用於生成莫納甜異構體及其前體的多肽和生物合成途徑的製作方法

2023-06-21 00:57:16

專利名稱：：用於生成莫納甜異構體及其前體的多肽和生物合成途徑的製作方法
技術領域：
：本發明提供了可用於生成D-色氨酸，噴噪-3-丙酮酸，R-2-羥基-2-(n引哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(R-MP)和某些莫納甜(monatin)異構體，如R,R和S，R莫納甜及其鹽的多肽和生物合成途徑。
背景技術：
：莫納甜是一種高強度甜味劑，其具有如下化學結構式莫納甜含有兩個手性中心導致其具有四種可能的立體異構構型。R，R構型("R，R立體異構體"或"R,R莫納甜，，)；S,S構型("S，S立體異構體"或"S，S莫納甜")；R,S構型("R,S立體異構體"或"R,S莫納甜")；和S,R構型("S,R立體異構體"或"S，R莫納甜")。在本文中，除非另有規定，所用的術語"莫納甜"是指包括所有四種莫納甜立體異構體的組合物，含有任何莫納甜立體異構體組合(例如僅含有莫納甜的R，R和S，S異構體)，以及單種異構體形式的組合物。為清楚說明，按以上所示將莫納甜的碳骨架編號，與醇基直接共價連接的碳被稱為2位碳而與氨基直接共價連接的碳被稱為4位碳。因此，除非另有說明，本文所涉及的R,R莫納甜，S，S莫納甜，R，S莫納甜，和S,R莫納甜分別是指2R,4R莫納甜，2S，4S莫納甜，2R,4S莫納甜，和2S，4R莫納甜。應注意的是，在文獻中，還採用了另一習慣對莫納甜碳骨架編號，與醇基相連的碳是4位碳，而與氨基相連的碳是2位碳。因此，例如，在本文中所涉及的2S,4R莫納甜與採用另一編號習慣的文獻中所涉及的2R，4S莫納甜是一樣的。而且，由於各種命名習慣，莫納甜具有多個可供選擇的化學名稱，包括2-羥基-2-(卩引哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羥基-2-(111』引哚-3-甲基)-戊二酸；4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)穀氨酸；和3-(1-氨基-1,3-二羧基-3-羥基-4-丁基)吲哚。在南非德蘭士瓦地區的南非灌木似冬青葉硬木朔GScWerac/7to"///"/0//""植物的根皮中可發現某些莫納甜的異構體形式。美國專利申請No.l0/422,366('366申請")，10/979,821('821申請")，禾n11/114，922('922申請)中特別公開了用於體內和體外生成莫納甜的多肽，途徑和微生物，這些文獻被引入本文作為參考。發明簡述本發明特別提供了可用於生成D-色氨酸，卩引哚-3-丙酮酸，R-2-羥基-2-(口引哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也被稱為R-a酮酸莫納甜，R-莫納甜前體，R-MP，和莫納甜的a酮形式)和某些莫納甜立體異構體，如R,R和S，R莫納甜，和其鹽的多肽和生物合成途徑。該方法包括採用一種或多種多肽，尤其是酶，例如消旋酶(如穀氨酸消旋酶，天冬氨酸消旋酶和丙氨酸消旋酶)，寬特異性D-氨基轉移酶(也稱為D-丙氨酸氨基轉移酶，D-胺基酸氨基轉移酶和D-天冬氨酸氨基轉移酶)，L-氨基轉移酶(包括L-色氨酸氨基轉移酶，L-芳族氨基轉移酶，L-天冬氨酸氨基轉移酶和L-丙氨酸氨基轉移酶)，醛縮酶(如，R-特異性醛縮酶)，D-苯基甘氨酸氨基轉移酶(也稱為D-4-羥苯基甘氨酸氨基轉移酶)，D-甲硫氨酸氨基轉移酶，穀氨酸脫羧酶，天冬氨酸脫羧酶和天冬氨酸-4-脫羧酶來生成富含4R異構體形式的莫納甜組合物和/或不使用化學計量的D-胺基酸底物作為MP胺化的胺基酸來源以生成R,R莫納甜。為力求簡練，在說明書和權利要求中鑑定形成了中間物/產物(如莫納甜或莫納甜前體)時，術語"和/或其鹽"應理解成包括在可適用情況。換句話說，例如，短語"吲哚-3-丙酮酸被轉化成MP"應理解成"吲哚-3-丙酮酸被轉化成MP和/或其鹽"。事實上，普通技術人員應明白在所示的反應條件下中間物/產物的鹽類實際上是存在的或同時存在的。根據某些實施方式，所述方法生成莫納甜組合物，其中組合物中莫納甜成分僅包括莫納甜的R，R和S，R形式。當使用術語"僅"表示僅形成特定的異構體時，除非另有規定，如果不發生外消旋作用，該途徑僅生成鑑定的異構體。因此，術語"僅"不應用於表示缺乏其它異構體，而是普通技術人員應理解成其它異構體形式可能以相對小量存在，因為可能發生外消旋作用。根據某些實施方式，所述方法生成莫納甜組合物，其中組合物中莫納甜成分僅包含莫納甜的R,R形式(這意味著除非發生外消旋作用才導致形成其它異構體形式)。在本文中，短語"莫納甜組合物"是指含有一種或多種莫納甜異構體的組合物；該術語還可以表示僅含有單種莫納甜異構體形式而不含其它(取決於上下文)的組合物。根據本發明，在某些實施方式中，提供了一種生成莫納甜組合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸("莫納甜前體"或"MP")，和由MP生產莫納甜。由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反應是經酶促進的，該酶以L-色氨酸作為底物比R-MP，R,R莫納甜，或兩者時具有更強的特異性，更高的活性。根據特定的實施方式，吲哚-3-丙酮酸的反應是由具有R特異性醛縮酶活性的酶所促進的，從而生成R-MP。根據特定實施方式，提供了一種消旋酶，其可促進在L-色氨酸轉氨基反應中形成的副產物胺基酸(或其是由色氨酸反應的副產物另一種胺基酸所形成)的由一種異構體形式至另一種異構體形式的差向立體異構反應。在本發明的某些實施方式中，提供了一種生成莫納甜組合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羥基-2-([1引哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸("莫納甜前體"或"MP")，和由MP生產莫納甜。由L-色氨酸生成噴哚-3-丙酮酸的反應是經酶促進的，該酶以L-色氨酸作為底物比R-MP，R,R莫納甜，或兩者時具有更強的特異性，更高的活性，而由MP形成莫納甜的反應是經對R-MP有立體選擇性的酶所促進的。應該注意的是，對於前述段落中涉及的一系列反應，本發明不需要明確10地執行每個步驟；實質地執行這些步驟即可。換句話說，例如，生成莫納甜組合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羥基-2-(卩引哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸("莫納甜前體"或"MP")，和由MP生產莫納甜，其中每個反應都由適當的酶來促進，通過將L-色氨酸和酶組合併設定好條件以使所列的反應得以發生。在這種情況下L-色氨酸能反應生成吲哚-3-丙酮酸，經L-色氨酸反應生成的吲哚-3-丙酮酸可反應形成MP,而經吲哚-3-丙酮酸反應生成的MP可反應形成莫納甜。該方法還可通過以下方式進行，通過提供能生成L-色氨酸的化合物，在適宜L-色氨酸生成的條件下進行並將該化合物與能夠促進一系列反應的酶組合，在適宜這些反應發生的條件開始反應。按另一種方式，該方法可通過提供按所述途徑能產生莫納甜的經基因工程改造的微生物，並為發酵過程的發生提供適宜的條件。例如，將能天然生產大量L-色氨酸(或D-色氨酸)的微生物進行基因工程改造以生成或過量生成一種或多種可用於促進莫納甜途徑中反應的酶，並提供適宜的條件以使微生物能產生莫納甜。在本發明的另一實施方式中，提供了一種生成莫納甜的方法，其中在L-色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸，剛哚-3-丙酮酸反應形成MP(其包括R-MP和S-MP優選只包括或主要包括R-MP)時a酮酸底物形成了一種L-胺基酸，而在R-MP轉化成R，R莫納甜時L-胺基酸反應再生成(也稱為"再循環")a酮酸底物。R-MP形成R,R莫納甜的反應是由立體轉化(stereoinverting)氨基轉移酶如D-甲硫氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄41)或源於D-苯基甘氨酸氨基轉移酶的酶所促進的。在本發明的另一實施方式中，提供了一種生成莫納甜組合物的方法，其包括由L-色氨酸生成D-色氨酸，由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成R-MP，並由R-MP生成R,R莫納甜。L-色氨酸生成D-色氨酸是由色氨酸消旋酶和功能相當的酶促進的。在特定實施方式中，D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸和MP生成莫納甜的反應是由相同的酶促進的。在其它的進一步實施方式中，n引哚-3-丙酮酸的反應是由具有R特異性醛縮酶活性的酶促進的從而形成R-MP，而D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸和R-MP生成R，R莫納甜的反應是由相同的酶促進的。ii在本發明的其它實施方式中，披露了一種生成R，R莫納甜或其鹽的方法，包括，或基本由(a)利用色氨酸消旋酶(消旋酶應對莫納甜活性受限或沒有活性)由L-色氨酸生成D-色氨酸，(b)由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，(c)由吲哚-3-丙酮酸生成R-莫納甜前體，和(d)由R-莫納甜前體生成R,R莫納甜組成。儘管公開了多種實施方式，本發明的其它實施方式對於本領域技術人員基於說明書而言是明顯的。由本文說明書應該認識到，本發明可以從多方面進行改變，而不偏離本發明的實質和範圍。因此，附圖和詳細描述應被認為是對特性的例舉性說明而非限制。附圖簡述圖1顯示的是本發明中由L-色氨酸生成R,R莫納甜的酶促反應過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括在L-色氨酸反應中採用L-氨基轉移酶(實例包括L-色氨酸氨基轉移酶，L-芳族氨基轉移酶，L-天冬氨酸氨基轉移酶，和L-丙氨酸氨基轉移酶)，其在以L-色氨酸為底物時比以R-MP和/或具有對底物R,R莫納甜的限制活性和/或選擇性的L-胺基酸氧化酶為底物具有更高的特異性和/或選擇性。圖2顯示的是本發明中生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括採用對R-MP具有立體選擇性的酶將R-MP轉化成莫納甜。圖3顯示的是本發明中由L-色氨酸生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括利用色氨酸消旋酶將L-色氨酸轉化成D-色氨酸並將反應產物D-胺基酸聯繫反應形成吲哚-3-丙酮酸，以此作為底物反應形成R,R莫納甜。圖4顯示的是本發明中由L-色氨酸生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括將與L-色氨酸反應聯接的反應中形成的L-胺基酸轉化為D-胺基酸；該D-胺基酸作為R-MP轉化成R,R莫納甜反應中的氨基供應者。圖5顯示的是本發明中由L-色氨酸生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括採用立體轉化酶促進的R-MP向R，R莫納甜的轉化，以使與L-色氨酸反應聯接的反應中形成的L-胺基酸可作為與R-MP向R，R莫納甜反應聯接的反應的底物。圖6顯示的是本發明中生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括再循環反應中生成的L-胺基酸以形成吲哚-3-丙酮酸，再以D-胺基酸作為反應物與R-MP通過一系列轉化反應形成R，R莫納甜。圖7顯示的是本發明中生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括通過將反應的副產物L-胺基酸轉化成另一種產物來推動L-色氨酸反應的發生(即將該反應朝生成吲哚-3-丙酮酸的方向推動)。在這個實例中，L-天冬氨酸的副產物L-胺基酸在脫羧酶促進的可逆反應中被轉化成L-丙氨酸。圖8顯示的是本發明中生成R,R莫納甜的另一過程的實例流程圖。在這個實例中，過程包括再循環L-色氨酸反應副產物胺基酸，通過一系列轉化反應以胺基酸作為R-MP反應的反應物。圖9(A和B)顯示的是多種公開的芽孢桿菌D-胺基酸氨基轉移酶("DAAT")的胺基酸序列比對。劃線的胺基酸代表同源區。根據保守區設計了五對PCR引物。PCR引物如下5'GAAGACCGTGGTTATCAATTT3'(SEQIDNO:65)(正向引物，如圖9A所示的Fl)，5'GATGGTATTTACGAAGTAATC3'(SEQIDNO:66)(正向弓l物，如圖9A所示的F2)，5'AGATTTAATATCACAACGTAAC3'(SEQIDNO:67)(反向引物，如圖9A所示的Rl)，5'GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA3'(SEQIDNO:68)(反向引物，如圖9A所示的R2)，5'ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG3'(SEQIDNO:69)(反向引物，如圖9B所示的R3)。圖10(A和B)顯示的是來自於球形芽孢桿菌(及^^am'cz^)DAAT的ATCC4978和ATCC7063的兩種新型DAAT的胺基酸序列比對(實施例18所克隆的)。劃線的是非同源胺基酸。發明詳述縮寫與術語以下所提供的術語和方法的解釋是為更好地描述發明並引導本領域技術人員實踐本發明。本文所用的，"包括(including)"表示"包括(comprising)"。任何使用術語"包括"的地方，都應理解成"包括但不限於"的意思，而無論是否明確指出了"不限於"。此外，單數形式的"一"或"該"包括複數情況除非文中另有明確規定。例如，涉及"包括一種蛋白質"則包括一種或多種這類蛋白，而涉及"所述細胞"則包括一種或多種細胞和本領域技術人員已知的等效情況，等等。術語"大約"包含在任何測量中發生的實驗性誤差範圍。除非另有規定，推定在所有測量數據前都有"大約"，即使並未明確使用"大約"這個詞。保守替換在多肽中以另一種胺基酸替換一種胺基酸，該替換對多肽活性幾乎沒有影響。該替換被認為是保守的而不管交換的胺基酸是否表現出結構或功能的相似性。例如，理想地，包括一個或多個保守替換的色氨酸氨基轉移酶多肽鏈保持了色氨酸氨基轉移酶活性。可採用例如標準方法如位點定向誘變或PCR或本領域公知的方法通過操作編碼多肽的核苷酸序列來製備含有一個或多個保守替換的多肽。胺基酸可被蛋白中的新胺基酸替換其若對多肽活性幾乎沒有影響則被認為是保守替換，這類非限制實例包括以ser或thr替換Ala;以gln，his，或lys替換arg;以glu，gln，lys，his,asp替換asn;以asn，glu，或gln替換asp;以ser或ala替換cys;以asn，glu，lys,his,asp，或arg替，奐gln;以asn，gln，lys，或asp替換glu;以pro替換gly;以asn，lys，gln，arg，tyr替換his;以leu，met,val，phe替換ile;以ile，met，val，phe替換leu;以asn，glu，gln，his，arg替換lys;以ile，leu，val，phe替換met;以trp，tyr，met，ile，或leu替換phe;以thr，ala替換ser;以ser或ala替換thr;以phe，tyr替換trp;以his，phe，或trp替換tyr;而以met，ile，leu替換val。在其它文獻中Ben-Bassat等，J.Bacteriol.169:151-151，(1987);O'Regan等，Gene77:237-251，(1989);Sahin-Toth等，ProteinSci3:240-247，(1994);Hochuli等，Bio/Technology(5:1321-1325，(1988);WO00/67796(Curd等)和遺傳學和分子生物學教科書中可發現更多的關於保守替換的信息。源自就說明書和權利要求而言，如果符合下列情況中的任何一種或多種則一種物質是"源自"生物體或來源1)該物質存在於生物體/來源中；2)該物質從天然宿主中移除；或3)該物質從天然宿主移除並通過例如突變而發展。分離的本文所用的術語"分離的"是指從它的天然宿主中移除的任何物質；該物質無需表現出任何特定的純度。例如"分離的核酸"是指沒有直接與兩端序列連接的天然存在的核酸，在其所源自的天然存在的生物體基因組中它是直接連接的(一在5'端和一在3'端)。例如，分離的核酸可以是但不限於任意長度的重組DNA分子，倘若一段核酸序列被發現正常地直接側向連接則天然存在的基因組中的重組DNA分子被移除或缺失。因而，分離的核酸包括但不限於:不依賴其它序列而以獨立分子存在的重組DNA(例如經PCR或限制性內切酶處理而生成的cDNA或基因組DNA片段)以及被整合入載體，自主複製質粒，病毒(例如逆轉錄病毒，腺病毒，或皰疹病毒)，或併入原核細胞或真核細胞基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可包括是雜交或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。本文所用的涉及核酸的術語"分離的"還包括任何非天然存在的核酸，因為非天然存在的核酸在自然中未被發現並且在天然存在的基因組中沒有可直接聯接的序列。例如，非天然存在的核酸如工程核酸被認為是分離核酸。可利用普通的分子克隆或化學核酸合成技術來製備工程核酸。分離的非天然存在的核酸可不依賴於其它序列，或被整合入載體，自主複製的質粒，病毒(例如逆轉錄病毒，腺病毒，或皰疹病毒)，或原核細胞或真核細胞基因組DNA。此外，非天然存在的核酸可包括是雜交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。存在於例如cDNA或基因文庫，或含有基因組DNA限制性酶消化物的凝膠切片中的成千上萬其它核酸分子之中的核酸不被認為是分離核酸。純化的本文所用的術語"純化的"是指雜質已從感興趣的樣品中去除。術語"純化的"不要求絕對純度，而是相對性術語，除非文中另有指示。因而，例如，純化的多肽或核酸製備物是一種其中的目標多肽或核酸比多肽或核酸15的生物體天然環境擁有更高濃度或比其所出處的環境擁有更高濃度的物質。立體轉化氨基轉移酶"立體轉化氨基轉移酶"是一種可以優選地或選擇性地生成手性胺基酸產物(如莫納甜)並採用相反的手性底物作為氨基供應者的多肽。例如，立體轉化氨基轉移酶可以是D-苯基甘氨酸氨基轉移酶(也稱為D-4-羥苯基甘氨酸氨基轉移酶)其可優選地或選擇性地以L-穀氨酸作為底物以生成R,R莫納甜。立體轉化氨基轉移酶的非限制性實例包括D-甲硫氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄41)和具有D-苯基甘氨酸氨基轉移酶活性或D-4-羥苯基甘氨酸氨基轉移酶活性的酶。互補基因"互補基因"是被表達時可使生物體突變無效的基因。例如，如果生物體在一段基因中有細胞合成色氨酸所要求的無效突變，互補基因則是其被表達時可使菌株在基礎培養基(即沒有色氨酸)中生長。立體選擇性酶"立體選擇性酶"是相對於對另一種異構體的特異性和/或活性，其對一種異構體具有更強的特異性和/或更高的活性的酶。例如，一種立體選擇性酶是一種對R-MP具有比對S-MP更高的特異性和/或活性的酶。在優選的實施方式中，相對於另一異構體，立體選擇性酶對一種異構體具有限制活性。"限制"活性表示活性是最小的或不可覺察的，例如在本文中實驗所測定的。例如，實施例6確定了HEXAspCP9T/R122G是對S，S莫納甜具有限制活性的一種酶。實施例8確定了苜蓿中華根瘤菌(S.mdiloti)TatA是對S-MP具有限制活性的另一種酶。在實施例18中，耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)D-氨基轉移酶對R-MP具有比對S-MP更高的選擇性，可生成更高立體純度的R，R莫納甜。還有，實施例19表明了相對於R-MP，雜合DAT對S-MP具有限制活性。同源的本文所用的術語"同源的"表示當採用標準方法比對兩組序列時，蛋白或核酸表現出與另一蛋白或核酸的序列具有很大程度的序列同一性。例如，當採用標準方法比對兩組序列時，若R特異性醛縮酶含有與SEQID22的醛縮酶至少約50%的序列同一性，則R特異性醛縮酶與SEQID22的醛縮酶是同源的。EC編號酶的分類編號是由生物化學與分子生物學國際聯合會所確定。生成R，R莫納甜和莫納甜的其它立體異構體的生物合成途徑特別如WO03/091396A2(參見例如圖1-3和11-13)所述，通過涉及生物轉化(即以多肽促進底物至產物的反應)的多步驟途徑可由色氨酸生成莫納甜。所述的途徑包括色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的生物轉化，噴哚-3-丙酮酸向2-羥基-2-(B引哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸("MP，，)的生物轉化，和MP向莫納甜的生物轉化。本發明中用於生成莫納甜的生物合成途徑可包括，或基本由以下的一個或多個步驟，機制和/或途徑組成。下述的步驟，機制和/或途徑將被僅視為是示例性的。生成莫納甜或其鹽的方法包括(a)由色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，(b)由吲哚-3-丙酮酸生成莫納甜前體，和(c)由莫納甜前體生成莫納甜。可用於將色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的酶包括酶分類("EC")2.6丄27，1.4.1.19，1.4.99.1，2.6.1.28，1.4.3.2，1.4.3.3，2.6.1.5，2.6.1,，2.6.1.1，2.6.1.21和3.5.1.-的成員。這類別包括多肽如色氨酸氨基轉移酶，其將L-色氨酸和a-KG(即a-酮戊二酸，也稱為2-酮戊二酸)轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-穀氨酸；D-色氨酸氨基轉移酶，其將D-色氨酸和2-酮酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸；色氨酸脫氫酶，其將L-色氨酸和NAD(P)轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H;D-胺基酸脫氫酶，其將D-胺基酸和FAD轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2;色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶，其將L-色氨酸和苯丙酮酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-胺基酸氧化酶，其將L-胺基酸和H20和02轉化成2酮酸和NH3和H202;D-胺基酸氧化酶，其將D-胺基酸和H20和02轉化成2酮酸和NH3和H202;和色氨酸氧化酶，其將L-色氨酸和H20和02轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H202。這類別還包括酪氨酸(芳族)氨基轉移酶，天冬氨酸氨基轉移酶，D-胺基酸(或D-丙氨酸)氨基轉移酶，和具有多種氨基轉移酶活性的寬(多底物)氨基轉移酶，其中一些可以將色氨酸和2酮酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸。此外，這類別包括苯丙氨酸脫氨酶，在水的參與下其可將色氨酸轉化成剛哚-3-丙酮酸和銨。由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸還可由一種或多種對底物L-色氨酸比對MP或莫納甜具有更高的活性，更高的特異性或兩者的酶來促進。對底物L-色氨酸比對MP或莫納甜具有更高的活性和/或更高的特異性的酶實例包括但不限於L-色氨酸氨基轉移酶，L-芳族氨基轉移酶，L-天冬氨酸氨基轉移酶，和L-胺基酸氧化酶。用於將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP的酶包括酶分類EC4.1.3,，4丄3.16，4丄3.H，和4丄2.-的成員。這類別包括碳碳合酶/裂合酶，如可促進兩個羧酸底物縮合的醛縮酶。酶分類EC4丄3,是那些利用酮酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電試劑形成碳碳鍵的合酶/裂合酶。例如，已知KHG醛縮酶(EC4丄3.16)和ProA醛縮酶(EC4丄3.17)可將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸轉化成MP。儘管ProA醛縮酶被認為是只表示源自睪丸酮叢毛單胞桿菌(Comamo"wtototow7/)的4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶，本文中術語ProA醛縮酶被用於表示任何具有4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶活性的多肽，除非另有規定。Pro醛縮酶的適宜實例包括睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA(SEQIDNO.l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列》和苜蓿中華根瘤菌ProA(NCBI登錄號CAC46344)，或表現出與睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA(SEQIDNO:l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列))和/或苜蓿中華根瘤菌ProA(NCBI登錄號CAC46344)同源的酶。