基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法與流程
2023-06-20 13:19:56 2
本發明屬於胺基酸測序技術領域，尤其涉及一種基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法。
背景技術：
目前，抗體藥物是近年來生物製藥領域增長率最快的一類生物技術藥物，以靶向性強、副作用小等優勢在癌症、自身免疫性疾病等領域應用廣泛。目前，單抗藥物佔據了全球十大暢銷藥物的半壁江山。在中國，單抗藥物的申報和銷售也呈急速上升趨勢，隨著原研產品專利過期，有越來越多的企業投身於單抗生物類似藥的研發和生產。因單抗藥物存在巨大的經濟利益，不少不法分子製造生產單抗假藥，嚴重危害國民的健康。因此，對單抗藥物的質量研究刻不容緩。
胺基酸序列是單抗藥物的一級結構，是單抗藥物研究的基礎。但是由於專利保護等原因，在專利期內的單抗藥物胺基酸序列較難獲得，成為研發瓶頸。基於軟電離技術的開發，質譜成為蛋白質藥物研究的重要手段。在單抗藥物胺基酸序列的鑑定和確證中，首先用胰蛋白酶等進行酶解，獲得肽段用質譜進行一級掃描和二級碎裂。得到的數據與已知的單抗藥物胺基酸序列進行匹配以獲得鑑定結果。再通過完整蛋白和輕重鏈的理論與測定分子量的一致性比較進一步確證單抗的胺基酸序列。當無法獲得胺基酸序列時，可以通過文獻檢索等方法初步獲得。但由於自我保護等原因，文章中公布的胺基酸序列通常與真實序列存在較大差異，需要進一步驗證和研究。質譜數據採集的方法包含有數據依賴性(DDA)、全信息串聯(MSE)採集等。數據依賴性採集(DDA)利用一級全掃描檢測肽段母離子，然後按信號強度排列，將前若干位的母離子依次選擇、碎裂，並掃描二級碎片離子。由於DDA通常選擇一級掃描中信號最強的1～10個母離子進行碎裂，因此二級碎裂圖譜的質量較高。對於準確解析肽段的胺基酸序列非常有力。但DDA也存在一定的局限性先強後弱的採集方式易造成低豐度肽段信息丟失。全信息串聯(MSE)指從液相色譜流出的所有肽段峰以及每個肽段的各個價態都會進行碎裂，並同時採集一級質譜數據。MSE能夠給出更全面的信息，所有的離子信息都被記錄，定量、定性更加準確。但由於肽段的豐度差異比較大，而圖譜的信號動態範圍有限，有些碎裂譜圖不是特別理想。不同數據採集方式獲得的數據需要不同的軟體進行數據分析。DDA可採用PepFinder等，而MSE可採用UNIFI，Biopharmalynx等。質譜de novo測序是一種直接解釋串聯質譜數據的方法。每個串聯質譜峰對應一對肽鍵的裂解，通過確定質譜中峰的離子類型可以得到這個峰對應肽段的前綴或後綴子序列的質量。理論上，可以根據串聯質譜中信號強度高的碎片離子之間的質量差和母離子信號確定離子類型，得到相應的b離子、y離子或其他離子峰。然後通過計算相鄰的同類型碎片離子之間的質量差獲得肽段的全長序列。為了更準確地分析胺基酸序列，de novo測序對質譜一級、二級譜圖的質量偏差、碎片離子的數量、豐度均有較高的要求。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法，旨在解決現有的胺基酸序列不公開或公布的胺基酸序列通常與真實序列存在較大差異，測序中數據採集方式易造成低豐度肽段信息丟失，對質譜一級、二級譜圖的質量偏差、碎片離子的數量、豐度均有較高要求的問題。
本發明是這樣實現的，一種基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法，所述基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法利用質譜數據依賴性和全信息串聯採集相結合；將質譜DDA採集獲得的數據用Peaks軟體進行從頭測序後，再用MSE採集獲得的數據進行胺基酸序列的驗證。
進一步，所述基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法包括以下步驟：
步驟一，文獻檢索，在Pubmed輸入需要解析單抗藥物的名稱、研發企業或結合抗原等特徵詞進行查找，找到與胺基酸序列研究相關的文獻，獲得該單抗IgG類型，CDR區、恆定區、可變區序列信息；
步驟二，採用胰蛋白酶進行酶解；
