基中回收植酸酶。
14.一種食品，飼料或藥物組合物，其含有權利要求1-6之任一的植酸酶。
全文摘要
本發明涉及改進的植酸酶,優選是增加了熱穩定性的植酸酶,以及產生植酸酶的方法。具體的,將穩定的胺基酸突變導入到同源蛋白中,或使植酸酶的活性位點部分或全部被取代。本發明還公開了相應的DNA序列及其製備方法,以及生產改進的植酸酶的方法,及其應用。本發明還公開了煙麴黴植酸酶和共有植酸酶的特異性突變體。
文檔編號C12R1/865GK1344315SQ00805245
公開日2002年4月10日 申請日期2000年1月21日 優先權日1999年1月22日
發明者馬丁·萊曼, 索倫·F·拉森 申請人:諾維信公司