例如，適宜的酶具有與睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA(SEQIDNO:2)和/或苜蓿中華根瘤菌ProA(NCBI登錄號:CAC46344)至少約40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，禾口/或99%胺基酸序列同一性。還可通過化學反應如醛縮合生成MP。可用於將MP轉化成莫納甜的酶包括酶分類(EC):色氨酸氨基轉移酶(2.6丄27)，色氨酸脫氫酶(1.4丄19)，D-胺基酸脫氫酶(1.4.99.1)，穀氨酸脫氫酶(1.4丄2-4)，苯丙氨酸脫氫酶(1.4丄20)，色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(2.6丄28)的成員，或氨基轉移酶家族(2.6丄-)中更普通的成員如天冬氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄1)，酪氨酸(芳族)氨基轉移酶(2.6丄5)，D-色氨酸氨基轉移酶，或D-丙氨酸(2.6.1.21)氨基轉移酶(參見WO03/091396A2的附圖2)。還可採用化學反應來進行該反應。利用氨和硼氫化鈉通過還原胺化進行酮酸(MP)的胺化。WO03/091396A2的附圖11-13顯示了可用於將MP轉化成莫納甜的其它多肽，並可提供由吲哚-3-丙酮酸或色氨酸生成莫納甜的更高產量。莫納甜組合物的味覺特徵可通過調控組合物中各種莫納甜立體異構體的相對量而改變。本發明提供了生成具有理想的R,R莫納甜和/或S，R莫納甜百分比的莫納甜組合物的途徑和物質。18經本文所述途徑生成的莫納甜化合物的手性可通過pH和生物轉化中所用的多肽而改變。當採用生物合成途徑形成莫納甜時，需考慮以下內容。在生物促進反應中，莫納甜碳2的手性(參見上文的化學結構)是由將B引哚-3-丙酮酸轉化成MP的酶所決定的。多種酶(例如來自於EC4丄2.-，4丄3,)可將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP。因而，可選擇能形成所需異構體的酶。此外，吲哚-3-丙酮酸轉化成MP的酶的對映特異性可通過使用可被工程改造成能促進所需反應的定向發展或促進抗體而被改進。一旦生成MP(通過酶促或化學縮合)，可立體特異性地添加氨基。取決於使用的是D-或L-芳族酸氨基轉移酶可生成碳4的R或S構型(參見上文的化學結構)。許多氨基轉移酶是對L-異構體特異的，而D-色氨酸氨基轉移酶存在於特定的植物中(KohibaandMito，Proceedingsofthe8thInternationalSymposiumonVitaminB6andCarbonylCatalysis,Osaka,Japan1990)。此夕卜，D-丙氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄21)，D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基轉移酶(EC2.6丄41)和(R)-3-氨基-2-甲基丙酸酯氨基轉移酶(EC2.6丄61)，(S)-3-氨基-2-甲基丙酸酯氨基轉移酶(EC2.6丄22)己被鑑別。某些氨基轉移酶可能只接受具有特定C2碳構型作為該反應的底物。因此，即使向MP的轉化不是立體特異性的，最終產物的立體化學可通過選擇適宜的氨基轉移酶而被控制。因為反應是可逆的，未反應的MP(非期望的異構體)可被循環回它的成分，並再形成消旋的MP混合物。現在參照附圖，應注意以下問題。流程圖是生成莫納甜途徑的實例，而附圖中顯示的途徑和本發明的方法不限於實踐途徑的任何特定的方法，除非另有規定。例如，途徑可在體內，體外或它們的結合中實施。另外，利用本文公開的一種或多種途徑來實施本發明的方法不要求每個成分(如反應物和酶)都準確地和由實施者提供的一樣；而是，給組合物(或宿主細胞)提供成分(或成分源)，和反應條件或其它有效條件以使途徑能被有效實施即可。換句話說，例如，在附圖中描述了生成莫納甜組合物的過程，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羥基-2-(B引哚一3-基甲基)-4-酮戊二酸("莫納甜前體"或"MP")，和由MP生產莫納甜，其中每個反應都由適應的酶來促進，可以設想實施該途徑包括將L-色氨酸和a-酮戊二酸和預期用於促進同一反應酶組合，而在適宜於每個反應發生的條件哚-3-丙酮酸或MP。在這種情況下L-色氨酸能與a-酮戊二酸反應生成n引哚-3-丙酮酸。根據條件和所提供的酶，經L-色氨酸反應生成的吲哚-3-丙酮酸可反應形成MP，而再根據條件和所提供的酶，經吲哚-3-丙酮酸反應生成的MP可反應形成莫納甜。應該注意的是利用本文公開的一種或多種途徑來實施本發明的方法不要求實施者準確地提供確定的起始物質或酶，如果這些原料或酶已經存在或是有效可用，或可以從反應體系中已經存在或有效可用的物質合成而來。換句話說，構想了實施確定以L-色氨酸作為起始物質的任何途徑包括提供能生成L-色氨酸的化合物，在適宜L-色氨酸生成的條件下進行並將該化合物與能夠促進一系列反應的酶組合，在適宜這些反應發生的條件開始反應。在另一實例中，還構想了實施確定的途徑包括提供經基因工程改造的微生物以按照所述途徑生成莫納甜，並為發酵過程的進行提供適宜的條件。例如，將能自然生產大量L-色氨酸或D-色氨酸(參見美國專利No.5，728,555)的微生物進行基因工程改造以生成或過量生成一種或多種可用於促進(促進)莫納甜途徑中反應的酶，並提供適宜的條件以使微生物能產生莫納甜。現在輪到圖1，所示的流程圖示意性地描述了本發明中製備含有R,R莫納甜的莫納甜組合物的過程。如圖l所示，整個途徑包括色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反應，吲哚-3-丙酮酸生成MP的反應，和MP生成包含R,R莫納甜的莫納甜的反應。圖l進一步圖示了整體途徑的特定變形，設計成在消耗莫納甜S,S，R，S和S,R形式下增加莫納甜R,R形式的生成。尤其是，圖1圖示了實施方式其中在L-色氨酸反應中採用的氨基轉移酶對該反應比對MP和4S莫納甜反應具有更高的活性和/或特異性，或氧化酶對L-色氨酸比對4R莫納甜具有更高的活性和/或特異性；促進吲哚-3-丙酮酸反應的酶是R特異性醛縮酶；而促進MP反應的酶是寬特異性的D酶，優選使其發展成與MP的R異構體一起能更高效地工作。圖1還圖示了設計成使R,R莫納甜生成更經濟的特定變形。例如，在圖1中不同於D-色氨酸或L-和D-色氨酸的組合，L-色氨酸被確定為起始物質。當對色氨酸特定形式的選擇不影響莫納甜組合物中最終莫納甜化合物的手性(因此色氨酸反應形成剛哚-3-丙酮酸，其還沒有手性)，有時可優選採用L-色氨酸作為起始物質至少因為L-色氨酸通常不很昂貴且比D-色氨酸更容易獲得。現在關注圖1所示的第一反應，當色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸時，a-酮戊二酸，草醯乙酸，和/或丙酮酸的任一種或多種與色氨酸反應形成胺基酸(分別是穀氨酸，天冬氨酸，和丙氨酸)和吲哚-3-丙酮酸。圖l描述了實施方式其中色氨酸起始物質是L-色氨酸，而a-酮戊二酸，草醯乙酸，和/或丙酮酸生成胺基酸的L-異構體形式(例如分別是L-穀氨酸，L-天冬氨酸，和L-丙氨酸)。如圖1所示，增加R,R莫納甜生成的方法包括以具有對色氨酸不同於對MP或莫納甜的更高的特異性，更高的活性/或兩者的酶促進L-色氨酸的反應，而以D特異性酶促進MP的反應。如WO03/091396A2所公開的，特定的酶能促進色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反應，以及MP生成莫納甜的胺化反應。在胺化步驟中採用L-氨基轉移酶可產生在莫納甜C-4位上的S手性中心，而採用D酶可產生在莫納甜C-4位上的D手性中心。因而，在這種情況下促進色氨酸反應的L-氨基轉移酶在MP反應中也是有活性的，根據存在的MP形式可生成R,S和S,S莫納甜。此外，其它某些酶，L-胺基酸氧化酶，不僅能促進色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的反應，還具有降解R,R莫納甜的副活性。在某些實施方式中，這種4R副活性被最小化或被消除。根據所需的最終組合物，氧化酶對莫納甜4S形式的副活性可降低或使其對最終產物最小化可以是有益的。因此，所選擇的L酶對色氨酸具有比對MP或莫納甜更高的特異性和/或活性，則生成的R,R和S,R的量相對於S,S和R,S莫納甜就越咼c根據圖1所示的實施方式，適宜於色氨酸反應的酶包括可以促進L-色氨酸反應形成吲哚-3-丙酮酸的L-氨基轉移酶，其具有對該反應比對R-MP形成莫納甜4S異構體的反應更高的特異性；而，可以促進L-色氨酸反應形成口引哚_3_丙酮酸的L-胺基酸氧化酶，其具有對該反應比對莫納甜4R異構體形成MP的反應更高的特異性和/或活性，和任何前述酶的功能等效物。更具體而言，適宜酶的非限制性實施例可從L-色氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄27)和酪氨酸(芳族)氨基轉移酶(EC2.6丄5)和L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)，和源自於具有天冬氨酸氨基轉移酶活性的酶的突變體中選擇。實施例6確定了一種特定酶，突變的HEXaspC多肽，其包含Pro9至Tyr替換和Argl22至Gly替換，可用於促進L-色氨酸和a-KG，草醯乙酸，丙酮酸，或它們的組合分別形成吲哚-3-丙酮酸和L-穀氨酸，L-天冬氨酸，和L-丙氨酸的反應。另一具有限制活性的特定酶是TatA，來自苜蓿苜蓿中華根瘤菌(S.mdilod)的L-色氨酸氨基轉移酶。根據圖1所示途徑的優選實施方式適宜於色氨酸反應的其它酶包括具有以下特性的那些如實施例6中酶對MP的轉氨基速率是1/10或低於L-色氨酸的速率或如實施例9中，酶與消旋酶一起使用時，將生成大於90X的莫納甜4R異構體。相對於MP向莫納甜的轉化，對L-色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的轉化具有高度特異性的酶包括HEXAspC(實施例6)，碩大利什曼原蟲(丄^/z顧m'amq/or)寬特異性氨基轉移酶(WO03/091396A2)，豬氨基轉移酶(WO03/091396A2)和球形紅細菌(i/2C^oZacto^^/wera/tfes)TatA(實施例9)。例如通過誘變可以使這些酶發展成相對於色氨酸，其具有對R-MP和/或R,R莫納甜的限制活性。現在關注圖1所確定的第二反應，對用於促進(或催化)吲哚-3-丙酮酸向MP反應的酶的選擇將影響R，R莫納甜與S,R莫納甜的相對量。通常，生成的R-MP比S-MP的相對量越高，則生成的R，R莫納甜比S,R莫納甜的相對量也越髙(以D酶促進MP至莫納甜的反應)。在這方面可用的酶包括酶可產生的R-MP:S-MP比例高於由大腸桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號AAC74920.1)，芽孢桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號CAB14127.1)或睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶(SEQIDNO:l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列》中的任一種促進時噴哚-3-丙酮酸和丙酮酸反應產生的比例的酶。因而，若希望優選生成R-MP，可採用一種或多種能生成更高的R-MP比S-MP相對量的酶。當希望莫納甜組合物中以R,R形式的莫納甜作為其唯一的莫納甜成分時，應採用可選擇性地生成與S-MP相反的R-MP的酶("R特異性酶")。可用於選擇性地生成與S-MP相反的R-MP的R特異性酶的實例包括如實施例3所示的SEQIDNO:22的醛縮酶和苜蓿苜蓿中華根瘤菌HGM醛縮酶。圖1確定了特定實施方式，其中R特異性醛縮酶促進吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成R-MP的反應。還構想了在吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反應中使用醛縮酶優選生成R-MP，以及酸縮酶可產生的R-MP:S-MP比例高於由大腸桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號AAC74920.1)，芽孢桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號CAB14127.1)或睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶(SEQIDNO:l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列))中的任一種酶所產生的比例。此外，還構想了吲哚-3-丙酮酸可與不同C3源(例如絲氨酸或半胱氨酸)反應形成R-MP而其它酶(例如其它裂合酶或合酶)可促進該反應。還可採用其它易於轉化成丙酮酸的底物(如草醯乙酸)。實施例3提供了可優選地或選擇性地生成R-MP或可產生的R-MP:S-MP比例高於由大腸桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號AAC74920.1)，芽孢桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號CAB14127.1)或睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶(SEQIDNO:l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列))中的任一種酶所促進的吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反應產生的比例的酲縮酶源，例如SEQIDN0.22的醛縮酶。實施例5還提供了用於鑑別這類酶的篩選方法。還構想了可優選地或選擇性地生成R-MP或可產生的R-MP多於由大腸桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號AAC74920.1)，芽孢桿菌KHG醛縮酶(Genbank登錄號CAB14127.1)或睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶(SEQIDNO:l(核酸序列)，SEQIDNO:2(胺基酸序列》中的任一種酶所產生的酶能由自然中已知或已發現的醛縮酶發展而來。可應用現有技術中已知的用於發展酶的任何技術，例如為改善期望特性-如為與野生型酶相比增強酶對底物活性。實施例4，5，6，7，9，10和11提供了一些發展酶的技術。現在關注圖1中確定的最後步驟，所示的R-MP形成R,R莫納甜反應是由寬特異性D-氨基轉移酶所促進的，例如D-丙氨酸氨基轉移酶(EC2.6.1.21，也稱為D-胺基酸氨基轉移酶或D-天冬氨酸氨基轉移酶)或D-胺基酸脫氫酶。如上所述，MP向莫納甜的轉化是胺化反應，其產生了在莫納甜C-4碳上的手性中心。若希望C-4位是R手性形式，則應採用能在胺基酸中生成"R"手性中心的酶。非限制性示例性酶包括源自芽孢桿菌的D-丙氨酸氨基轉移酶(實施例15-18)，包括源於耐鹽芽孢桿菌(^acz7/^/2fl/o^rara)的D-丙氨酸氨基轉移酶(實施例18)和具有改迸的立體特異性的突變支鏈氨基轉移酶(實施例7)。其它示例性酶包括雜合D-氨基轉移酶。雜合D-氨基轉移酶可包含來自兩種不同胺基酸氨基轉移酶的結構元件。為改進其將MP轉化成莫納甜的性能，雜合D-氨基轉移酶還可進一步發展(例如，經由誘變或重組改造)。實施例19中展示了一個這類雜合D-氨基轉移酶的實例。實施例19中例示的雜合D-氨基轉移酶包括了來自於球形芽孢桿菌(及v^n'cw)D-氨基轉移酶和嗜熱脂肪土芽孢桿菌(G他ara決ermopMw"D-氨基轉移酶的元件。採用這類D-氨基轉移酶可生成R,R莫納甜(實施例19)。實施例2也表明了採用不同D-氨基轉移酶生產R，R莫納甜。根據某些實施方式，相對於對吲哚-3-丙酮酸，D-氨基轉移酶對底物R-MP具有更強的特異性，更高的活性，或兩者。在特定的其它實施方式中，D-氨基轉移酶對底物吲哚-3-丙酮酸具有限制活性。具備這種特性的酶能從現存的酶中發展或突變而來，例如實施例6所示。此外，在某些實施方式中，R-MP形成R，R莫納甜的反應可由D-胺基酸脫氫酶所促進。實施例20表明了利用D-胺基酸脫氫酶(D-AADH-101至108，BioCatalytics)由R-MP生成R,R莫納甜。為改進性能可進一步發展這類D-胺基酸脫氫酶(例如經由誘變或重組改造)。圖2描繪了以生成R，R莫納甜為目標的另一種策略。在圖1的實施方式中，用於吲哚-3-丙酮酸形成R-MP反應的醛縮酶會影響形成的R，R:S，R比例，而在圖2的實施方式中，促進MP向莫納甜轉化的D-酶會影響形成的R，R:S,R比例。根據圖2的實施方式，非立體特異性酶可用於促進吲哚-3-丙酮酸向R-MP的反應，結果可形成S-MP和R-MP。為獲得理想的R,R莫納甜與S,R莫納甜比例，要選擇(或發展)相對於對S-MP具有對R-MP的適宜立體選擇性的D酶。若希望莫納甜組合物是以R.R形式的莫納甜作為其唯一的莫納甜成分時，可優選相對於對S-MP向莫納甜的反應能選擇性地促進R-MP向莫納甜反應的酶。例如，可採用耐鹽芽孢桿菌(&"7^/^/o^rara)的D-氨基轉移酶(實施例18)和包含來自於球形芽孢桿菌和嗜熱脂肪土芽孢桿菌的結構元件的雜合D-氨基轉移酶(實施例19)作為選擇性促進R-MP向莫納甜反應的酶。圖3圖示了生成富含R，R莫納甜的組合物的另一可選途徑。圖3的途徑是圖1途徑的改進型。在圖3所示途徑中，由L-色氨酸間接而不是直接生成了n引哚—3-丙酮酸。更具體而言，L-色氨酸被轉化成D-色氨酸，而D-色氨酸再轉化成吲哚-3-丙酮酸。實施例4圖示了利用色氨酸消旋酶由L-色氨酸生成R,R莫納甜。L-色氨酸向D-色氨酸的轉化可由色氨酸消旋酶或其功能等效物促進。實施例4提供了色氨酸消旋酶的有效來源和鑑別這類酶的篩選方法。實施例4描述了能夠將L-色氨酸轉化成D-色氨酸的色氨酸消旋酶的實例。為改進性能可進一步發展這類色氨酸消旋酶(例如，經由突變或重組改造)。色氨酸消旋酶的非限制性實例包括胺基酸消旋酶(EC5丄l.-)的同源物或突變體，例如絲氨酸消旋酶，其中該同源物或突變體能夠將L-色氨酸轉化成D-色氨酸。胺基酸消旋酶來自的來源的非限制性實例包括微生物例如鼠傷寒沙、門氏菌(5b/mo"e〃a/^p/n.mwn'wm」，大月^桿菌(E^c/2en,c/2/aco//)，枯草芽包豐幹菌(5crcz7/wss由他)，球形芽孢桿菌(5ac/〃jw—flWc—，耐鹽芽孢桿菌(B(3"7/iw/2a/oc/wra"s)，嗜熱月旨肪土芽孢桿菌(Geo6acz7/tw■stearaf/zermop/zZ/tw)，地衣芽孢桿菌(Bacz'腸//c/z，ybnm\s)，銅綠假單胞菌(i^ewcb,"(351oer—腦")，霍舌L弧菌(附/"'oc/zo/erae)，慄酒裂殖酵母(Sc/z/zosflcc戸sp簡Ze)，蠟狀芽孢桿菌(5腦'腸cer醋)，鵓雞腸球菌(淑eracoccusga〃/"or,)，戊糖片球菌(/Wz'ococc^pe"toyace—，短小芽孢桿菌(Ba"'〃"s/7wmz7w"，發酉孝孚[!桿菌(丄0:"06(3"7///￡^^""')，短乳桿菌(丄(actoZjac/〃ws6rev&)，嗜火產液菌O^Mzybc/,op/n7w力，乳桿菌(丄flctoZflc/〃z')，f連球菌(5^e;tococcM力，魚腥藻C4"atee"fl條紋j叚單胞菌(屍MM(icw20"asr/ato)，香燕(丄e"""wec/cxias)，魁甜(5"cap/za腦6raw/^函7)，脫硫球菌(Dasi^,coc，^.)，卩耆熱球菌(77^rmococcw^.)，和條紋假單胞菌。胺基酸消旋酶來自的來源的其它非限制性實例包括家蠶，大鼠腦，或小鼠腦。為改進其將L-色氨酸轉化成D-色氨酸的性能，可進一步發展這類胺基酸消旋酶(例如，經由誘變或重組改造)。適宜的色氨酸消旋酶的有效來源的非限制性實例包括微生物例如假單25胞菌，如綠針假單胞菌(P^wJowowosc/z/orara/7/^)(致黃假單胞菌(屍sewofowo"osm^ereo/adera))(ATCC15926)，和吡菌素伯克霍爾德氏菌(5wr狄oWen'ap,rac/m)(ATCC15958)。適宜的色氨酸消旋酶的有效來源的其它非限制性實例包括植物，例如菸草植物如菸草(iV7co"a"ato6acwm)，小麥植物如小麥(7H"cwmae^vwm)，甜菜，番茄，和南非灌木似冬青葉硬木朔圖3所示的途徑具備特定優勢，包括當希望生成R，R莫納甜時，同一酶可用於生成吲哚-3-丙酮酸的反應以及生成產物莫納甜的反應。即在圖l所展示的途徑中，L-氨基轉移酶(或適宜的L酶)促進生成吲哚-3-丙酮酸的反應，而D-氨基轉移酶促進生成莫納甜的反應。與圖3的途徑相比，促進生成吲哚-3-丙酮酸反應的特定D-氨基轉移酶還可以促進生成莫納甜的反應。因此，在圖3的途徑中，若希望在形成吲哚-3-丙酮酸的反應以及形成莫納甜的反應中使用同一酶，可優選寬特異性D-氨基轉移酶。相反，在圖l，2，4，6，7和8的途徑中，選擇與R-MP相比對吲哚-3-丙酮酸具有限制活性和域特異性的D-氨基轉移酶，能更高效地生成莫納甜。圖3中示意描述的途徑的另一優勢在於與生成吲哚-3-丙酮酸反應相連的反應產物胺基酸現在可作為生成莫納甜反應中的反應底物。即，在圖l所示的途徑中，L-色氨酸反應生成吲哚-3-丙酮酸而同時草醯乙酸，a-酮戊二酸和/或丙酮酸反應產生L-胺基酸。因為形成莫納甜的反應與利用D-胺基酸作為底物的反應是相連的，在所示條件下，形成吲哚-3-丙酮酸反應中的L-胺基酸不能循環用於與R-MP反應相連的反應。相反，在圖3所示途徑中，由D-色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反應是與形成D-胺基酸產物的反應相連的，其中D-胺基酸可循環用於與R-MP反應相連的反應中。這可實現在步驟1中使用非化學計量的氨基受體並由步驟1生成用於步驟3的氨基供體。圖4和5圖示了圖1途徑的其它改進型。這些改進型涉及再循環由與L-色氨酸轉氨反應相連的反應中形成的胺基酸產物和以與MP向莫納甜的反應相連的反應的胺基酸反應物。然後是圖4，再循環是由能促進L-胺基酸向D-胺基酸轉化及其逆反應的酶所完成的。更具體而言，如圖4所示，在L-色氨酸反應形成吲哚-3-丙酮酸時a-KG反應形成L-穀氨酸，可提供穀氨酸消旋酶(EC5丄1.3)或功能等效物以促進L-穀氨酸向D-穀氨酸的轉化及其逆反應。在這種情況下，隨著吲哚-3-丙酮酸的生成而形成的產物L-穀氨酸被部分移除，因為它會轉化成D-穀氨酸，而由L-穀氨酸轉化形成的D-穀氨酸可有效地作為與MP至莫納甜的反應相連的反應的底物。類似地，在D-穀氨酸反應中形成的a-KG可有效地作為與L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反應相連的反應的底物。穀氨酸消旋酶的有效來源的非限制性實例包括戊糖片球菌，短小芽孢桿菌，發酵乳桿菌，短乳桿菌，大腸桿菌，嗜火產液菌和枯草芽孢桿菌。更具體而言(也是非限制性的)，穀氨酸消旋酶可由核酸如戊糖片球菌murl基因(Genbank登錄號L22789)表達，或短乳桿菌穀氨酸消旋酶。當L-色氨酸反應形成吲哚-3-丙酮酸時草醯乙酸反應形成L-天冬氨酸，可提供天冬氨酸消旋酶^05丄1.13)或功能等效物以將1^-天冬氨酸轉化成0-天冬氨酸。在這種情況下，在生成吲哚-3-丙酮酸的相同反應中形成的L-天冬氨酸會被部分移除，因為它會轉化成D-天冬氨酸，而該D-天冬氨酸可有效地作為與MP至莫納甜的反應相連的反應的底物。類似地，在D-天冬氨酸反應中形成的草醯乙酸可有效地作為與L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反應相連的反應的底物。具有天冬氨酸消旋酶活性的適宜酶的非限制性實例包括ASPR-101(BioCatalytics，Inc.，129N.HillAve,Suite103，Pasadena,CA91106-1955)和能夠促進L-天冬氨酸向D-天冬氨酸轉化的胺基酸消旋酶(EC5丄l.-)的同源物或突變體。天冬氨酸消旋酶的有效來源的非限制性實例包括脫硫球菌，嗜熱球菌，雙殼類軟體魁蚶，不動桿菌(Jc/"eto6fl"w)，土壤桿菌(Jgra6acfen'i/m)，古生球菌C4rc/zaeog/o6w"，芽孢桿菌，博德特菌，慢生根瘤菌CBratfyrAizoZj/wm)，短桿菌，伯克霍爾德菌(5wrAr/zo/<afen'a)，彎曲桿菌(Camp_y/oZ(3c^)，念珠斷Ca"(i油)，柄桿菌(CaM/o6a"er)，梭菌(C7o欲W謂)，脫亞硫酸菌(Desw折to&acfe"'畫)，脫硫菌(Desw一a/efl)，腸球菌(五"feracoc譜)，歐文氏菌(五rw/m'a)，埃希氏菌C&c/zer/cWa)，鐵原體菌CFem^/osma)，幽門螺桿菌(/^/^0^^^)，克雷伯桿菌(K/eZw'd/a)，乳酸桿菌(Lactobacillus)，曼氏27桿菌(Ma朋/7e/w/a)，苜蓿(Medicago)，中慢生根瘤菌(^^07-/^06/"7)，甲烷球菌(A/ef/za"ococcw力，甲烷八疊球菌(Afe^3"oran^"a)，海洋芽孢桿菌(Ocea77o6o!c/腸)，酒球菌(Owococc—，片球菌(iW/ococc—，極地桿菌CPo/an'6acfer)，假單胞菌(屍化W(iomowas)，熱球菌(/yracoccw力，羅爾其jf通氏菌(Ralsonia)，志賀氏菌(57'^//力，中華根瘤菌，沙門氏菌，鞘氨醇單胞菌(iS//2/"gcw70wos)，鏈球菌，熱厭氧桿菌(77zermo朋aera6ac/er)，弧菌(附n'o)，沃林氏菌(fTo/Z"e〃a)，黃單胞菌(Z朋Aomo"os)，黃色桿菌(Jra"Ao6acfer)，耳卩爾辛氏菌(Jera/"/a)，和發酵單胞菌(Z;womo"a)。