生產葡糖胺的方法和原料的製作方法

2023-05-29 06:49:06 2

專利名稱：生產葡糖胺的方法和原料的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過發酵生產葡糖胺的方法。本發明還涉及用遺傳工程方法修飾的用於生產葡糖胺的微生物菌株。
背景技術：
氨基糖通常是作為複合寡糖和多糖中的單體殘基。葡糖胺是這種單糖，葡萄糖的氨基衍生物。葡糖胺和其他氨基糖是許多天然多糖的重要組成部分。例如，含氨基糖的多糖可形成細胞的結構物質，類似於結構蛋白。
葡糖胺被製成營養品用於治療動物和人的骨關節炎。葡糖胺的市場日益增大。此外，葡糖胺的世界市場價格不會顯著降低。
目前通過酸水解幾丁質，一種衍生於N-乙醯-D-葡糖胺的複雜碳水化合物獲得葡糖胺。或者，通過酸水解各種乙醯化的殼聚糖生產葡糖胺。運些方法產率低(底物到葡糖胺的轉化率為50％)。此外，原料(即幾丁質源，例如蟹殼)日益缺乏。因此，為了商業銷售和使用的目的，工業上需要一種成本合算的用於高產率生產葡糖胺的方法。
發明簡述本發明的一個實施方案涉及通過微生物發酵生產葡糖胺的方法。該方法包括以下步驟(a)在發酵培養基中培養氨基糖代謝途徑中有遺傳修飾的微生物；(b)回收從培養步驟產生的選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物。這類氨基糖代謝途徑選自將葡糖胺-6-磷酸轉變成另一種化合物的途徑、用於合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸轉運出所述微生物的途徑、將葡糖胺轉運到所述微生物中的途徑以及與葡糖胺-6-磷酸生產有關的底物競爭的途徑。發酵培養基包括可吸收的碳、氮和磷源。在優選的實施方案中，所述微生物是細菌或酵母，更優選埃希菌屬的細菌，最佳為大腸桿菌。
在一個實施方案中，通過從微生物中回收細胞內葡糖胺-6-磷酸和/或從發酵培養基中回收細胞外葡糖胺可回收產物。在另一實施方案中，回收步驟可包括從發酵培養基中純化葡糖胺，從微生物中分離葡糖胺-6-磷酸和/或將葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以產生葡糖胺。在一實施方案中，回收至少約1g/L產物。
在另一實施方案中，培養步驟包括將培養基中的碳源保持在約0.5％-約5％的濃度。在另一實施方案中，培養步驟在約28℃-約37℃完成。在另一實施方案中，培養步驟是在發酵罐中完成。
在本發明的一個實施方案中，所述微生物在其編碼蛋白質的基因中有修飾，所述蛋白質包括但不限於N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。
在另一實施方案中，遺傳修飾包括其中提高微生物中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用的遺傳修飾。所述遺傳修飾包括用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化所述微生物以提高所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用和/或使所述微生物過量表達葡糖胺-6-磷酸合酶。在一個實施方案中，將所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連。在另一實施方案中，將所述重組核酸分子整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的所述重組核酸分子含有可提高所述合酶之作用的遺傳修飾。所述遺傳修飾例如可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用。
在一實施方案中，含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的本發明重組核酸分子編碼胺基酸序列SEQ ID NO:16。在另一實施方案中，所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核酸序列。優選的本發明重組核酸分子包括pKLN23-28、nglmS-282184和nglmS-281830。
本發明還包括編碼葡糖胺-6-磷酸合酶並含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用之遺傳修飾的重組核酸分子(即葡糖胺-6-磷酸合酶同系物)。所述遺傳修飾可例如降低所述合酶的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用。在一個實施方案中，在編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的本發明重組核酸分子中的所述遺傳修飾產生至少一個胺基酸修飾，其選自增加、取代、缺失和/或衍生葡糖胺-6-磷酸合酶的一個胺基酸殘基。在一個實施方案中，所述胺基酸修飾是在修飾的蛋白質(即同系物)中的胺基酸序列位置上，對應於胺基酸序列SEQ ID NO:16的下列一個或多個位置Ile(4)、Ile(272)、Ser(450)、Ala(39)、Arg(250)、Gly(472)、Leu(469)。在另一實施方案中，所述胺基酸修飾選自下列胺基酸的取代(a)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(4)；(b)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(272)；(c)有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Ser(450)；(d)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫例基團的胺基酸殘基取代Arg(250)；(f)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Gly(472)；(g)有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的組合。
在本發明的另一實施方案中，上述胺基酸修飾優選是選自下列的取代Ile(4)變為Thr、Ile(272)變為Thr、Ser(450)變為Pro、Ala(39)變為Thr、Arg(250)變為Cys、Gly(472)變為Ser、Leu(469)變為Pro以及其組合。
在另一實施方案中，本發明的遺傳修飾的重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有選自SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的胺基酸序列。在另一實施方案中，本發明的遺傳修飾的重組核酸分子含有選自SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。本發明優選的遺傳修飾的重組核酸分子包括pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本發明的另一實施方案涉及具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由具有遺傳修飾的核酸序列編碼，所述修飾導致葡糖胺-6-磷酸作用的提高。所述核酸序列是上述本發明的重組核酸分子。
本發明的另一實施方案涉及通過發酵生產葡糖胺的方法，所述方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發酵培養基中培養具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾的微生物，其中所述遺傳修飾的微生物是通過含下列步驟的方法產生的(1)在含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的分離的核酸分子中產生修飾以產生多個修飾的核酸序列；(2)用所述修飾的核酸序列轉化微生物以產生遺傳修飾的微生物；(3)就葡糖胺-6-磷酸合酶作用篩選經遺傳修飾的微生物；(4)篩選具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾的微生物；(b)回收產物。培養步驟從所述微生物中產生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物。
在另一實施方案中，本發明微生物在編碼N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾減弱了所述蛋白質的作用。在另一實施方案中，本發明的微生物在編碼磷酸酶的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。在優選的實施方案中，本發明的微生物在編碼下列蛋白質的基因中還有遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，所述修飾包括但不限於缺失至少所述基因的一部分。
本發明的另一實施方案涉及通過發酵生產葡糖胺的方法，所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發酵培養基中培養用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化的大腸桿菌以生產產物，(b)回收產物。所述產物包括從大腸桿菌中回收的細胞內葡糖胺-6-磷酸和/或從發酵培養基中回收的細胞外葡糖胺。在本實施方案中，所述重組核酸分子提高了大腸桿菌對葡糖胺-6-磷酸合酶的表達，而且所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連。在一個實施方案中，所述重組核酸分子含有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用的遺傳修飾。在另一實施方案中，所述大腸桿菌在選自下列的至少一個基因中還有遺傳修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG和/或磷酸酶基因。在另一實施方案中，其他修飾包括nagA、nagB、nagC、nagD、nagE的缺失和manXYZ中的突變，其中所述修飾導致N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的酶活性降低。
本發明的另一實施方案涉及通過生物合成方法生產葡糖胺的微生物。用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化所述微生物，其中將所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連。所述重組核酸分子還含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的遺傳修飾。所述重組核酸分子的表達提高了微生物對葡糖胺的生產。在優選的實施方案中，將所述重組核酸分子整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，所述微生物在編碼選自下列的蛋白質的基因中至少還有一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修飾減弱了所述蛋白質的作用。在另一實施方案中，本發明的微生物在編碼磷酸酶的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。在另一實施方案中，所述微生物在編碼下列蛋白質的基因中還有遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的酶活性。在優選的實施方案中，所述遺傳修飾是缺失所述基因的至少一部分。
在另一實施方案中，所述微生物是大腸桿菌，其在選自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、ptsGg基因和/或磷酸酶基因的基因中有修飾。在一實施方案中，所述大腸桿菌缺失了nag調節子基因，在另一實施方案中，所述大腸桿菌缺失了nag調節子基因並在manXYZ基因中有遺傳修飾以便由manXYZ基因編碼的所述蛋白質具有降低的作用。
本發明的另一實施方案是上述微生物，當在含14g/L K2HPO4、16g/LKH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、lmM CaCl2和約0.2-約1mM IPTG的pH7.0的發酵培養基中，在約28℃-約37℃培養約10-60小時達到細胞乾重至少約8g/L的細胞密度時，所述微生物產生至少約1g/L葡糖胺。
本發明的另一實施方案是用於通過生物合成方法生產葡糖胺的微生物，所述微生物含有(a)與轉錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子；(b)在編碼選自下列蛋白質的基因中至少一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修飾減弱了所述蛋白質的作用。在另一實施方案中，所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還有至少一個遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物中葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。在另一實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