具體條件及過程為：
1.取單抗原液100μL(10mg/mL)，加水稀釋至樣品濃度為5mg/mL。
2.計算稀釋體積，使得樣品終體積為1ml，終濃度為1mg/mL，用7M鹽酸胍、250mM Tris、1mM EDTA(pH＝7.5)的蛋白變性緩衝液稀釋。
3.加入10μL 1M二硫蘇糖醇(DTT)到稀釋後樣品中，在37℃孵育1小時，使蛋白還原。
4.加入12μL 2.9M碘乙醯胺(IAA)到還原後的樣品中，在室溫下暗室反應40分鐘，使蛋白烷基化。然後加入30μL 1M DTT到烷基化後樣品中，終止反應。
5.用10mL 100mM Tris(pH＝7.5)酶解緩衝液，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重複加入20次。
6.加入500μL還原烷基化後的樣品到平衡後的NAP-5柱子中，每個樣品使用兩個NAP-5柱子，棄去流出的餾分。
7.對於每個NAP-5柱子，用800μL酶解緩衝液洗脫，並收集洗脫液。
8.根據樣品濃度，加入胰蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育1.5小時，使蛋白酶解成肽段。
9.將酶解後樣品進行冷凍乾燥，然後用100μL水重新溶解，加入進樣小瓶。
再通過DDA數據採集獲得高質量一級譜圖和二級譜圖。
具體數據採集方法為1色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH130C18(1.7μm，2.1mm×150mm)；流動相:A相為0.1％三氟乙酸水溶液，B相為0.09％三氟乙酸90％乙腈溶液；梯度洗脫；2-47分鐘B相從1-40％，流速為0.3mL/min，柱溫65℃。
2質譜條件:採用正離子模式，噴霧電壓為4.0kV；離子傳輸管溫度為325℃；S-lens為60％。掃描模式為DDA,選擇一級譜圖中相對強度最高的3個離子去做二級碎裂；一級掃描為Orbitrap；掃描範圍為m/z 200-2000；解析度為60K；碰撞模式為CID；碰撞能量為35％；二級掃描為離子阱；掃描速度為Normal。
將一級、二級譜圖用Peaks軟體進行de novo解析，獲得初步的胺基酸序列結果。
具體方法為採用SwissProt人資料庫(20197條序列)和添加的該單抗蛋白胺基酸序列合併後進行蛋白質鑑定。鑑定採用Peaks Studio 8.0軟體，設置參數如下：酶解方式為胰蛋白酶；質量容差一級為7ppm；二級為0.05Da；固定修飾包括：還原烷基化：半胱氨酸+57Da；可變修飾:氧化甲硫氨酸+16Da，脫醯胺化天冬醯胺、穀氨醯胺+0.98Da；結果質控方式：譜圖水平1％假陽性率。差異比較採用PEAKS Q非標記定量算法，基於一級譜峰峰面積強度進行肽段定量並整合為蛋白質的差異信息，歸一化對添加單抗蛋白強度計算後以此歸一化，結果取倍數變化大於2倍結果進行差異蛋白選取。
步驟三，採用多種蛋白酶進行酶解，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及為了鑑定到N-糖基化位點而進行的PNGase F酶串聯胰蛋白酶切。糜蛋白酶具體條件與過程與胰蛋白酶基本一致，只是在酶反應時間上略有區別。糜蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時。
Glu-C和Lys-C酶解，1-4步驟與胰蛋白酶酶解步驟一致。
5.用10mL水，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重複加入20次。
6.加入還原烷基化後的樣品到平衡後的NAP-5柱子中，棄去流出的餾分。
7.用800μL水洗脫，並收集洗脫液。
8.取200μL洗脫液，加入磷酸鹽緩衝液，終濃度為100mM。根據樣品濃度，加入Glu-C，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時，使蛋白酶解成肽段。
9.另取200μL洗脫液，加入碳酸氫銨緩衝液，終濃度為50mM。根據樣品濃度，加入Lys-C，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時，使蛋白酶解成肽段。