當L-色氨酸反應形成吲哚-3-丙酮酸時丙酮酸反應形成L-丙氨酸，可提供丙氨酸消旋酶或功能等效物以將L-丙氨酸轉化成D-丙氨酸。在這種情況下，在生成吲哚-3-丙酮酸的相同反應中形成的L-丙氨酸會被部分移除，因為它會轉化成D-丙氨酸，而該D-丙氨酸可有效地作為與MP至莫納甜的反應相連的反應的底物。類似地，在D-丙氨酸反應中形成的丙酮酸可有效地作為與L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反應相連的反應的底物。適宜的丙氨酸消旋酶的非限制性實例包括A8936(Sigma，POBox14508，St.Louis,MO，63178)和實施例4所述嗜熱脂肪土芽孢桿菌的丙氨酸消旋酶。丙氨酸消旋酶的有效來源的非限制性實例包括流產布魯氏菌(^mce/toa6o/^w)，糞鏈球菌(5^印tococcRs/aecafo)，鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，霍亂弧菌，慄酒裂殖酵母，蠟狀芽孢桿菌和香菇。實施例9和12圖示了上述消旋酶的應用，以及它們在增加所需莫納甜產物比例上的影響，並且提供了消旋酶的有效來源。然後是圖5，立體轉化氨基轉移酶被用於促進R-MP至莫納甜的反應。儘管形成R，R莫納甜(或S，R莫納甜)的R-MP(或S-MP)反應通常是與D-胺基酸反應相連的，但立體異構氨基轉移酶可促進相連的利用L-胺基酸由R-MP(或S-MP)形成R，R莫納甜(或S，R莫納甜)的反應。這樣的話，L-色氨酸氨基轉移酶反應的產物L-胺基酸可作為MP至莫納甜的轉氨反應的底物，而與MP至莫納甜的反應相連的反應產物(即草醯乙醯，丙酮酸，和/或a-KG)可作為L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反應相連的反應起始物質。可用的立體轉化氨基轉移酶的非限制性實例包括源自D-苯基甘氨酸氨基轉移酶(EC2.6.1.72,也稱為D-4-羥苯基甘氨酸氨基轉移酶)，D-甲硫氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄41，也稱為D-甲基-氨基轉移酶和D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基轉移斷的突變體，和其同源物。D-苯基甘氨酸氨基轉移酶的突變體的有效來源的非限制性實例包括假單胞菌，如惡臭假單胞菌(屍化i^omo"wpw^/a)LW-4和施氏假單胞菌CP""Amo"wWwteen')ST-201。D-甲硫氨酸氨基轉移酶的有效來源的非限制性實例包括花椰菜和花生。實施例10和11共同提供了立體轉化酶的有效來源，和製備這類酶的方法。實施例還提供了鑑別這類酶的篩選方法。也構想了這類酶可由自然界已知或己發現的立體轉化酶發展而來。作為立體轉化酶的非限制性實例可以是D-胺基酸氨基轉移酶的同源物或突變體或胺基酸消旋酶(EC5丄l.-)的同源物或突變體。圖6和7也展示了圖l途徑的改進型。圖6和7所示的途徑提供了通過可逆反應移除色氨酸反應的副產物和在某些情況下為MP反應提供底物來推動平衡反應動向(即朝產生莫納甜的方向)的方法。然後是圖6，所示的途徑通過將L-胺基酸轉化成不同的L-胺基酸和C02來移除與色氨酸反應相連的反應產物L-胺基酸，然後還通過將新形成的L-胺基酸轉化成D-胺基酸來給與MP反應相連的反應提供底物。具體而言，所顯示的L-色氨酸與草醯乙酸反應形成了吲哚-3-丙酮酸和L-天冬氨酸。天冬氨酸4-脫羧酶(EC4.1丄12)或功能等效物被用於促進L-天冬氨酸向L-丙氨酸和二氧化碳的轉化，而具有丙氨酸消旋酶活性的酶被用於促進L-丙氨酸向D-丙氨酸的轉化，其中D-丙氨酸可作為R-MP向莫納甜轉化中的氨基供體。接著是圖7，所示的途徑圖示了移除與色氨酸反應相連的反應產物L-胺基酸的其它方法。圖中介紹的實施方式產生了在逆方向難以有效反應的副產物，例如由於揮發性(例如二氧化碳)或自發轉化成不能反應的終產物。這種途徑的實例包括這樣的實施例，其中a-KG與L-色氨酸反應生成L-穀氨酸，而且若需要，可提供穀氨酸脫羧酶(EC4丄1.15)或功能等效物以促進L-穀氨酸向4-氨基丁酯(二氧化碳作為副產物)的轉化。L-穀氨酸氨脫羧酶的有效來源的非限制性實例包括產氣莢膜梭菌(C/o欲W廳per/W"gms)，魏氏梭菌(C.聰/cM)，或大腸桿菌。用於驅動色氨酸反應動向(在生成莫納甜方向)的這類途徑的其它實例包括這樣的反應，其中以草醯乙酸作為採用色氨酸的反應的共同底物且該草醯乙酸被轉化成L-天冬氨酸，若需要，可提供天冬氨酸脫氫酶(EC4丄1.11)或功能等效物以促進L-天冬氨酸向P-丙氨酸(二氧化碳作為副產物)的轉化。然後是圖8，所示途徑圖示了將與色氨酸反應相連的反應產物L-胺基酸轉化成與MP反應相連的反應底物的其它方法。具體而言，在同一反應中採用(x-KG和L-色氨酸，而a-KG形成L-穀氨酸，可提供具有L-丙氨酸氨基轉移酶活性的酶和丙酮酸，而L-丙氨酸氨基轉移酶促進丙酮酸和L-穀氨酸反應形成L-丙氨酸。為了促進L-丙氨酸向D-丙氨酸的轉化還可提供丙氨酸消旋酶或功能類似物，其中D-丙氨酸可作為底物隨MP—起生成莫納甜和丙酮酸。參見實施例12。在以上生物合成途徑，和以下實施例描述的反應中所暗中描述的是含有生成莫納甜(包括R，R莫納甜)或莫納甜前體(包括R莫納甜前體)的生物合成途徑所需的一種或多種化合物和/或酶的混合物。對於體外的製備，本文所述的任意或所有的生物合成途徑或本文所述途徑中的單個步驟都可以在體外方案或體內，宿主細胞中，連續或平行進行操作。當本發明的方法是在體外進行一個或多個反應時，可以通過在水性反應介質或溶液中混合反應所需成分來實施在體外進行的生物合成反應。將如此形成的反應混合物維持足夠的時間以合成所需的產物。此外，通過在一種或多種酶的純化中持續使用輔因子可增強一種或多種酶的活性。例如，在純化球形芽孢桿菌D-丙氨酸氨基轉移酶時，5'磷酸吡哆醛可實現活性的增強(實施例14)。若本發明途徑中的一個或多個反應將在體外進行，可任選地將本文所述生物合成途徑中所採用的任意或所有酶固定在固體支持物上。該固定支持物的實例包括含有環氧基，醛基，螯合劑，或伯胺基的那些。適宜固定支持物的具體實例包括但不限於EupergitC(RohmandHaasCompany,Philadelphia,PA)樹脂微球和SEPABEADSEC-EP(Resindion)。實施例21例示了球形芽孢桿菌D-丙氨酸氨基轉移酶在EupergitC樹脂微球上的固定。實施例22例示了苜蓿中華根瘤菌ProA醛縮酶在EupergitC樹脂微球上的固定。實施例23展示了應用了這些固定化酶的R，R莫納甜的製備。本文所述生物合成途徑中所示的單個反應可由單個酶或同時作用的多種酶的混合物來促進(催化)。本發明方法可用於製備含有所需百分比的R,R莫納甜，或最小所需百分比的R，R莫納甜的莫納甜組合物。除上述反應步驟之外，特定反應步驟可由一種以上的酶來促迸，例如，酶的混合物，以使最終的組合物或製備物含有所需百分比的R,R莫納甜，例如，含有最小所需百分比的R,R莫納甜，或最大所需百分比的R，R莫納甜。可選地，通過組合本發明方法中兩種獨立工程途徑製備莫納甜，以生成含有所需百分比的R,R莫納甜的組合物或製備物。若採用指定酶分類中的酶作為實例時，可以預料的是具有至少約50%，55%，60%,65%,70%，75%,80%，82%，85%，87%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，和99%同源性的酶也可應用於該反應中。例如，與SEQIDNO:22的醛縮酶具有至少約50。/。，55%，60%，65%，70%,75%,80%，82%，85%，87%，90%，91%，92%,93%，94%,95%,96%，97%，98%,和99。/。同源性的R特異性醛縮酶可用於上述任意途徑中以產生R，R莫納甜。此外，若採用指定酶分類中的酶作為實例時，可以預料的是具有相同活性的所述酶的片段也可應用於該反應中。例如，具有醛縮酶功能的SEQIDNO:22醛縮酶的片段可用於上述任意途徑中以產生R，R莫納甜。採用本文公開的一種或多種多肽或生物合成途徑生成的莫納甜通常是R，R莫納甜佔生成莫納甜總重量的至少約0.5-30%。在其它實施方式中，採用本文公開的一種或多種多肽或生物合成途徑生成的莫納甜是R，R莫納甜大於生成莫納甜總重量的30%;例如，R,R莫納甜大於生成莫納甜總重量的40%，50%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%或99%。可選地，不同量的兩種或多種莫納甜製備物可被組合在一起以使製備物具有所需百分比的R,R莫納甜。例如，含30%R,R莫納甜的莫納甜製備物可與含90%R,R莫納甜的莫納甜製備物組合在一起；若組合等量的30%R,R莫納甜31和卯。/。R,R莫納甜製備物，則所得的莫納甜製備物將含60°/。R，R莫納甜。採用本文公開的一種或多種多肽或生物合成途徑生成的莫納甜或中間物(包括莫納甜前體)可由反應成分純化而得。在一個實施方式中，莫納甜或中間物如莫納甜前體可通過移除將從其被合成的酶製備中純化出的物質來簡單純化。在其它實施方式中，中間物，莫納甜前體或莫納甜是從其被合成的製備物純化而來，以使所得"純化的"組合物或製備物是莫納甜佔有機化合物總重的至少約5-60%。在另一實施方式中，莫納甜或中間物如莫納甜前體可被純化至佔有機化合物總重的至少約70%，80%，90°/。，95%或99%的純度。採用本文公開的一種或多種多肽或生物合成途徑生成的莫納甜或中間物(含有莫納甜前體)可通過本領域普通技術人員公知的方法由反應成分純化而得。在一個實施方式中，莫納甜或中間物可按實施例13所述進行純化。任選地，純化的莫納甜或中間物可進行重複結晶直至獲得期望的純度。實施例實施例1莫納甜，色氨酸，丙氨酸和穀氨酸的檢測該實施例描述了用於檢測莫納甜，色氨酸和穀氨酸存在的方法。它還描述了用於分離和檢測莫納甜的四種立體異構體的方法。莫納甜和色氨酸的LC/MS/MS多反應監測("MRM")分析由體外或體內生物化學反應而來的莫納甜和色氨酸混合物的分析是採用Waters/Micromass液相色譜-串聯質譜(LC/MS/MS)設備，包括Waters2795液相色譜，其具有順序位於色譜和MicromassQuattroUltima三級四級杆質譜儀之間的Waters996光電二極體陣列(PDA)吸收監控器。LC分離是採用2.1mmx250mm的XterraMSCg反相色譜柱在40。C完成的。LC流動相是由A)含0.05%(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05°/。(v/v)三氟乙酸的甲醇所組成的。梯度洗脫是5%B至35%B線性洗脫0-4min，35%B至60%B線性洗脫4-6.5min，60%B至90%B線性洗脫6.5-7min，90%B等度洗脫7-11min，90%B至95%B線性洗脫11-12min，95%B至5%B線性洗脫12-13min，以及洗脫之間2min的再平衡期。流動速率為0.25mL/min，而PDA吸收是監測200nm-400nm。ESI-MS的所有參數是根據感興趣分析物的質子化分子離子([M+H]+)的產生，和特徵片段離子的產生來進行最優化和選擇的。莫納甜和色氨酸的LC/MS/MS多反應監測(MRM)分析採用以下設備參數毛細管電壓3.5kV;錐孔電壓40V;Hexl:20V;Aperture:OV;Hex2:0V;源溫度10(TC;脫溶劑溫度35(TC;脫溶劑氣流500L/h;錐孔氣流50L/h;低質解析度(Q1):12.0;高質解析度(Q1):12.0;離子能量0.2;入口-5V;碰撞能量8;出口1V;低質解析度(Q2):15;高質解析度(Q2):15;離子能量(Q2):3.5;增效器650。五種莫納甜特異性的親代至子代MRM躍遷被用於在體外或體內反應中特異地檢測莫納甜。監測的躍遷是293.1至158.3，293.1至168.2，293.1至211.2，293.1至230.2，和293.1至257.2。以204.7至146.4的MRM躍遷監測色氨酸。為莫納甜和色氨酸的內標定量，分析了含有四種不同比例的d5-色氨酸和d5莫納甜分析物的四種標準物。對這些數據進行線性最小二乘分析形成了莫納甜和色氨酸的標準曲線。每個樣品都加入了固定量的d5-色氨酸和d5莫納甜(d5莫納甜是按照WO03/091396A2的方法由d5-色氨酸合成而得)，和相應比例(莫納甜/d5莫納甜；色氨酸/d5-色氨酸)與上述標準曲線聯合使用以計算混合物中的每種分析物的量。準確的莫納甜質量測定可採用AppliedBiosystems-PerkinElmerQ-Star串聯四級杆/時間飛行時間質譜儀進行高解析度MS分析。測得的質子化莫納甜質量採用色氨酸作為內部質量校準標準。基於基本組合物CwHnN205，校準的質子化莫納甜質量是293.1137。利用實施例2和3所述的生物催化方法生成的莫納甜表現出293.1144的測量質量。這是小於百萬分之二(ppm")的質量測量誤差，提供酶促產生的莫納甜基本組合物的結論性證據。莫納甜的手性LC/MS/MS("MRM")測量在體外和體內反應中莫納甜立體異構體分布的測定可通過l-氟-2,4-二硝基苯-5-L-丙氨醯胺("FDAA")進行衍生，之後通過反相LC/MS/MSMRM測定完成。以FDAA衍生莫納甜向50的樣品或標準品加入200!iL的1°/。FDAA的丙酮溶液。加入4t)iiL的l.OM碳酸氫鈉，將混合物在4(TC溫育lh並不定時混合。取出樣品並冷卻，再以20pL的2.0MHC1中和(需要更多的HC1以實現緩衝生物性混合液的中和)。排氣完成後，樣品準備以LC/MS/MS進行分析。用於測量體外和體內反應中莫納甜立體異構體分布的LC/MS/MS多反應監測採用上述的LC/MS/MS設備進行分析。能夠分離所有四種莫納甜立體異構體(具體是FDAA-莫納甜)的LC分離是在PhenomenexLuna2.0x250mm(3pm)C18反相色譜柱於40。C實施的。LC流動相是由A)含0.05%(質量/體積)醋酸胺的水和B)乙腈所組成的。洗脫是13%B等度洗脫0-2min，13%B至30%B線性洗脫2-15min，30%B至80%B線性洗脫15-16min，80%B等度洗脫16-21min，和80%B至13%B線性洗脫21-22min，在洗脫之間有8min的再平衡期。流動速率為0.23mL/min，而PDA吸收是監測200nm-400nm。ESI-MS的所有參數是根據FDAA-莫納甜的質子化分子離子([M+H]+)的產生，和特徵片段離子的產生來進行最優化和選擇的。陰性離子ESI/MS模式的莫納甜的LCMS分析採用以下設備參數毛細管電壓2.0kV;錐孔電壓25V;Hexl:10V;Aperture:0V;Hex2:0V;源溫度100。C;脫溶劑溫度350。C;脫溶劑氣流500L/h;錐孔氣流50L/h;低質解析度(Q1):12.0;高質解析度(Q1):12.0;離子能量0.2;入口-5V;碰撞能量:20;出口1V;低質解析度(Q2):12;高質解析度(Q2):12;離子能量(Q2):3.0;增效器:650。三種FDAA-莫納甜特異性的親代至子代躍遷被用於在體外或體內反應中特異地檢測FDAA-莫納甜。躍遷是543.6至268.2，543.6至499.2，和543.6至525.2。FDAA-莫納甜立體異構體的鑑別是基於與純化的合成莫納甜立體異構體相比的色譜滯留時間，和質譜數據。包括穀氨酸和丙氨酸的胺基酸的液相色譜柱後螢光檢測用於測定體外和體內反應的穀氨酸的液相色譜及柱後螢光檢測是在與Waters474掃描螢光檢測器，和Waters柱後反應模塊聯合的Waters2690LC系統或等效物上進行的。LC分離是在負載相互作用鈉的離子交換柱於60°C進行的。流動相A是PickeringNa328緩衝液(PickeringLaboratories,Inc.;MountainView,CA)。流動相B是PickeringNa740緩衝液。梯度洗脫是0%B至100%B線性洗脫0-20min，100%B等度洗脫20-36min，和100%B至0。/。B線性洗脫36-37min，在洗脫之間有至少8min的再平衡期，取決於樣品基體。流動相的流速是0.5mL/min。OPA柱後衍生溶液的流速是0.5mL/min。螢光撿測器設置為EX338nm和Em425nm。採用正亮氨酸作為分析的內標。胺基酸的鑑別是基於純化的標準物的色譜滯留時間數據。以LC/MS/MS檢測L-和D-胺基酸首先用蟻酸處理含有L-和D-胺基酸如來自於生物化學反應實驗中的色氨酸，穀氨酸，和天冬氨酸的混合物的樣品以變性蛋白。然後將樣品離心並在LC/MS/MS分析之前通過0.45|im尼龍注射過濾器過濾。L-和D-胺基酸的鑑別是基於滯留時間和質量選擇性檢測。LC分離是採用Waters2690液相色譜系統和柱溫設定在45°C的ASTEC2.1mmx250mmChirobioticTAG色譜柱完成的。LC流動相A和B分別是0.25。/。乙酸和甲醇中的0.25。/。乙酸。設定60%流動相A和40%B以0.25ml/min的流速等度洗脫穀氨酸；而設定30%流動相A和70%B以0.3ml/min的流速等度洗脫天冬氨酸和色氨酸。用於分析L-和D-胺基酸的檢測系統包括Waters996光電二極體陣列(PDA)檢測器和MicromassQuattroUltima三級四級杆質譜儀。從195至350nm掃描的PDA順序位於所述色譜系統和質譜儀之間。在陽性電噴霧電離模式(+ESI)下操作的MicromassQuattroUltima三級四級杆質譜儀的參數設置如下毛細管電壓3.0kV;錐孔電壓20V;Hex1:15V;Aperture:1V;Hex2:0V;源溫度10(TC;脫溶劑溫度35(TC;脫溶劑氣流530L/h;錐孔氣流:30L/h;低質Q1解析度12.5;高質Ql解析度12.5;離子能量1:0.2;入口-5;碰撞8;出口1:10;低質Q2解析度12.5;高質Q2解析度12.5;離子能量2:0.5;增效器650V。多反應監測(MRM)模式的MS/MS實驗被設定為選擇性地監測反應躍遷204.70至146.50，147.8至84.2，147.8至102.1，134.00至74.30，和134.00至88.2。色氨酸，穀氨酸，和天冬氨酸的定量分別是基於m/z446.5，m/z=102.1，和m/z二88.2的信號反應。作為標準和用於試驗的莫納甜和莫納甜前體("MP")的生成莫納甜的生成按美國專利5,128,482所述合成生成R，R和S，S莫納甜的消旋混合物。通過衍生和水解步驟將R，R和S,S莫納甜分離。簡單而言，莫納甜消旋混合物被酯化，以Cbz封閉游離的氨基，形成內酯，採用固定化的蛋白酶選擇性地水解S，S內酯。還可按照Bassoli，A.etal，Eur.J.Org.Chem.，5:1652-1658，(2005)中所述的分離莫納甜。MP的生成通過採用在0.1M磷酸鉀緩衝液中的AT-103廣譜D-氨基轉移酶(BioCatalytics)進行R,R莫納甜氨基轉移以生成R-MP，並以丙酮酸作為氨基受體。通過採用在0.1M磷酸鉀緩衝液中的AT-102廣譜L-氨基轉移酶(BioCatalytics)進行S，S莫納甜氨基轉移以生成S-MP，並以丙酮酸作為氨基受體。兩個反應都在3(TC和約pH8.0-8.3下進行約20小時。兩種化合物都採用製備級HPLC和Rohm和Haas(Philadelphia,PA)疏水樹脂(XADTM1600)以水洗脫進行純化。含有大於90%純度莫納甜前體的樣品被收集和凍幹。實施例2由吲哚-3-丙酮酸生成莫納甜AT-103轉氨酶是從BioCatalytics(Pasadena，CA)購買的轉氨酶文庫的一部分，該酶經檢驗用於與採用來自於睪丸酮叢毛單胞桿菌的ProA醛縮酶的反應相連的莫納甜的生成。按WO03/091396A2所述製備醛縮酶。AT-103是來自於需要D-胺基酸(如D-穀氨酸，D-天冬氨酸，或D-丙氨酸)作為胺基酸供體的芽孢桿菌種的寬特異性D-轉氨酶(EC2.6丄21)。將酶和其它成分/底物直接加入到試劑盒提供的反應緩衝液，其含有100mM磷酸鉀緩衝液pH7.5，100mM氮基供體，和0.1mM5'磷酸吡眵醛("PLP")。在lmL反應緩衝液中加入4mgB引哚-3-丙酮酸，20mg丙酮酸，約50嗎以細胞提取物提供的ProA，l|iL2MMgCl2，和2mg的氨基轉移酶。反應平行進行。反應在30°C溫和振蕩(IOOrpm)下過夜溫育。按實施例1所述的過濾樣品並進行反相LC/MS/MS分析。結果表明採用AT-103酶生成了大約370嗎/mL莫納甜。在層析分離期間解決的兩種立體異構體的峰面積聯接的基礎上，進一步分析結果測定S,R/R，S對R，R/S，S莫納甜的比例。由AT-103生成的莫納甜總量中，36與混合的異構體相比，69X是R,R/S,S莫納甜。該酶與WO03/091396A2中所述的枯草芽孢桿菌DAT酶是同源的，已知後者對D-胺基酸具有寬特異性。採用實施例1所述的FDAA方法進行手性分析，其證實了如所預料的，D-氨基轉移酶主要生成R，R莫納甜，和一部分S,R莫納甜。以S,S莫納甜或R，R莫納甜和a-酮戊二酸作為底物的進一步的躍遷實驗證實了如所預料的BioCatalytics酶對在C4上的D-構型具有高度選擇性。這些實驗中，在S,S莫納甜和cc-酮戊二酸作為底物的反應中未檢測到穀氨酸。為降低在與AT-103(廣譜D-轉氨酶)和ProA醛縮酶相關反應中作為副產物生成的S，S莫納甜或R,S莫納甜的量，可採用組氨酸結合柱按照生產商的方案(Novagen，Madison，WI)純化醛縮酶。純化的酶優選應不含有細胞提取物中存在的野生型L-氨基轉移酶活性(如天然的大腸桿菌AspC或TyrB活性)。採用PD-10柱(G25Sephadex，Amersharn-Pharmacia)將組氨酸結合洗脫液脫鹽以去除咪唑並以50mMTris-Cl，pH7進行洗脫。實驗以lmL體積平行進行，其中含有100mMTris-Cl緩衝液，pH7.8，50昭ProA醛縮酶，4mg吲哚-3-丙酮酸，1或2mgD-氨基轉移酶，200mM丙酮酸鈉，2mMMgCl2，3mM磷酸鉀，O.lmMPLP，和14.7mgofD-穀氨酸。將管在3(TC溫和振蕩下進行溫育。達到兩小時的時間點立即在-20。C冷凍。在兩小時用NaOH將pH從5調整至7-8，並將試驗物溫育過夜。按實施例1所述地過濾樣品並分析莫納甜。兩小時樣品不具有可檢測量的莫納甜，可能是由於低pH。使用lmg的D-氨基轉移酶時過夜樣品含有大約190ng/mL莫納甜，約84%是R,R莫納甜而16°/。是S,R莫納甜。使用2mg的D-氨基轉移酶時，生成540ng/mL莫納甜，大約71%是R,R莫納甜。採用BioCatalytics氨基轉移酶緩衝液進行類似實驗，其含有lOOmM磷酸鉀pH7.5，O.lmMPLP,和100mMD-穀氨酸。如上添加固體吲哚-3-丙酮酸和D-氨基轉移酶。以原液添加ProA醛縮酶(50嗎)，MgCl2，和50mM丙酮酸。同上處理試驗物，且在此實驗中不要求調整pH。以只提供酶和緩衝液而不含莫納甜的BioCatalytics做陰性對照。實驗結果如表1所示。表h在磷酸緩衝液中由吲哚-3-丙酮酸生成莫納甜tableseeoriginaldocumentpage38在磷酸緩衝液中莫納甜的產量明顯高於在Tris緩衝體系中莫納甜的產為比較來自於WO03/091396A2中的含BioCatalytics酶(AT-103)的克隆枯草芽孢桿菌DAT的活性，進行了其它實驗。將枯草芽孢桿菌dat基因亞克隆到pET30a中以去除His-6標籤。按WO03/091396A2所述在BL21(DE3)中產生不帶標籤和帶標籤的酶。按上文所述製備細胞提取物並進行總蛋白試驗以估算蛋白濃度。進行平行的lmL反應，其含有500嗎D-氨基轉移酶，50昭ProA醛縮酶，100mM磷酸鉀pH7.5，3mMMgCl2，4mg吲哚-3-丙酮酸，200mM丙酮酸鈉，7.35mg(50mM)D-穀氨酸，和O.lmMPLP。將樣品在30°C溫育1小時，2小時，和過夜，並過濾用於LC/MS/MS分析。採用實施例l所述FDAA衍生方案來測定,樣品中僅含有莫納甜的S，R和R,R立體異構體。結果如下表2所錄。通過經反相色譜分離的峰面積來測定％RR。表2:D-氨基轉移酶的比較酶時間(小時)莫納甜(ppb)%R,R莫納甜枯草芽孢桿菌DAT-HIS1512未測定枯草芽孢桿菌DAT不帶標籤11056未測定BioCatalyticsAT-10312353未測定枯草芽孢桿菌DAT-HIS289480-90%枯草芽孢桿菌DAT不帶標籤2191380%BioCatalyticsAT-1032688792.5%枯草芽孢桿菌DAT-HIS16301431枯草芽孢桿菌DAT不帶標籤16561233BioCatalyticsAT-103161613166HIS-6標籤的去除表現出具有改進的枯草芽孢桿菌D-氨基轉移酶活性；但是，明顯地BioCatalyticsD-氨基轉移酶同源物具有最高的活性。還表現出對R-莫納甜前體更高的底物偏好性。延長溫育時間表現出降低了生成的R,R莫納甜對映體過量。由於芽孢桿菌D-氨基轉移酶對以丙酮酸作為氨基受體和以D-丙氨酸作為氨基供體具有偏好性，可以預料的是採用D-丙氨酸作為MP至莫納甜轉化的氨基供體會具有相似或更好的結果。進行平行的lmL反應，其含有500嗎D-氨基轉移酶，50嗎純化的ProA醛縮酶，lOOmM磷酸鉀pH7.5，3mMMgCl2，4mg吲哚-3-丙酮酸，100mM丙酮酸鈉，25mMD-穀氨酸或D-丙氨酸，和0.1mMPLP。在分析前將樣品溫育2小時，並按如上處理。當以D-丙氨酸作為氨基供體，產生了略高於預期的莫納甜水平(23對21ppm)。