附圖簡述

圖1是大腸桿菌中葡糖胺和N-乙醯-葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代謝途徑的示意圖。
圖2是對大腸桿菌中與葡糖胺過量生產中氨基糖代謝途徑有關的途徑的修飾示意圖。
圖3是含manXYZ、ptsG和△nag突變組合的大腸桿菌菌株的生產示意圖。
圖4說明向培養基中加入額外的葡萄糖和硫酸銨對葡糖胺積累的作用的線性圖。
圖5說明通過葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺抑制葡糖胺-6-磷酸合酶的線性圖。
圖6是說明在突變體glmS克隆中，葡糖胺-6-磷酸合酶的產物抑制活性的線性圖。
圖7是說明構建含突變glmS基因的大腸桿菌菌株的策略示意圖。
圖8說明在含整合的突變glmS基因的大腸桿菌菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的產物抑制作用的線性圖。
圖9說明在含整合的突變glmS基因的突變大腸桿菌菌株中，葡糖胺生產的線性圖。
圖10說明在生產葡糖胺的菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的抑制作用的線性圖。
圖11A說明在45℃，生產葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶熱穩定性的線性圖。
圖11B說明在50℃，生產葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶熱穩定性的線性圖。
圖12說明IPTG濃度對葡糖胺生產的影響的線性圖。
圖13說明IPTG濃度和溫度對葡糖胺生產的影響的線性圖。
圖14A是說明30℃時葡糖胺生產菌株2123-54的生長和葡糖胺生產情況線性圖。
圖14B說明37℃時葡糖胺生產菌株2123-54的生長和葡糖胺生產情況線性圖。
圖15A是說明30℃時葡糖胺生產菌株2123-49的葡糖胺生產的線性圖。
圖15B是說明30℃時葡糖胺生產菌株2123-124的葡糖胺生產的線性圖。
圖16A是說明37℃時在葡萄糖限量的發酵罐中葡糖胺生產菌株的葡糖胺生產情況線性圖。
圖16B是說明30℃時在葡萄糖限量的發酵罐中葡糖胺生產菌株的葡糖胺生產情況線性圖。
圖16C是說明30℃時在葡萄糖過量的發酵罐中葡糖胺生產菌株的葡糖胺生產情況線性圖。
發明詳述本發明涉及生產葡糖胺的生物合成方法。所述方法包括發酵遺傳工程修飾的微生物以生產葡糖胺。本發明還涉及用於生產葡糖胺的遺傳工程修飾的微生物，例如大腸桿菌菌株。文中所用術語葡糖胺和N-葡糖胺可以交換使用。同樣，術語葡糖胺-6-磷酸和N-葡糖胺-6-磷酸也可以交換使用。還可將葡糖胺縮寫為GlcN，將葡糖胺-6-磷酸縮寫為GlcN-6-P。
本發明通過發酵生產葡糖胺的新方法不昂貴，而且葡糖胺的產率超過目前每成本通過水解方法生產葡糖胺的產率。另外，通過使用本文所述的遺傳工程方法修飾的微生物，很容易對本發明方法進行改變以便根據葡糖胺的生產適用於特定的問題或者變化的要求。
N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)和葡糖胺(GlcN)等氨基糖是微生物中非常重要的分子，因為它們是主要大分子，具體地講，是糖結合物(即含共價寡糖鏈的大分子)生物合成的前體。例如，在大腸桿菌中，N-乙醯葡糖胺和葡糖胺是兩種細胞膜大分子，肽聚糖和脂多糖的前體。阻斷肽聚糖或脂多糖之生物合成的突變是致死的，會導致喪失細胞膜的完整性並最終導致細胞溶解。
本發明的一個實施方案涉及通過微生物發酵生產葡糖胺的方法。該方法包括步驟(a)在發酵培養基中培養在氨基糖代謝途徑具有遺傳修飾的微生物，所述代謝途徑包括將葡糖胺-6-磷酸轉變成另一種化合物的途徑、合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸運輸到所述微生物外的途徑、將葡糖胺運輸到所述微生物內的途徑以及與葡糖胺-6-磷酸生成競爭底物的途徑，以由所述微生物生成包括細胞內葡糖胺-6-磷酸和/或細胞外葡糖胺的產物；及(b)通過從所述微生物中回收細胞內葡糖胺-6-磷酸和/或從發酵培養基中回收細胞外葡糖胺來回收產物。發酵培養基包含可吸收的碳、氮和磷源。
本發明的另一實施方案涉及通過發酵生產葡糖胺的方法。所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發酵培養基中培養用重組核酸分子轉化的大腸桿菌，所述核酸分子編碼葡糖胺-6-磷酸並與轉錄控制序列有效相連；(b)回收選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物。所述重組核酸分子可提高大腸桿菌葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。在另一實施方案中，所述重組核酸分子含有降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用的遺傳修飾。在另一實施方案中，所述大腸桿菌還至少有一個選自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和/或磷酸酶基因的遺傳修飾。
為了通過本發明的發酵方法以顯著高的產率生產葡糖胺，對微生物進行遺傳修飾以提高葡糖胺的生產。如文中所述，遺傳修飾的微生物例如大腸桿菌含有從其正常(即野生型或天然)形式修飾(即突變或改變的)的基因組。利用經典菌株開發和/或分子遺傳學技術可以完成微生物的遺傳修飾。所述技術通常公開於例如Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室出版社。Sambrook等的文獻全文引入本文作為參考。另外，在實施例節詳細描述了用於遺傳修飾微生物的技術。遺傳修飾的微生物可包括天然遺傳變體以及其中以所述修飾可在所述微生物內提供所需作用的方式已對核酸分子進行插入、缺失或修飾(即突變；例如通過核苷酸的插入、缺失、取代和/或倒置)的微生物。根據本發明，遺傳修飾的微生物包括已用重組技術修飾過的微生物。如文中所用，可將導致基因表達、基因功能或基因產物(即由該基因編碼的蛋白質)之功能降低的遺傳修飾稱為基因的失活(完全的或部分的)、缺失、斷裂、阻斷或下調。例如，導致基因編碼之蛋白質功能降低的基因中的遺傳修飾可能是下列原因的結果所述基因完全缺失(即該基因不存在，因此所述蛋白質不存在)、導致蛋白質不完整或不翻譯(例如蛋白質不表達)的基因中的突變、或者降低或消除了所述蛋白質的天然功能(例如被表達的蛋白質的酶活性或作用降低或沒有活性或作用)的基因突變。可將導致基因表達或功能增強的遺傳修飾稱為基因的擴增、過量生產、過量表達、激活、提高、增加或上調。
在本發明的一個實施方案中，微生物的遺傳修飾提高或降低了與本發明氨基糖代謝途徑有關的蛋白質的作用。所述遺傳修飾包括任何類型的修飾，具體包括通過重組技術和經典誘變產生的修飾。例如，在一實施方案中，本發明的微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。應注意本文所討論的葡糖胺-6-磷酸合酶及其他酶作用(或活性)的提高指導致下列結果的所述微生物中的任何遺傳修飾所述酶功能提高並包括所述酶的較高活性(例如比活性或體內酶活性)、所述酶的抑制作用降低或所述酶的降解以及所述酶的過量表達。例如可增加基因拷貝數、利用比天然啟動子有更高表達水平的啟動子可以提高表達水平或者通過遺傳工程方法或經典誘變可改變基因以提高所述酶的作用。在實施例節中描述了已經經過遺傳修飾提高了葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的實例。同樣，本文所討論的酶作用的降低指可導致下列結果的任何遺傳修飾酶功能降低並包括酶活性(例如比活性)降低、酶的抑制作用增強或者降解增加以及所述酶表達的減少或消除。例如通過阻斷或減少所述酶的生產、降低酶活性或者抑制所述酶的活性可以降低本發明酶的作用。酶生產的阻斷或減少包括將編碼所述酶的基因放在啟動子的控制下，所述啟動子需要在生長培養基中含有誘導化合物。通過確定條件從所述培養基中除去所述誘導劑，可以關閉編碼所述酶之基因的表達(並因此，關閉酶合成)。酶活性的阻斷或降低還可包括利用與美國專利4,743,546所述相似的切割技術，該專利引入本文作為參考。為了利用該方法，將編碼目的酶的基因克隆在可使得特異性地有控制地從基因組中切割所述基因的特異性遺傳序列間。例如按美國專利4,743,546所述通過培養溫度的改變或者通過一些其他物理或營養信號可以促進切割。
氨基糖是糖的一種氨基衍生物(例如氨基代替了羥基的糖)。根據本發明，氨基糖代謝途徑是與氨基糖的生物合成、合成代謝或分解代謝有關或影響其生物合成、合成代謝或分解代謝的任何生物化學途徑。本文所用氨基糖代謝途徑包括與氨基糖和其前體運輸入或出細胞有關的途徑，還可包括競爭氨基糖生物合成或分解代謝有關的底物的生物化學途徑。例如，最早形成的氨基糖之一的中間前體是果糖-6-磷酸(F-6-P)，其在與穀氨醯胺(Gln，氨基供體)的生物化學反應中形成葡糖胺-6-磷酸。果糖-6-磷酸還是糖酵解途徑的中間產物。因此，通過底物果糖-6-磷酸的競爭，糖酵解途徑與葡糖胺-6-磷酸生物合成途徑競爭。另外，通過一系列的生物化學反應可將葡糖胺-6-磷酸轉變成其它氨基糖並形成各種大分子的組分。因此，果糖-6-磷酸/葡糖胺-6-磷酸途徑、果糖-6-磷酸糖酵解途徑在其影響葡糖胺-6-磷酸之生物合成的程度上，以及葡糖胺-6-磷酸/大分子生物合成途徑均被認為是本發明的氨基糖代謝途徑。
總之，帶有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的微生物含有至少一個上述遺傳修飾，與同樣條件下培養的野生型微生物相比，所述修飾導致上述一個或多個氨基糖代謝途徑的改變。氨基糖代謝途徑中的這類修飾改變了所述微生物生產氨基糖的能力。根據本發明，遺傳修飾的微生物與同樣條件培養的野生型微生物相比優選其具有提高的生產葡糖胺的能力。通常可將影響葡糖胺生產的氨基糖代謝途徑劃歸至少下列途徑之一(a)將葡糖胺-6-磷酸轉變成其它化合物的途徑，(b)合成葡糖胺-6-磷酸的途徑，(c)將葡糖胺運輸到細胞中的途徑，(d)將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸運輸出細胞的途徑以及(e)與生產葡糖胺-6-磷酸競爭底物的途徑。
用於本發明方法的遺傳修飾的微生物通常具有至少一種修飾的至少與一種氨基糖代謝途徑有關的基因，所述修飾導致(a)將葡糖胺-6-磷酸轉變成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代謝或合成代謝途徑的抑制作用)，(b)生產(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高，(c)將葡糖胺運輸進細胞的能力降低，(d)將葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺運輸出細胞的能力提高和/或(e)使用與葡糖胺-6-磷酸生產有關的底物進行競爭性生物化學反應的能力降低。
應理解，本發明公開了在發酵過程中利用具有生產商業有用量葡糖胺之能力的微生物的方法(即優選與在相同條件下培養的野生型微生物相比生產葡糖胺的能力提高)。通過遺傳修飾編碼與氨基糖代謝途徑有關之蛋白質的一個或多個基因而完成所述方法，所述遺傳修飾導致生成(表達)與相應的野生型蛋白質相比具有改變的(例如提高或降低的)功能的蛋白質。所述改變的功能提高了遺傳修飾的微生物生成葡糖胺的能力。本領域技術人員應理解生產經如實施例所述特異性篩選技術所得含本文特定之功能改變的遺傳修飾微生物可產生許多符合特定功能要求的生物，但需經各種遺傳修飾。例如，在指定核酸序列中的不同的隨機核苷酸缺失和/或取代均可產生相同的表型(例如由所述序列編碼之蛋白質作用的減弱)。本發明設想了可產生具有本文所述特徵之微生物的任何這類遺傳修飾。
對於不同微生物來說，已闡明了許多氨基糖代謝途徑。具體地講，已闡明了大腸桿菌中葡糖胺和N乙醯葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代謝途徑。這些途徑包括利用這些氨基糖為碳源的多運輸系統。已克隆並測序了大腸桿菌中編碼直接與氨基糖之運輸、分解代謝和生物合成有關的酶和蛋白質的基因。另外，已分離了在氨基糖代謝幾乎每一步阻斷的大腸桿菌的各突變株。圖1說明了大腸桿菌氨基糖代謝的已知途徑。
如下文將詳細討論的，儘管已闡明了與氨基糖代謝途徑有關的許多途徑和基因，但直到本發明為止，並不知道在許多可能的遺傳修飾中究竟哪一種對於產生可生產商業顯著量葡糖胺之微生物是必需的。確實，本發明人首次設計並生產出具有遠大於任何已知野生型或突變微生物之葡糖胺生成能力的葡糖胺-生成微生物。本發明人還首次認識到所述遺傳修飾的微生物可用於生產商業用葡糖胺的方法。
用於本發明發酵方法的微生物優選是細菌或酵母。更優選所述微生物是埃希菌屬的細菌。大腸桿菌是用於本發明發酵方法的最佳微生物。特別優選的大腸桿菌菌株包括K-12、B和W，最佳為K-12。儘管大腸桿菌是最佳的，但應理解生成葡糖胺的並可經遺傳修飾以提高葡糖胺生成的任何微生物均可用於本發明方法。還可將用於本發明發酵方法的微生物稱為生產微生物。
下文將描述作為本發明具體實施方案的大腸桿菌的氨基糖代謝途徑。應理解，其他微生物，具體地講，其他細菌具有類似的氨基糖代謝途徑以及在所述途徑內具有類似結構和功能的基因和蛋白質。因此，下丈有關大腸桿菌的原理也適用於其他微生物。