10.將酶解後樣品分別進行冷凍乾燥，然後用50μL水重新溶解，加入進樣小瓶，待後續檢測。
PNGase F串聯胰蛋白酶酶解，1-7步驟均與Glu-C和Lys-C酶解一致。
8.在洗脫液中補加磷酸鹽緩衝液。根據樣品濃度，加入PNGase F，37℃孵育18小時；然後補加胰蛋白酶，蛋白：酶＝20:1，37℃孵育8小時。
9.將酶解後樣品進行冷凍乾燥，然後用100μl水重新溶解，加入進樣小瓶，待後續檢測。
MSE採集數據後可獲得所有肽段峰以及每個肽段的各個價態完整和碎裂的信息，具體數據採集方法為1色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH130C18(1.7μm，2.1mm×150mm)；流動相:A相為0.1％甲酸水溶液，B相為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫；3-93分鐘開始B相從0-35％，流速為0.2mL/min，柱溫65℃。
2質譜條件：ESI正離子模式，脫溶劑氣體溫度350℃，源溫度105℃，脫溶劑氣流速800L/h，毛細管電壓3kV，錐孔電壓25V，數據採集範圍m/z 50～2000。使用MSE採集方法，即在碰撞池內等頻率交替進行低碰撞能量(4V)和高碰撞能量(從25～40V的變化區間)切換，分別獲得各個肽段母離子一級質譜數據(MS)及其二級碎片數據(MSE)。用嵌入式輔助泵持續注射100fmol/mL的Glu1-血纖維蛋白肽B(GFP)溶液(乙腈∶水＝50∶50，含0.1％甲酸)，流速10μL/min，用於獲得Lockmass參比質量信號，以便對所測得的質量數進行實時校準。
步驟四，在UNIFI數據處理軟體中分析獲得的各個蛋白酶MSE數據，輸入初步的胺基酸序列，將數據處理後的序列覆蓋率進行分析。再結合人工對匹配到肽段的碎片離子的強度和數量進行分析，實現胺基酸序列的驗證。具體方法為分別選擇胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及PNGase F酶串聯胰蛋白酶切數據來確定單抗一級序列，考慮半酶切及漏切1個位點肽段對序列覆蓋率的貢獻。根據數據分別選擇酶解方式為胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C；半胱氨酸還原烷基化(+57.02Da)被選為固定修飾，N-去醯胺化(天冬氨酸和異天冬氨酸產物，+0.98Da；琥珀醯亞胺中間產物，-17.03Da)和甲硫氨酸-氧化(+15.99Da)被選為可變修飾，已知的存在於單抗中的寡糖也被選為可變修飾。母離子和碎片離子的質量偏差分別設為10ppm和20ppm。如果某肽段中至少有3個碎片離子與in-silico理論值相匹配，則認MSE二級質譜數據可確證該肽段的序列。
進一步，採用DDA模式進行肽段的色譜分離和質譜數據的採集。採用PepFinder分析處理數據，用已有的胺基酸序列進行匹配，判斷已有胺基酸序列是否正確；若錯誤率高則利用Peaks軟體對DDA質譜數據進行從頭測序的軟體分析。
進一步包括：採用多種蛋白酶分別酶解該單抗，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及PNGase F酶串聯胰蛋白酶切；採用MSE模式採集肽段數據去驗證de novo後的結果。
本發明提供的基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法，具體是充分利用質譜數據依賴性(DDA)和全信息串聯(MSE)採集各自優勢。將質譜DDA採集方法獲得的數據用Peaks軟體進行從頭測序(de novo)後，再用MSE採集獲得的數據進行胺基酸序列的驗證；單克隆抗體藥物分子量巨大達到了150KDa，儘管來源於相同IgG類型的單抗有部分序列是相同的，但是決定其與抗原的特異性識別和結合的CDR區，不同單抗藥物是截然不同的。由於分子特性不同，單抗的可變區胺基酸序列也可能存在差異。因此，研究單抗藥物的胺基酸序列是藥物研發最基本也是最重要的部分。目前有部分單抗的研發是基於已上市的單抗進行的優化和改造，無法得到已上市單抗的胺基酸序列無疑會給這類單抗藥物的研發造成困難。CFDA明確要求，單抗的生物類似藥必須要與原研藥有著完全相同的胺基酸序列，因此對原研單抗胺基酸序列的解析是生物類似藥研發中最基本的一步。單抗的胺基酸有時會發生修飾，將會影響藥物的安全性與有效性。想要分析這些修飾以實現藥物的質量分析首先要掌握單抗的胺基酸序列。然而，目前上市的很多單抗藥物均存在著胺基酸序列不公開，或公開的序列存在錯誤的問題。採用本發明能夠高效地實現對其胺基酸序列的測定，為單抗藥品的研發、生物類似藥研究和質量控制提供重要手段，實現了單抗藥物胺基酸序列的從頭測序(de novo)，打破壁壘。