而且，可以預期的是高濃度的丙酮酸可抑制轉氨步驟，因而一段時間內給予更小量的丙酮酸可改善莫納甜生成的總體速率。從上述數據可觀察到相對於上表在此實驗中只使用一半的丙酮酸，並生成了明顯更多的莫納甜。儘管文獻中報導ProA醛縮酶主要生成羥醛的S-對映體縮合產物，本研究中使用的ProA醛縮酶明顯產生了高百分比的R-MP並在相關實驗中生成高達92%的R，R莫納甜。如實施例19所示，高百分比的R,R莫納甜不是由於D-氨基轉移酶選擇性。實施例3由D-色氨酸生成R，R莫納甜在每lmL反應混合物中添加以下物質大約60嗎睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶(如WO03/091396A2所述以細胞提取物供應)，4mMMgCl2，50mMD-色氨酸，0.5mgBioCatdyticsD-氨基轉移酶(AT-103)，100mM丙酮酸鈉，100mM磷酸鉀緩衝液pH7.5或100mM乙酸鈉緩衝液pH8，0.05mMPLP，3mM磷酸鉀(僅加入乙酸鹽反應中)，禾tU0mMa-酮戊二酸。平行進行實驗，以不加醛縮酶的作為陰性對照。樣品在3(TC溫和振蕩下溫育過夜(20小時)。乙酸鈉樣品的實際pH大約是5，而磷酸緩衝樣品的最終pH大約是7。無一醛縮酶表現出在pH5具有明顯活性；含ProA醛縮酶的樣品略高於陰性對照但可能不大於實驗誤差。在磷酸鉀中，ProA醛縮酶產生了73.4ppm莫納甜，其中R,R:S，R比例為1.7:l(63。/。R，R來自於D-色氨酸)。由於芽孢桿菌D-氨基轉移酶對以丙酮酸作為氨基受體和以D-丙氨酸作為氨基供體具有偏好性，可以預料的是由D-色氨酸生成R，R或S,S莫納甜時沒有必要添加a-酮戊二酸。採用純化的ProA醛縮酶(50-60昭)和2,5小時的溫育時間重複上述實驗(在100mM磷酸鉀緩衝液中)。平行進行用或不用a-酮戊二酸的實驗。當加入10mMa-酮戊二酸時，採用D-色氨酸作為底物可形成56.1ppm莫納甜(79.5%R,R，20.5%S,R)。當省略a-酮戊二酸時，可形成102.5ppm莫納甜(79%R，R，21%S,R)。對於來自苜蓿中華根瘤菌，睪丸酮叢毛單胞桿菌的HMG醛縮酶，和SEQIDNO:22的醛縮酶的莫納甜總產量和異構體分布的比較從BioCatalytics(Pasadena,CA)購買AT-103轉氨酶(寬特異性D-氨基轉移酶)並按美國公開申請2005282260所述在以HMG醛縮酶由D-色氨酸和丙酮酸生成莫納甜的相關反應中使用該酶或實施例18中生成的球形芽孢桿菌重組酶。按美國公開20040063175和WO03091396A2所述製備和純化來自睪丸酮叢毛單胞桿菌(ProA)和苜蓿中華根瘤菌的HMG酸縮酶。為生成SEQIDNO:22醛縮酶的試驗數量，50mL培養物在含氨苄青黴素(IOO嗎/mL)的Luria-Bertani("LB")培養液中生長至約OD咖為大約0.5。以200嗎/L脫水四環素誘導含SEQIDNO:21構建體的菌株。細胞在誘導後生長5小時，並根據生產商的方案(Novagen，Bugbusterreagent)製備細胞提取物。還加入苯並核酸酶和蛋白酶抑制劑。在BioRadLaboratoriesExperion自動化電泳臺上分離細胞提取物中的可溶蛋白並採用1丄98.0版本的Experion軟體分析濃度和表達百分比。SEQIDNO:22的醛縮酶以原酶(未純化)用於以下反應中。在每lmL反應混合物中加入以下物質大約50叱醛縮酶，4mMMgCb，50mMD-色氨酸，0.5mg純化的球形芽孢桿菌D-氨基轉移酶，200mM丙酮酸鈉，100mM磷酸鉀緩衝液pH7.5，和0,05mMPLP。平行進行實驗，以不加醛縮酶的作為陰性對照。樣品在30'C溫和振蕩下溫育1小時和過夜(18小時)。由於鎂和磷酸鹽促進了非酶反應，在無醛縮酶的過夜反應中生成了小量的莫納甜(〈0.5ppm)。從以下顯示的數據中減去這些值，顯示平均結果。當採用這類方法生成莫納甜時能檢測到的立體異構體僅是R,R和S，R。R,R百分比如下所列，是由反相LC峰面積測定的。表3:由D-色氨酸生成的總莫納甜和n/。R,Rtableseeoriginaldocumentpage41還採用實施例1所列的FDAA衍生方法分析SEQIDNO:22醛縮酶的18小時樣品在立體異構體上的分布，其產生的結果為94.9%R,R和5.1%S，R莫納甜。與睪丸酮叢毛單胞桿菌和苜蓿中華根瘤菌HMG醛縮酶相比，SEQIDNO:22醛縮酶對R-MP生成具有更高的對映體特異性。採用L-色氨酸作為起始底物並將按美國公開申請2005282260所述地製備並純化而得的HexAspC寬特異性L-氨基轉移酶和醛縮酶聯合，同時進行相同的實驗。這些反應主要應生成S，S莫納甜和R，S莫納甜。反應還補充了lOmMot-酮戊二酸作為L-色氨酸轉氨中的氨基受體。此外，將以下平行結果平均化得到總莫納甜(減去無醛縮酶存在的背景水平)，而S，S莫納甜百分比是基於反相LC峰面積而顯示的。在某些情況下，因為醛縮酶是相當R特異性的幾乎不生成總莫納甜，立體異構分布的反相估計更不準確，因為一些色氨酸峰尾可與S，S/R,R莫納甜峰一起洗脫出來。與醛縮酶的R特異性相比該趨勢仍有價值。在括號中顯示了採用FDAA衍生方法進一步分析的結果，其更準確。在大約400ppm以上的總莫納甜數高於用來定量結果的標準級的線性範圍，只能定性結果。如美國公開申請2005282260所示，睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶通常產生95-100%S，S莫納甜。表4:由L-色氨酸生成的總莫納甜和。/。S,Stableseeoriginaldocumentpage42可以觀察到SEQIDNO:22醛縮酶的R特異性與基準ProA酶相比相當高。這種R特異性還反映在生成低的％S，S莫納甜，儘管在這些反應中HexAspC氨基轉移酶對S-MP具有高度特異性。另外，根據所生成的S，S莫納甜水平，苜蓿中華根瘤菌HMG酸縮酶的R特異性處於睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶和SEQIDNO:22醛縮酶之間。當將S，S莫納甜產量與R，R莫納甜產量比較時，總莫納甜量不指示酸縮酶的活性。對於MP轉氨反應，D-氨基轉移酶比HexAspC更不活躍，尤其是在這些反應的MP濃度下。為了進一步比較SEQIDNO:22醛縮酶和來自睪丸酮叢毛單胞桿菌的ProA酶，在開始於D-胺基酸的反應中採用不同的D-氨基轉移酶/醛縮酶比例(這些實驗沒有平行樣品)。同上所述進行反應。反應中醛縮酶濃度保持恆定，使用大約50pg醛縮酶。反應中D-氨基轉移酶的量保持恆定，使用大約0.5mg。對於2和10mg/mL濃度的D-氨基轉移酶，使用凍幹酶。對於2個最高的D-氨基轉移酶濃度，平行進行。表5:D-氨基轉移酶濃度對於R，R莫納甜生成的影響tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44若莫納甜水平在400ppm以上，結果不在標準曲線的線性範圍內，只是大約值。當適當稀釋時，生成的R,R莫納甜最大值大約是1100ppm。對以10mg/mLD-氨基轉移酶進行SEQIDNO:22醛縮酶的FDAA立體異構分析。在2小時，樣品含有98.5%R，R莫納甜。在17小時，樣品含有95.9%R，R莫納甜。即便在長時間溫育後並使用大量氨基轉移酶，SEQIDNO:22醛縮酶也產生高百分比的R,R莫納甜。若供應足夠的D-氨基轉移酶，SEQIDNO:22醛縮酶產生與睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶一樣多的總莫納甜，表現出相似的特異活性。表6:醛縮酶濃度對於R,R莫納甜生成的影響tableseeoriginaldocumentpage44當醛縮酶濃度改變時，在總莫納甜上沒有太多增長。R,R莫納甜百分比隨時間也隨醛縮酶濃度降低，尤其當D-氨基轉移酶有限時。為進一步測試試驗醛縮酶的R特異性，將按美國公開申請2005282260所述地製備和純化的L-色氨酸和HexAspC氨基轉移酶一起開始進行實驗。在轉氨中相對於R-MP，HexAspC顯示出對S-MP的強選擇性，因而高於50%R，S莫納甜的百分比指示了高立體特異性醛縮酶。提供10mMa-酮戊二酸作為氨基受體；但是在高濃度時，丙酮酸也被L-氨基轉移酶所利用。在這些反應中，通常只生成在FDAA衍生方案檢測限內的S，S和R，S莫納甜。表7:L-氨基轉移酶濃度對於S，S莫納甜生成的影響tableseeoriginaldocumentpage45表8:醛縮酶濃度對於S，S莫納甜生成的影響tableseeoriginaldocumentpage46對於高度R-特異性的醛縮酶，如SEQIDN0.22，生成較少的總莫納甜且增加醛縮酶的量會增加總莫納甜(以及％S，S)。這些醛縮酶產生較少的S-MP底物，是所用L-氨基轉移酶的優選底物。對於R-特異性更弱的酶，如ProA，增加醛縮酶不會顯著改善總莫納甜產量或c/。S,S莫納甜。增加所加入的L-氨基轉移酶的量會降低所產生的S,S莫納甜的百分比。在兩個緩衝體系如上所述的100mM磷酸鉀和100mM3-(N-嗎啉代)丙磺酸("MOPS")(含3mM磷酸鉀)中，進一步研究了SEQIDNO:22醛縮酶的活性和特異性。同上採用lmg/mlAT-103D-氨基轉移酶和50mMD-色氨酸進行實驗。平行進行實驗4.5小時。在磷酸鉀中SEQIDNO:22醛縮酶生成了116ppm莫納甜和99.1%R，R莫納甜(FDAA衍生方法)，在MOPS中SEQIDNO:22醛縮酶生成了75.5ppm莫納甜且96.2%是R，R莫納甜。甚至與對照比，在MOPS中無SEQIDNO:22醛縮酶時生成的莫納甜背景水平明顯更高，且MOPS中R,R百分比更低。可能是MOPS的存在影響了D-氨基轉移酶的選擇性和活性。SEQIDNO:21的亞克隆SEQIDNO:21的醛縮酶基因是來自於DiversaCorp。SEQIDNO:21是DiversaCorp篩選的環境文庫的一部分。但SEQIDNO:21的醛縮酶基因可通過本領域普通技術人員已知的任何方法進行重新構建。例如，按實施例10，18和19所述，可採用組合PCR方法重構SEQIDNO:21的醛縮酶基因。以下引物可用於PCR擴增醛縮酶基因(SEQIDNO:21):5'畫gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3'(SEQIDNO:23)禾Q5'-agaagacatatgatttatcagccggggac-3'(SEQIDNO:24)。用Xhol和Ndel消化獲得的PCR產物，並在被設計進引物的位點上切開。將片段進行凝膠純化(QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Velencia，CA))並與經Xhol和Ndel消化和凝膠純化的pET28b連接。以化學方法將連接物轉移到TOP10F感受態細胞中。為插入物篩選平板上生長的菌落並將帶有插入物的幾個單菌落進行DNA序列分析(Agencourt，Beverly，MA)。SEQIDNO:22醛縮酶的純化證實的醛縮酶克隆被轉化到BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS中。加入適宜抗生素的過夜生長的培養物被稀釋到新鮮培養液中(通常1:100)並在37。C通風條件下生長至OD6。。0.6。然後用異丙基硫代半乳糖苷("IPTG")誘導培養物並轉換至30。C(通風)持續溫育過夜。離心收集細胞。通常對細胞團進行冷凍解凍循環以幫助細胞裂解。在BugBuster和Benzoase(Novagen，Madison，WI)中裂解細胞團(按照生產商的方案)。離心去除細胞碎片。將原始的蛋白提取物應用到按照生產商方案製備好的組氨酸結合柱上。洗滌該柱並按照生產商的方案洗脫蛋白。用PD-10柱(GEHealthcare,Piscataway，NJ)將純化的蛋白脫鹽。用於交換的緩衝液是50mM磷酸鉀pH7.5，100mMNaCl，4mMMgCl2。以Amicon離心濃縮器(Millipore，Billerica，MA)濃縮純化的蛋白。實施例4(1)色氨酸消旋酶以D-色氨酸作為起始物質，採用D-氨基轉移酶和醛縮酶生成了R，R莫納甜(實施例3)。儘管那樣，由於幾個因素L-色氨酸還是一種優選的起始物質。例如，L-色氨酸更便宜，比D-色氨酸更易於獲得。本發明描述了獲取活性色氨酸消旋酶的幾種方法。通過採用R特異性醛縮酶，即優選地或選擇性地生成R-MP的醛縮酶來改善R,R莫納甜的產生。圖1和2圖示了採用色氨酸消旋酶，D-氨基轉移酶和R特異性醛縮酶由L-色氨酸生成富含R,R莫納甜立體異構體的方法。通過構建需要活性消旋酶生長的菌株來選擇色氨酸消旋酶。色氨酸營養缺陷型在基礎培養基中生長需要L-色氨酸源。補充含D-色氨酸的培養基是選擇能將D-色氨酸轉化成L-色氨酸的消旋酶的一個途徑。色氨酸營養缺陷型在補充D-色氨酸的基礎培養基中生長。來自ColiGeneticStockCenter的菌株CAG18455和CAG18579和NRRL12264(lipA—，XDE3溶源化，並以其質粒固化)在補充D-色氨酸時不生長而在補充L-色氨酸時生長。大腸桿菌可作為宿主微生物但也可採用其它宿主微生物，如酵母，其它芽孢桿菌，或其它真核生物體。當經D-氨基轉移酶轉化時，色氨酸營養缺陷型(特別是NRRL12264(lipA—，？J)E3溶源化並消除其質粒))能在D-色氨酸上生長。這證實了大腸桿菌將D-色氨酸轉運入細胞的能力。Salcher和Lingens公開了在致黃假單胞菌(ATCC15926)中存在色氨酸消旋酶。Salcher，0.，和Lingens，F.，J.Gen.Microbiol.121:465-471(1980)。還公開了在幾種植物中存在色氨酸消旋酶包括，菸草，甜菜，番茄，和小麥，而該酶表現出在滲透壓或乾旱條件被誘導。色氨酸消旋酶可在黃麥爵(Sderochitonilidfolius)的天然莫納甜生成途徑中發揮作用。為分離消旋酶活性，由ATCC15926(或另一具有消旋酶活性的生物體)構建表達文庫且將該文庫轉化到色氨酸營養缺陷型中。選擇以D-色氨酸作為色氨酸源時能生長的菌株。相似的方法還被用於篩選含已知消旋酶的許多菌株以尋找對D-色氨酸具有活性的消旋酶。對D-色氨酸具有活性的消旋酶實例包括丙氨酸消旋酶，絲氨酸消旋酶，和穀氨酸消旋酶。YoshimuraT.，禾卩Esaki，N.，"AminoAcidRacemases:FunctionsandMechanisms,"JournalofBioscienceandBioengineering96，103-109，(2003).丙氨酸消旋酶是依賴PLP的己由鼠傷寒沙門氏菌(dadB基因)克隆而得。丙氨酸消旋酶的其它來源是大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，霍亂弧菌，慄酒裂殖酵母和蠟狀芽孢桿菌。擔子菌蘑燕，香燕也含有寬活性的丙氨酸消旋酶。絲氨酸消旋酶是依賴PLP的，在真核生物(例如家蠶，大鼠腦，小鼠腦cDNA)以及芽孢桿菌(鵓雞腸球菌)中被發現。穀氨酸消旋酶是不依賴PLP的並已由戊糖片球菌，短小芽孢桿菌，發酵乳桿菌，短乳桿菌，大腸桿菌，嗜火產液菌，和枯草芽孢桿菌克隆而得。某些穀氨酸消旋酶是非常特異的，因而，即使結構類似的胺基酸天冬氨酸，天冬醯胺，和穀氨醯胺都不可作為該酶的底物。天冬氨酸消旋酶也是存在的並且是不依賴PLP的。天冬氨酸消旋酶在乳桿菌，鏈球菌菌株中，和某些古細菌如脫硫球菌和嗜熱球菌菌株中被發現。雙殼類軟體魁蚶也含有天冬氨酸消旋酶。在文獻中發現的其它消旋酶包括來自魚腥藻和條紋假單胞菌的胺基酸消旋酶(EC5丄1.10)，脯氨酸消旋酶，和多功能苯基丙氨酸消旋酶。還正在檢驗相關的異構酶或消旋酶。檢驗有效的消旋酶以確保它們不是D-色氨酸氨基轉移酶。通過序列分析和/或酶試驗完成有效消旋酶的篩選。用於選擇色氨酸消旋酶的篩選方法還可用於己公開含有色氨酸消旋酶的其它芽孢桿菌或古芽孢桿菌，以及己經構建可以表達的真核cDNA文庫。按實施例8所述，在對莫納甜活性上篩選通過色氨酸消旋酶檢驗的酶。理想的是，獲得的酶對色氨酸非常特異並對莫納甜幾乎沒有或沒有消旋酶活性。色氨酸消旋酶也可由現存的消旋酶，轉氨酶，或異構酶發展和/或改進而得(經由誘變或重組改造)。此外，因為丙氨酸氨基轉移酶(和其它氨基轉移酶)的晶體結構是已知的，它們可以作為理性的基於結構的誘變的基礎。上述過程可用於色氨酸消旋酶活性的初步選擇和改進活性的篩選。(2)色氨酸消旋酶文庫文庫的構建吡菌素伯克霍爾德氏菌(ATCC15958)和綠針假單胞菌(ATCC15926)是從美國典型培養物保藏中心獲取的。按ATCC所推薦培養它們並按Mekalanos，J丄，"DuplicationandamplificationoftoxingenesinVibriocholerae,"Cell35:253-263，(1983)中所述的方法製備基因組DNA。以&w3AI限制性內切酶部分消化基因組DNA。採用QiagenQIAquick凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)凝膠純化l-3Kbp片段。純化的DNA被連接到經萬"mffl消化並按如上純化的pTrc99a中(Amersham，Piscataway，NJ)。以3:1的插入物/載體摩爾比將連接物在室溫下過夜溫育。用化學方法將連接文庫轉化入TOP10F'感受態細胞(Invi加gen，Carlsbad,CA)並塗布在含100昭/ml氨苄青黴素的LB培養基上。將轉化的平板溫育過夜後，將菌落從平板上挑下，用液體LB培養基洗滌並採用QiagenQIAquick小量製備試劑盒(Valencia，CA)小量製備適宜大小的細胞團。大約30000個菌落被聚集並小量製備。聚集的質粒被轉化入CAG18455OpC83::Tn",rp/z-7)或CAG18579OpC::Tn/欣aw,rp/z-"。兩個菌株都是色氨酸缺陷型，因此它們在M9基礎培養基(Difco)上不會生成，除非培養基中補充了色氨酸。該轉化體被塗布在補充了色氨酸的M9基礎培養基上。這可選擇能將D-色氨酸轉化成L-色氨酸的菌株。文庫轉化之前，檢驗菌株在含L-或D-色氨酸的基礎培養基上的生長。檢驗菌株在補充了D-色氨酸的基礎培養基上的生長並觀察到其不生長。兩種菌株在以L-色氨酸代替D-色氨酸的基礎培養基上都能生長。此外，以D-特異性氨基轉移酶由枯草芽孢桿菌(WO03/091396)轉化得到NRRL12264的衍生物(所用菌株已消除了色氨酸操縱子質粒，以XDE3溶源化，刪除/*」，除其它染色體的編碼突變外OeM,ZW/^仏mo4厶ara戶))。NRRL12264菌株不能在補充D-色氨酸的基礎培養基上生長，但能在以L-色氨酸代替D-色氨酸的相同基礎培養基上生長。由T7啟動子啟動D-氨基轉移酶的表達。轉化的菌株能在補充D-色氨酸的M9基礎培養基上生長。篩選在D-色氮酸培養基上生長的菌落。分離質粒並重新轉化到親代菌株(CAG18455或CAG18579)中以證實在D-色氨酸培養基上的生長是依賴於質粒而不是宿主的突變。分析與色氨酸缺陷型互補的質粒核酸序列。並進一步分析確定含有色氨酸消旋酶的克隆。以相似方式從其它組織來源分離色氨酸消旋酶。有文獻報導在菸草組織培養細胞(A^'cof/朋atoZwctwiL.var.Wisconsin38)(Miura，G.A.，和Mills，S,E.，TheconversionofD-tryptophantoL-tryptophanincellculturesoftobacco:PlantPhysiol.47:483-487，(1974))和小麥(7H"cwwm幼'vmw)原蛋白提取物(Rekoslavskaya,N.I.，等，"SynthesisandphysiologicalflmctionofD-tryptophanduringwheatgermination,"RussianJ.PlantPhysiol.44:196-203，(1997))中者卩有色氨酸消旋酶活性。如文獻中所述，製備了組織的cDNA表達文庫，而該表達文庫被用於按以上所述轉化色氨酸缺陷型。可以預期的是若使用相同的菌株並按文獻所述複製相同的生長條件，具有色氨酸消旋酶活性的酶能被分離或mRNA可被分離且能製得cDNA表達文庫，其含有具備色氨酸消旋酶活性的酶的編碼序列。例如，可能要求特定生長階段或特定培養基成分以誘導具有色氨酸消旋酶活性的酶的細胞生成。C)色氨酸消旋酶試驗將被鑑別為可能含有色氨酸消旋酶的克隆轉化到通常用於重組蛋白表達的大腸桿菌菌株中，如BL21。細胞在LB肉湯中生長至600nm光學濃度為0.4-0.6。以IPTG(O.lmM終濃度)誘導啟動子驅動消旋酶的表達。誘導之後，細胞可以在37。C下表達蛋白1-3小時(通風)。收集細胞並通過法蘭西壓搾，超聲波處理，或以化學手段(如BugBuster(Novagen))裂解。離心裂解的細胞以去除細胞碎片。澄清的提取液直接用於試驗。在溶液中加入不同量的提取液以使終濃度是50mM磷酸鉀(pH7.0)和2mML-色氨酸。加入5'磷酸吡哆醛至終濃度為10pM。溫育樣品然後進行LC/MS分析。當僅採用L-色氨酸作為底物時出現D-色氨酸峰則表明是陽性結果。D-色氨酸濃度應該隨時間延長而增加直至達到平衡，而速率也應隨著蛋白濃度增加直至酶濃度高到不再被底物飽和。同上D-色氨酸還可被轉化成L-色氨酸。互補基因可編碼D-氨基轉移酶。該轉氨反應需要a-酮酸如a-酮戊二酸，草醯乙酸，或丙酮酸作為氨基受體。這些化合物可能存在於細胞提取物中，通常以較小的量。可採用PD-10脫鹽柱去除這些化合物且仍可用原提取物進行試驗。同樣地，互補基因還可編碼D-胺基酸氧化酶或D-胺基酸脫氫酶。這些酶還要求輔因子和共底物，它們可通過PD-10脫鹽柱去除。可採用傳統的柱層析純化色氨酸消旋酶活性。最後，被鑑別為有效色氨酸消旋酶的開放讀碼框被克隆到帶親合標籤的表達載體中。然後通過親和層析純化有效的色氨酸消旋酶。在任一情況中基本按以上所述在酶試驗中使用被純化的蛋白。(4)色氨酸消旋酶的反向基因工程改造通過常規的蛋白純化技術，包括硫酸銨分級和常規柱層析，可從植物或微生物源中純化色氨酸消旋酶。一旦純化蛋白使其可在雙向凝膠中分離，即可採用多肽微測序技術或常規Edman型胺基酸測序(在網際網路上，該類技術通常使用的方案和設備的說明，可參見"golgi.harvard.edu/microchem/")。在某些情況下，生物體的基因組序列不能作為用於蛋白純化的蛋白源，因為這類序列還未被測定。對於這種情況，可根據從最接近的已知相關蛋白源獲得的序列設計第一套簡併引物。然後按照己建立的方案進行簡併PCR和基因組步行，以分離色氨酸消旋酶的編碼序列。(5)從嗜熱脂肪土芽孢桿菌中克隆丙氨酸消旋酶從嗜熱脂肪土芽孢桿菌中克隆了丙氨酸消旋酶(SEQIDNO:41)。嗜熱脂肪土芽孢桿菌(ATCC12980D)的基因組DNA是從ATCC(Manassas，VA)購買的。以下引物被用於擴增來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的丙氨酸消旋酶5'-atggacgagtttcaccgcga-3'(SEQIDNO:25)禾Q5'-ttatgcatcgcttcatccgc-3'(SEQIDNO:26)。並利用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad,CA)將PCR產物與pCR-Blunt-TOPO連接。通過測序證實正確的克隆子(Agencourt，Bevery，MA)。並以正確的克隆作為後續PCR反應的模板。以下引物被用於擴增所述丙氨酸消旋酶5'-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3'(SEQIDNO:27)禾卩5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3'(SEQIDNO:28)。以限制性內切酶Kpnl和BamHI消化PCR產物。這類酶在被設計進引物的位點上切割。將消化的PCR產物進行凝膠純化並與經Kpnl和BamHI消化和凝膠純化的pTrc99a連接。以化學方法將連接物轉化到TOP10F感受態細胞中並塗布在補充了50嗎/ml卡那黴素的LB平板上。為插入物篩選分離物並通過序列分析(Agencourt，Beverly,MA)證實帶有插入物的幾個分離物具有正確序列(SEQIDNO:40)。採用Stratagene(LaJolla，CA)快變多位點定向誘變試劑盒對pTrc99a/丙氨酸消旋酶構建體進行位點誘向突變("SDM")。誘變引物如下5'-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3'(SEQIDNO:29)，5'-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3'(SEQIDNO:30)，5'-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3'(SEQIDNO:31)，5'-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3'(SEQIDNO:32)，5'-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3'(SEQIDNO:33)，5'-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3'(SEQIDNO:34)(n={壬意核苷酸而k-g或t)。通過分析現有的嗜熱脂肪土芽孢桿菌的丙氨酸消旋酶晶體結構選擇用於誘變的殘基。選擇來自活性位點的在5A和10A之間的大胺基酸殘基。在SDM反應中按照生產商的方案使用了所有六對引物。根據生產商的方案SDM反應被轉化進XL-10Gold。轉化反應被塗布在補充了100pg/ml氨苄青黴素的LB培養基上。在平板中添加LB肉湯並從平板上挑取菌落。讓重懸細胞在37。C生長几個小時並採用QIAquick小量製備試劑盒小量製備質粒。