在本發明的一個實施方案中，遺傳修飾的微生物包括合成葡糖胺-6-磷酸的能力提高的微生物。根據本發明，「合成產物的能力提高」指在涉及產物合成的氨基糖代謝途徑中的任何提高或上調以致與相同條件下培養的野生型微生物相比，本發明微生物生成產物的數量增加。在本發明的一實施方案中，微生物合成葡糖胺-6-磷酸能力的提高是通過增加葡糖胺-6-磷酸合酶基因的表達而完成的，在大腸桿菌中，該基因是glmS基因，其產物是葡糖胺-6-磷酸合酶。葡糖胺-6-磷酸合酶催化其中果糖-6-磷酸和穀氨醯胺形成葡糖胺-6-磷酸和穀氨酸的反應。在大腸桿菌中，例如通過導入編碼glmS基因的重組核酸分子可增加葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。
glmS的過量表達對於葡糖胺-6-磷酸的細胞內積累並最終生成葡糖胺是很重要的，因為細胞內葡糖胺-6-磷酸合酶的水平將控制碳流出糖酵解途徑和進入葡糖胺-6-磷酸合成途徑。glmS基因位於大腸桿菌染色體上的84min,該染色體區的序列分析表明glmS與glmU基因位於同一操縱子內，glmS編碼雙功能酶，葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶。葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶在通過一系列生物化學反應將葡糖胺-6-磷酸摻入大分子的氨基糖代謝途徑中發揮功能。在glmS上遊未檢測到明顯的啟動子；glmUS操縱子的轉錄是從glmU上遊的兩個啟動子序列開始的。因此，優選將glmS基因克隆在人工啟動子的控制下。所述啟動子可以是任何可在生產生物體中提供保持足夠水平的葡糖胺-6-磷酸合酶所需之glmS表達水平的啟動子。優選的啟動子是組成型(而不是誘導型)啟動子，因此而不需要加入昂貴的誘導劑。所述啟動子包括已通過遺傳修飾，例如較弱的突變阻遏基因的應用而成為功能組分或「滲漏」的正常可誘導型啟動子系統。可與glmS一起使用的特別優選的啟動子是lac,λPL和T7。根據最大產物形成量的要求可以改變glmS基因的量(拷貝數)。在一實施方案中，將重組glmS基因整合到大腸桿菌染色體中。
因此，本發明的一個實施方案是提供用含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子轉化的微生物，例如大腸桿菌，此時葡糖胺-6-磷酸是由glmS基因編碼的。含所述核酸序列的優選重組核酸分子包括含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有胺基酸序列SEQ ID NO:16。本發明其他優選的重組核酸分子包括含有選自SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15之核酸序列的核酸分子。本發明特別優選的重組核酸分子包括含有核酸分子nglmS-282184和/或nglmS-281830的核酸分子。稱為pKLM23-28的一個本發明的重組分子包括SEQ ID NO:13、14和15，且對於在微生物中表達葡糖胺-6-磷酸合酶是特別有用的。上述鑑定的核酸分子代表了含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質之野生型(即天然或內源)核酸序列的核酸分子。本發明還包括含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶同系物(即修飾的和/或突變的)之核酸序列的遺傳修飾的核酸分子，下文將詳細描述。
報導的大腸桿菌果糖-6-磷酸合酶對果糖-6-磷酸和穀氨醯胺的Km分別是2mM和0.4mM。這些值相對較高(即該酶對其底物的親和性相當弱)。因此，本發明的另一實施方案是提供葡糖胺-6-磷酸合酶與其底物的親和性提高的微生物。可通過任何適宜的遺傳修飾或蛋白質工程方法生產與其底物親和性提高的葡糖胺-6-磷酸合酶。例如，可以用以計算機為基礎的蛋白質工程設計具有較高穩定性和較好底物親和性的葡糖胺-6-磷酸合酶。參見例如Maulik等，1997，分子生物技術治療應用與策略(Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies)；Wiley-Liss,Inc.，已全文引入本文作為參考。
White(1968，生物化學雜誌(Biochem.J.)106:847-858)首次表明葡糖胺-6-磷酸合酶是由葡糖胺-6-磷酸抑制的。本發明確定這種抑制作用是限制葡糖胺在本發明設計的商業用葡糖胺生產菌株中積累的關鍵因素。因此，本發明的另一實施方案提供了具有減弱的葡糖胺-6-磷酸產物反饋抑制作用之葡糖胺-6-磷酸合酶的微生物。具有減弱的產物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶可以是突變的(即遺傳修飾的)葡糖胺-6-磷酸合酶基因，例如可以通過任何適宜的遺傳修飾方法產生。例如通過插入、缺失和/或取代核苷酸的方法，例如通過易錯PCR可修飾編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子。用該方法，在導致高頻率摻入錯誤的條件下通過用於擴增的DNA聚合酶擴增所述基因。結果，在PCR產物中得到高頻突變。在實施例5中將詳細描述該方法。然後通過檢測突變基因使被測微生物與攜帶非突變的重組葡糖胺-6-磷酸合酶核酸分子的微生物進行比較具有提高的葡糖胺生產能力，可篩選具有減弱的產物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶基因突變株。應注意，葡糖胺-6-磷酸合酶的產物抑制作用降低通常會導致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高，甚至當與天然葡糖胺-6-磷酸酶相比，該酶的比活性仍相同或實際上降低時也會如此。因此，本發明的一個實施方案是生產具有提高的作用和提高的體內酶活性的遺傳修飾的葡糖胺-6-磷酸合酶，遺傳修飾的所述酶與天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有未改變的或者甚至降低的比活性。本發明還包括遺傳修飾的具有提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶。
因此，本發明的一個實施方案用遺傳修飾的重組核酸分子轉化的微生物，例如大腸桿菌，所述核酸分子含有編碼突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白或葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。本文將這類葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白也稱為葡糖胺-6-磷酸合酶同系物。下丈將詳細描述蛋白質同系物。含這類核酸序列的優選重組核酸分子包括含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，所述酶含有選自下列的胺基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:31。其他優選的重組核酸分子含有選自下列的核酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和/或SEQ ID NO:30。可用於本發明的特別優選的遺傳修飾的重組核酸分子包括含選自下列之核酸分子的核酸分子nglmS-492184、nglmS-491830,nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。質粒pKLN23-49、pKLN23-54、PKLN23-124、pKLN23-149和pKLN23-151是本發明的重組核酸分子，它們對於在微生物中表達本發明葡糖胺-6-磷酸合酶同系物是特別有用的。
在細胞內有足夠的穀氨醯胺(Gln)對於葡糖胺-6-磷酸合酶反應是很重要的。檢查葡糖胺-6-磷酸的合成和降解途徑表明存在潛在的無效循環，藉助該循環果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸的連續互變會導致穀氨醯胺的不經濟消耗。在本發明的一個實施方案中，通過對生產生物體進行遺傳修飾以提高細胞內的穀氨醯胺生產，或者通過修飾發酵培養基(即向發酵培養基中加入穀氨醯胺)可以提高穀氨醯胺的供應以確保穀氨醯胺的供應不會限制葡糖胺-6-磷酸的生產。
在本發明的另一實施方案中，所述潛在的果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸無效循環是通過抑制或阻斷葡糖胺-6-磷酸轉變成果糖-6-磷酸的逆向反應而實現的。在該實施方案中，遺傳修飾微生物以便其催化該轉變的基因，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶失活或缺失，在大腸桿菌中該基因是nagB基因。nagB基因是數個nag基因中的-種，這些nag基因是nag調節子的一部分。與葡糖胺和N-乙醯-葡糖胺降解有關的nag基因作為調節子存在於大腸桿菌染色體上的15min。在另一實施方案中，使完整的nag調節子失活或缺失。下文將詳細討論缺失全部nag調節子的優點。
如上所討論，葡糖胺-6-磷酸合酶的過量生產導致果糖-6-磷酸合成轉成葡糖胺-6-磷酸合成。但是，許多其他酶可以爭奪底物果糖-6-磷酸。因此，本發明的一個實施方案包括其中阻斷這些競爭性副反應的微生物。在優選的實施方案中，提供了含有完全或部分失活的編碼磷酸果糖激酶之基因的微生物。糖酵解途徑的第二步通過磷酸果糖激酶將果糖-6-磷酸轉變成果糖-1,6-二磷酸，在大腸桿菌中，磷酸果糖激酶作為由pfkA或pfkB編碼的兩種同工酶存在。pfkA或pfkB基因的完全或部分失活會降低果糖-6-磷酸進入糖酵解途徑的速度，並促進果糖-6-磷酸轉變成葡糖胺-6-磷酸。丈中所用基因的失活指對導致所述基因之活性(即表達或功能)降低的基因的任何修飾，包括活性的減弱或活性的完全缺失。
在本發明的另一實施方案中，遺傳修飾的微生物將葡糖胺-6-磷酸轉變成其他化合物的能力降低。如上所述，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的失活代表一種所述修飾，但是，葡糖胺-6-磷酸是其他生物化學反應的底物。導致大分子例如大腸桿菌脂多糖和肽聚糖產生之途徑中的第一步是通過磷酸葡糖胺變位酶將葡糖胺-6-磷酸變為葡糖胺-1-磷酸，在大腸桿菌中，所述變位酶是glmM基因的產物。最近通過克隆glmM基因確定了脂多糖和肽聚糖的生物合成有該酶活性的參與。結果，尚未詳細研究出glmM基因的調節，其天然產物，磷酸葡糖胺變位酶。但是已表明磷酸葡糖胺變位酶與所研究的所有其他磷酸己糖變位酶一樣均是通過磷酸化調節的。這種酶水平的調節通常對該途徑末端產物的水平極為敏感。因此，通過磷酸葡糖胺變位酶的碳流可能是自我調節的，並且不是葡糖胺-6-磷酸積累的問題。glmM基因序列是已知的，但是，本發明優選的實施方案是提供其中磷酸葡糖胺變位酶編碼基因被中斷或缺失的微生物。更優選，將編碼磷酸葡糖胺變位酶的基因通過突變下調，但不是完全失活，以便不會完全阻斷重要細胞膜組分的生物合成。
導致葡糖胺-6-磷酸轉變成另一化合物的另一途徑是由N-乙醯葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶催化的。N-乙醯葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶能夠催化葡糖胺-6-磷酸(加乙醯CoA)轉變成N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸的逆反應。這可能導致葡糖胺-6-磷酸和N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸的無效循環並導致產生由葡糖胺和N-乙醯-葡糖胺組成的混合物。因此，本發明的另一實施方案是提供其中編碼N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶的基因，在大腸桿菌中是nagA基因失活的遺傳修飾的微生物。
本發明的另一實施方案是使微生物中葡糖胺的運輸系統失活以便細胞一旦分泌出葡糖胺後，不會再攝入。這種修飾有助於避免對細胞有毒的高水平的細胞內葡糖胺，並促進產物的回收，因為產物仍在細胞外。在本發明優選的實施方案中，將葡糖胺的運輸系統失活以便微生物一旦產生葡糖胺後，將葡糖胺保持在所述微生物外。在大腸桿菌在僅以葡糖胺為碳源生長的過程中，通過PEP甘露糖磷酸轉移酶(PTS)系統將葡糖胺運輸到細胞內，該系統不僅能夠將葡糖胺運輸到細胞內，而且是由葡糖胺誘導的。因此，本發明的一個實施方案是提供沒有將葡糖胺運輸到細胞內之能力的微生物。例如，manXYZ突變株(即編碼PEP甘露糖PTS之EIIM,P/ⅢMan的基因缺乏或有突變的大腸桿菌)不能通過該機制將葡糖胺運輸到細胞內。另一方面，大腸桿菌的PEP葡萄糖PTS能夠將葡萄糖和葡糖胺運輸到細胞內，但是葡糖胺不能誘導該系統。因此，為了使manXYZ突變株在葡糖胺上生長，必須使細胞先在葡萄糖上生長以誘導(可替換的)葡萄糖運輸系統的表達並允許葡萄糖(優選的碳源)運輸到細胞內。然後這些被誘導的細胞能夠經葡萄糖轉運蛋白將葡糖胺運輸到細胞內。類似的情況存在於經PEP果糖PTS運輸葡糖胺，儘管在這種情況下，通過酶ⅡFru運輸的葡糖胺很少。下文討論抑制這些二級葡糖胺運輸途徑的方法。本發明的另一實施方案是提供PEP葡萄糖PTS(上述)功能降低的微生物。所述修飾對於避免來自培養基的葡糖胺再吸收可能是必需的。例如，ptsG突變株(即編碼PEP葡萄糖PTS之酶ⅡGlc的基因缺乏或有突變)。由於所述微生物利用葡萄糖作為碳源的生長能力降低，因此，可對所述生物體進行進一步地遺傳修飾以便通過與PEP葡萄糖PTS無關的機制攝入葡萄糖。例如已表明可篩選PEP葡萄糖PTS缺陷型突變微生物，所述微生物仍有在葡萄糖上生長的能力(Flores等，1996，天然生物技術(NatureBiotechnology)14:620-623)。