通過質譜對完整蛋白進行分子量檢測(圖3)。如果分子量與預測的不同則可以直觀地發現胺基酸序列不正確。並且肽段鑑定中胺基酸序列覆蓋率未達到100％，因此該檢測是胺基酸序列必不可少的環節。從去卷積的結果圖4可以看到，峰1檢測分子量為150179.97Da，理論分子量為150179.56Da，峰2檢測分子量為150342.52Da，理論分子量為150341.70Da。可以看出峰1，2檢測與理論分子量的質量偏差均小於1Da。峰3和峰4的檢測分子量與理論分子量的差異很小，均在4Da以內。可以看出胺基酸序列應該是正確的。單抗由兩個輕鏈和兩個重鏈組成，在亞基水平檢測可以進一步驗證輕鏈和重鏈各自的胺基酸序列是否正確(圖5)。重鏈去卷積的結果圖6可以看到，峰1檢測分子量為50967.25Da，理論分子量為50968.35Da，質量偏差僅約1Da。峰2和3質量偏差分別為4.56Da和6.19Da。質量偏差小說明重鏈的胺基酸序列是正確的。輕鏈去卷積後的結果圖7可以看到，檢測分子量為24127.96Da，理論分子量為24127.47Da，質量偏差僅為0.5Da。說明輕鏈的胺基酸序列是正確的。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法流程圖。
圖2是本發明實施例提供的肽段VTITADESSTTAYMELSSLR的二級譜圖解析示意圖。
圖3是本發明實施例提供的完整蛋白質譜圖。
圖4是本發明實施例提供的去卷積後完整蛋白平均分子量解析圖；
圖中：峰1-4分別為G0F糖基化(2)，C末端賴氨酸缺失(2)，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化(2)；G0F糖基化(1)，G1F糖基化(1)，C末端賴氨酸缺失(2)，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化(2)；G1F糖基化(2)，C末端賴氨酸缺失(2)，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化(2)；G1F糖基化(1)，G2F糖基化(1)，C末端賴氨酸缺失(2)，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化(2)；「」代表修飾位點的個數。
圖5是本發明實施例提供的輕鏈和重鏈各自的胺基酸序列示意圖。
圖6是本發明實施例提供的去卷積後重鏈平均分子量解析圖；
圖中：峰1-3分別為G0F糖基化，C末端賴氨酸缺失，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化；G1F糖基化，C末端賴氨酸缺失，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化；G2F糖基化，C末端賴氨酸缺失，N末端穀氨醯胺焦穀氨酸化。
圖7是本發明實施例提供的去卷積後輕鏈平均分子量解析圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
如圖1所示，本發明實施例的基於質譜技術實現單克隆抗體藥物胺基酸序列的測序方法包括以下步驟：
S101：通過文獻檢索獲得該單抗IgG類型，CDR區、恆定區、可變區序列等信息；
S102：採用胰蛋白酶進行酶解，再通過DDA數據採集獲得高質量一級譜圖和二級譜圖，將一級、二級譜圖用Peaks軟體進行de novo解析，獲得初步的胺基酸序列結果；
S103：採用多種蛋白酶進行酶解，MSE採集數據後可獲得所有肽段峰以及每個肽段的各個價態完整和碎裂的信息；