製得的誘變文庫被用於轉化色氨酸營養缺陷型CAG18455。轉化被塗布在補充了葡萄糖，痕量元素，維生素，100(ig/ml氨苄青黴素，100nMIPTG和3mMD-色氨酸的M9基礎培養基上。在37'C溫育幾天之後，長出了菌落。將這些菌落在LB(100]ig/ml氨苄青黴素)上劃線。從這些分離物中分離質粒並重新轉化進CAG18455。再轉化細胞被塗布到含100pg/ml氨苄青黴素的LB上。形成單菌落後，如上所述將這些菌落在M9D-色氨酸培養基上劃線。看起來所有菌落都再生長，這表明了生長是由於消旋酶的誘變形式。可以觀察到對照細胞不生長。幾個單菌落被用於體外活性試驗。細胞生長至OD,大約為0.6再以100nMIPTG誘導。將細胞在37t:下再溫育2小時並通過離心收集。細胞團被儲存於-8(TC直至後一天的使用。將細胞團在冰中解凍。以BugBuster(不含伯胺)細胞裂解試劑和Benzoase(Novagen)裂解細胞。通過離心移除細胞碎片(10,000xg，30分鐘，4°C)。將上清液作為原細胞提取物保留。試驗緩衝液含有50rnM磷酸鉀(pH8.0)，lO^M磷酸吡哆醛，0.01%(3-巰基乙醇，和50mMD-或L-色氨酸。每mL試驗液中加入200提取物。將樣品冷凍表示0時間點，以及30分鐘和過夜時間點的時間。將樣品旋轉，過濾，並轉移到SRC進行分析。表9:始於L-色氨酸的試驗結果tableseeoriginaldocumentpage54表10:始於D-色氨酸的試驗結果tableseeoriginaldocumentpage54確定了這個分離物中的消旋酶基因的DNA序列(SEQIDNO:42)並發現該分離物具有三種突變。在相應的蛋白分離物中的突變如下M35C，F66E，和Y354A(SEQIDNO:43)。在這個突變體中還發現了另一個突變。這是一種自發突變，並非位點定向誘變的部分。將突變的消旋酶克隆到用於表達和純化的pET30中。下列引物被用於來自pTrc99a構建體中的消旋酶基因的PCR擴增5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3(SEQIDNO:35)禾口5'-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg畫3'(SEQIDNO:36)。以TVcoI禾卩Samffl消化PCR產物，凝膠純化，並與經Wcol和BamHI消化然後凝膠純化的pET30連接。以化學方法將連接物轉化到TOP10感受態細胞中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。為插入物篩選轉化的分離物。將帶有插入物的質粒進行測序(Agencourt，Beverly,MA)。帶有正確序列的分離物被轉化到用於表達和純化的BL21XDE3或BL21JDE3pLysS。該新構建體被命名為pET30Trp消旋酶。(6)色氨酸消旋酶的純化在含有適宜抗生素(50ng/ml卡那黴素和20pg/ml氯黴素)的新鮮LB培養液中亞培養含有pET30Trp消旋酶構建體的過夜培養物並生長至OD6oo0.6(37。C通風)。以100jiMIPTG誘導表達並繼續在37。C通風溫育2小時。離心收集細胞並儲存於-8(TC直至使用。將細胞團在冰中解凍並以不含伯胺的BugBuster細胞裂解試劑和Benzoase核酸酶(Novagen，Madison，WI)裂解細胞。通過離心移除細胞碎片而將上清液作為原蛋白提取物使用。採用0.45pm注射過濾器過濾原蛋白提取物並將其用於已根據生產商說明預平衡好的組氨酸結合柱(Ncwagen，Madison，WI)中。洗滌柱並按照生產商方案洗脫蛋白。以50mM磷酸鉀pH8.0，10pM5'磷酸吡哆醛("PLP")作為洗脫液用PD-10柱(GEHealthcare,Piscataway，NJ)將純化的蛋白脫鹽。利用Amicon離心濃縮器(Millipore，Billerica，MA)將脫鹽蛋白濃縮。按上述方法純化野生型丙氨酸消旋酶。(7)色氨酸消旋酶的試驗在幾個試驗中檢驗經純化的消旋酶。在一個試驗中，採用由D-胺基酸氧化酶生成過氧化氫作為一個檢測體系。經由按該實施例所述而分離的消旋酶由L-色氨酸生成氧化酶的D-色氨酸底物。試驗物包括每個試驗0，1，10，25，50，100，200嗎酶，50mM磷酸鉀pH8.0，10pMPLP，50mML-色氨酸。試驗物在37'C溫育1小時。溫育後，在反應混合物中加入100mg/mlD-胺基酸氧化酶(AOD-lOlBioCatalytics，Pasadena，CA)禾口0.5mMFAD。利用AmplexRed試齊U盒(MolecularProbes，Eugene,OR)禾卩PerkinElmerHTS7000PlusBioAssay閱讀螢光儀(Wellesley，MA)測定生成的過氧化氫。試驗數據總結在以下的表ll和12。tableseeoriginaldocumentpage56表13:tableseeoriginaldocumentpage57突變消旋酶表現出保留了對原始底物丙氨酸的活性。以L-色氨酸，D-色氨酸，L-丙氨酸，D-丙氨酸的一種作為底物檢測突變消旋酶的活性。反應緩衝液含有100mM磷酸鉀pH8.0，10PLP，50mM底物，94pg/ml突變消旋酶。用1體積0.5M蟻酸終止反應並按實施例1所述進行分析。以丙氨酸作為底物的試樣在室溫下(22'C)溫育而以色氨酸作為底物的試樣則在37'C溫育。結果總結在下表14。表14:tableseeoriginaldocumentpage57消旋酶在雙向上起作用並保留了野生活性。用幾種底物檢驗了突變消旋酶。按以上所述純化用於試驗的酶。試驗條件如下50mM磷酸鉀pH8.0，10pMPLP，25mM底物，40嗎/ml突變消旋酶。用1體積2M蟻酸終止反應並按實施例1所述進行分析。試樣在37°C下溫育。結果(由L-異構體生成的D-異構體ppm)總結在下表15中(nd二未檢出)表15:tableseeoriginaldocumentpage58可能這種消旋酶能消旋除在此檢驗之外的其它胺基酸。儘管突變消旋酶對多種胺基酸表現出活性，但對莫納甜未表現出任何消旋活性。按以上所述純化用於試驗的酶。試驗條件如下lOOmM磷酸鉀pH8.0，10pMPLP，50mM莫納甜，lmg/ml突變消旋酶。試樣在37'C下溫育。通過如實施例1所述的FDAA衍生分析試樣。試驗結果如下表16所示表16:tableseeoriginaldocumentpage59甚至使用突變消旋酶18小時後，也未出現S,S莫納甜向S,R莫納甜或R，R莫納甜向R，S莫納甜的轉化。理想的酶具有對色氨酸的活性，而對其它胺基酸或胺基酸樣化合物，尤其是莫納甜，幾乎沒有或沒有活性。若酶具有對莫納甜的顯著活性，可誘變酶以降低其對莫納甜和/或穀氨酸的活性，而保持色氨酸活性不變或在足夠高的水平以用於產生莫納甜。可用於誘變的技術包括但不限於易錯PCR，定位突變，建模以識別原位突變靶點(參與底物結合的位點)，通過誘變菌株(passagethroughmutagenicstrains),禾卩DNA、昆編。(8)色氨酸消旋酶莫納甜生成在每lmL反應混合物中添加以下物質大約50叱SEQIDNO:22的醛縮酶，16mg/mL純化色氨酸消旋酶，4mMMgCl2，50mML-色氨酸，0.5mgD-氨基轉移酶(由實施例14所述的球形芽孢桿菌純化而來)，100mM丙酮酸鈉，lOOmM磷酸鉀緩衝液pH7.5，和0.05mMPLP。由於丙酮酸是寬特異性D-氨基轉移酶的可接受氨基受體，不使用a-酮戊二酸。對照中以D-色氨酸作為起始底物而不含有消旋酶。樣品在30'C溫和振蕩下溫育2小時或過夜。按實施例l所述分析樣品。試驗結果如下表17所示(nd二未檢出)表17:tableseeoriginaldocumentpage59表17顯示了利用色氨酸消旋酶將L-色氨酸底物轉化成D-色氨酸而生成的R，R莫納甜。未使用色氨酸消旋酶由D-色氨酸生成的R,R莫納甜作為對照。所產生的R,R莫納甜百分比幾乎與以L-或D-色氨酸作為起始物質時相同。這結果表明消旋酶在促進R,R莫納甜消旋中不具有可檢測的活性。(9)關鍵胺基酸變化的分離製備了誘變丙氨酸消旋酶的幾種回復體。利用上述的快變多位點定向誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)通過定位誘變製備回復體，採用下列引5'畫gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3'(SEQIDNO:37)，5'-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3'(SEQIDNO:38)，5'-gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3'(SEQIDNO:39)單個或組合使用引物，嘗試製備在位點35，66和354(根據源於ATCC12980的胺基酸序列編號)上三種突變的六種可能組合。製備了突變的幾種組合併檢驗了色氨酸消旋酶活性。試驗條件如下50mM磷酸鉀pH8.0，10pMPLP，30mML-色氨酸，100嗎/ml酶。試驗在37。C下溫育特定時間。按實施例l所述分析樣品。試驗結果總結在下表18中(11(1=未檢出)。表18tableseeoriginaldocumentpage60突變列表-MF1:N41S(自發突變)，P197L，Y354AMF2:F66E，P197L，Y354AMY1:M35C，F66E，P197L誘變的消旋酶M35C，F66E，P197L，Y354A結果表明Y354A突變是對色氨酸的活性所必需的。若缺乏該突變則沒有可檢測的對色氨酸的活性。通過任意方法如誘變PCR，通過誘變菌株，或其它本領域公知技術，丙氨酸消旋酶可被進一步轉化成更寬特異性消旋酶。更受關注的丙氨酸消旋酶的進行可集中於活性位點殘基，包括Lysl29，Metl34,以及包括和在Gly283和Trp288之間的殘基(嗜熱脂肪土芽孢桿菌中的編號)。實施例5用於篩選重組大腸桿菌中丙酮酸醛縮酶的選擇方法在實施例4(5)，9和10(3)所述的和圖l-9所示的許多步驟將以優選由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸生成R-MP的醛縮酶最佳地進行。因此，方法被描述以分離和檢驗含有編碼優選生成R-MP的醛縮酶的核酸的克隆。之前已描述了在以核糖作為碳源的M9基礎培養基上生長時需要補充丙酮酸的大腸桿菌菌株。Ponce，E.，等，"CloningofthetwopyruvatekinaseisoenzymesstructuralgenesfromEscherichiacoli.:Therelativerolesoftheseenzymesinpyruvatebiosynthesis,"J.Bacterial177:5119-5722，(1995)。該菌株的相應基因型為Zl;^fc4zl;j^F。通過Datsenko禾nWanner,Proceed.Natl.Acad.Sd.USA97:6640-6645，(2000)中的方法生成了雙敲除型。這些菌株可形成生成丙酮酸的醛縮酶的篩選基礎以篩選對莫納甜的特定立體異構體，莫納甜前體的特定立體異構體，或莫納甜或莫納甜前體的類似物更為活躍的醛縮酶。莫納甜前體的類似物包括已被鑑定為ProA醛縮酶或KHG醛縮酶底物的化合物，例如4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸，4-羧基-4-羥基-2-酮己二酸，4-羥基-4-甲基-2-酮己二酸，或在醛醇縮合反應中被轉化成丙酮酸的其它富含羧基化合物。可採用的莫納甜類似物的實例是4-羥基-4-甲基穀氨酸，通過試驗細胞中的天然氨基轉移酶其易被轉氨成4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸(ProA的底物)。克隆下列引物可用於生成敲除型5'-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC畫3'(SEQIDNO:3)禾口5'-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATATGAATATCCTCCTTAG-3'(SEQIDNO:4)。下列引物可用於生成PJ汝F敲除型5'-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'(SEQIDNO:5)禾口5'-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC匿3'(SEQIDNO:6)。採用標準方案以pKD3或pKD4作為模板進行PCR反應。PCR產物被電穿孔表達X紅色同源重組體系的大腸桿菌菌株中。PCR產物與;^fc4或;^^1具有同源性並被重組到染色體上的這些位點。當出現雙交叉時，所得的子代攜帶了刪除;^U或的基因和抗生素抗性標記。通過標準Pl轉導技術將具有抗生素抗性標記的刪除基因轉導入大腸桿菌菌株(MG1655)。菌株分析檢測了雙敲除型在補充了Balch's維生素溶液，Balch's改進的痕量元素溶^夜(Balch，W.E.，等，"Methanogens:revaluationofauniquebiologicalgroup,"Microbiol.Rev.43:260-296，(1979))，和0.4%D-核糖的基礎培養基(M9鹽)(Difco)上的生長。未觀察到雙突變型的生長，除非培養基中還含有5mM丙酮酸。而野生型MG1655在含有和缺乏丙酮酸的上述培養基上都能生長。檢測了雙敲除型在補充了0.4%葡萄糖而不是核糖的上述基礎培養基上的生長。在該培養基上的生長類似於野生型菌株所觀察到的。在這個培養基中，經;^/基因產物(可由磷酸烯醇丙酮酸製成丙酮酸並將磷酸轉移至葡萄糖的磷酸轉移酶系統的酶)可由葡萄糖生成丙酮酸。還檢測了雙敲除菌株在上述的補充了0.4。/。L-阿拉伯糖或0.4。/。D-木糖而不是核糖的基礎培養基上的生長。生長的這些含5-碳(非PTS)底物沒有生成丙酮酸。雙敲除型在這些條件下未生長，除非補充5mM丙酮酸，而野生型菌株在含有和缺乏丙酮酸下都能正常生長。利用pBAD-TOPOTA表達試劑盒(Invitrogen)將WO03/091396A2實施例2中所述的來自睪丸酮叢毛單胞桿菌的proA醛縮酶基因(在pET30Xa/LIC中克隆的)和WO03/091396A2實施例3中所述的aspC/proA基因操縱子(在pET30Xa/LIC和pET32中克隆的)亞克隆到pBAD-TOPO中。通過可誘導的araBAD啟動子調控基因在這些構建體中的表達。存在阿拉伯糖(例如4X)和IPTG時，表達基因。除非補充丙酮酸或丙酮酸源，否則菌株在基礎培養基上不生長。可在培養基中補充莫納甜，莫納甜前體，或莫納甜或莫納甜前體的類似物。文獻中所用底物的典型範圍是0.5-5mM。例如，ProA醛縮酶可將莫納甜前體轉化成丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸，為菌株提供丙酮酸源並使其能在含0.4%阿拉伯糖的基礎培養基上生長。表達proA和aspC基因的構建體可將莫納甜轉化為莫納甜前體並將莫納甜前體轉化為丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸。此外，氨基轉移酶可將吲哚-3-丙酮酸轉化成L-色氨酸並與色氨酸營養缺陷型互補。這個體系被用於篩選醛縮酶並篩選對莫納甜的特定立體異構體，莫納甜前體的特定立體異構體，或莫納甜或莫納甜前體的類似物更為活躍的酸縮酶。例如，如果對WO03/091396A2實施例2中公開的任意醛縮酶實施定向發展，利用含R或S莫納甜前體的培養基的平板試驗被用於比較製得的突變酶的對映體特異性。如果在含R莫納甜前體的平板上生長而在含S莫納甜前體的平板上幾乎不或不生長，則該醛縮酶對在反應位點為R手性的底物具有特異性。製備了含lxBalch's維生素溶液和Balch's改進的痕量元素溶液的M9基石出培養基平板。Balch，W.E.，等，"Methanogens:reevaluationofauniquebiologicalgroup."Microbiol.Rev.43:260-296，(1979)。含有葡萄糖或阿拉伯糖作為碳源(0.4%w/v)並在平板中補充了溶解在20mM磷酸鉀緩衝液(pH8.0)的5mM莫納甜(R,R;S，S消旋混合物)或等體積的不含莫納甜的磷酸鉀緩衝液。生長情況總結在下表20中表20:tableseeoriginaldocumentpage64可以預期的是通過控制ProA和AspC水平，增加莫納甜的吸收，以莫納甜前體替換莫納甜(在這種情況下不需要氨基轉移酶)，或使用莫納甜的較不疏水的類似物，例如上述的那些，可優化篩選。增加莫納甜吸收的方法包括添加胺基酸混合物，添加特定胺基酸，和使用清潔劑，抗生素，抗生素類似物，或有助於滲透細胞壁的酶，和添加少量丙酮酸以使其生長以防醛縮酶不能提供足以支持生長的丙酮酸。多粘菌素B九肽(Dixon和Chopm，AntimicrobialAgentsandChemotherapy2P:781-788(1986))和微囊藻素RR(Dixon，等，FEMSMicrobiologyLetters230:167-170(2004))已被公開可作為滲透大腸桿菌外膜的製劑。可以預期的是將其它啟動子體系/質粒用於這個篩選系統會具有等效的結果。實例包括T7啟動子體系，和IPTG可誘導啟動子例如tac和lac。aspC和proA被克隆到pTrc99a表達載體中(Amersham，Piscataway，NJ)。得到的載體被轉化到色氨酸營養缺陷型CAG18455或CAG185799(參見實施例4的菌株說明)。轉化體被塗布到含O.lmMIPTG和5mM莫納甜的M9基礎培養基。37°C3天後，含操縱子質粒的菌株形成了菌落，而親代菌株看起來不生長。此外，生長依賴於IPTG的存在，這表明操縱子的表達是生長所必需的。在該互補性研究中，aspC/proA操縱子將莫納甜形成MP再將MP形成吲哚-3-丙酮酸。然後卩引哚-3-丙酮酸被轉化成L-色氨酸，使色氨酸營養缺陷型在M9基礎培養基上生長。幾種有效的生物可能含有R特異性醛縮酶並可按上述檢測。在穀氨酸棒狀桿菌的培養懸浮物中檢測到R,R莫納甜的存在。這表明了存在可以形成R莫納甜前體的酶。此外，利用反相色譜在苜蓿中華根瘤菌的無細胞提取物中檢測到多種莫納甜異構體的存在，再次表明可能存在可以形成莫納甜前體的R立體異構體的醛縮酶或氨基轉移酶。通過以proA(睪丸酮叢毛單胞桿菌)作為模板的BLAST分析發現稻草假單胞菌(屍seMcfowowasWram/wea)(黃褐假單胞菌(屍化W(iowowayoc/zraceae)NGJI)，苜蓿中華根瘤菌，鞘氨醇單胞菌LB126，節桿菌(v4r決ra6a"erA:ej^en〕12B，鼠疫耳卩爾森菌(I^raz'"z'(3pe幼》C092株，'優生大豆根瘤菌USDA110株，少動鞘氨醇單胞菌(假單胞鼠疫耳，爾森菌(Jera/m'ape他)KIM，耐重金屬青枯菌(7^/^0"^柳""//^^"瓜)034，假結核耶爾森菌(!^廠s/m'a/wewdo/^Z^/rw/os/^IP32953，碗豆豐艮瘤菌(Rhizobiumleguminosarumbiovarviciae)rhiz23g02-plk—1009—341(SangerInstitute),新鞘氨醇桿菌(M)vo5p/>7goZ)/wwarama"c/voraw)DSM12444，惡臭假單胞菌KT2440,趨磁磁螺菌CMag"etoy;/n.〃wwmag"etotoc"cww)MS-l，沼澤紅假單胞菌(屍/2ocfo/wew(iowo"as/a/wWn》CGA009，野油菜黃單胞菌(Xa"/Z7謹ow(ZsC(3mpe血》ATCC-33913，鞭毛地毪黃單胞菌(Jfa"^zomo"<asaxo"opW51cz'W)306，和阿弗曼鏈黴菌OS"fre;tom3;cMaver柳/"7/力MA畫4680具有同源性。參見美國申請20050282260。這些生物體用作為DNA源並在上述篩選中檢測。能在沒食子酸，丁香酸，原兒茶酸，鄰苯二甲酸，對羥基苯甲酸，和芴中生長的生物體可能含有能形成莫納甜的醛縮酶並具有用於上述篩選的可能。下列生物體經4，5-雙加氧酶途徑代謝原兒茶酸並具有有效的酲縮酶支氣管敗血波氏桿菌(BoWete//a6rawc/n';se;^ca)RB50,副百日咳博德特桿菌(^ordefe//";arapeWwM&)12822，月巿炎克雷伯菌(X7efo/e〃a;"ewmo"/ae)MGH78578，趨磁磁螺菌MS-1，沼澤紅假單胞菌CGA009，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasaromaticivorans)F199，鞭毛地毯黃單胞菌306，野油菜黃單胞菌ATCC-33913。而下列生物體經3,4-雙加氧酶途徑降解原兒茶酸並具有有效的醛縮酶乙酸f丐不動桿菌G4c/""c^a"erca/coacWcw力ADPl，不動桿菌ATCC33305，ADP1，根癌農桿菌C58，棕色固氮菌C4zoto6fl"wv/"e/a"A7)AvOP，慢生大豆根瘤菌USDA110株，慢生大豆根瘤菌USDA438株，流產布魯氏菌，羊種布魯氏菌CSrace〃awe/zYera/力16M，羊種豬種布魯氏菌(^^<^//0we/"e"^w/》1330，洋蔥伯克霍爾德菌CBw^o/cfen'acepac/a)J2315，真菌伯克霍爾德菌C6wr狄oWen'a/w"gorww〉LB400，類鼻疽伯克霍爾德菌C6wrA:/zo/(ien'ap化wofowa〃e/)K96243，棒狀桿菌(Corynebacteriumefficiens)YS-314，穀氨酸棒狀桿菌(C07"eZacten'wwg/wto,"/cww)ATCC-13032，百脈根中慢生根瘤菌(Merar/z/zo6/wm/o"〕MAFF303099，鳥分枝桿菌副結核亞種(Myco6acten'wmrn^rnw&P.)kl0株，銅綠假單胞菌PAOl，螢光假單胞菌PfD-l，螢光假單胞菌SBW25，惡臭假單胞菌KT2440，丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000t朱(屍5^"(icw70"fiws;^7'"gaepv.tomatostr.DC3000)，茄禾鬥羅爾斯通氏菌(ifl/"o"/aM/anaceanw7)，紅球菌124(IG-15)株，苜蓿中華根瘤菌1021，阿維鏈黴菌(S/r，畫戸saverw"z7/力MA-4680，天藍鏈黴菌(&r，謹戸51coe//co/or)A3(2)，鞭毛地毯黃單胞菌306，野油菜黃單胞菌ATCC-33913。實施例6HEXAspC的位點定向誘變發現大腸桿菌AspC的六突變體(hexamutant)(HEXaspC)相對於AspC在S,S莫納甜的生成上具有更好的活性，如WO03/091396A2實施例6所述。HEX(登錄號:/AHFAgi:1271卯)包括以下來自AspC的突變體(大腸桿菌編號)V35L，K37Y，T43I,N64L，T104S，和N285S。根據結構分析和文獻報導(Rothman，S.，和Kirsch，J.，J.Mol.Biol,327:593-608，(2003);Rothman，S.，等，ProteinScience13:763-772，(2004))，創建了多於5種的突變體，其被認為能增加向在莫納甜生成途徑中所用的底物的動力學活性L-色氨酸，S-MP，或兩者。其中兩種突變體增加了色氨酸和S,S莫納甜的轉氨速率。其中兩種突變體對S，S莫納甜的形成表現出增強的立體選擇性而一種是較小的立體選擇性。根據這些，可以預期具有類似突變體的來自芽孢桿菌的寬特異性D-氨基轉移酶可用作圖3所示的R,R莫納甜途徑中的D-氨基轉移酶，如實施例4(4)所述。其中一種突變體(HEXaspCP9T/R122G)對L-色氨酸轉氨作用具有增強活性，但在S，S莫納甜生成或S，S莫納甜轉氨作用中的活性明顯下降。因而，可以預期這種酶在圖1，2，4，5，6，7，禾B8中所示的R,R莫納甜生成的第一步中，如實施例9和10(3)所述。通常，對L-色氨酸具有與AspC類似活性，對R-MP和S-MP具有限制活性的氨基轉移酶可用於圖1，2，4，5，6，7，和8所描述的過程中。方法和材料由J.F.Kirsch教銜DepartmentofMolecularandCellBiology,UniversityofCalifornia,Berkeley,Berkeley,CA94720-3206)提供了在pUC19中克隆的HEX基因並將其作為模板將所述基因克隆進pET23a的模板。參見Onuffer，J.J.，禾口Kirsch，J.F.，"RedesignofthesubstratespecificityofEscherichiacoliaspartateaminotransferasetothatofEscherichiacolityrosineaminotransferasebyhomologymodelingandsite-directedmutagenesis,"ProteinScience4:1150-1151(1995)。還參見NCBI登錄號1AHF—AGI:127190(HEX胺基酸序列)。為將HEX基因克隆進pET23a載體(Novagen，Madison，WI)設計了以下引物HEXaspC引物N端5'-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3'(SEQIDNO:7);C端5'-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG醫3'(SEQIDNO:8)採用以下PCR方案進行基因擴增在100|iL反應中，加入50ngDNA模板，1.0每種引物，0.2mM每種dNTP，1UPfuTurbo聚合酶(Stratagene;LaJolla，CA)，和IX克隆Pfo緩衝液。熱循環器的程序採用94。C熱啟動5分鐘，隨後25個循環的94'C變性步驟(30s)，55。C的退火步驟(1分鐘)，72°C的延長步驟(2分鐘)，最後在72。