大腸桿菌nag調節子的DNA測序表明nagE基因位於所述調節子的一個臂上並由所述調節子另一臂上的其它nag基因(nagBACD)轉錄，它編碼PEP糖磷酸轉移酶(PTS)系統中的N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag蛋白，該酶與葡糖胺運輸到細胞內有關。因此，導致大腸桿菌運輸葡糖胺至細胞內之能力降低的另一遺傳修飾是nagE基因的失活或缺失，或者編碼用於本發明方法的任何微生物中類似酶之基因的失活或缺失。
如上所述，在本發明的一個實施方案中，用於本發明方法的遺傳修飾大腸桿菌的整個nag調節子已缺失。完整染色體nag調節子的缺失是優選的，因為將同時使許多不利於葡糖胺-6-磷酸產生的基因失活。上文已詳細討論了nagA、nagB和nagE基因。nagC基因編碼一調節蛋白，該蛋白是nag調節子的阻遏物並且既是glmUS操縱子的激活劑，也是glmUS操縱子的的阻遏物。上文詳細討論了glm基因。nagD基因的功能是未知的，但由於其位於nag調節子內，因此認為其也與氨基糖代謝有關。因此，在大腸桿菌中，nag調節子的全部缺失避免了在用於過量生產葡糖胺的大腸桿菌菌株中，初始細胞內產物(葡糖胺-6-磷酸)的分解代謝。優選的具有nag調節子缺失的大腸桿菌突變株是具有ΔnagEBACD∷tc缺失/插入的大腸桿菌。
就glmUS操縱子的失活(nagC的功能)而言，儘管編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的glmS基因的失活為所需，但是glmU基因產物，葡糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶水平的增加對於葡糖胺-6-磷酸的積累可能不利，因為它可能導致碳源流向細胞膜組分。因此，本發明的一個實施方案是使本發明方法所用微生物的葡糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶失活。在其中glmUS操縱子或其等同物已被失活或缺失的微生物中，本發明的另一實施方案是通過重組方法在所述微生物中產生位於人工啟動子控制下的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之基因，從而遺傳修飾所述微生物。
在本文所述之遺傳修飾微生物中的初始細胞內產物是葡糖胺-6-磷酸。在許多微生物，包括大腸桿菌中，葡糖胺-6-磷酸通常在運輸出細胞前去磷酸化成為葡糖胺。然而，本發明的另一實施方案是提供經遺傳修飾具有將葡糖胺-6-磷酸轉變成葡糖胺的相應磷酸酶活性的微生物。這類磷酸酶包括但不限於，例如鹼性磷酸酶。在優選的實施方案中，這類大腸桿菌具有增強的(即提高的)磷酸酶活性(即磷酸酶作用)。
如上所述，在本發明生產葡糖胺的方法中，在用於生產葡糖胺的發酵培養基中培養具有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的微生物。適宜的或有效的發酵培養基指當被培養時，本發明遺傳修飾的微生物能夠產生葡糖胺的任何培養基。所述培養基通常是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養基。所述培養基還可包括適宜的鹽、礦物質、金屬和其他營養成份。本文所述的對微生物之遺傳修飾的一項優點是儘管所述遺傳修飾顯著地改變了氨基糖的代謝，但是對於生產生物體並沒有任何營養需求。因此，優選用以葡萄糖為唯一碳源的基本-鹽培養基作為發酵培養基。用於葡糖胺發酵的基本-鹽-葡萄糖培養基還有利於葡糖胺產物的回收和純化。
還可在常規發酵生物反應器中培養本發明的微生物。可通過任何發酵方法培養所述微生物，所述方法包括但不限於分批培養、補料分批培養、細胞再循環以及連續發酵。優選，通過分批培養或補料分批培養發酵方法培養本發明微生物。
在本發明的一個實施方案中，接種前，使發酵培養基達到理想溫度，通常約20-約40℃，優選約25℃-約40℃，約28℃-約37℃，在一些實施方案中，約30℃-約37℃是最佳的。本發明人發現受控於T7-lac啟動子(參見實施例節)的核酸分子所轉染的本發明微生物於30℃培養時停止生長但繼續生產葡糖胺，於37℃時生長和葡糖胺生產並存。37℃生長比30℃稍微好些，但是30℃時的葡糖胺生產顯著好於37℃。應注意本發明微生物的生長和葡糖胺生產的最佳溫度可隨各種因素而改變。例如，用於微生物中重組核酸分子表達的特定啟動子的篩選可能會影響最佳培養溫度。本領域技術人員很容易用標準技術，例如實施例節中所述的用於本發明微生物的技術確定本發明任何微生物的最佳生長和葡糖胺生產溫度。
用經過合理的生長期足以產生高細胞密度量的遺傳修飾的微生物的活躍生長培養物接種培養基。使細胞生長至至少約10g/l的細胞密度，優選約10g/l-約40g/l，更優選至少約40g/l。該過程通常需要約10-60小時。
在發酵過程中須將足夠的氧加到培養基中以便在開始的細胞生長中保持細胞生長並保持代謝和葡糖胺生產。一般通過培養基的攪拌和通氣提供氧。可用攪拌或振蕩等常規方法給培養基通氣。培養基中的氧濃度優選大於飽和值(即在大氣壓和約30-40℃，培養基中的氧溶解度)的約15％，更優選大與飽和值的約20％，儘管如果對發酵沒有不利影響，可達到較低的氧濃度。通過常規方法例如用氧電極可監測培養基的氧濃度。可以使用其他氧源，例如未稀釋的氧氣和用除以外的其它惰性氣體稀釋的氧氣。
由於葡糖胺的發酵生產優選以葡萄糖為唯一碳源，因此在優選的實施方案中，將在大腸桿菌中誘導PEP葡萄糖PTS。因此，甚至在沒有PEP甘露糖PTS的功能性EIIM,P/ⅢMan的情況下(例如，在帶有manXYZ突變的大腸桿菌中)，仍將由細胞經誘導的葡萄糖運輸系統攝入產物葡糖胺。但在有過量葡萄糖時，葡糖胺的攝入受到嚴重抑制。因此，本發明的一個實施方案是通過在發酵生物反應器中保持過量葡萄糖來抑制葡糖胺產物的攝入。本文所用「過量」的葡萄糖指葡萄糖的量高於正常條件，例如上述培養條件下保持微生物生長所需的量。優選，將葡萄糖濃度保持在發酵培養基重量/體積約0.5％-約5％。在另一實施方案中，將葡萄糖濃度保持在約5g/L-約50g/L發酵培養基，最佳為約5g/L至約20g/L發酵培養基。在一實施方案中，通過任何適宜的方法(例如用葡萄糖檢測條)監測發酵培養基的葡萄糖濃度，當葡萄糖濃度耗盡或接近耗盡時，再向培養基中加入葡萄糖。在另一實施方案中，通過向發酵培養基中半連續或連續補料來保持葡萄糖的濃度。本文公開的葡萄糖參數適用於本發明發酵培養基所用的任何碳源。還應理解，可使碳源在發酵過程的任何適宜時間段達到不可檢測的水平，只要其可促進葡糖胺的生產。
本發明的另一實施方案是根據保持和/或促進生產生物體生產葡糖胺的需要，補充和/或控制發酵培養基的其他組分和參數。例如，在一個實施方案中，發酵培養基含有硫酸銨，而且通過加入過量硫酸銨補充培養基中硫酸銨的濃度。優選將發酵培養基中的硫酸銨量保持在約0.1％-約1％(重量/體積)，優選約0.5％。在另一實施方案中，監測發酵培養基pH的波動。在本發明的發酵方法中，優選將pH保持在約pH6.0-約pH8.0，更優選約pH7.0。在本發明方法中，如果發酵培養基的起始pH為7.0，則監測發酵培養基的pH是否顯著偏離pH7.0，並通過例如加入氫氧化鈉作相應調整。
本發明的另一實施方案是改變碳流，使其從乙酸鹽生產流向較低毒性副產物的生產。用所述方法，可避免與發酵培養基中葡萄糖過量有關的毒性問題。從乙酸鹽生產改變碳流向的方法是本領域已知的。
在本發明的分批發酵過程中，持續發酵直到通過細胞外葡糖胺的積累表明葡糖胺的形成基本上停止為止。總發酵時間通常為約40-約60小時，更優選約48小時。在連續發酵過程中，隨葡糖胺在培養基中的積累將其從反應器中取出。本發明的方法可生產包括細胞內或細胞外葡糖胺-6-磷酸和細胞內或細胞外葡糖胺的產物。
本發明方法還包括回收產物，所述產物可以是細胞內糖胺-6-磷酸或細胞外葡糖胺。術語「回收葡糖胺」簡單指從發酵生物反應器中收集產物，並不指其他分離或純化步驟。例如，回收步驟指從生物反應器中取出全部培養物(即微生物和發酵培養基)，從生物反應器中取出含細胞外葡糖胺的發酵培養基，和/或從生物反應器中取出含細胞內葡糖胺-6-磷酸的微生物。這些步驟後可進行進一步純化。優選回收基本上純形式的葡糖胺。本文所用「基本上純的」指葡糖胺作為用於商業銷售的營養化合物可有效使用的純度。在一實施方案中，優選從生產生物體和其他發酵培養基組分中分離葡糖胺產物。下文描述完成所述分離的方法。
通過本發明方法，優選從微生物和/或發酵培養基中回收至少約1g/L產物(即葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸)。通過本發明方法，更優選回收至少約5 g/L產物，最佳至少約10g/L產物，更好至少約20g/L產物，更好至少約50g/L產物。在一實施方案中，回收約1g/L-約50g/L的葡糖胺產物。
通常，用本發明方法生產的大部分葡糖胺是細胞外的。通過常規方法，例如通過過濾或離心可從發酵培養基中回收所述微生物。在一實施方案中，回收產物的步驟包括從發酵培養基中純化葡糖胺。通過常規方法，例如色譜、提取、結晶(例如蒸髮結晶)、膜分離、反滲透和蒸餾可從無細胞發酵培養基中回收葡糖胺。在優選的實施方案中，通過結晶從無細胞發酵培養基中回收葡糖胺。在另一實施方案中，回收產物的步驟包括濃縮細胞外葡糖胺的步驟。
在一實施方案中，葡糖胺-6-磷酸在細胞內積累，回收產物的步驟包括從所述微生物中分離葡糖胺-6-磷酸。例如，通過不會降解葡糖胺產物的方法溶解微生物細胞，離心裂解物以除去不溶的細胞碎片，然後通過上述常規方法回收葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸可回收產物。
在本文所述的遺傳修飾的微生物中的初始細胞內產物是葡糖胺-6-磷酸。通常認為，在從微生物向外運輸的過程中，磷酸化的中間產物被去磷酸化，最可能歸因於微生物的壁膜間隙中存在鹼性磷酸酶。在本發明的一實施方案中，在從細胞向外運輸前或過程中，通過天然磷酸酶將葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以便有利於生成所需產物葡糖胺。在該實施方案中，不需要提高細胞內重組磷酸酶的活性或者用磷酸酶處理髮酵培養基。在另一實施方案中，通過包括但不限於遺傳修飾內源磷酸酶基因的方法或者通過重組修飾微生物以表達磷酸酶基因可提高生成生物體中的磷酸酶水平。在另一實施方案中，在葡糖胺-6-磷酸被釋放到培養基後，例如按上述溶解細胞後，用磷酸酶處理回收的培養基。
如上所述，本發明方法生成了顯著量的細胞外葡糖胺。具體地講，該方法生成細胞外葡糖胺，佔總葡糖胺約50％以上的是細胞外的，更優選約75％以上的均是細胞外的，最佳約90％以上的均是細胞外的。通過本發明方法，細胞外葡糖胺的濃度可大於約1g/l，優選大於約5g/l，更優選大於約10g/l，最佳大於約20g/L，甚至優選大於約50g/l。
本發明的一個實施方案涉及通過發酵生成葡糖胺的方法，所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發酵培養基中培養帶有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的大腸桿菌以生成產物，(b)回收產物。所述產物包括從大腸桿菌中回收的細胞內葡糖胺-6-磷酸和/或從發酵培養基中回收的細胞外葡糖胺。
本發明的一個實施方案涉及用於通過生物合成方法生成葡糖胺的微生物。用與轉錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化所述微生物。所述重組核酸分子帶有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用的遺傳修飾。所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。在優選的實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，所述微生物在編碼選自下列蛋白質的基因中帶有至少一個另外的遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。所述遺傳修飾降低了蛋白質的作用，例外是在磷酸酶的情況下，其中優選提高了所述磷酸酶的作用。在另一優選的實施方案中，所述微生物在編碼N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的基因中帶有修飾，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用。在一實施方案中，所述遺傳修飾是缺失至少所述基因的一部分。
在優選的實施方案中，所述遺傳修飾的微生物是細菌或酵母，更優選埃希菌屬的細菌，最佳是大腸桿菌。遺傳修飾的大腸桿菌優選在包括但不限於下列的基因中帶有修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG或磷酸酶基因。在另一實施方案中，所述遺傳修飾的大腸桿菌帶有nag調節子基因的缺失，在另一實施方案中，帶有nag調節子基因的缺失並在manXYZ基因中帶有遺傳修飾以致由manXYZ基因編碼的蛋白質具有降低的作用。
本發明的另一實施方案涉及通過生物合成方法生成葡糖胺的微生物，所述微生物含有與轉錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子；並在編碼選自下列蛋白質的基因中含有至少一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan。所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用，所述重組核酸分子的表達提高了微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶表達。在另一實施方案中，所述微生物在磷酸酶基因中至少有一個遺傳修飾，使該基因編碼的磷酸酶的作用增強。在另一實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