S104：將獲得的更加全面的質譜數據與初步的胺基酸序列進行匹配，實現胺基酸序列的驗證。
酶解具體條件及過程為：
1.取單抗原液100μL(10mg/mL)，加水稀釋至樣品濃度為5mg/mL。
2.計算稀釋體積，使得樣品終體積為1ml，終濃度為1mg/mL，用7M鹽酸胍、250mM Tris、1mM EDTA(pH＝7.5)的蛋白變性緩衝液稀釋。
3.加入10μL 1M二硫蘇糖醇(DTT)到稀釋後樣品中，在37℃孵育1小時，使蛋白還原。
4.加入12μL 2.9M碘乙醯胺(IAA)到還原後的樣品中，在室溫下暗室反應40分鐘，使蛋白烷基化。然後加入30μL 1M DTT到烷基化後樣品中，終止反應。
5.用10mL 100mM Tris(pH＝7.5)酶解緩衝液，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重複加入20次。
6.加入500μL還原烷基化後的樣品到平衡後的NAP-5柱子中，每個樣品使用兩個NAP-5柱子，棄去流出的餾分。
7.對於每個NAP-5柱子，用800μL酶解緩衝液洗脫，並收集洗脫液。
8.根據樣品濃度，加入胰蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育1.5小時，使蛋白酶解成肽段。
9.將酶解後樣品進行冷凍乾燥，然後用100μL水重新溶解，加入進樣小瓶。
再通過DDA數據採集獲得高質量一級譜圖和二級譜圖。
具體數據採集方法為：
1色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH130C18(1.7μm，2.1mm×150mm)；流動相:A相為0.1％三氟乙酸水溶液，B相為0.09％三氟乙酸90％乙腈溶液；梯度洗脫；2-47分鐘B相從1-40％，流速為0.3mL/min，柱溫65℃。
2質譜條件:採用正離子模式，噴霧電壓為4.0kV；離子傳輸管溫度為325℃；S-lens為60％。掃描模式為DDA,選擇一級譜圖中相對強度最高的3個離子去做二級碎裂；一級掃描為Orbitrap；掃描範圍為m/z 200-2000；解析度為60K；碰撞模式為CID；碰撞能量為35％；二級掃描為離子阱；掃描速度為Normal。
將一級、二級譜圖用Peaks軟體進行de novo解析，獲得初步的胺基酸序列結果。
具體方法為採用SwissProt人資料庫(20197條序列)和添加的該單抗蛋白胺基酸序列合併後進行蛋白質鑑定。鑑定採用Peaks Studio 8.0軟體，設置參數如下：酶解方式為胰蛋白酶；質量容差一級為7ppm；二級為0.05Da；固定修飾包括：還原烷基化：半胱氨酸+57；可變修飾:氧化甲硫氨酸+16，脫醯胺化天冬醯胺、穀氨醯胺+0.98；結果質控方式：譜圖水平1％假陽性率。差異比較採用PEAKS Q非標記定量算法，基於一級譜峰峰面積強度進行肽段定量並整合為蛋白質的差異信息，歸一化對添加單抗蛋白強度計算後以此歸一化，結果取倍數變化大於2倍結果進行差異蛋白選取。
步驟三，採用多種蛋白酶進行酶解，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及為了鑑定到N-糖基化位點而進行的PNGase F酶串聯胰蛋白酶切。糜蛋白酶具體條件與過程與胰蛋白酶基本一致，只是在酶反應時間上略有區別。糜蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時。
Glu-C和Lys-C酶解包括：
1.取單抗原液100μL(10mg/mL)，加水稀釋至樣品濃度為5mg/mL。
2.計算稀釋體積，使得樣品終體積為1ml，終濃度為1mg/mL，用7M鹽酸胍、250mM Tris、1mM EDTA(pH＝7.5)的蛋白變性緩衝液稀釋。
3.加入10μL 1M二硫蘇糖醇(DTT)到稀釋後樣品中，在37℃孵育1小時，使蛋白還原。
4.加入12μL 2.9M碘乙醯胺(IAA)到還原後的樣品中，在室溫下暗室反應40分鐘，使蛋白烷基化。然後加入30μL 1M DTT到烷基化後樣品中，終止反應。
5.用10mL水，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重複加入20次。