C終止步驟(7分鐘)。以Bamffl和MfeI(NewEnglandBiolabs)限制性內切酶消化經純化的PCR產物。利用Roche快速DNA連接試劑盒，將PCR產物連接到也經BamHl和iV&I消化的pET23a上。利用Bio-Rad基因脈衝發生器II系統按照生產商的方案將脫鹽的連接物電穿孔到大腸桿菌DH10B細胞中。利用QiagenSpin小量製備試劑盒製備小量製備DNA並將其作為誘變反應的模板。按照生產商的方案(Novagen)將質粒轉化到EcoliBL21(DE3)細胞中。根據蛋白建模觀察，在130位的色氨酸殘基被認為對於與吡眵醛環堆積作用是重要的，而且表現為是S莫納甜前體("S-MP")底物的空間位阻來源。因此，具有更小疏水側鏈的胺基酸(苯丙氨酸)被用於替代色氨酸。突變的靜止是基於文獻的動力學數據，不過創建了期望突變的新組合。對HEXaspC的所有突變，除了W130F，都是採用Stratagene快變試劑盒按照生產商的說明所進行的。W130F突變是採用Stratagene快變試劑盒按照生產商的說明只除了將PCR反應的延伸溫度降至66T:所進行的。除W130F單突變引物之外，用於多變試劑盒的引物都是利用在〈www.stratagene.com〉上的快變多試劑盒引物設計工具設計的。引物序列如下表21所列表2h引物序列(5'-3')AspCW130F—反向CGCTCTTATGGTTCGGTTTGCTTGGGTTGCTCACCC(SEIDNO:9)AspCW130F—正向GGGTGAGCAACCCAAGCTTTCCGAACCATAAGAGCG(SEQIDNO:10)R122G-"CAAAAAATACCAGCGTTAAGGGAGTGTGGGTGAGCAACC(SEQIDNO:11)P9T—4aCATTACCGCCGCTACTGCCGACCCGATTC(SE(3IDNO:12)168v-rCACCAAAAATTACCTCGGCGTAGACGGCATCCCTGAATT(SE(3IDNO:13)T156A3TGATGCGGAAAATCACGCTCTTGACTTCGATGCAC(SEQIDNO:14)a表示引物經5'磷酸化修飾。HEXaspC突變基因的表達和酶活性的分析將來自以下菌株的新鮮平板或冷凍甘油儲藏物接種到Novagen過夜表達TM自誘導體系2(目錄號存71366-3;溶液l-6)的液態培養物(5mL)中:大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCpET23a大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/Tl56ApET23a大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/Rl22GpET23a大腸桿菌BL21(DE3)::HEXaspCR122G/T156ApET23a培養物在37"C230rpm下溫育6-8小時。測定每種培養物的OD,並計算獲得25mLOD,為0.03-0.05所需要的培養物體積。將計算體積的每種液態培養物轉移到含25mL相同培養基的燒瓶中。過夜表達TM自誘導體系2是一個完善的化學定義培養基，其用於以乳糖作為誘導劑的IPTG誘導表達系統的高水平表達，並且不需要監測細胞生長。過夜表達培養物在3(TC230rmp振蕩下溫育18小時。通過離心收集細胞並用冷50mMMOPS，pH7.0洗滌一次。然後採用含l|iL/mLbenzonase核酸酶(Novagen目錄號#70746-3)，5^L/mL蛋白酶抑制劑調配液II(Novagen目錄號#539132)和0.33^1710mLr-裂解酶(Novagen目錄號#71110-3)的Bugbuster(不含伯胺)提取試劑(Novagen目錄號#70923-3)按照Novagen推薦方案裂解細胞。25。C溫和振蕩溫育15分鐘後，4。C下21000g離心15分鐘將每種懸浮液中的細胞碎片聚團。小心地將上清液移出作為無細胞提取物分析。通過在30%Bugbuster(不含伯胺)提取試劑懸浮細胞碎片部分，21,000xg離心10分鐘，在10%Bugbuster(不含伯胺)提取試劑懸浮離心得到的細胞團，再次離心以分離洗滌後的細胞團，來分離包含體部分。通過在4-15。/。梯度凝膠(Bio-Rad^161-1104)的SDS-PAGE對無細胞提取物和包含體部分進行蛋白表達分析。對於細胞提取物樣品，20微克的可溶蛋白點樣到每個凝膠泳道(和IX蛋白上樣緩衝液預混並在95'C加熱5分鐘)。以1X蛋白上樣緩衝液(0.2mL)溶解包含體部分，在95'C加熱10分鐘，並將5^L每種溶液點樣到每條泳道中。採用LabworksBiolmaging1D-凝膠工具(UVP，Inc.Upland,CA)通過條帶亮度分析計算每種HEX突變體相對於上樣到每條泳道中的可溶蛋白總量的量，結果如下表22:表22tableseeoriginaldocumentpage70凝膠分析顯示HEXaspCR122A/T156A突變體是唯一的被發現實際質量與包含休一樣的蛋白。TheHEXaspCP9T/T156A蛋白具有最高的表達水平，比HEXaspC蛋白好大約90。/。。相反，W130F，T156A和P9T/R122G表達的濃度低於HEXaspC。利用以下反應條件測定用於生成S,S莫納甜的HEXaspC突變蛋白的活性每lmL反應中含有50mMTAPS，pH8.2，4mMMgCl2，3mM磷酸鈉，pH8.0，200mM丙酮酸鈉(pH調整至8)，5mMa-酮戊二酸(pH調整至8)，50mM色氨酸，0.05mM3-磷酸敗眵醛，50pg/mLProA醛縮酶(以無細胞提取物加入)和不同濃度的(約50和500嗎/mL)氨基轉移酶(以無細胞提取物加入)。脫氣水被用於製備儲液並將反應混合物體積調整至l.OmL。在加酶之前加入磷酸吡眵醛。將反應管在3(TC溫和振蕩下溫育4小時。加酶之後在l，2，和4小時抽取樣品(0.01mL)，過濾，並以LC/MS/MS分析，如實施例1所述。根據反應中存在的氨基轉移酶的量標準化莫納甜的產量。在這些試驗條件下，HEXaspC和HEXaspCT156A每mg氨基轉移酶生成了最多的總莫納甜，而P9T/R122G蛋白生成了最少，之後是HEXaspCW130F。HEXaspCW130F和P9T/R122G酶對S-MP表現出最高的立體選擇性(大於98°/。S，S莫納甜)，即使在使用高酶濃度時(大於300pg/mL)。在含有高濃度的P9T/T156A酶的酶促反應中S，S莫納甜產物的百分比降至小於90%。其它突變體表現出的產物立體選擇性與原始HEXaspC突變體十分類似(約95%S,S莫納甜)。按實施例1所述採用FDAA衍生試劑分析含有HEXaspC酶的反應的產物，發現形成的第二立體異構體是R,S莫納甜。色氨酸和莫納甜氨基轉移酶活性的分析試驗以L-色氨酸和S,S莫納甜作底物檢測了突變體的轉氨活性。按實施例1所述以帶OPA柱後衍生的HPLC，根據之後的反應共產物穀氨酸的生成測定了氨基轉移酶活性。在1.0mL反應混合物中含有lOOmMHEPPS緩衝液，pH8.0，20mMa-酮戊二酸，0.08mM磷酸吡眵醛，25mM色氨酸或S,S莫納甜，和酶(以2.5mg的細胞提取蛋白提供)。除酶之外將所有成分混合在一起。加酶以啟動反應並將反應溶液在3(TC(溫和振蕩)溫育卯分鐘。反應平行進行，以不加酶的作為陰性對照。通過加入10%蟻酸(終濃度)終止反應，以21000rpm離心混合物，並小心移出上清液過濾。根據穀氨酸的背景水平和加入酸以沉澱蛋白的稀釋來修正數據，然後通過加入的突變氨基轉移酶量進行標準化。以色氨酸作為底物時，HEXaspC每mg氨基轉移酶每小時產生13.0mM穀氨酸。突變體的相對活性如下，以百分比表示HEXaspCWBOF(156%)，HEXaspCT156A(151%)，HEXaspCP9T/T156A(63.7%)，甜作為底物時，HEXaspdmg氨基轉移酶每小時產生7.43:M穀氨酸。突變體的相對活性如下，以百分比表示HEXaspCW130F(113%)，HEXaspCT156A(87.7%)，HEXaspCP9T/T156A(67.3%)，HEXaspCP9T/R122G(11.2%)，和HEXaspCR122G/T156A(114%)。HEXaspCP9T/R122G突變體對色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的轉化具有增強活性，但對S,S莫納甜轉氨的活性降低。色氨酸與莫納甜活性的比例是18.2，與之相比HEXaspC是1.75，使其成為利用需要L-氨基轉移酶如實施例9和10(2)所述的那些的途徑生成R，R莫納甜的理想候選酶。可見，HEXaspCP9T/R122G是對S,S莫納甜以及MP具有限制活性的氨基轉移酶的實例。71大部分突變改進了L-色氨酸活性，只有兩種突變增強了對L-色氨酸和S,S莫納甜兩者的活性(HEXaspCW130F和HEXaspCR122G/T156A)。由於在這些試驗中使用了25mM底物，酶極可能被飽和，而活性是酶k^t的反映。但是，在如上所述的實施生成S，S莫納甜試驗的條件下，S-MP的濃度不可能足以飽和酶，因而S，S莫納甜的生成沒有總體上升，由於k^的增加被Km的增加所抵消。據報導，對於類似底物，某些突變使l^t增加，還增加了對胺基酸底物的表觀Km。如果利用增加底物濃度，可以預期的是相對於HEXaspC，這兩種突變體會在S,S莫納甜的產率上具有優勢。在上述的生成S,S莫納甜的條件下，HEXaspCT156A突變表現出具有增強的色氨酸轉氨速率但對MP轉氨速率沒有顯著影響。通過對HEXaspC和其中一種芽孢桿菌D-氨基轉移酶(參見例如Sugio，S，等，Biochemistry34:9661-9669，(1995))結構的比較，AspC的W130F，R122G，T156A，和HEX突變可與D-氨基轉移酶結構上相應的殘基對應。可以預期的是在寬特異性D-氨基轉移酶上的類似突變會改進R,R莫納甜的整體產量，如實施例3所述。例如，在AspC上由色氨酸130提供的官能性在芽孢桿菌D-氨基轉移酶上通過絲氨酸179-181與穀氨酸166(YM-1編號規則)的側鏈之間的氫鍵所替代。為減少空間位阻，穀氨酸可被突變成天冬氨酸殘基。某些D-氨基轉移酶在179位具有蘇氨酸殘基，其將增加空間位阻，應被避免。球形芽孢桿菌酶在181位上以丙氨酸替代了絲氨酸，其也可減小空間位阻。天冬氨酸氨基轉移酶研究的其它信息也可被應用於D-氨基轉移酶。AspC酶在活性位點上具有精氨酸，其可與二羧酸酯底物的側鏈相互作用，D-氨基轉移酶具有Ser240-Ser243的環。Ser240，Thr242，和Ser243的側鏈面向相同方向並與Sed80的羥基形成口袋，為非極性和極性底物提供了可相互作用的表面。Ser180參與PLP結合;但是，為改進D-氨基轉移酶對R-MP的活性，可修飾Ser240，Thr242，或Ser243殘基以接受更大的底物或親合負電荷底物。例如，Thr242可被突變成Ser以減小側鏈長度。其中一個殘基可被突變賴氨酸或精氨酸，例如Ser243。Val30-Va136殘基(YM-I編號)位於卩鏈上穿過了D-氨基轉移酶的活性位點，對於活性也是很重要的。Tyr31，Val33，Glu32，和Lys35被認為是面向活性位點。Tyr31，Glu32,和Val33在所有的芽孢桿菌同源體中是不變的。Ro，等，FEBSLett398:141-145，(1996))將Val33誘變成Ala並發現其略微地增強對a-酮戊二酸轉氨反應的促進效率而明顯地改進了對較大體積底物(更小空間位阻)的促進效率。在某些同源物中Lys35被Arg所取代，但若考慮空間位阻是，則優選Lys殘基。對於保守替代例如異亮氨酸而言還優選纈氨酸34和36，也是由於對大分子如MP更小的空間位阻。由於實施例15和16所述的新型D-氨基轉移酶("4978")比實施例19所述的球形芽孢桿菌酶和雜合DAT具有更高的活性，因此明顯地成為進一步誘變反應的選擇。基於對YM-lD-氨基轉移酶的晶體結構分析，上述觀點可被應用於來自ATCC株4978的D-氨基轉移酶。上述胺基酸的編號比在4978蛋白序列上的相應胺基酸小1個胺基酸。實施例7在莫納甜的生成中使用支鏈氨基轉移酶("BCAT")AT-102和AT-104是從BioCatalytics(Pasadena，CA)購買的支鏈L-氨基轉移酶(EC2.6丄42)。利用化學方法製備的S,S和R，R莫納甜底物檢測了酶的轉氨活性。反應在0.5mL的總體積內進行，並平行進行。試驗含有50mMTrispH7.8，0.08mMPLP，10mMa-酮戊二酸("a-KG")，5mM莫納甜，和1mg/mL氨基轉移酶。陰性對照不含有外源氨基轉移酶。樣品在3(TC100rpm振蕩下溫育2小時。過濾樣品進行LC/MS/MS分析，如實施例l所述，進行至特定的穀氨酸水平。穀氨酸水平應與MP產量在化學計量上是相關。以R,R作為反應底物時，陰性對照中存在很低水平的穀氨酸。AT-104比陰性對照生成了稍多的穀氨酸，這表明對R，R莫納甜(D胺基酸)活性水平低。兩種支鏈L-氨基轉移酶對S,S莫納甜都表現出活性。AT-102生成了102叱/mL穀氨酸而AT-104生成64昭/mL穀氨酸。作為比較，在這些條件下寬特異性氨基轉移酶(AT-101,也來自BioCatalytics)生成了75pg/mL。支鏈氨基轉移酶具有的高活性是有些預料不到的，因為莫納甜與通常作為寬特異性或天冬氨酸氨基轉移酶的底物的二羧酸胺基酸和芳族胺基酸具有更高的結構類似性。但是，由於莫納甜的穀氨酸骨架，可利用穀氨酸作為氨基供體的許多氨基轉移酶也具有對莫納甜的活性。使用BCAT由吲哚-3-丙酮酸生成莫納甜檢測了AT-102和AT-104在採用來自睪丸酮叢毛單胞桿菌的ProA醛縮斷按WO03091396A2所述製備的)的相連反應中生成的莫納甜。在試劑盒所提供的反應緩衝液中直接加入酶和其它成分/底物，其包括100mM磷酸鉀緩衝液pH7.5，lOOmML-穀氨酸，禾no.lmMPLP。在lmL反應緩衝液中加入了4mg吲哚-3-丙酮酸，20mg丙酮酸，約50pg以細胞提取物提供的ProA，1pL2MMgCl2，和2mg待檢測的氨基轉移酶。所有反應均平行地進行，並以不添加額外的氨基轉移酶的反應作為陰性對照。以陽性對照(AT-101)為陽性對照進行比較；這種酶是寬特異性L-氨基轉移酶。莫納甜的背景產量是由於在重組ProA酶的細胞提取物中存在天然大腸桿菌氨基轉移酶。反應在30"C溫和振蕩(100rpm)下溫育過夜。按實施例1所述過濾樣品並進行反相LC/MS/MS分析。結果如下表23所示表23酶生成的莫納甜ng/mLAT-lOl173.05AT-102122.05AT-104133.05陰性73.25明顯地AT-102和AT-104氨基轉移酶比陰性對照生成了更多莫納甜並具有陽性對照的大約50-60%活性。來自大腸桿菌的支鏈氨基轉移酶已被研究成熟並詳細地分析了其晶體結構。Okada,K.，等，(1997)J.Biochem(Tokyo)121:631-641，(1997)。該酶與芽孢桿菌D-氨基轉移酶如實施例2，3，和6所述的具有相似的整體摺疊和顯著的序列同源性。此外，BCAT酶和來自芽孢桿菌的D-氨基轉移酶是僅有的兩類PLP依賴型氮基轉移酶，面對PLP加氫表現出立體異構特異性。Yoshimura，T.，等，J.Am.Chem.Soc.115:3897-3卯0，(1993)。BACT被認為是唯一的(X-胺基酸底物結合到它的與磷酸基團同邊的羧基上，使其具有與D-氨基轉移酶相似的摺疊和機制而仍保留對L-胺基酸的特異性的酶。Peisach，D.，等，Biochemistry57:4958-4967,(1998)。據信BCAT的L-特異性源於在BCAT中定位底物a-羧基的D-氨基轉移酶的極性胺基酸側鏈被非極性殘基所取代的事實。可以預期的是如果所有或者部分這類殘基被突變成芽孢桿菌D-氨基轉移酶的相應胺基酸，可將BCAT轉化成D-特異性氨基轉移酶。對大腸桿菌BCAT可進行以下突變(根據登錄號gi:14719463編號)Phe37至Tyr，ValllO至His,Metl08至Arg。如實施例6所述在這些位點上還可進行其它極性胺基酸取代，以剪切酶活性位點接受大的二羧酸底物。還需將Tyrl65轉化成Leu，以反映D-氨基轉移酶的PLP相互作用；還需要對Tyr96(至Phe)，Arg41，和Arg98進行突變以防止cc-羧基結合到BCAT酶的不正確方向上。也可將Trpl27突變成Tyr以降低疏水側鏈與pro-S構型結合的可能性；Tyr32和Tyrl30可與L-穀氨酸在BCAT的活性位點上相互作用並被突變成負電荷胺基酸以使這種作用最小化。Goto,M.，etal，Biochemistry42:3725-3733，(2003);Okada，K.，Biochemistry40:7453-7463，(2001)。由於D-氨基轉移酶和支鏈氨基轉移酶都具有生成莫納甜的活性，可以預期BCAT可被轉化成具有生成R,R莫納甜活性的D-氨基轉移酶，從而提供另一種可能的D-氨基轉移酶以用於許多實施例所述的反應方案。根據上述結果，可能的是AT-104酶已表現出對莫納甜D-氨基構象的若干活性。芽孢桿菌支鏈氨基轉移酶的克隆和誘變地衣芽孢桿菌包含與大腸桿菌支鏈氨基轉移酶相比，被公認的和D-氨基轉移酶更密切相關的支鏈氨基轉移酶。檢驗了D-轉氨活性，並根據上述預測的大腸桿菌BCAT活性位點殘基進行誘變。菌株地衣芽孢桿菌(ATCC編號14580)在營養瓊脂中30'C過夜生長。菌落團被置於100滅菌水中95'C加熱10分鐘，以裂解細胞。3mL被用於後續的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。聚合酶鏈式反應方案利用Ncol和Sail位點設計引物以將地衣芽孢桿菌基因(915bp)克隆進pET28b和pET30a載體(Novagen，Madison,WI)和pTRC99a(GEHealthcareLifeSciences)。pET30構建體含有N末端組氨酸標籤和S標籤，而pET28構建體未被標記。地衣芽孢桿菌bcat引物N端5'-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3'(SEQIDNO:44);和C端5'-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT-3'(SEQIDNO:45)採用下列PCR方案擴增編碼區。在50pL反應中，使用了3pL模板，1^M每種引物，0.4mM每種dNTP，3.5U延伸高保真聚合酶，和IX含Mg延伸tm緩衝液(Roche，Indianapolis,IN)。所採用的熱循環儀程序包括96°C熱啟動5分鐘，之後30次重複下列步驟94'C30秒，5(TC1分鐘45秒,和72C2分鐘15秒。30次循環之後，樣品在72r保持7分鐘然後4t:儲藏。獲得正確大小的潔淨PCR產物(大約900pb)。克隆PCR產物被純化並以Sail和Ncol在Sail緩衝液(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA)中消化。利用QiagenQIAquick凝膠提取試劑盒純化經消化的載體(pET28，pET30，和pTRC99a)和插入物。利用Roche快速DNA連接試劑盒(Roche)製成連接物並純化。利用0.2cm小池和Bio-Rad基因脈衝發生器II系統按Bio-Rad電穿孔手冊所述將連接物轉化到大腸桿菌DH10B中。可在900fiLSOC培養基37"C225rpm離心30分鐘回收細胞。細胞被塗布在含卡那黴素(25昭/mL)的LB瓊脂平板上。利用Qiagenspin小量製備試劑盒純化質粒DNA並通過Sail和Ncol的限制性消化篩選正確插入物。表現為具有正確，薛入的質粒的序列可通過AgencourtBioscienceCorporation(Beverly,MA)的雙脫氧鏈終止DNA測序儀來確認。測序證實的編碼序列在NCBI登錄號CP000002GI561609842851268..2850354，其生成具有如登錄號AAU24468GI52004526所列的胺基酸序列的蛋白。基因表達和試驗質粒DNA(pET載體)被轉化進大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)(Novagen，76Madison，WI)以構建pET載體。培養物生長並利用Qiagen小量製備試劑盒分離質粒，通過限制性消化分析以確認同一性。一般在含卡那黴素(50嗎/mL)的LB培養基上進行誘導。細胞在37。C生長至OD6。o為0.4-0.8並以O.lmMIPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導，誘導後3-4小時取樣。按照NovagenBugBusterTM試齊U(含benzonase核酸酶並加入Roche完全蛋白酶抑制劑調配液)所帶的方案製備細胞提取物。經SDS-PAGE鑑定，獲得了高水平的預期分子量的可溶蛋白。通過SDS-PAGE分離細胞提取物中的可溶蛋白。採用以下方案通過由丙酮酸(或由a-酮戊二酸至穀氨酸)禾卩D-色氨酸生成丙氨酸來分析細胞提取物的D-氨基轉移酶活性；平行的lmL反應通常在lOOmM磷酸鉀緩衝液(pH7.5)，50pM磷酸吡眵醛，25mM丙酮酸鈉，和50mMD-色氨酸中進行。通過加入無細胞提取物或純化酶啟動反應並在30。C溫和振蕩下溫育15分鐘過夜。為進行比較，在每個試驗中加入大約相同水平的D-氨基轉移酶(通常接近0.5mg)，而AT-103(BioCatalytics)往往作為基準酶。加入蟻酸至終濃度為百分之二以終止反應，通過離心去除沉澱的蛋白。還進行了不加蛋白的對照反應。也以零時間點作為陰性對照。按實施例l所述採用OPA衍生檢測丙氨酸和穀氨酸。相對於AT-103和球形芽孢桿菌酶，支鏈氨基轉移酶具有低水平的D-氨基轉移酶活性。還檢測了支鏈氨基轉移酶由D-色氨酸生成莫納甜的能力(如實施例3)，但在檢測條件下未表現出活性。pTRC99a構建體被轉化進電轉感受態大腸桿菌CAG18455細胞中，其是用於色氨酸生成的營養缺陷型。細胞在含Balch's維生素，100mg/LL-色氨酸，0.4%葡萄糖，和氯化鈣的M9基礎培養基上生長。沒有L-色氨酸則細胞不能生長。以10，100和1000pMIPTG在OD6Q。0.4誘導4.5小時。在SDS-PAGE上可觀察到正確MW的條帶。利用QuikChange⑧多位點定向誘變試劑盒(Stratagene)突變質粒。按生產商所述設計了下表24中的引物。表24:tableseeoriginaldocumentpage78胺基酸的突變是基於大腸桿菌BCAT晶體結構的且上表中的編號是對大腸桿菌蛋白而言。DNA突變的編號是基於地衣芽孢桿菌bcat基因。引物被稀釋至0.1mg/mL且在50pL誘變反應中通常使用大約lOOng每種寡核苷酸引物，對於更大的引物按比例提高使用濃度。對於與退火的相同模板區域基本互補寡核苷酸引物，有時在該區域的整個引物池的使用總量為100ng。在反應中使用200ng的模板(在pTRC99a中的地衣芽孢桿菌bcat)，5jiL10X快變緩衝液，2pLdNTPs，和2pL酶混合物。在37'C下以i^"I限制性內切酶(Stratagene)(2^L)處理擴增產物2小時，並轉移至1.5mL厚壁管進行乙醇沉澱。重懸的(濃縮的)反應混合物(2.5pL)被轉化進快變試劑盒所包含的XL10-Gold超感受態細胞中。小量製備了幾個菌落並測序以確保突變是隨機的並估計獲得的誘變水平。平板上的菌落被重懸並進行大容量的小量製備。然後將小量製備DNA轉化到色氨酸營養缺陷株中，並塗布在上述的基礎培養基上(含IPTG)或採用以D-色氨酸作為唯一氮源的基礎培養基。禾U用在之前輪表現為不能很好結合的引物在大容量的小量製備中進行第二輪和第三輪突變。在每個階段，將在基礎培養基上快速生長的菌落(較大菌落)保留以進一步分析。從選擇平板中分離出下表25所示的突變。在某些情況下，出現在選擇培養基上的這類相同突變大於一次。表25克隆突變4F37Y，Y96F6Y96F28F37Y，Y165L32Y96F，L127K5陽1F37Y，Y96F，R98Y，L108R，L110H，L127Y5-2F37Y，R41K，Y96F，R98Y，L108R，L110H，L127Y在LB培養基上誘導突變構建體以製備重組蛋白，並如上製備細胞提取物。在BioRadLaboratoriesExperion自動化電泳臺上分離細胞提取物的可溶79蛋白並利用版本L1.98.0的Experion軟體分析濃度和表達百分比。觀察到很低水平的可溶重組蛋白；因而感興趣條帶的定量是不可能的。採用50-250pL細胞提取物進行試驗以檢測D-色氨酸轉氨反應。以a-酮戊二酸和丙酮酸作為氨基受體分析克隆4，6，28，和32，並在3(TC下溫育2小時和過夜。細胞提取物中的丙氨酸/穀氨酸的背景水平被減去。對5-l和5-2的試驗，通過Experion軟體估計的BCAT的蛋白濃度是野生型酶為275.1ng/pL，BCAT5-1為409.3ng/pl,而BCAT5-2為148.2ng4U。試驗結果如下表26-28所示。表26tableseeoriginaldocumentpage80表28BCAT穀氨酸(mM)l小時穀氨酸(mM)過夜野生型(50pL)0.0180,075野生型(100nL)0.0370.1525匿l(50pL)0.0050.0175-l(100|iL)0.010.0455鄰0jiL)0.0010.0115-2(1OO)iL)0扁0.031明顯地與大多數L-氨基轉移酶一樣，相對於丙酮酸酶對a-酮戊二酸作為氨基受體具有偏好性。所有突變體具有D-氨基轉移酶活性，如野生型親代一樣。不清楚野生型酶具有更高還是更低的D-氨基轉移酶活性，因為對細胞提取物中的BCAT蛋白進行精確定量是不可能的。但是，可以預期的是突變酶相對於野生型具有更低的L-氨基轉移酶活性，從而改進了D-對L-轉氨率的比值。持續誘變可為莫納甜途徑提供可選的酶。穀氨酸和天冬氨酸消旋酶的克隆，表達，和檢測該實施例中描述了用於克隆和檢測可用於L-穀氨酸和D-穀氨酸(或L-和D-天冬氨酸或L-和D-丙氨酸)之間相互轉化的胺基酸消旋酶的方法。