本發明的另一實施方案涉及任何上述微生物，其在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和1mM IPTG的發酵培養基中37℃培養約24小時達到至少約8g/L細胞乾重的細胞密度時，所述微生物產生至少約1g/L葡糖胺。
本發明更優選的實施方案涉及上述任何微生物，當在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和0.2mM-約1mM IPTG的發酵培養基中在約28℃-約37℃培養約10-約60小時達到至少約8g/L細胞乾重的細胞密度時，所述微生物產生至少約1g/L葡糖胺。在優選的實施方案中，IPTG的量是約0.2mM。
本發明的另一實施方案涉及任何上述遺傳修飾的微生物，其在本文所述培養條件下培養時，產生至少約1g/L，優選至少約5g/L，更優選至少約10g/L，甚至更優選至少約20g/L，甚至更優選至少約50g/L葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。本發明的另一實施方案涉及任何上述遺傳修飾的微生物，其比相同條件下培養的野生型(即未修飾的天然)微生物生產至少多約2倍的葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸，優選至少多約5倍，更優選至少多約10倍，更優選多至少約25倍，更優選多至少約50倍，甚至更優選多至少約100倍，甚至更優選多至少約200倍葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。在實施例節中鑑定了許多具體的微生物。本發明的其他實施方案包括這些微生物和具有實施例中具體鑑定之微生物的特定特徵的微生物。所述微生物優選是酵母或細菌，更優選是細菌，最佳是大腸桿菌。所述鑑定特徵可包括實施例中微生物的任何或所有基因型和/或表型特徵，包括其生產葡糖胺的能力。
本發明優選的微生物包括已用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化的大腸桿菌菌株。優選所述核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。特別優選的微生物是大腸桿菌菌株2123-12。菌株2123-12含有整合到其基因組中的含核酸序列SEQ ID NO:15的重組核酸分子，所述核酸序列代表含有胺基酸序列SEQ ID NO:16之野生型(即正常、未修飾的或天然)葡糖胺-6-磷酸合酶的編碼區。本發明特別優選的微生物已用含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的核酸分子轉化，已對所述核酸序列進行了遺傳修飾以致所述合酶具有提高的作用(上述)。最佳，與未用所述核酸分子轉化的微生物相比，所述遺傳修飾提高了所述微生物生產葡糖胺的能力。在實施例節中描述了本發明特別優選的遺傳修飾的微生物，包括大腸桿菌菌株2123-49、2123-54、2123-124、2123-149和2123-151。
用經典菌株培育和分子遺傳技術均可開發經遺傳修飾，生產葡糖胺之能力提高的微生物。總之，產生具有提高的葡糖胺生產之微生物的策略是(1)失活或缺失至少一個，優選一個以上其中對葡糖胺-6-磷酸生產有不利影響(即抑制)的氨基糖代謝途徑；(2)擴增至少一個，優選一個以上其中提高葡糖胺-6-磷酸生產的氨基糖代謝途徑。因此，本發明遺傳修飾的微生物具有(a)將葡糖胺-6-磷酸轉變成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代謝或合成代謝途徑的抑制作用)；(b)生產(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高；(c)將葡糖胺運輸到細胞內的能力降低；(d)將葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺運輸出細胞的能力提高和/或(e)利用與葡糖胺-6-P生產有關之底物競爭進行生物化學反應的能力減弱。
如前文所討論的，在一實施方案中，遺傳修飾的微生物可以是以下微生物，其中核酸分子已缺失、插入或修飾(如通過核苷酸插入、缺失、取代和/或倒置)而在所述微生物內提供所需的影響。在某些實施方案中，所述遺傳修飾可以在核酸分子之編碼蛋白的編碼區內，其使為所述微生物提供所需影響的蛋白質產生胺基酸序列內的胺基酸修飾如插入、缺失、取代。遺傳修飾的微生物可通過重組技術例如將分離的核酸分子導入微生物中來修飾。例如，可用編碼目的蛋白，如需提高表達之蛋白的重組核酸分子轉染遺傳修飾的微生物。轉染的核酸分子以其表達能力得到保持的方式成為染色體外組分或者整合到轉染(重組)的宿主細胞染色體上一個或多個位點。優選，用核酸分子轉染本發明的宿主細胞後，將所述核酸分子整合到宿主細胞基因組中。整合的顯著優點是可以將核酸分子穩定地保持在細胞內。在優選的實施方案中，整合的核酸分子與可被誘導以控制所述核酸分子表達的轉錄控制序列(下文)有效相連。
通過隨機或定靶整合可將核酸分子整合到宿主細胞的基因組中。所述整合方法是本領域已知的。例如，按實施例2中的詳細描述，大腸桿菌菌株ATCC47002(表1)含有使其不能保持含ColE1複製起點之質粒的突變。當這類質粒轉移到該菌株中時，對該質粒上所含遺傳標記的選擇會使該質粒整合到染色體中。例如用含目的基因和大腸桿菌lacZ基因之5』和3』末端側翼的可選擇標記的質粒轉化該菌株。lacZ序列可將接納的DNA靶向染色體中的lacZ基因。lacZ位點的整合取代了編碼β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因，其中部分lacZ基因被目的基因隔斷。根據β-半乳糖苷酶陰性可篩選成功的整合體。也可通過轉導噬菌體的利用等方法將核酸分子導入受體細胞基因組中，以產生遺傳修飾的微生物。利用重組技術和轉導噬菌體技術以產生本發明的不同遺傳修飾的微生物是本領域已知的並在實施例節中詳細描述。根據本發明，一種基因，例如pstG基因包括與天然pstG基因有關的所有核酸序列，例如控制該基因編碼的pstG蛋白質(PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc)生產的調節區(例如但不限於轉錄、翻譯或翻譯後控制區)以及其編碼區本身。在另一實施方案中，一種基因，例如pstG基因可以是與編碼給定的pstG基因的核酸序列相似但不相同的等位基因變體(即天然等位基因變體)。具有給定的核酸序列之pstG基因的等位基因變體是在與給定核酸序列基本相同的基因組座位上出現，但由於例如突變或重組引起的天然變異而具有相似但不相同序列的基因。等位基因變體通常編碼與其對照基因編碼的蛋白質具有類似活性的蛋白質。等位基因變體還可在所述基因的5』或3』非翻譯區(例如在調節控制區)含有改變。等位基因變體是本領域技術人員熟知的並被認為會在給定的微生物例如大腸桿菌和/或兩種或多種微生物中發現。
儘管術語「核酸分子」主要指物理核酸分子，而術語「核酸序列」主要指所述核酸分子上的核苷酸序列，但這兩個術語可以互換使用，尤其關於核酸分子或核酸序列能夠編碼與氨基糖代謝途徑有關的基因時。另外，術語「重組分子」主要指與轉錄控制序列有效相連的核酸分子，但可與在宿主細胞中分離並表達的術語「核酸分子」互換使用。
知道本發明特定核酸分子，特別是大腸桿菌核酸分子的核酸序列，本領域技術人員可以例如(a)製備這些核酸分子的拷貝和/或(b)得到含至少所述核酸分子一部分(例如含全長基因，全長編碼區，調控序列，截短的編碼區的核酸分子)的核酸分子。所述核酸分子可以用各種方法得到，包括利用寡核苷酸探針篩選適宜的文庫或DNA，然後用寡核苷酸引物PCR擴增適宜的文庫或DNA的傳統克隆技術。用於篩選或從中擴增核酸分子的優選文庫包括細菌和酵母基因組DNA文庫，特別是大腸桿菌基因組DNA文庫。在例如Sambrook等，同上文中公開了克隆和擴增基因的技術。
根據本發明，分離的核酸分子是已脫離其天然環境(即經過人為操作)的核酸分子。因此，「分離的」並不反映所述核酸分子已被純化的程度。分離的核酸分子可包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。對核酸分子的最大長度沒有限制，不同於實踐限制，因為核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多個基因，或者其部分。
本發明分離的核酸分子可從其天然來源以完整(即全部)基因或其能與該基因形成穩定雜化物的部分的形式而獲得。還可用重組DNA技術(例如聚合酶鏈反應(PCR)擴增、克隆)或者化學合成方法生產分離的核酸分子。分離的核酸分子包括天然核酸分子和其同系物，所述同系物包括但不限於天然等位基因變體和修飾的核酸分子，所述修飾指核苷酸已插入、缺失、取代和/或倒置，從而為所述微生物提供所需效應。
利用本領域技術人員熟知的許多方法(參見例如Sambrook等，見上丈)均可生產核酸分子同系物。例如可用各種技術修飾核酸分子，所述技術包括但不限於經典誘變技術和重組DNA技術，例如定點誘變，對核酸分子進行化學處理以誘導突變，核酸片段的限制酶裂解，核酸片段的連接，核酸序列所選區域的PCR擴增和/或誘變，寡核苷酸混合物的合成以及混合物組的連接以「建立」核酸分子混合物及所述方法結合使用。通過篩選由所述核酸編碼之蛋白質的功能和/或與野生型基因雜交可從修飾核酸的混合物中篩選核酸分子同系物。在實施例節中詳細描述了所述技術的實例。
在本發明的一個實施方案中，本發明核酸分子的核酸同系物優選含有導致由所述核酸同系物編碼之蛋白質的作用改變的遺傳修飾。例如，在本發明的一個實施方案中，提供了一種遺傳修飾的重組核酸分子，該核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質同系物的核酸序列，其中優選與編碼沒有所述遺傳修飾的天然葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子相比，所述遺傳修飾提高了葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的作用。所述遺傳修飾通過例如編碼具有減弱的葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用和/或提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶來提高葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。帶有遺傳修飾的所述重組核酸分子在本文稱為編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的野生型核酸分子的核酸同系物。根據本發明，具有因其核酸分子之遺傳修飾所致修飾的蛋白質在本文稱為蛋白質同系物或給定蛋白質的同系物。
因此，例如具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性並可用於本發明的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質可以是全長葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，全長葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質的酶活性部分，或者所述蛋白質的任何同系物，例如含有至少一個或數個胺基酸修飾的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白，其中胺基酸殘基已被缺失(例如所述蛋白質的截短物，例如肽)、插入、倒置、取代和/或衍生(例如通過糖基化，磷酸化，乙醯化，豆蔻醯化，異戊二烯化，棕櫚酸化，醯胺化和/或糖基磷脂醯肌醇的加成)的。
本發明所述的氨基糖代謝途徑內之任何蛋白質的同系物是具有與天然蛋白質胺基酸序列(即天然、未修飾的或野生型)足夠相似之胺基酸序列的蛋白質，其核酸序列在嚴緊條件下能夠與編碼天然蛋白質的核酸分子雜交(即與編碼天然蛋白質胺基酸序列的核酸鏈互補)。本發明任何核酸序列的互補核酸序列指與所引述之序列鏈互補(即能與整個分子形成雙螺旋)的核酸鏈的核酸序列。應注意，已確定是由SEQ ID NO表示其一條鏈的本發明的雙鏈核酸分子還包括含有該SEQ ID NO之互補鏈序列的互補鏈。因此，本發明的核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的，包括在嚴緊雜交條件下與本文的某一SEQ ID NO和/或該SEQ ID NO之互補物(在本文中可標明或不標明)形成穩定雜交物的那些核酸分子。推導互補序列的方法是本領域技術人員已知的。
本發明蛋白質同系物的最小長度是足以由能夠與編碼相應天然蛋白質之核酸分子的互補序列形成穩定雜交物的核酸分子編碼的長度。另外，本發明蛋白質同系物的最小長度是足以具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用(例如催化或酶活性部分)的長度，優選可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的長度。因此，編碼所述蛋白質同系物之核酸分子的長度取決於核酸組成以及核酸分子與互補序列間的同源百分比和雜交條件本身(例如溫度，鹽濃度以及甲醯胺濃度)對核酸分子的最大長度沒有限制，不同於實踐限制，因為核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多個基因，或者其部分。同樣，本發明蛋白質同系物的最小長度為約4-約6個胺基酸，優選長度取決於是否需要所述蛋白質的全長，多價(即具有一個以上功能結構域的融合蛋白)或者功能部分。