6.加入還原烷基化後的樣品到平衡後的NAP-5柱子中，棄去流出的餾分。
7.用800μL水洗脫，並收集洗脫液。
8.取200μL洗脫液，加入磷酸鹽緩衝液，終濃度為100mM。根據樣品濃度，加入Glu-C，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時，使蛋白酶解成肽段。
9.另取200μL洗脫液，加入碳酸氫銨緩衝液，終濃度為50mM。根據樣品濃度，加入Lys-C，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小時，使蛋白酶解成肽段。
10.將酶解後樣品分別進行冷凍乾燥，然後用50μL水重新溶解，加入進樣小瓶，待後續檢測。
PNGase F串聯胰蛋白酶酶解包括：
1.取單抗原液100μL(10mg/mL)，加水稀釋至樣品濃度為5mg/mL。
2.計算稀釋體積，使得樣品終體積為1ml，終濃度為1mg/mL，用7M鹽酸胍、250mM Tris、1mM EDTA(pH＝7.5)的蛋白變性緩衝液稀釋。
3.加入10μL 1M二硫蘇糖醇(DTT)到稀釋後樣品中，在37℃孵育1小時，使蛋白還原。
4.加入12μL 2.9M碘乙醯胺(IAA)到還原後的樣品中，在室溫下暗室反應40分鐘，使蛋白烷基化。然後加入30μL 1M DTT到烷基化後樣品中，終止反應。
5.用10mL水，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重複加入20次。
6.加入還原烷基化後的樣品到平衡後的NAP-5柱子中，棄去流出的餾分。
7.用800μL水洗脫，並收集洗脫液。
8.在洗脫液中補加磷酸鹽緩衝液。根據樣品濃度，加入PNGase F，37℃孵育18小時；然後補加胰蛋白酶，蛋白：酶＝20:1，37℃孵育8小時。
9.將酶解後樣品進行冷凍乾燥，然後用100μl水重新溶解，加入進樣小瓶，待後續檢測。
MSE採集數據後可獲得所有肽段峰以及每個肽段的各個價態完整和碎裂的信息，具體數據採集方法為：
1色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH130C18(1.7μm，2.1mm×150mm)；流動相:A相為0.1％甲酸水溶液，B相為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫；3-93分鐘開始B相從0-35％，流速為0.2mL/min，柱溫65℃。
2質譜條件：ESI正離子模式，脫溶劑氣體溫度350℃，源溫度105℃，脫溶劑氣流速800L/h，毛細管電壓3kV，錐孔電壓25V，數據採集範圍m/z 50～2000。使用MSE採集方法，即在碰撞池內等頻率交替進行低碰撞能量(4V)和高碰撞能量(從25～40V的變化區間)切換，分別獲得各個肽段母離子一級質譜數據(MS)及其二級碎片數據(MSE)。用嵌入式輔助泵持續注射100fmol/mL的Glu1-血纖維蛋白肽B(GFP)溶液(乙腈∶水＝50∶50，含0.1％甲酸)，流速10μL/min，用於獲得Lockmass參比質量信號，以便對所測得的質量數進行實時校準。
下面結合具體實施例對本發明的應用原理作進一步的描述。
1文獻檢索與整理
通過文獻檢索得到了三篇包含有該單抗胺基酸序列相關信息的文獻。分別是：1Characterization of a recombinant monoclonal antibody by mass spectrometry combined with liquid chromatography.Journal of Chromatography B,752(2001)247-261；2Humanization of a mouse monoclonal antibody that blocks the epidermal growth factor receptor:recovery of antagonistic.Immunotechnology 3(1997)71-81；3Nimotuzumab,an Antitumor Antibody that Targets the Epidermal Growth Receptor,Blocks Ligand Binding while Permitting the Active Receptor Conformation.Cancer Research,69(2009)5851-5857。