穀氨酸，天冬氨酸和丙氨酸消旋酶被用於生成R,R莫納甜的生物合成途徑中，在該途徑中一個步驟生成L-胺基酸(如L-穀氨酸，L-天冬氨酸，或L-丙氨酸)而另一步驟消耗D-胺基酸(如D-穀氨酸，D-天冬氨酸，或D-丙氨酸)。圖4圖示了採用L-色氨酸特異性氨基轉移酶，R-特異性醛縮酶，D-氨基轉移酶和穀氨酸(或天冬氨酸或丙氨酸)消旋酶由L-色氨酸生成R,R莫納甜的生物合成途徑。將基因克隆進pET28和pET30載體以生成未標記蛋白和帶可切割的N端HIS6-Tag/T7-Tag融合蛋白。利用固定化金屬親和層析純化得到的蛋白。實驗綜述在大腸桿菌中克隆和表達來自短乳桿菌(Genbank登錄號D29627，核酸序列)，和戊糖片球菌(murl基因)(Genbank登錄號L2W89)的編碼穀氨酸消旋酶(EC5丄1.3)的基因。檢測提取物在L-穀氨酸向D-穀氨酸和D-穀氨酸向L-穀氨酸轉化中的活性。還以L-和D-天冬氨酸之間的相互轉化檢測了BioCatalytics天冬氨酸消旋酶(EC5丄1.13)。用於克隆的基因組DNA的分離從美國典型培養物保藏中心獲取了短乳桿菌基因組DNA(ATCC8287D)。戊糖片球菌(ATCC25745)在乳酸菌MRS肉湯中於37。C下生長並取2mL用於採用Mekalanos，J丄，"DuplicationandamplificationoftoxingenesinVibriocholerae,"Cell35:253-263，(1983)中的方法的基因組DNA分離。聚合酶鏈式反應方案用於克隆進pET28和pET30載體(Novagen，Madison，WI)的引物被設計成帶5'限制性位點和懸臂。短乳桿菌穀氨酸消旋酶引物N端5'-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG-3'(SEQIDNO:15)，和C端5'-GCGGCGGTCGACGCAATTACAATTGTGTTTGTC陽S'(SEQIDNO:16)。戊糖片球菌穀氨酸消旋酶引物N端5'-GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG-3'(SEQIDNO:17)，和C端5'畫GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT-3'(SEQIDNO:18)。採用以下PCR方案擴增來自短乳桿菌的基因。在50pL反應中，使用了0.150嗎模板，1.6laM每禾中弓l物，0.4mM每種dNTP，2.8U延伸高保真tm聚合酶(Roche，Indianapolis,IN)，0.5UPfli聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)和IX含Mg延伸tm緩衝液。採用的熱循環儀程序包括96。C熱啟動3分鐘，8次重複下列步驟94。C30秒，52。C45秒，禾卩72。C2分鐘，之後22次重複以下步驟94°C30秒，60TM5秒，和72°C2分鐘。22次重複後，樣品在72°C保持7分鐘然後於4'C儲存。這個PCR方案生成的產物為830bp，是通過與DNA大小標記的比較鑑定的。採用以下PCR方案擴增來自戊糖片球菌的基因。在50pL反應中，使用了0.15pg模板，1.6pM每種引物，0.4mM每種dNTP，2.8U延伸高保真tm聚合酶，0.5UPfu聚合酶和lX含Mg延伸tm緩衝液。採用的熱循環儀程序包括96i:熱啟動3分鐘，8次重複下列步驟94°C30秒，37°C45秒，和72°C2分鐘，之後8次重複以下步驟94X:30秒，45XM5秒，和72°C2分鐘，接著14次重複以下步驟94°C30秒，55°C45秒，和72°C2分鐘。14次重複後，樣品在72X:保持7分鐘然後於4t:儲存。這個PCR方案生成的產物為840bp，是通過與DNA大小標記的比較鑑定的。克隆採用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化PCR產物。採用SmartSpec3000TM分光光度計定量PCR產物。以限制性酶臉ol和按照生產商的推薦方案(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)消化產物並採用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化。通過限制性酶^01和&/1的消化製備？￡丁28和？￡丁30載體，之後以蝦類鹼性磷酸酶處理並採用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中純化。採用快速TMDNA連接試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)連接經消化的載體和插入物。將大約50ng處理插入物，100ng處理載體(插入物與載體的摩爾比為3:1)，5UT4DNA連接酶(快速TMDNA連接試劑盒中含有的)，和IX連接緩沖液在室溫下溫育5分鐘。採用高純度PCR產物純化試劑盒(Roche)純化連接反應物並將其轉化進大腸桿菌DH10B電轉感受態細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在lO^L連接反應物中加入40pLDH10B細胞並採用BioRad基因脈沖發生器II通過電穿孔進行轉化，條件如下在0.2cm小池中2.5kV，25jiF，200ohm。在37。C225rpm振蕩下以lmL室溫SOC回收細胞1小時。將細胞塗布在含卡那黴素(50pg/mL)的LB平板上。利用Qiagenspin小量製備試劑盒從製得的轉化體中純化質粒DNA，並通過iVwI和Sa/I的限制性消化篩選正確插入物。表現為具有正確插入物的質粒的序列可通過雙脫氧鏈終止DNA測序儀來確認。基因表達和試驗經序列分析證實的質粒DNA被亞克隆進大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WT)中。培養物在生長並採用Qiagen小量製備試劑盒分離質粒，通過限制性消化分析以證實同一性。在BL21(DE3)中對pET28(未標記)和pET30(組氨酸標籤)載體中的短乳桿菌和戊糖片球菌穀氨酸消旋酶開始進行誘導。進行了時程研究，讓培養物在250mL含卡那黴素(50iig/mL)的LB中生長至OD600為0.5-0,6並以100mMIPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導，在誘導後0和3小時取樣。600jiL(0小時)和275(iL(3小時)中的細胞被重懸在40nL含2-巰基乙醇的十二垸基硫酸鈉緩衝液中，並在95。C加熱10分鐘，再冷卻。採用4-15%梯度凝膠通過SDS-PAGE分析這類總細胞蛋白樣品份。還從3小時培養物中製備了細胞提取物，通過採用含0.625nLbenzonase核酸酶和3pL蛋白酶抑制劑調配液#3的0.625mLNovagenBugBusterTM試劑(Calbiochem-NovabiochemCorp.，SanDiego，CA)在室溫下溫和振蕩20分鐘以懸浮來自5mL培養物的細胞團，並在16000xg離心以去除細胞碎片。上清液(細胞提取物)被點樣到4-15%梯度凝膠中以分析細胞可溶蛋白。來自克隆的短乳桿菌和戊糖片球菌穀氨酸消旋酶的3小時樣品顯示出總蛋白和可溶蛋白都符合正確大小(大約31kDa)。相對於短乳桿菌pET28(未標記)的基因產物以及在兩種載體中的戊糖片球菌基因產物，短乳桿菌pET30(組氨酸標籤)基因產物在更高水平過量表達，並有更多可溶蛋白(>20%的可溶蛋白)。在pET28和pET30載體中的戊糖片球菌基因產物表現出等效的過量表達和可溶性，其明顯低於短乳桿菌pET30基因產物的觀察結果。來自誘導培養物(250mL)的細胞被離心並以0.85n/。NaCl洗滌一次。將細胞團重懸在含5pL/mL蛋白酶抑制劑調配液#3(Calbiochem-NovabiochemCorp.,SanDiego，CA)和lpL/mLbenzonase核酸酶的5mL/g(細胞溼重)的BugBusterTM(Novagen)試劑中。將樣品在定軌搖床上溫室誘導20。C分鐘。通過在4。C下16，000Xg離心20分鐘去除不溶細胞碎片。採用以下方案試驗細胞提取物的穀氨酸消旋酶活性。在10mM磷酸鉀(pH8.0)，0.2mM二硫蘇糖醇("DTT")，和10mML-穀氨酸和D-穀氨酸中進行400卞L反應。通過加入20-10(HiL無細胞提取物起始反應並室溫溫育。在l分鐘，5分鐘，IO分鐘，20分鐘和1小時的時程後採取樣品份(0分鐘樣品作為對照反應)。在每份40卞L樣品中加入2M蟻酸(25pL)以終止反應並通過離心去除沉澱的蛋白。移除上清液，-80°。冷凍直至1^顏8艦3分析。由100mMIPTG(3小時)誘導的pET30細胞提取物的試驗結果證明短乳桿菌(Genbank登錄號BAA06106.1GI:468450)和戊糖片球菌(Genbank登錄號AAA16761.1GI:349029)酶對兩種穀氨酸異構體都具有相當水平的消旋酶活性。戊糖片球菌消旋酶(2(^L細胞提取物)以任一底物啟動10-20分鐘即在L-和D-穀氨酸之間達到了平衡。短乳桿菌酶(20pL細胞提取物)也在大約20分鐘內達到平衡。利用與上述相似的方案試驗了從BioCatalytics，Inc.(Pasadena,CA)購買的部分純化天冬氨酸消旋酶(目錄號#ASPR-101)對L-天冬氨酸和D-天冬氨酸的活性。商業化酶對兩種異構體都表現出消旋酶活性。使用0.5-lmg酶，在20-60分鐘內達到平衡。還利用以下方案試驗了所有三種消旋酶(短乳桿菌穀氨酸消旋酶，戊糖片球菌穀氨酸消旋酶和BioCatalytics天冬氨酸消旋酶)對S，S莫納甜的活性。在10mM磷酸鉀(pH8.0)，0.2mMDTT，禾口10mMS，S莫納甜中進行40(HiL反應。通過加入無細胞提取物(短乳桿菌和戊糖片球菌)或純化酶(BioCatalytics天冬氨酸消旋酶)起始反應並室溫溫育。在1分鐘，5分鐘，10分鐘，20分鐘和1小時的時程後採取樣品份(作為對照反應的0分鐘樣品以及無酶樣品)。在每份40卞L樣品中加入2M蟻酸(25pL)以終止反應並通過離心去除沉澱的蛋白。移除上清液，-80匸冷凍直至LC/MS/MS分析(實施例1)。隨時間過去S,S莫納甜濃度沒有降低，S,R莫納甜也沒有任何增加(開始存在95%S，S莫納甜，因為細胞提取物中存在一定量的天然L-氨基轉移酶。但是，含有消旋酶的樣品降低了總莫納甜的量因為消旋酶使L-穀氨酸對MP的轉氨效力變小。沒有消旋酶，在時程內產生了1545-2355ppm莫納甜(主要是S，S)。存在消旋酶，僅產生了340-879ppm(短乳桿菌酶)，444-53lppm(戊糖片球菌酶)，禾Q506-1460ppm莫納甜(天冬氨酸消旋酶)。這些數據表明消旋酶在生成莫納甜所要求的反應條件下是有活性的。為使由細胞提取物酶，例如天冬氨酸氨基轉移酶形成的S,S莫納甜最小化，以純化酶和更高的D-氨基轉移酶/L-氨基轉移酶比例來實施進一步的實驗。L-色氨酸向含4-R異構體莫納甜的轉化採用大約54嗎純化L-氨基轉移酶(短乳桿菌酶或戊糖片球菌TatA)，lmg天冬氨酸氨基轉移酶(BioCatalytics)，lmgD-氨基轉移酶，5mM草醯乙酸作為氨基受體，和75昭純化醛縮酶重複上述實驗。反應平行進行2小時取樣並溫育過夜。以苜蓿中華根瘤菌L-氨基轉移酶但不含醛縮酶作為陰性對照。除以反相色譜對R,R/S,S和S,R/R,S莫納甜峰值定量之外，利用實施例1所述的FDAA衍生技術測定每種立體異構體的百分比。結果如下表29所述。表29L-氨基轉移酶溫育時間總莫納甜(PPm)%S,S%R，R%R,S%S,R苜蓿中華根瘤菌TatA2小時17.110.258.10.831.0苜蓿中華根瘤菌TatA2小時15.813.355.31.030.4苜蓿中華根瘤菌TatA過夜77.725.840.01,332.9苜蓿中華根瘤菌TatA過夜67.929.437.31.531.8球形紅芽孢桿菌TatA2小時241.296.32.30.80.6球形紅芽孢桿菌TatA2小時223.295.72.71.00.6球形紅芽孢桿菌TatA過夜600.496.61.80.51.1球形紅芽孢桿菌TatA過夜618.596.12.10.51.3無消旋酶的對照2小時7.192.01.46.60.0無消旋酶的對照2小時5.794.01.24.80.0無消旋酶的對照過夜44.693.51.34.70.5無消旋酶的對照過夜37.595.40爭93.70.0明顯地，當以苜蓿中華根瘤菌TatA用於L-色氨酸轉氨時消旋酶的存在增加了所生成的莫納甜的總量。莫納甜水平在2小時試驗中從平均6.4增至16.5ppm，在過夜試驗中從41至73ppm。此外，通過使用消旋酶形成的R，R百分比從約1%增至多達58%。另一種有效甜味劑，莫納甜S，R立體異構體是另一種主要成分，從陰性對照的接近0增至31。/^。相對於苜蓿中華根瘤菌L-色氨酸轉氨酶，球形紅芽孢桿菌TatA對S-MP明顯具有更高活性，表明了當莫納甜4-R異構體是期望產物時，具有一種對L-色氨酸比對MP有高的底物特異性的酶的重要性。在2小時時間點總莫納甜的大約10X是4S，苜蓿中華根瘤菌TatA被認為對MP具有限制活性。以純化的苜蓿中華根瘤菌TatA(54pg)和短乳桿菌穀氨酸消旋酶重複實驗。若採用純化的穀氨酸消旋酶，每lmL反應使用大約64嗎。還檢測了含有穀氨酸消旋酶的細胞提取物並使用了1.4mg可溶蛋白。仍採用無消旋酶的陰性對照且所有樣品平行進行。結果如下表30所示。表30tableseeoriginaldocumentpage89仍然，消旋酶的加入明顯地增加了由L-色氨酸生成的總莫納甜，也增加了含4R異構體莫納甜與S,S莫納甜的相對量。使用純化的醛縮酶，消旋酶，和L-氨基轉移酶大大改善了控制期望立體異構體形成的能力。L比D氨基轉移酶的比例也是調控終產物立體異構性的途徑。當對實施例2表1和2所示的結果和類似於上述條件的反應條件的結果進行比較時，可以觀察到由吲哚-3-丙酮酸形成了大約7-29ppm的莫納甜且形成的R，R莫納甜百分比大約為51-90%。天冬氨酸消旋酶的使用使產生的總莫納甜增至16-78ppm莫納甜，其中R，R大約40-58%。此外，採用了更穩定和更便宜的原材料(L-色氨酸)。在實施例3中，由D-色氨酸生成了大約73ppm莫納甜，其中R,R:S,S大約為1.7:1。4R異構體的總量是總莫納甜的>80%。因為R,R莫納甜和R,S莫納甜都是有效的甜味劑(比蔗糖甜>1000倍)，不要求昂貴的D-胺基酸底物而富含這類異構體的能力是很關鍵的。可以預期的是非特異性或R特異性醛縮酶的有效性會增加反應速率還會增加形成的R,R莫納甜百分比。參見實施例5。儘管據報導用於這些試驗的來自睪丸酮叢毛假單胞菌的ProA醛縮酶在裂解反應中主要偏好S構型底物，但明顯地這種ProA醛縮酶會生成R-MP。因而，更優選生成R構象MP的醛縮酶有利於生成更高百分比的R,R莫納甜。此外，可以預期的是對生成莫納甜具有更低活性的L-色氨酸氨基轉移酶也會降低形成的S,S和R,R莫納甜量。最後，可對D-氨基轉移酶進行改進，或使用可選的D-氨基轉移酶，相對於S-MP可增加對R-MP的底物特異性。如果需要，這還可增加R，R產物的形成。重複天冬氨酸消旋酶實驗以比較SEQIDNO:22的R選擇性醛縮酶活性和來自睪丸酮叢毛假單胞菌的ProA醛縮酶活性。大約50嗎純化的L-氨基轉移酶(苜蓿中華根瘤菌TatA)，lmg天冬氨酸消旋酶(BioCatalytics)，lmgD-氨基轉移酶(AT-103，BioCatalytics),5mM草醯乙酸作為氨基受體，和50嗎適當的純化的醛縮酶。反應平行進行並在3(TC下溫育過夜。採用實施例1所述的FDAA衍生技術測定每種立體異構體的百分比。結果如下表31所示。表31醛縮酶總莫納甜(ppm)%S,S%R，R%R,S%S,RSEQIDNO:2221172.727.3睪丸酮叢毛假單胞菌42230.238.531.3睪丸酮叢毛假單胞菌ProA的異構體分布與以上的之前實驗一致，而採用SEQIDNO:22的R選擇性醛縮酶時，R，R莫納甜的百分比高得多，生成的S，S量檢測不到，且S,R莫納甜的量也更低。如實施例2和3所述，D-丙氨酸可作為MP至莫納甜轉氨反應的氨基供體。許多L-氨基轉移酶具有一定程度上以丙酮酸作為氨基受體並生成L-丙氨酸的能力。由於以上提及的反應使用高濃度的丙酮酸，一些丙酮酸可能轉化成L-丙氨酸。例如，在L-色氨酸的轉氨反應中，發現如果缺乏a-酮戊二酸在2小時內實施例6所述的HexAspC酶將10-18。/。的丙酮酸(50-200mM初始濃度)轉化成L-丙氨酸。當兩種氨基受體以高濃度(>50mM)存在時，酶對90a-酮戊二酸顯示出IO倍偏好性。AspC(WO03/091396A2所述的)也由丙酮酸生成一些L-丙氨酸。因此，可以期望的是在上述反應中可省略添加a-酮戊二酸或草醯乙酸並採用丙氨酸消旋酶(EC5丄1.1)替代穀氨酸或天冬氨酸消旋酶。在流產布魯氏菌和糞鏈球菌中首先鑑定出丙氨酸消旋酶。Marr，AG.，andWilson，P.W.，Arch.Biochem.Biophys,，49:424-433，(1954);Wood,W.A.，andGunsalus，LC，J.Biol.Chem.190:403-416，(1951)。鼠傷寒沙門氏桿菌中的dadB基因被確定為丙氨酸消旋酶活性的來源並在基因組資料庫中發現幾百種同源物。其它已知的丙氨酸消旋酶活性來源是大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，霍亂弧菌，慄酒裂殖酵母，蠟狀芽孢桿菌。擔子菌類蘑菇，香菇也含有寬活性丙氨酸消旋酶。嗜熱脂肪土芽孢桿菌的熱穩定同源物是從Sigma-Aldrich(目錄號M8936)購買的並被固定化作為商業應用。Inagaki，K.，Biochemistry25:3268(1986)。以丙氨酸消旋酶生成莫納甜利用睪丸酮叢毛假單胞菌ProA醛縮酶檢測莫納甜的生成。大約50嗎純化的L-氨基轉移酶(苜蓿中華根瘤菌TatA)，lmgD-氨基轉移酶(AT-103，BioCatdytics)，丙酮酸作為氨基受體，50嗎純化的醛縮酶，和70嗎從Sigma(St.Louis,MO)(目錄號A8936)購買的丙氨酸消旋酶。反應平行進行並溫育過夜。採用實施例1所述的FDAA衍生技術測定每種立體異構體的百分比。不含消旋酶的作為對照。結果如下表32所示。表32tableseeoriginaldocumentpage91與無丙氨酸消旋酶相比，存在丙氨酸消旋酶時在1小時時間點有多3倍R，R莫納甜。結果顯示採用丙氨酸消旋酶可能產生R,R莫納甜。通過採用選擇性生成R-莫納甜前體的醛縮酶可改進所生成的R,R莫納甜百分比，L-氨基轉移酶對R-莫納甜前體不具有或具有限制活性而D-氨基轉移酶對吲哚-3-丙酮酸不具有或具有限制活性。實施例10D-苯基甘氨酸氨基轉移酶(D-4-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶)如圖3所示，立體轉化氨基轉移酶可用於生成莫納甜的生物合成途徑。例如，D-苯基甘氨酸氨基轉移酶或其突變體可以L-穀氨酸作為氨基供體由R-MP生成R,R莫納甜。(1)由寡核苷酸引物PCR合成施氏假單胞菌4D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶該實施例描述了合成可用於以L-穀氨酸作為氨基供體將R莫納甜前體轉化成R,R莫納甜的4D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶，立體轉化酶的方法。引物設計以施氏假單胞菌4D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶(4D-HPGAT)的公開序列(Genbank登錄號.AY319935，核酸序歹U;Genbank登錄號.AAQ8290，蛋白序列)作為PCR引物設計的模板。可選地，以來自惡臭假單胞菌的4D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶(CAD42450(蛋白)，AX467211(核酸))作為序列模板。總共設計了34個正向引物和35個反向引物；正向和反向引物為40mer共享了20個重疊鹼基對。此外，設計了2個含有用於克隆進pET28和pET30載體(Novagen，Madison，WI)的5'限制性位點和懸臂的外引物。施氏假單胞菌4D-HPGAT外引物N端(帶M&I位點)NO:19)，和C端(帶iol位點)5'-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT-3'(SEQIDNO:20)聚合酶鏈式反應方案採用下列方案擴增來自施氏假單胞菌的基因序列。初級的1OOpLPCR反92應包含0.05pM每種69個內引物，0.4mM每種dNTP，10Ur7%聚合酶XL(Roche，Indianapolis,IN)，0.625UPfU聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)，1XXL緩衝液和lmMMg(OAc)2。所採用的熱循環儀程序包括94'C熱啟動3分鐘，15次重複以下步驟94。C30秒，42。C30秒，和68。C15秒，之後10次重複以下步驟94'C30秒，52。C30秒，和68°C30秒，之後10次重複以下步驟94X:30秒，60。C30秒，和68'C1分鐘15秒。最後10個循環後，將樣品在68'C維持7分鐘然後於fC儲存。這個PCR方案生成產物的成片條帶在0.8。/。TAE-瓊脂糖凝膠中的0.5kb。採用初級PCR反應作為模板建立二級PCR反應。二級的100|iLPCR反應包含2.5iiL初級PCR反應物，0.5pM每種2個外引物(;帶Mfel和^oI限制性位點)，0.4mM每種dNTP，10Ur7狄聚合酶XL，0.625UPfii聚合酶，IXXL緩衝液和lmMMg(OAc)2。所採用的熱循環儀程序包括94。C熱啟動3分鐘，IO次重複以下步驟94。C30秒，52。C30秒，和68IM分鐘30秒，之後15次重複以下步驟94°C30秒，60°C30秒，和68°C1分鐘30秒。15次重複之後，將樣品在68。C維持7分鐘然後於4。C儲存。這個PCR方案生成了特徵性產物條帶在0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中的1.4kb。採用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化PCR產物。按照生產商的方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)，產物被TOPO克隆並轉化進TOP10細胞。採用Qiagenspin小量製備試劑盒從製得的轉化體中純化質粒DNA並通過A^oI和S^I的限制性消化篩選正確的插入物。表現為具有正確插入物的質粒的序列可通過帶有通用M13正向和M13反向引物的雙脫氧鏈終止DNA測序儀來確認。對其中IO個克隆測序後，所有都具有由期望序列的至少一種突變。最佳的克隆具有引起胺基酸改變的單鹼基對突變。採用快變誘變方案按照生產商推薦(Stratagene，LaJolla，CA)修正這個克隆的序列。按照生產商推薦的方案(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)以限制性酶iWfel和Iol消化修正的TOPO克隆並採用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化。通過限制性酶MM和lol消化製備載體pET28和pET30，隨後以奸類磷酸化酶處理並採用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8%TAE-瓊脂糖凝膠中純化。採用NEB快連接試劑盒(Beverly，MA)連接消化的載體和插入物。將大約50ng處理的插入物，lOOng處理的載體(插入物與載體的摩爾比3:1)，5UT4DNA連接酶，和1X連接緩衝液在室溫下溫育5分鐘。以化學方法將連接混合物轉化進TOP10F感受態細胞(Invitrogen)。在37°C225rpm振蕩下以0.25mL室溫SOC回收細胞1小時。將細胞塗布在含卡那黴素(50pg/mL)的LB平板上。利用Qiagenspin小量製備試劑盒從製得的轉化體中純化質粒DNA，並通過MM和lol的限制性消化篩選正確插入物。基因表達和試驗質粒DNA被轉化進大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)。培養物生長並利用Qiagen小量製備試劑盒分離質粒，通過限制性消化分析以確認同一性。對pET28(組氨酸標記)和pET30(未標記)載體中的施氏假單胞菌D-4-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶實施誘導。進行了時程研究，讓培養物在250mL含卡那黴素(5(Vg/mL)的LB中生長至OD柳為0.5-0.6並以100mMIPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導，在誘導後0和3小時取樣。來自0小時和3小時的適宜體積細胞被重懸在40pL含2-巰基乙醇的十二烷基硫酸鈉緩衝液中，並在95。C加熱10分鐘，再冷卻。採用4-15%梯度凝膠通過SDS-PAGE分析這類總細胞蛋白樣品份。還從3小時培養物中製備了細胞提取物，通過採用含0.625benzonase核酸酶和3pL蛋白酶抑制劑調配液#3的0.625mLNovagenBugBusterTM試劑(Calbiochem-NovabiochemCorp.,SanDiego，CA)在室溫下溫和振蕩20分鐘以懸浮來自5mL培養物的細胞團，並在16000xg離心以去除細胞碎片。上清液(細胞提取物)被點樣到4-15%梯度凝膠中以分析細胞可溶蛋白。之後，採用組氨酸結合900柱按照生產商的方案(Novagen，Madison，WI)純化蛋白並採用PD-10柱(G25Sephadex，Arnersham-Pharmacia)脫鹽以去除咪唑。