文中所用嚴緊雜交條件指用於鑑定相似核酸分子之核酸分子的標準雜交條件。所述標準條件公開於例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A LAboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，1989。Sambrook等，出處同上，全文引入本文作為參考(具體參見9.31-9.62頁，11.7和11.45-11.61)。另外，在例如Meinkoth等，1984,分析生物化學(Anal.Biochem.)138,267-284中公開了計算適宜雜交和洗滌條件以完成允許不同程度核苷酸錯配之雜交的公式；Meinkoth等，出處同上，全文引入本文作為參考。
更具體地講，本文所稱嚴緊雜交條件指在雜交反應中可以分離與用作探針的核酸分子具有至少約70％，優選至少約75％，最佳至少約80％核酸序列同一性之核酸分子的條件。所述條件根據是否形成DNA:RNA或DNA:DNA雜交物而改變。計算的DNA:DNA雜交物的解鏈溫度比DNA:RNA雜交物的低10℃。在具體的實施方案中，DNA:DNA雜交物的嚴緊雜交條件包括0.1X SSC(0.157M Na+)的離子強度，溫度為約20℃-約35℃，更優選約28℃-約40℃，最佳約35℃-約45℃。在具體的實施方案中，DNA:RNA雜交物的嚴緊雜交條件包括0.1×SSC(0.157M Na+)的離子強度，溫度為約30℃-約45℃，更優選約38℃-約50℃，最佳約45℃-約55℃。這些值根據大於約100個核苷酸，0％甲醯胺和G+C含量約50％的分子的解鏈溫度計算。或按Sambrook等，同上文11.55-11.57頁所述憑經驗計算Tm。
與本發明氨基糖代謝途徑有關的蛋白質的同系物可以是天然等位基因變異或天然突變的結果。本發明的蛋白質同系物也可用本領域已知的技術生產，所述技術包括但不限於直接修飾蛋白質或修飾編碼該蛋白質的基因，如用經典或重組DNA技術以引起隨機或定靶誘變，如上文所討論。
在本發明的一個實施方案中，在編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的本發明重組核酸分子中的遺傳修飾產生至少一個選自下列的胺基酸修飾(即所編碼蛋白的胺基酸序列改變)葡糖胺-6-磷酸合酶的胺基酸殘基的增加、取代、缺失和/或衍生。通過與野生型或天然葡糖胺-6-磷酸合酶例如含有胺基酸序列SEQID NO:16的葡糖胺-6-磷酸合酶進行比較可確定所編碼蛋白的胺基酸序列中的修飾。與具有胺基酸序列SEQ ID NO:16的天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比，一個或多個所述胺基酸修飾導致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高。在一個實施方案中，所述胺基酸修飾位於所修飾蛋白質(即同系物)中對應於胺基酸序列SEQ ID NO:l 6的Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),Gly(472),Leu(469)的一個或多個位置上。
在另一實施方案中，所述胺基酸修飾選自下列取代(a)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(4)；(b)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(272)；(c)有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Ser(450)；(d)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫側基團的胺基酸殘基取代Arg(250)；(f)有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Gly(472)；(g)有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的組合。根據本發明，帶有脂肪族羥基的胺基酸殘基包括絲氨酸和蘇氨酸，帶有脂肪族側基團的胺基酸包括甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和脯氨酸。
在本發明的另一實施方案中，上述胺基酸修飾優選是選自下列的取代Ile(4)到Thr、Ile(272)到Thr、Ser(450)到Pro、Ala(39)到Thr、Arg(250)到Cys、Gly(472)到Ser、Leu(469)到Pro以及其組合。在實施例節中詳細描述了具有導致所述胺基酸修飾的遺傳修飾的重組核酸分子的實例。
含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶(其作用提高)的核酸序列的優選遺傳修飾之重組核酸分子包括含有編碼下述葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的重組核酸分子，所述合酶含選自下列之胺基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31。其它優選的遺傳修飾的重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:30的核酸序列。用於本發明的特別優選的遺傳修飾的重組核酸分子包括含選自下列之核酸分子的核酸分子pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本發明包括重組載體，所述載體包括至少一個本發明的分離的核酸分子，其已插入到能夠將核酸分子傳遞到細菌細胞中的任何載體中。所述載體可含有天然情況下不與待插入到載體中的核酸分子相鄰的細菌核酸分子。所述載體可以是RNA或DNA，通常是質粒。可將重組載體用於克隆、測序和/或核酸分子的其它操作。可將本文稱為重組核酸分子並在下文詳細描述的一種重組載體用於表達核酸分子。優選的重組載體能夠在轉化的細菌或酵母細胞，特別是大腸桿菌細胞中複製。
通過可將核酸分子插入到細胞中的任何方法完成核酸分子向細胞內的轉化。轉化技術包括但不限於轉染，電穿孔和顯微注射。
本發明的重組分子可以是DNA或RNA，還可含有其他調節序列，例如翻譯調節序列，複製起點和與重組細胞相容的其他調節序列。可用本發明的一個或多個重組分子生產編碼產物(即葡糖胺-6-磷酸合酶)。在一實施方案中，通過在有效生成編碼蛋白的條件下表達本發明的核酸分子來生成該蛋白質。這類條件(即培養條件)已在上丈描述並將在實施例節進一步討論。生產編碼蛋白的優選方法是用本發明的一個或多個重組分子轉染宿主細胞以形成重組細胞。
如上所討論，本發明的優選重組分子包括nglmS-282184、nglmS-281830、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-15l2184、nglmS-1511830、pKLN23-28、pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149和/或pKLN23-151。
優選用一個或多個重組分子轉化細菌細胞(即宿主細胞)來生產重組細胞，所述重組分子各含有一個或多個有效相連至表達載體(其含一個或多個轉錄控制序列)的核酸分子。術語，有效相連指核酸分子以其轉化到宿主細胞中能夠被表達的方式向表達載體的插入。本文所用表達載體是能夠轉化宿主細胞並能夠影響具體核酸分子表達的DNA或RNA載體。優選所述表達載體還能夠在所述宿主細胞內複製。在本發明中，表達載體通常是質粒。本發明的表達載體包括在酵母宿主細胞或細菌宿主細胞，優選大腸桿菌宿主細胞中可發揮功能(即指導基因表達)的任何載體。在實施例節中列出了本發明優選的重組細胞。
可將本發明的核酸分子與表達載體有效相連，所述表達載體含有調節序列例如轉錄控制序列、翻譯控制序列、複製起點和與重組細胞相容和控制本發明核酸分子表達的其他調節序列。具體地講，本發明的重組分子包括轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄的開始、延伸和終止的序列。特別重要的轉錄控制序列是控制轉錄開始的序列，例如啟動子、增強子、操縱子和阻遏子序列。適宜的轉錄控制序列包括在酵母或細菌細胞，優選大腸桿菌中發揮作用的任何轉錄控制序列。各種此類轉錄控制序列為本領域技術人員已知。
本領域技術人員應理解重組DNA技術的應用可通過操作如宿主細胞內的核酸分子拷貝數，所述核酸分子的轉錄效率，所得轉錄子的翻譯效率以及翻譯後的修飾效率而提高轉化的核酸分子的表達。用於提高本發明核酸分子表達的重組技術包括，但不限於將核酸分子與高拷貝數的質粒有效相連，將核酸分子整合到宿主細胞染色體中，將載體穩定性序列加到質粒中，取代或修飾轉錄控制信號(例如啟動子、操縱子、增強子)，取代或修飾翻譯控制序列，對本發明的核酸分子進行修飾以對應於宿主細胞的慣用密碼子，缺失使轉錄子不穩定的序列，以及利用控制信號使發酵過程中的重組細胞生長與重組酶生產在不同時間發生。通過將編碼所述蛋白質的核酸分子片段化、修飾或衍生可提高本發明表達之重組蛋白質的活性。在實施例節詳細描述了所述修飾。
提供下列實施例是為了說明而不是限制本發明的範圍。
實施例實施例1下列實施例描述了大腸桿菌突變株的產生，所述菌株中與葡糖胺降解有關的氨基糖代謝途徑被阻斷。
構建本文所述所有葡糖胺過量生產菌株的起始菌株是大腸桿菌W3110(可從美國典型培養物保藏中心以編號ATCC 25947獲得)，該菌株是原養型，大腸桿菌K-12的F-λ-衍生物(Bachmann,1987，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，細胞和分子生物學1190-1219頁；該文獻全文引入本文作為參考)。在表1中列出了下列實施例中所用和所生產的所有菌株。
表1．細菌菌株
阻斷了葡糖胺攝入和降解的宿主菌株是通過在nagE、manXYZ和ptsG基因中導入突變以阻斷葡糖胺的轉運、在與葡糖胺-6-磷酸代謝有關的nagA、-B、-C和-D基因中導入突變而構建。已在前文詳細描述了這些基因。用轉導噬菌體Plvir(如Miller,1972，分子遺傳學實驗(Experiments inMolecular Genetics)所述，冷泉港實驗室出版社，該文獻全文引入本文作為參考)將這些基因中的突變導入菌株。
在該技術中，用轉導噬菌體Plvir將來自一個菌株(供體菌)的基因或突變轉移到受體菌中。當噬菌體Plvir在供體菌中生長時，所產生的少部分噬菌體顆粒含有供體菌染色體DNA，而不含噬菌體DNA的正常互補物。用在供體菌上生長的噬菌體轉染受體菌後，含供體菌染色體DNA的噬菌體顆粒可將該DNA轉移到受體菌中。如果對供體菌的DNA存在強選擇，可選出含供體菌相應基因或突變的受體菌。
為使Plvir在供體菌中生長，用現有的噬菌體原液感染該菌株的培養物。使受體菌在37℃的LBMC培養基(10g/L細菌用胰蛋白腖，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl,1mM MgCl2,5mMCaCl2)中生長直到在600nm的吸收值為約1.0，相當於約6×108細胞/mL培養物。然後以約1個噬菌體/10個細胞的比例使稀釋的噬菌體原液感染1毫升培養物。在37℃，將混合物非振蕩培養20分鐘，然後轉移到125毫升帶擋板之錐形瓶中的10毫升預熱LBMC肉湯中。將所得培養物在37℃劇烈振蕩2-3小時。在該過程中，通常觀察到培養物變渾濁，這標明細菌生長。在該培養期結束時，培養物將變澄清，這表明由於噬菌體的生長使細胞溶解。溶解發生後，將培養物在冰上冷卻，加入數滴氯仿，短時振蕩。然後將燒瓶的內含物離心以除去細胞碎片和氯仿，所得的上清液通常含108-109噬菌體/mL。
通過用上述適宜供體菌中生長的Plvir進行轉導將突變轉移到受體菌。為了進行Plvir轉導，使受體菌培養物在37℃的LBMC肉湯中過夜生長。將0.1mL培養物與在無菌試管中的0.1mL噬菌體裂解物或者裂解物的系列稀釋物混合，然後在37℃保溫20分鐘。將0.2mL檸檬酸鈉加到試管中，將混合物鋪板於選擇性培養基上。為每次轉導如上述設置含未感染細胞和無細胞噬菌體裂解物的對照。為了生產葡糖胺降解阻斷的菌株，按下文所述篩選四環素抗性。通過鋪在含12.5μg/mL四環素和10mM檸檬酸鈉的LB培養基(10g/L細菌用胰蛋白腖，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中篩選四環素抗性突變株。
將nag基因中的突變作為缺失突變(Δnag∷TcR)同時導入。在含該突變的菌株IBPC590(Plumbridge，表1)中，已用四環素-抗性(TcR)決定簇代替nag基因。結果，將除去了nag功能之突變通過四環素抗性篩選轉移到適宜的受體宿主中。在這種情況下，由於在所需突變中含有TcR決定簇，所以Δnag與TcR突變100％連鎖。即所有接受了IBPC590之TcR決定簇的受體菌也接受了Δnag突變。這可以通過因在IBPC590上生長的Plvir轉染而產生的四環素抗性菌株的生長表型來確定。所有這類菌株均不能在以葡糖胺或N-乙醯葡糖胺為碳源的培養基上生長，這表明存在Δnag突變。