通過文獻整理獲得了該單抗的大致的胺基酸序列。如下所示：
輕鏈
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鏈
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2DDA模式採集數據和de novo測序
將該單抗進行了還原烷基化和胰酶酶解，採用DDA模式(儀器：UPLC-Obitrap Elite)進行肽段的色譜分離和質譜數據的採集。採用PepFinder分析處理數據，用已有的胺基酸序列進行匹配。發現鑑定覆蓋率輕鏈為90.0％，重鏈為86.1％。而且對於單抗發揮結合活性至關重要的CDR區的19個胺基酸序列未鑑定到。利用Peaks軟體對DDA質譜數據進行從頭測序(de novo)的軟體分析。Peaks軟體從人的蛋白資料庫、Ig G的類型、文獻中獲得的胺基酸序列、DDA採集的一級二級譜圖等方面進行解析和匹配獲得了該單抗藥物的胺基酸序列。並提示可能發生的胺基酸替換、增加或缺失。主要是輕鏈ETVAAPSVFIFPPSDEQLK這條肽鏈上的第一個胺基酸E是多餘的，另外在重鏈CDR區上也有幾個胺基酸可能發生了突變。獲得了該單抗可能的胺基酸序列。
3MSE模式採集數據和胺基酸序列驗證
採用多種蛋白酶分別酶解該單抗，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及為了鑑定到N-糖基化位點而進行的PNGase F酶串聯胰蛋白酶切。採用MSE模式(儀器：UPLC-Synapt G2-s)採集肽段數據去驗證de novo後的結果，結果顯示鑑定覆蓋率大大提高，由原來的輕鏈90.0％提高到了99.09％，重鏈86.1％提高到了97.57％。CDR區的序列均被鑑定到。表1顯示了多種蛋白酶酶解產生肽段經MSE模式數據採集鑑定的胺基酸覆蓋率。
表1
此外，藉助了MSE採集數據進一步驗證肽段胺基酸序列時，一個胺基酸的交換被發現。通過DDA數據採集de novo分析獲得重鏈上的一條肽段為VTITADESTSTAYMELSSLR(加粗部分代表錯誤的胺基酸序列)。藉助MSE數據採集獲得的更為全面的二級碎裂信息。找到了其中至關重要的y11這個碎片離子，證明胺基酸的順序應該為ST(如圖2所示)。
通過以上方法最終獲得的該單抗的胺基酸序列如下所示
輕鏈
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鏈
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4完整蛋白水平的驗證
通過質譜對完整蛋白進行分子量檢測(圖3)。如果分子量與預測的不同則可以直觀地發現胺基酸序列不正確。並且肽段鑑定中胺基酸序列覆蓋率未達到100％，因此該檢測是胺基酸序列必不可少的環節。從去卷積的結果圖4可以看到，峰1檢測分子量為150179.97Da，理論分子量為150179.56Da，峰2檢測分子量為150342.52Da，理論分子量為150341.70Da。可以看出峰1，2檢測與理論分子量的質量偏差均小於1Da。峰3和峰4的檢測分子量與理論分子量的差異均在4Da以內。由於峰3和峰4信號強度遠遠低於峰1和峰2，因此它們檢測與理論分子量的偏差較峰1和峰2大，但均在可接收的範圍內。可以看出胺基酸序列應該是正確的。
5還原輕/重鏈水平的驗證
單抗由兩個輕鏈和兩個重鏈組成，在亞基水平檢測可以進一步驗證輕鏈和重鏈各自的胺基酸序列是否正確(圖5)。重鏈去卷積的結果圖6可以看到，峰1檢測分子量為50967.25Da，理論分子量為50968.35Da，質量偏差僅約1Da。峰2和峰3分別為4.56Da和6.19Da。質量偏差小說明重鏈的胺基酸序列是正確的。輕鏈去卷積後的結果圖7可以看到，檢測分子量為24127.96Da，理論分子量為24127.47Da，質量偏差僅為0.5Da。說明輕鏈的胺基酸序列是正確的。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。