(2)含D-苯基甘氨酸氨基轉移酶("DPGAT")的生物體的分離按以下方式分離含立體轉化D-苯基甘氨酸氨基轉移酶(也被稱為D-4-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶)的假單胞菌屬和類屬。將土壤樣品接種於含以下培養基的培養皿上(每升)15g瓊脂，3.4gKH2P04，3.55gNa2HP04，0.2gMgS04-7H20，8mgCaCl2-2H20，lOmg酵母提取物，1mllOOOx痕量元素溶液(Balch，W.E.，等，"Methanogens:reevaluationofauniquebiologicalgroup,"Microbiol.Rev.43:260-296，(1979))，禾卩lgD-苯基甘氨酸(D-4-羥基苯基甘氨酸)。如下通過PCR檢測分離物中立體轉化氨基轉移酶(由已知的D-苯基甘氨酸氨基轉移酶設計引物)的存在或進一步富集以檢測立體轉化氨基轉移酶的存在來自平板的分離物在不含瓊脂的上述液體培養基上3(TC振蕩生長至OD6oo約1.0。通過離心收集細胞並以0.85。/。NaCl洗滌兩次。將10mg(溼重)樣品懸浮在lml磷酸鉀緩衝液(pH7.0)和5mMD-苯基甘氨酸或D-4-羥基苯基甘氨酸。將被中和的15mM(氨氧基)醋酸加入按上述所製備的平行樣品中。通過HPLC測量D-苯基甘氨酸(或D-4-羥基苯基甘氨酸)的消耗。選擇能夠降解D-苯基甘氨酸(或D-4-羥基苯基甘氨酸)、但存在(氨氧基)醋酸時降解速率降低的分離物作進一步分析。通過PCR檢測分離物中立體轉化氨基轉移酶(由已知的D-苯基甘氨酸氨基轉移酶設計引物)的存在。通過在上述液體培養基中生長培養物來證實立體轉化氨基轉移酶的存在，收集細胞並製備無細胞原提取物("CFE")檢測D-苯基甘氨酸氨基轉移酶或D-4-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶的活性。將CFE加入具有以下終濃度的反應混合物中0.1M3-(環己胺)-l-丙磺酸("CAPS")(pH9.5)，60mML-穀氨酸(鈉鹽)，5mM苯醯甲酸甲酯或4-羥基苯甲酸和50pMPLP。通過將CFE加入含以下濃度的反應混合物中測定逆反應50mM磷酸鉀(pH7.0)，60mMD-苯基甘氨酸或D-4-羥基苯基甘氨酸，5mMa-酮戊二酸，禾口50pMPLP。試驗在35。C溫育將在時間點取樣並通過煮沸2分鐘終止。通過Gil-Av，E.，等，"Resolutionofunderivatizedaminoacidsbyreversedphasechromatography,"J.Am.Chem.Soc，102:5115-5117，(1980)的HLPC方法或通過實施例1所述測量生成穀氨酸的方法定量產物。作為PCR方法的替換方案，通過常規蛋白純化技術，包括硫酸銨分級，和常規柱層析從分離的芽孢桿菌中純化立體轉化D-苯基甘氨酸氨基轉移酶。一旦蛋白被純化至合理純度，即可採用多肽微測序技術或常規Edman胺基酸測序(參見http:〃golgi.harvard.edu/microchem/對於使用這類技術的方案和設備說明)。可根據從最接近的已知相關蛋白源獲得的序列設計簡併引物。然後按照己建立的方案進行簡併PCR和基因組步行以分離立體轉化D-苯基甘氨酸氨基轉移酶的編碼序列。(3)DPGAT莫納甜的生成如以上(1)和(2)所述的D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶被用於原無細胞蛋白提取物，或按以上(l)所述的純化。按WO03/0913%A2實施例1中所述製備苜蓿中華根瘤菌和球形紅細菌酪氨酸(芳族)氨基轉移酶。按WO03/091396A2實施例4中所述製備睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶。利用Bio-Rad總蛋白試驗按照生產商的方案(Hercules，CA)進行總蛋白試驗。反應混合物(lmL體積，平行進行)中含有lOOmM磷酸鉀緩衝液(pH8)，2mMMgCl2，0.05mM5，磷酸吡卩多醛("PLP")，200mM丙酮酸鈉，5mMa-酮戊二酸鈉，大約280嗎/mL以細胞提取物供應的苜蓿中華根瘤菌TatA，100(iL/mLD-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶細胞提取物或lmg/mL純化的D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶，和大約10(Vg/mL以細胞提取物供應的ProA醛縮酶。加入固體色氨酸至濃度10.2mg/ml。建立不含有D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶的陰性對照。樣品在30。C溫和振蕩下溫育約1小時或過夜。離心樣品以去除沉澱，注射器過濾，並於-8(TC儲存，直至按實施例1所述採用LC/MSMS方法分析莫納甜。採用本領域公知的誘變技術，包括誘變PCR，通過突變菌株，位點定向誘變，易錯PCR，或通過如DNA混編或其它定向發展技術製備對莫納甜生成具有改進活性的D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶。通過在以R，R莫納甜作為氮源的基礎培養基上的生長選擇改進的D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶。開始，選擇是基於生長，但對於選擇改進的氨基轉移酶，是基於生長速率進行篩選。S卩，培養含突變基因的細胞並在以R,R莫納甜作為氮源的基礎培養基上表達基因。比較含突變基因的細胞和未突變類型的生長速率。選擇那些具有更快生長速率的細胞並進一步分析氨基轉移酶。可進一步突變D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶直至獲得所需的活性。(4)DPGAT試驗96如以上(l)所述表達不含組氨酸標籤的DPGAT並將提取物用於試驗。建立試驗，其包含100mM磷酸鉀pH7.0，60mMD-苯基甘氨酸，5mMa-酮戊二酸，和50pM5'磷酸吡哆醛。在每ml試驗體積中加入按該實施例之前所述製備得到的100pL提取物啟動試驗。在幾個時間點(O，，2，5，10，30，60，和120分鐘)採取樣品並以等體積的2M蟻酸終止。也在過夜溫育後採取樣品(1200分鐘)。通過實施例1所述的OPA方法分析樣品中的穀氨酸生成。結果總結在下表33中。表33條件時間(分鐘)^VI/mLL-穀氨酸無底物00.03310.03320.0330.035100.034300.036600.0441200.03812000.058D-苯基甘氨酸00.05510.11220.1690.315100.387300.892601.3041201.51412001,056明顯地，酶對D-苯基甘氨酸具有一定活性。還檢測了對R，R莫納甜的酶活性。按以上所述建立試驗，其含有60mM濃度的R，R莫納甜。結果如下表34所示。表34tableseeoriginaldocumentpage98對R，R莫納甜沒有表現出任何可檢測活性。但是，可以預期的是任意或該實施例(3)中所述的SDM方法可被用於改進對R，R莫納甜或R-MP的轉氨活性。例如，已經完成了施氏假單胞菌酶的結晶和初步分析。Kongsaeree，P.，等，ActaCryst.D5P:953畫954，(2003)。一旦結構被公開，可採用軟體如Accelrys完成分子對接實驗以測定哪裡的空間位阻或離子排斥會抑制R，R莫納甜與D-羥基苯基甘氨酸底物結合位點的結合。D-羥基苯基甘氨酸是較大的分子，R，R莫納甜也是。兩種成分都具有疏水區域和羥基。如實施例6所述可對結合口袋進行修飾以使酶更適合於二羧酸底物。例如，接近第二個羧基的殘基被修飾成鹼性的如精氨酸。此外，在部分(l)中所述的惡臭假單胞菌基因和可按(2)中所述被分離的其它基因可作為基因混編的模板。此外，可採用寡核苷酸改組或其它誘意突變方法誘變在該實施例中收集的施氏假單胞菌，並按以上(3)所述進行篩選。實施例11D-甲硫氨酸氨基轉移酶基因的發現站旦冃眾D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基轉移酶(EC2.6丄41)被認為是另一個立體轉化轉氨酶，儘管是很少的。該酶促進D-甲硫氨酸和丙酮酸向L-丙氨酸和4-甲硫-2-酮丁酸的可逆轉化。草醯乙酸，苯基丙酮酸，2-酮丁酸，2-酮戊酸，2-酮庚酸，乙醛酸，和酮戊二酸也可作為氨基受體。D或L甲硫氨酸的轉氨反應被認為是高等植物(花椰菜，番茄，蘋果，豌豆，香蕉，花生)以及土壤微生物(大腸桿菌，假單胞菌豌豆致病變種CPyewdfomowos;^/)，銅綠假單胞菌，蕈狀芽孢桿菌CBac/〃wwjcoWm)，乙酸,丐不動桿菌，嗜水氣單胞菌(Arawo"m//j^ra/7/w7a)B12E，三葉草根瘤菌CR/n'zo^'ww^yb/")N2P7，指狀青黴CPe"/c!Wwm(^gtofwm)，酉良酒酵母，棒狀桿菌D7F)中乙烯生成途徑的一部分。Billington，D.C.，等，BiochemJ.182:827-836，(1978)。在細菌中，L-甲硫氨酸通常作為乙烯生成研究中底物而寬特異性酶如來自大腸桿菌的TyrB或AspC被認為是負責轉氨反應的。但是，Primrose,S.B,，J.Gen.Microbiol.PJ:159-65，(1976)和Primrose，S.B.，J.Gen.Microbiol.98:519-528，(1977)中指出大腸桿菌的SPAO株(沃裡克大學培養物保藏中心)由D-甲硫氨酸產生的乙烯幾乎與批量培養物中由L-甲硫氨酸產生的一樣多。由於在大腸桿菌未鑑別到寬特異性D-氨基轉移酶，一種可能的解釋是大腸桿菌D-胺基酸脫氫酶(由dadA基因所編碼)將D-甲硫氨酸轉化成4-甲硫-2-酮丁酸。在大腸桿菌中可能存在甲硫氨酸消旋酶，但沒有文獻公開了這種酶。與大腸桿菌相反，相對於L-甲硫氨酸和丙酮酸當D-甲硫氨酸和丙酮酸被補給到酶提取物中時，花椰菜小花(線粒體提取製備物)和萌發中的豌豆種子中生成的乙烯更高。Mapson，L.W.，etah，BiochemJ.115:653-661，(1969);Durham,J.I.，等，Phytochemistry12:2123-2126，(1973)。因此，數據不支持甲硫氨酸和L-氨基轉移酶的組合的可能性。通過透析花椰菜細胞提取物排除了脫氫酶活性；在試驗混合物中不存在NAD。由於不消耗氧可排除氧化酶活性且不需要FAD。純化了來自花生組織的D-甲硫氨酸氨基轉移酶，表99現為依賴PLP，並表現為不依賴L-甲硫氨酸氨基轉移酶活性。有可能這些D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基轉移酶實際上生成D-丙氨酸作為副產物(類似於實施例2和3所述的芽孢桿菌酶)且細胞含有丙氨酸消旋酶可將D-丙氨酸再生成L-丙氨酸(或類似的氨基供體)。另一種情況，從高等植物中發現的寬特異性D-氨基轉移酶有利於發展生成R，R莫納甜或S，S莫納甜的方法。實驗綜述利用標準層析方案和PharmaciaAKTAExplorer系統從花椰菜小花和萌發中的豌豆胚中部分純化D-甲硫氨酸氨基轉移酶。通過LC/MS/MS指紋圖譜技術並利用哈佛痕量化學工具搜索資料庫以測定同源蛋白的蛋白序列。通過標準PCR方案或通過實施例10(7)所述的基因合成從cDNA文庫中克隆植物基因的編碼區域。可選地，由在D-甲硫氨酸存在(並生成乙烯)下生長的花椰菜組織或花生種子構建cDNA表達文庫(Stratagene，LaJolla，CA)。文庫被轉化進來自大腸桿菌基因儲藏中心(耶魯)的大腸桿菌甲硫氨酸營養缺陷型如RC519或AB1931株。能在含D-甲硫氨酸的基礎培養基中生長的菌株的質粒含有感興趣的編碼區域(參見實施例4(1)，類似篩選技術)。一旦獲取感興趣的編碼區域並在標準大腸桿菌實驗室株中表達，製得的基因產物可用於實施例10(3)所述的生成R,R莫納甜的試驗以替代D-羥基苯基甘氨酸氨基轉移酶，除了pH為7.5之外(氨基轉移酶的最適pH)。若D-甲硫氨酸氨基轉移酶對氨基供體底物有嚴格要求，則該酶可用於如實施例2和3所述的製備R,R莫納甜。該基因可被誘變並按實施例10(3)所述篩選增強的活性。方法從花椰菜分離通過攪拌器交替浸泡和混合以400mL4'C蔗糖/緩衝溶液(0.4M蔗糖和0.1M磷酸鈉緩衝液pH7.4)提取了400g新鮮採摘的花椰菜小花。通過紗布過濾以去除細胞碎片並在4"C下40000xg離心30分鐘。固體材料(含線粒體)被重懸在20mL10mM磷酸鈉緩衝液pH7.4並以200mL冷丙酮(-3(TC)提取酶。再將懸浮液離心並採用SavantSpeedVac乾燥沉澱。以10mM磷酸鈉緩100衝液pH7.4溶解固體材料並用PD-10柱去除殘留的丙酮。通過在0.1M磷酸鈉緩衝液pH7.4溫育5mMD-甲硫氨酸，lmM丙酮酸，0.05mMPLP和2mMEDTA以及酶製備物以試驗氨基轉移酶活性。試驗在25。C下進行16小時。利用LC/MS(m/z為328)和與實施例1類似的技術通過形成2,4-二硝基苯腙衍生物測定4-甲硫基-2-酮丁酸。製備了含0.4%(w/v)2,4-二硝基苯腙的2M硫酸溶液，並在溫育後將一半體積加入試驗混合物中。混合物在3(TC溫和振蕩下混合30分鐘並通過離心收集沉澱進行LC/MS分析。以類似方式試驗了通過標準層析技術分離的蛋白部分的活性，但通過實施例1所述OPA柱後衍生技術測定共產物丙氨酸。從花生分離(ArachiahypogeaL.cv.Starr,)按照Durham,J.I.，etal.，Phytochemistry12:2123-2126，(1973)的方法從萌發中的花生胚勻漿物(去除了子葉)中純化D-甲硫氨酸氨基轉移酶。在原提取物製備中使用還原劑以穩定酶，並通過33，000xg離心去除細胞碎片。通過低溫溫育並移除沉澱中的蛋白進一步純化35-50%硫酸銨部分。採用丙酮進一步分級上清液。然後通過凝膠過濾層析(Sephadex200G.E.Healthcare,Piscataway，NJ)進一步純化活性部分。因為蛋白部分富含轉氨酶蛋白，採用2D-凝膠電泳分離感興趣酶以用於微測序。在清楚闡述存於NCBI的植物序列中的同源編碼區後，利用標準分子生物學技術在大腸桿菌中重組生成D-氨基轉移酶蛋白。可以期望的是來自花椰菜小花或花生種子或重組生成的同源酶的細胞提取物可用於實施例10(3)所述(若為立體轉化轉氨酶)或實施例2和3所述(若為寬特異性D-氨基轉移酶)的R，R莫納甜生成中。實施例12L-丙氨酸氨基轉移酶/丙氨酸消旋酶/D-丙氨酸氨基轉移酶圖8圖示了採用L-胺基酸氨基轉移酶(例如L-芳族氨基轉移酶，L-丙氨酸氨基轉移酶和/或L-色氨酸氨基轉移酶)，R-特異性消旋酶，丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸氨基轉移酶由L-色氨酸生成富含立體異構體R，R莫納甜的生物合成途徑。101實施例6中描述了色氨酸特異性氨基轉移酶。可選的，如WO03/091396A2實施例1所述製備了苜蓿中華根瘤菌和球形紅芽孢桿菌酪氨酸(芳族)氨基轉移酶。如WO03/091396A2實施例4所述製備了睪丸酮叢毛單胞桿菌ProA醛縮酶。採用Bio-Rad蛋白試驗按照生產商的方案(Hercules，CA)完成了總蛋白試驗。丙氨酸消旋酶從Sigma(St.Louis，MO)(目錄號A8936)購買。D-丙氨酸氨基轉移酶從BioCatalytics(Pasadena,CA)(目錄號AT-103)購買。L-丙氨酸氨基轉移酶廣泛分布在真核生物，細菌和古細菌中。經鑑定(根據序列同源性)以下生物體含有L-丙氨酸氨基轉移酶(EC2.6丄2):擬南芥，棉阿舒囊黴(^Wago^;^/z')，棕色固氮菌，長雙歧桿菌(5訴doZ^cte〃'Mm/o"gww)，小秀麗線蟲(Caewor/zaZ^z'/lse/egara)，白色念珠菌(Ca"A,(iaa/Z)/ca"》，光滑念珠菌(Ca"W(iag7a6rato)，萊茵衣藻(C7z/畫^vi畫o"^re/"W淑)，新型隱球菌(C'，/ococ譜we咖環(m),漢遜德巴禾鵬母CDeZa770m戸s/2畫em7)，智人(7/o附ora;/e"力，大麥(7/orafew附w/gare)，乳酸克魯維酵母(X7wyi^ramyc&s/acto)，稻癟菌(Mag"a;o/^，蒺藜苜蓿(她血agofra"c偷/a)，小家屬(Mws聽腦/w力，粗糙脈孢菌(臉w冊poracra房)，水稻(Oyza贈'v")，黃孢原毛平革菌OP/w"erac/we/ec/20^05/on'wm)，火'J:巨松CPZm"stoeda)，惡臭假單孢菌，深海熱球菌(屍"coc，咖—，強烈火球菌(屍戶coc面/,'o願)，嗜熱古細菌OFyrococcws/7or汰os/zz"，褐家鼠CRa加s"orv"/cw)，釀酒酵母，慄酒裂殖酵母，紅鰭東方飩(rflh/wgwn^n)^s)，克氏錐蟲(7)y;a"c^cwzflCTOz/)，霍亂弧菌，副溶血弧菌(K力n'opara/zaewo(y"cw力，創傷弧菌(F^n'ovw/mycw)，解脂耶氏酵母Omnv/a/i^o/;^ca)，和玉米(Zeaway力。此外，許多氨基轉移酶具有低水平的丙氨酸氨基轉移酶活性，且給定高水平的L-穀氨酸和丙酮酸可將其轉化成L-丙氨酸和a-酮戊二酸。通過標準誘變技術如易錯PCR和經由突變菌株，或通過定向發展技術改進低活性的酶。利用公開有效的序列設計引物並採用標準的擴增，克隆，表達和純化基因/酶的技術克隆L-丙氨酸氨基轉移酶基因。反應混合物(lmL體積，平行進行)含有100mM磷酸鉀緩衝液(pH8)，2mMMgCl2，0.05mM5，磷酸吡眵醛("PLP")，200mM丙酮酸鈉，5mMa-酮戊二酸，大約280|ag/mL以細胞提取物供應的苜蓿中華根瘤菌TatA(或其它L-色氨酸特異性氨基轉移酶)(如實施例4(5)部分)，100ngL-丙氨酸氨基轉移酶，100pL/mL丙氨酸消旋酶細胞提取物或lmg/mL純化丙氨酸消旋酶(Sigma)，大約280pg/mL以細胞提取物供應的寬特異性D-丙氨酸氨基轉移酶(實施例15和18包含可用於該反應的D-氨基轉移酶實例)和大約100ng/mL以細胞提取物供應的ProA醛縮酶。加入固體色氨酸至濃度10.2mg/ml。陰性對照不含有丙氨酸消旋酶。樣品在3(TC下溫育約1小時或過夜。離心樣品以去除沉澱，注射器過濾，並按實施例1所述採用LC/MS/MS方法分析莫納甜，儲存於-8(TC。實施例13從酶促反應混合物中純化R,R莫納甜從以下反應混合物中純化產物R，R莫納甜。在0.33升體積中，室溫下將50mM碳酸氫銨，pH8.2，4mMMgCl2，0.05mM磷酸吡眵醛("PLP")，200mM丙酮酸鈉，和50mMD-色氨酸混合於500mL玻璃瓶中直至色氨酸溶解。用氮氣吹洗液體幾分鐘，然後加入3.0mg/mLBiocatalytics，Inc.(Pasadena，CA)寬特異性D-轉氨酶(目錄號弁AT-103)和O.lmg/mL純化的SEQIDNO:22的醛縮酶。在室溫下溫和攪動反應混合物。醛縮酶按實施例3所述純化。在混合物開始制好後的15小時和22小時以固體加入額外份的50mMD-色氨酸。每次加入後以氮氣吹洗上部空間。雖然所加的色氨酸沒有全部溶解，但濃度維持在約50mM。40小時後，將剩餘固體色氨酸過濾掉。由柱後螢光檢測液相色譜(參見實施例l)對反應混合物的分析顯示出溶液中色氨酸濃度是49mM而莫納甜濃度是3.9mM。通過兩步離子交換層析步驟純化產物莫納甜。首先將過濾好的反應溶液加到BioRadAG50W-X8樹脂柱中(140mL;結合容量為1.7meq/mL)。以2x150mLH20洗滌柱然後用1MNH4OH(lx450mL，之後3xl50mL)進行洗脫。NH40H部分是結合的，以HC1中和並通過Whatman(Maidstone,England)玻璃微纖維過濾器和GermanSciences(AnnArbor,MI)0.45過濾器連續過濾。然後採用具有YM100(MWCO100kDa)的Amicon(Millipore;Billerica，MA)超濾攪拌釜(8200型)超濾澄清溶液。採用帶溫水浴的roto-蒸發器將超濾的濾液蒸發至大約160mL。通過玻璃微纖維過濾器過濾再次澄清液體。將製得的溶液加到之前已通過以0.5LlMNaOH，H20，和l.OM碳酸氫銨洗滌再額外加水洗滌而轉化成碳酸氫鹽形式的1L快流速DEAE瓊脂糖凝膠柱(AmershamBiosciences)。以〈2mL/min力卩入溶液並以3-4mL/min加7jl洗滌直至在280nm處的吸收<1。以50mM碳酸氫銨，pH8.3(2.5L)洗脫R，R莫納甜。採用帶溫水浴的roto-蒸發器蒸發這部分洗脫液。將得到的漿液在4'C下溫育幾天直至形成結晶。收集結晶，以冷100%乙醇洗滌並在真空乾燥器中乾燥(0.38g)。採用FDAA衍生，之後以LC/MS/MS多反應監測分析固體產物的異構體純度(參見實施例1)，顯示樣品是96.3%的R，R莫納甜和3.7%S,R莫納甜。還通過總莫納甜方法(參見實施例l)分析了樣品相對於其它有機化合物的純度。以Photodiode陣列檢測儀掃描200-500nm的UV吸收。根據總體的峰面積，莫納甜佔了面積的96.1X(包括R,R和S,S峰)。由柱後螢光檢測液相色譜對樣品的分析顯示了樣品的胺基酸組成是98.8%的莫納甜含痕量的色氨酸(1.2%)和丙氨酸(0.02%)。MidwestMicrolab，LLC(Indianapolis，IN)上進行了元素分析。該分析表明了樣品含1%重量的不燃(有機)物質，和銨和碳酸氫鹽殘餘物。實施例14在純化期間改進D-氨基轉移酶活性保持純化球形芽孢桿菌HIS6-D-丙氨酸氨基轉移酶的標準程序從BL21(DE3)::球形芽孢桿菌datpET30a(實施例18)新鮮培養平板開始(含50pg/mL卡那黴素的LB瓊脂)，細胞在5mL含50嗎/mL卡那黴素的Luria-Bertani肉湯("LB")於37。C225rpm下生長3-5小時。隨後，培養物在0.25%(v/v)被轉移到含Novagen過夜表達系統II溶液1-6(EMDBioscience,Madison，WI)外加50pg/mL卡那黴素的燒瓶中。細胞在37。C225rpm下過夜生長(16-18小時)。當OD,為大約8.0時，在帶JS-16.25轉子的Beckman(Fullerton，CA)J25II離心機中以10,000rpm離心10分鐘收集細胞。用50mMEPPS緩衝液(pH8.2)洗滌細胞團一次，並再次離心細胞。收集洗滌後的細胞團立即使用或於-80。C冷凍直至需要純化。為製備含球形芽孢桿菌HIS6-D-丙氨酸氨基轉移酶(HIS6-BsphDAT)蛋白的無細胞提取物，以3-4體積的50mMEPPS，pH8.2懸浮細胞，然後用Microfluidics(Newton，MA)均質機(在20,000psi3孔)分散，保持懸浮液溫度低於15°C。之後所有純化步驟均在4。C進行。將細胞提取物在15,000xg離心15分鐘以去除細胞碎片。輕輕移出上清液立即使用或於-8(TC冷凍。將一份無細胞提取物加入之前已用含200mM氯化鈉的50mMEPPS，pH8.2平衡過的Novagen組氨酸結合柱(目錄#70971-4)或GEHealthcare(Piscataway，NJ)螯合瓊脂糖凝膠TM快流速樹脂柱(nickd(II)形式)(以1.2-1.5v/v比例)中。加入樣品後，以3-5體積的平衡緩衝液，3-5體積含25mM咪唑的平衡緩衝液，3-5體積含100mM咪唑的平衡緩衝液和3-5體積含500mM咪唑的平衡緩衝液連續洗滌/洗脫柱。在最後一次洗滌中HIS6-BsphDAT被洗脫。利用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15離心過濾裝置(MWCO10kDa)將500mM咪唑洗液濃縮2-10X。之前已用含50pMPLP的50mMEPPS，pH8.2平衡過的一次性GEHealthcarePD10脫鹽柱去除咪唑和氯化鈉。利用PierceBCA分析試劑盒(Rockford，IL)測定脫鹽後溶液中的蛋白濃度。採用Bio-Rad(Hercules,CA)ExperionPro260毛細管晶片系統或通過4-15%梯度凝膠的SDS-PAGE測定每種洗脫液的純度和無細胞提取物部分的表達水平。通常該過程生成多於300mg的酶(來自600mL過夜表達II培養)，經Experion軟體判斷其純度為90%。純化的酶按份(l-5mL)儲存於-8(TC直至使用。改進程序如上製備無細胞提取物。類似的His6-BsphDAT蛋白純化但有以下變化用於細胞裂解和蛋白純化的所有緩衝液含有100mM磷酸鉀，pH7.8，和50pMPLP。僅用GEHealthcare螯合瓊脂糖凝膠TM快流速樹脂(nickd(II)形式)純化蛋白。活性試驗利用通過兩種純化程序製備的酶試驗由色氨酸和丙酮酸生成吲哚-3-丙酮酸。反應混合物含有lOOmM磷酸鉀，pH7.8，0.05mM磷酸吡f]多醛，100mM105丙酮酸鈉，40mMD-色氨酸，和0.03-0.1mg/mL純化的酶。以固體形式加入色氨酸。除酶以外所有成分被混合在一起並於3(TC溫育直至色氨酸溶解。然後加入酶並將反應溶液在室溫下溫育。在預定的時間點，對反應取樣並將樣品立即在冰上儲存，稀釋後按實施例1所述柱後螢光檢測液相色譜法進行丙氨酸分析。下表34列出了以每分鐘每mg酶所形成的丙氨酸濃度表示酶製備物的比活性。表34:改進純化程序對酶活性的影響酶製備物比活性(pM丙氨酸(mg)"(min)—1)無50!iMPLP純化的His6-BsphDAT2.9含50nMPLP純化的His6-BsphDAT14.2表34所示的結果表明純化過程中使用磷酸吡哆醛導致活性增強。實施例15兩種新型芽孢桿菌D-胺基酸氨基轉移酶的克隆如實施例18所述重組製備了幾種芽孢桿菌D-胺基酸氨基轉移酶(EC2.6丄21,也稱為D-丙氨酸氨基轉移酶或D-天冬氨酸氨基轉移酶)以用於生成R,R莫納甜的相關試驗。這些酶與之前公開的用於生成莫納甜的D-氨基轉移酶(美國發明者B·J·布拉澤奧,C·索爾海德,D·韋納,E·伯克,F·A·桑切斯-列拉,M·德索薩,P·M·希克斯,P·盧京比爾,S·C·麥克法倫,S·J·戈特,S·R·科爾曼,T·理查森,趙立山申請人:嘉吉公司