通過用菌株IBPC566和IBPC522(Plumbridge，表1)中的Plvir噬菌體進行轉導也可分別在manXYZ和ptsG基因中導入突變。這些菌株也含有與所需突變連鎖的四環素抗性決定簇(分別稱為zdj-225∷Tn10和zcf-229∷Tn10)。在這些菌株中，TcR決定簇不在該基因內，但與該基因連鎖。因此，並不是所有接受TcR決定簇的受體菌均含所需突變。連鎖程度可說明TcR決定簇與所需突變在染色體上的距離。結果，必需篩選manXYZ和ptsG的四環素抗性菌株。manXYZ菌株在甘露糖上生長緩慢，不能以葡糖胺為唯一碳源生長。ptsG菌株以葡萄糖為唯一碳源生長緩慢。
由於上述突變的所有篩選均是針對四環素抗性，因此，如果要導入多個突變，則需要在各步驟間使菌株具有四環素敏感性。為了達到該目的，將四環素抗性菌株鋪在用於篩選四環素敏感性突變株的TCS培養基(15g/L瓊脂，5g/L細菌用胰蛋白腖，5g/L酵母提取物，50mg/L鹽酸金黴素，10g/LNaCl,10g/L NaH2PO4H2O,12mg/L鐮孢菌酸和0.1mM ZnCl2)中(描述於Maloy和Nunn,1981，細菌雜誌(J.Bacteriol.),145:1110-1112，該文獻引入本文作為參考)。將該培養基上長出的菌落通過在相同培養基上再劃線來純化，然後鋪板於含有和不含12.5μg/mL四環素的LB培養基上以逐個檢查每個菌落的四環素敏感性。
圖3圖示了用於產生含manXYZ、ptsG和Δnag突變組合的菌株的上述方案。
實施例2下列實施例描述了glmS基因的克隆和過量表達以及T7-glmS基因盒向大腸桿菌染色體中的整合。
glmS基因的克隆和過量表達用從glmS基因的公開序列(Walker等，1984，生物化學雜誌(Biochem.J.),224:799-815，該文獻全文引入本文作為參考)獲得的信息，合成引物以便用聚合酶鏈反應(PCR)從W3110菌株(表1)分離的基因組DNA中擴增該基因。用於PCR擴增的引物被稱為Up1和Lo8，並具有下列序列Up1:5＇-CGGTCTCCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3＇(SEQ ID NO:1)Lo8:5＇-CTCTAGAGCGTTGATATTCAGTCAATTACAAACA-3＇(SEQ IDNO:2)Up1引物含有位於BsaI限制性核酸內切酶位點(GGTCTC,SEQ ID NO:1中的核苷酸2-7)後glmS基因的前20個核苷酸的序列。Lo8引物含位於XbaⅠ限制性核酸內切酶位點(TCTAGA,SEQ ID NO:2的核苷酸2-7)下遊的glmS基因的下遊145-171鹼基(SEQ ID NO:2的核苷酸8-34)的序列。用標準方法完成PCR擴增，以產生以BsaⅠ和XbaⅠ位點為側翼的、包含glmS基因及其下遊DNA的171個鹼基對的片段。用製造商提供的材料和說明將該DNA片段克隆到載體pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,California)中。所得質粒稱為pKLN23-20。
該克隆的結果之一是將唯一的SacⅠ限制性核酸內切酶位點放在該基因的下遊。這使得可用限制性核酸內切酶BsaⅠ和SacⅠ從pKLN23-20中切割含glmS基因的DNA片段。然後將該片段克隆在表達載體pET-24d(+)(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)的NcoⅠ和SacⅠ位點之間以產生質粒pKLN23-23。pET-24d(+)表達載體是基於T7啟動子系統(Studier和Moffatt,1986，分子生物學雜誌(J.MoL Biol.),189:113-130)。用這種方法克隆使glmS基因被置於pET-24d(+)中T7-lac啟動子之後。T7-lac啟動子由T7RNA聚合酶特異性識別並僅在含克隆的T7基因1(編碼T7 RNA聚合酶)的菌株中表達。在稱為λDE3的缺陷型λ噬菌體中含有克隆的T7聚合酶基因。其中λDE3元件被整合到染色體中的菌株含有由lacUV5啟動子驅動的T7 RNA聚合酶基因。在那些菌株中，用乳糖類似物異丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)可誘導T7RNA聚合酶基因的表達。因此，將IPTG加到所述培養基中會誘導T7 RNA聚合酶基因並表達T7或T7-lac啟動子控制的任何基因。
為了證實pKLN23-23含有由T7-lac啟動子驅動的glmS基因，將所述質粒轉移到菌株BL21(DE3)(Novagen,Inc.)(表1)中。使菌株BL21(DE3)/pKLN23-23在含50mg/L卡那黴素(該質粒編碼卡那黴素抗性)的LB培養基中生長，一式兩份。其中一份用1mMIPTG誘導；而另一份不用。當用十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳監測這兩份培養物的總蛋白質時，在來自誘導的培養物的細胞中，顯著觀察到分子量為約70000的蛋白質，這對應於glmS基因產物的預測大小，但在來自未誘導的培養物的細胞中則觀察不到。來自誘導培養物的初步酶檢測表明在誘導的培養物中，葡糖胺-6-磷酸合酶活性比用野生型菌株觀察到高數百倍。
T7-glmS基因盒整合到大腸桿菌染色體中通過多步驟的方法，將由T7-lac(T7-glmS基因盒)啟動子驅動的glmS基因轉移到大腸桿菌菌株的染色體中。首先，將該盒克隆到質粒pBRINT-Cm(Balbas等，1996,基因(Gene)96:65-69，該文獻全文引入本文作為參考)。然後通過Balbas等，1996，同上文，描述的技術，將該基因盒整合到ATCC47002(表1)的染色體中以產生菌株T-71和T-81(表1)。最後，通過下文所述的Plvir轉導將該基因盒轉移到所需的菌株中。
通過用限制性核酸內切酶BglⅡ部分消化和用限制性核酸內切酶HinDⅢ完全消化，從pKLN23-23中切割T7-glmS盒。質粒pKLN23-23在T7啟動子上遊約20個鹼基對的位置含有BglⅡ位點。glmS基因也含有兩個BglⅡ位點。運用該酶進行的部分消化是在質粒上遊T7啟動子處切割，而避開兩個內含位點所必需的。質粒pKLN23-23還在glmS基因下遊含有唯一的HinDⅢ位點。將切割出的T7-glmS盒克隆到pBRINT-Cm的唯一BamHI和HinDⅢ位點之間。這樣產生稱為pKLN23-27和pKLN23-28的質粒。質粒pKLN23-27和pKLN23-28含有T7-glmS盒，還含有氯黴素抗性決定簇，其兩側為大腸桿菌lacZ基因的5』和3』末端。
ATCC 47002(表1)含有使其不能保持帶ColE1複製起點的質粒例如pBRINT-Cm的突變。當將所述質粒轉移到該菌株中時，對該質粒上所含遺傳標記的篩選使得該質粒整合到染色體中(Balbas等，1996，同上文)。如上所述，質粒pKLN23-27和-28含有T7-glmS盒和兩側帶有大腸桿菌lacZ基因的5』和3』末端的氯黴素抗性決定簇。lacZ序列將導入的DNA靶向染色體中所含的lacZ基因。lacZ位點的整合使編碼β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因為T7-glmS-Cm盒所隔斷的部分lacZ基因所取代。結果，在lacZ的整合導致該菌株變成β-半乳糖苷酶陰性。該質粒還含有遠離5』-lacZ-T7-glmS-cm-lacZ-3』盒的氨苄青黴素抗性決定簇。在lacZ的整合和質粒的丟失導致對氨苄青黴素的敏感。
將質粒pKLN23-27和-28轉移到ATCC 47002中，然後將細胞鋪在含10μg/mL氯黴素，1mM IPTG和40μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的LB培養基中。培養基中所含的X-gal是β-半乳糖苷酶的產色底物。β-半乳糖苷酶水解X-gal產生藍色衍生物。X-gal以及誘導天然lacZ基因的IPTG的存在導致出現藍色lacZ陽性菌落和白色lacZ陰性菌落。然後篩選並純化白色(lacZ-陰性)氯黴素抗性菌落。然後通過鋪在含有和不含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中確定所述菌株對氨苄青黴素的敏感性。按Balbas等1996(同上文)所述的PCR方案進一步證實DNA整合。整合子T-71和T-81(表1)分別是因質粒pLN23-27和pKLN23-28的目的片段整合到ATCC47002的染色體中而產生的。
然後按實施例1所述，用菌株T-71和T-81的裂解物通過Plvir轉導，將T7-glmS-Cm盒轉移到W3110(DE3),7101-9(DE3),7101-17(DE3)和2123-4(DE3)菌株中。這些菌株除含有從T7-lac啟動子表達所必需的λDE3元件外，還含有Δnag、manXYZ和ptsG突變的不同組合。用Novagen,Inc.(Madison,Wisconsin)生產的λDE3溶原化試劑盒將λDE3元件導入這些菌株。在含30μg/mL氯黴素和10mM檸檬酸鈉的LB瓊脂平板上篩選轉導子。在含X-gal和IPTG的平板上確定β-半乳糖苷酶活性的喪失，按Balbas等，1996(同上文)所述的PCR方案進一步確定DNA整合。
在含有和不含有IPTG的LB培養基中生長後，測定含整合的T7-glmS盒之生產菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶活性(表2)。用下文所述的比色或分光光度檢測(Badet等，1987，生物化學(Biochemistry)26:1940-1948)檢測細胞粗提物中的葡糖胺-6-磷酸合酶。通過將洗滌過的細胞沉澱以每克細胞溼重5mL的比例懸浮在0.1M KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中，讓懸浮液以16,000psi通過French壓力機，將破碎的細胞懸浮液以35,000-40,000xg離心15-20分鐘來製備用於那些檢測的提取物。用上清液作為所述檢測的酶的來源。
為了進行比色檢測，製備含45mM KH2PO4/K2HPO4,20mM果糖-6-磷酸，15mML-葡糖胺，2.5mM EDTA,pH7.5和細胞提取物的1mL反應液。將反應液在37℃保溫20分鐘，然後通過煮沸4分鐘終止反應。通過離心除去所得沉澱，然後按基本如Zalkin(1985，酶學方法113:278-281)所述但已改進的Elson和Morgan方法(1933，生物化學雜誌27:1824-1828)檢測上清液的葡糖胺-6-磷酸，所述兩篇文獻均全文引入本文作為參考。向100微升上述上清液中加入12.5微升飽和的NaHCO3和12.5微升冷的新鮮製備的5％含水醋酸酐。在室溫保溫3分鐘後，將混合物煮沸3分鐘以蒸掉過量醋酸酐。冷卻到室溫後，加入150微升0.8M硼酸鉀，pH9.2(用KOH將pH調到9.2的0.8MH3BO3)，然後將混合物煮沸3分鐘。冷卻到室溫後，將1.25mL Ehrlich＇s試劑(在含0.125N HCl的冰醋酸中的1％對二甲氨基苯甲醛)加到各試管中。在37℃保溫30分鐘後，測量在585nm的吸收值，用標準曲線確定形成的葡糖胺-6-磷酸量。不存在底物果糖-6-磷酸時，或者當檢測中使用煮沸的提取物時，在585nm沒有觀察到顯著的吸收值。
在室溫下用含50mM KH2PO4/K2HPO4,10mM果糖-6-磷酸，6mM L-葡糖胺，10mM KCl,0.6mM乙醯吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)和50-60單位的L-穀氨酸脫氫酶(來自牛肝的Sigma TypeⅡ)的1毫升反應液進行分光光度檢測。加入提取物後，監測在365nm的吸收值跟蹤活性，並用不存在提取物時的觀察值來校正吸收值的少量增加。用APAD的摩爾消光係數9100計算活性。
表2在含整合的T7-glmS盒的生產菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性
表2表明，平均來說，含整合的T7-glmS盒的生產菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性在用IPTG誘導時比不誘導時高約3-至4倍。該活性明顯高於用其天然啟動子驅動的野生型glmS菌株的(其通常為0.05-0.1μmol/分鐘/mL提取物)。菌株2123-6明顯帶有異常整合，因為其活性比其它菌株的低，而且不受培養基中IPTG存在的影響。
實施例3下列實施例說明菌株基因型對葡糖胺積累的影響。
使按實施例2所述生產的帶有T7-glmS整合子的菌株以及不帶整合DNA的相應親本菌株在含M9A培養基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)的振蕩燒瓶中生長，所述培養基添加有20g/L葡萄糖，10mM MgSO4，1mM CaCl2和1mM IPTG。每兩天取一次樣，用實施例2中所述的改進的Elson-Morgan試驗測量培養上清液中的葡糖胺濃度。樣品用醋酸酐處理和不處理，用標準曲線從淨吸收值確定存在的葡糖胺量。
表3列出了培養24小時後，濃度達峰值時葡糖胺的濃度。表3的結果表明，既然有顯著的葡糖胺生產，則一定存在T7-glmS基因盒。數據還表明宿主中Δnag突變的存在導致與其不存在相比，葡糖胺積累有顯著的增加。在該試驗中，幾乎觀察不到manXYZ突變的影響。但在進一步的振蕩燒瓶試驗中，菌株2123-12積累的葡糖胺濃度稍高於一貫的基礎。
表3生產菌株培養上清液中的葡糖胺
實施例4下列實施例說明向培養基中補充營養對葡糖胺的積累的影響。
在早期試驗中，觀察到當培養基中的葡萄糖耗盡時，葡糖胺積累停止。在表4和圖4總結的試驗中，發現當葡萄糖和硫酸銨快耗盡時補充它們可以提高葡糖胺積累。為了進行該試驗，使2123-12菌株在添加了10mM MgSO4,1mM CaCl2和1mM IPTG的M9A培養基中生長。按表4所示改變起始葡萄糖濃度和補料方案。在一個燒瓶中，起始硫酸銨的濃度為10g/L，而不是M9A培養基中所用的正常濃度5g/L。在培養過程中，用Diastix葡萄糖檢測條(Bayer Corporation Diagnostics Division,Elkhart,Indiana)監測燒瓶中葡萄糖濃度。當葡萄糖濃度耗盡或接近耗盡(剩餘＜5g/L)時，按表4的說明補充葡萄糖和/或硫酸銨。培養過程中還要監測pH。當pH相對於起始pH7.0顯著改變時，用氫氧化鈉將其調整到7.0。
表4檢測葡萄糖補料之影響的振蕩燒瓶試驗
如圖4所表明的，增加葡萄糖的供應對葡糖胺積累有積極作用。通過定期補充葡萄糖和硫酸銨(分別加入20g/L和5g/L)，觀察到最大葡糖胺積累0.4g/L，比沒有補充時高約4倍。
實施例5下列實施例描述突變的glmS基因的分離，所述基因編碼葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用減弱的葡糖胺-6-磷酸合酶基因。
White(1968，生物化學雜誌(Biochem.J.)106:847-858)首先證實葡糖胺-6-磷酸合酶受葡糖胺-6-磷酸抑制。用實施例2所述的用於葡糖胺-6-磷酸合酶的分光光度檢測，測定葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺對葡糖胺-6-磷酸合酶的影響。為了確定產物抑制作用，在存在不同濃度加入的葡糖胺-6-磷酸的條件下進行檢測。
如圖5所示，葡糖胺-6-磷酸明顯抑制該酶，而葡糖胺稍微抑制該酶。這些結果與White,1968(同上文)得到的相似。該抑制作用是葡糖胺生產菌株中限制葡糖胺積累的關鍵因素。
為了進一步提高生產菌株中的葡糖胺合成，作出了很大努力以分離編碼具有降低的產物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶變體的glmS基因。為了達到該目的，用易錯PCR技術擴增克隆的基因。用該方法，通過用於擴增的DNA聚合酶，在導致高頻錯配的條件下擴增所述基因。結果，在PCR產物中得到高頻突變。
質粒pKLN23-28在T7啟動子上遊25個鹼基對處和glmS基起點上遊111個鹼基對處含有一個唯一的SpeⅠ限制性核酸內切酶位點。該質粒還在glmS基因下遊177個鹼基對處含有一唯一的HinDⅢ位點。合成下列序列的PCR引物，所述引物分別對應SpeⅠ緊鄰上遊區和HinDⅢ緊鄰下遊區5＇-ATGGATGAGCAGACGATGGT-3＇(SEQ ID NO:3)5＇-CCTCGAGGTCGACGGTATC-3＇(SEQ ID NO:4)用這些引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)擴增可以誘變含完整glmS基因的2247個鹼基對區。PCR條件述於Moore和Amold,1996，天然生物技術(Nature Biotechnology)14:458-467，該文獻全文引入本文作為參考。簡而言之，製備100微升溶液，所述溶液含有四種脫氧核苷三磷酸各1mM,16.6mM硫酸銨，67mM Tris-HCl,pH8.8,6.1mM MgCl2,6.7μM EDTA,10mM β-巰基乙醇，10μLDMSO，引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)各30ng,7或35ng用KpnⅠ線性化的質粒pKLN23-28和2.5單位的Taq DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus,Emeryville,California)。用70μL礦物油覆蓋反應混合物，然後放在熱循環儀中，將下列步驟重複25個循環94℃1分鐘42℃1分鐘72℃2分鐘據報導在這些條件下，錯誤頻率為每1000個鹼基對約1個突變(Moore和Arno1d,1996，同上文)。回收反應產物，純化，然後用SpeⅠ和HinDⅢ消化，克隆到pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ骨架片段中，所述反應產物有效取代了pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ片段上的野生型glmS基因。用克隆的DNA轉化菌株NovaBlue(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)，然後將轉化的細胞鋪在含氨苄青黴素的LB瓊脂上。從氨苄青黴素平板上收集9000個含質粒的菌落，然後從收集的細胞中製備質粒DNA以得到pKLN23-28衍生的質粒文庫，其在克隆的glmS基因中含有突變。
在Δnag manXYZ DE3宿主背景中篩選通過易錯PCR產生的突變質粒提高葡糖胺生產的能力。該篩選是一種生物檢測，其中評估含質粒的菌株互養需葡糖胺之大腸桿菌的能力。
葡糖胺-6-磷酸合酶缺陷型的大腸桿菌(Sarvas,1971，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)105:467-471；Wu和Wu,1971，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)105:455-466)和枯草芽孢桿菌(Freese等，1970，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)101:1046-1062)生長時需要葡糖胺或N-乙醯葡糖胺。需要葡糖胺的大腸桿菌菌株用N-甲基-N＇-硝基-N-亞硝基胍(NG)誘變後進行分離。菌株LE392(表1)在LB培養基中生長至6×108個細胞/mL的密度。將溶解於甲醇的2.5mg/mL的NG50微升加到2mL該培養物中，然後將混合物在37℃培養20分鐘。該處理導致約10％的菌株存活。離心收集誘變的細胞，通過在0.9％NaCl中懸浮將細胞洗滌兩次，然後再離心。將洗滌過的細胞稀釋，然後以每平板50-200菌落形成單位的密度鋪到含0.2g/L N-乙醯葡糖胺的營養瓊脂培養基(NA；5g/L細菌用蛋白腖，3g/L牛肉提取物，15g/L瓊脂)。約鋪13000個菌落。將這些菌落複製鋪板到含和不含0.2g/LN-乙醯葡糖胺的NA瓊脂上。在含0.2g/LN-乙醯葡糖胺的NA瓊脂上生長了24個菌落，但在不含0.2g/L N-乙醯葡糖胺的NA瓊脂上沒有。這些菌落通過劃線到含0.2g/LN-乙醯葡糖胺的NA瓊脂上純化，然後再檢查其生長表型。在選出的最初22個菌落中，5個有預期的LE392之glmS突變株表型。它們不能在NA上生長，但可以在添加了0.2g/L葡糖胺或0.2g/LN-乙醯葡糖胺的NA上生長。它們也不能在葡萄糖基本瓊脂上生長，但能在添加了0.2g/LN-乙醯葡糖胺的葡萄糖基本瓊脂上生長。將這些突變株之一命名為2123-16(表1)。
在互養實驗中，用2123-16菌株的培養細胞覆蓋含甘油或果糖作為主要生長碳源的瓊脂平板，按上述分離需要葡糖胺的菌株。將生成葡糖胺的菌株穿刺接種到瓊脂中，根據穿刺點周圍指示菌株所形成暈的大小評估生成葡糖胺的能力。圍有較大暈的穿刺點被認為產生較大量的葡糖胺。
用於互養實驗的培養基由添加40mg/LL-甲硫氨酸(菌株LE392或菌株2123-16生長所必需)和2g/L甘油或果糖的M9基本培養基(6g/LNa2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/LNaCl,1g/L NH4Cl,1mM MgSO4,0.1mM CaCl2)組成。按下述用菌株2123-16覆蓋這些平板。在含1g/L N-乙醯葡糖胺的LB培養基中，在37℃使2123-16的培養物過夜生長。離心收集培養物，通過在0.9％NaCl中懸浮將細胞洗滌兩次，然後再離心。將洗滌過的細胞懸浮在原體積的0.9％NaCl中。對於待覆蓋的各平板，將0.1mL洗滌的細胞懸浮液與3mL溶化後的(50℃)F-頂層瓊脂(8g/L NaCl,8g/L瓊脂)混合，然後注到平板中。
將pKLN23-28突變質粒的文庫轉移到菌株7101-17(DE3)中，然後將轉化的細胞鋪到含100μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂上。在這些平板上生長的每個菌落都含有一種突變質粒文庫。將菌落從LB+氨苄青黴素平板中撿出，然後依次穿刺接種到(1)LB瓊脂+氨苄青黴素(2)用2123-16菌株覆蓋的甘油基本瓊脂；和(3)用2123-16覆蓋的果糖基本瓊脂中篩選菌落。
將所有平板在37℃保溫約24小時。保溫後，可在雙層平板中穿刺點周圍觀察到2123-16指示菌株的生長暈。從相應的LB+氨苄青黴素平板中撿出產生較大暈的那些菌落，然後劃線純化。在最初篩選中，篩選了4368個候選突變株，鑑定出96個最初候選菌株。再篩選後，30似乎優於其它的，即產生大於指示菌株的暈。
對6株如上分離的含質粒菌株進行酶試驗表明，其中3株對葡糖胺-6-磷酸之抑制作用的敏感性低於對照菌株7101-17(DE3)/pKLN23-28的酶。使菌株在含100μg/mL氨苄青黴素和1mM IPTG的LB肉湯中生長過夜。從那些培養物收集的細胞製備提取物，在添加和添加葡糖胺-6-磷酸的條件下，用分光光度檢測法(實施例2所述)檢測這些提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。突變克隆子11C、65A和8A對葡糖胺-6-磷酸的敏感性顯著低於對照菌株(圖6)。在該檢測法中其它突變株與對照無法區別。
實施例6下列實施例描述了構建並鑑定在glmS基因中帶有導致產物抑制作用降低之突變的葡糖胺生產菌株。
將從上述克隆11C,52B和8A分離的質粒DNA轉移到ATCC 47002中，其曾用於將克隆的T7-glmS構建體整合到大腸桿菌染色體中。用實施例2所述的方法很容易完成整合，將整合的DNA按實施例1所述通過P1轉導轉移到7101-17(DE3)中。這些方法產生與菌株2123-12有相同基因型，但在通過PCR產生的glmS基因中存在突變的菌株。將這些新突變的生產菌株分別稱為2123-49、2323-51和2123-54。圖7簡述了菌株構建的策略。
使菌株2123-12,2123-49,2123-51和2123-54在含1mM IPTG的LB肉湯中生長過夜。從那些培養物收集細胞製備提取物，在添加和不添加葡糖胺-6-磷酸的條件下，用分光光度檢測法(實施例2所述)檢測所述提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。這些檢測的結果列於圖8。
這些突變株中的葡糖胺生產比菌株2123-12中的顯著提高。用前文實施例4所述葡萄糖和硫酸銨補料的方法在振蕩燒瓶獲得的培養物進行葡糖胺生產的分析時，當培養物的細胞密度(測O.D.600)達到約14(約8.4g/L細胞乾重)時，菌株2123-49,2123-51和2123-54分別產生1.5,2.4和5.8g/L葡糖胺(圖9)，而菌株2123-12產生0.3g/L葡糖胺。
實施例7下列實施例描述了在glmS中帶有導致產物抑制作用降低之突變的另一菌株的產生。
同樣實施例5所述，用互養試驗篩選含有通過實施例5所述易錯PCR產生的突變質粒的另外6344個菌落。54個菌落產生比其餘菌落大的暈。分離所有54個菌落的DNA，按實施例6所述構建與菌株2123-12有相同基因型但glmS中的突變不同的菌株。
這些突變株中大部分的葡糖胺生產顯著高於2123-12菌株。在新分離的突變株中，產生最多葡糖胺的菌株是被稱為2123-124的菌株。當用實施例4所述的葡萄糖和硫酸銨補料方法在振蕩燒瓶中檢測生產情況時，該菌株產生3.6g/L葡糖胺，而在平行試驗中，2123-54菌株產生4.3g/L葡糖胺。
實施例8下列實施例描述了對質粒pKLN23-28中的克隆的野生型glmS基因的測序。另外，還測序並描述了在質粒pKLN2349,pKLN23-54和pKLN23-124中的序列，這些質粒含有分別用於構建菌株2123-49,2123-54和2123-124的突變glmS基因。
用AmpliTaq DNA聚合酶和Applied Biosystems(ABI)Prism DyeTerminator Cycle測序方法完成DNA測序反應。在ABIDNA測序儀373A或377上通過凝膠電泳分離所得產物。用來自ABI的ABI Sequencing Analysis3.0軟體和來自Gene Codes的Sequencher 3.1分析序列。
用於測序的引物如下PK-1:5＇-TGGATGAGCAGACGATGG-3＇(SEQ ID NO:5)PK-2:5＇-TCCGTCACAGGTATTTATTC-3＇(SEQID NO:6)PK-3:5＇-AGCTGCGTGGTGCGTAC-3＇(SEQ ID NO:7)PK-4:5＇-GGACCGTGTTTCAGTTCG-3＇(SEQID NO:8)PK-5A:5＇-GCCGTGGCGATCAGTAC-3＇(SEQ ID NO:9)PK-6A:5＇-GCCAATCACCAGCGGAC-3＇(SEQ ID NO:10)PK-7:5＇-ATGGTTTCCCGCTACTGG-3＇(SEQ ID NO:11)PK-8:5＇-GAACCAAGGTAACCCAGC-3＇(SEQ ID NO:12)確定含野生型glmS基因的質粒pKLN23-28的核苷酸序列是本文SEQID NO:13表示的7408bp核酸序列。用上述引物確定SEQ ID NO:13之位置1130與3313之間的2184個鹼基對。本文將代表SEQ ID NO:13之位置1130-3313的核酸分子稱為nglmS-282184，並進一步鑑定為SEQ ID NO:14。nglmS-282184表明包含用於按實施例5所述構建突變體質粒的SpeⅠ和HinDⅢ位點。SEQ ID NO:13的剩餘DNA序列是基於用於構建pKLN23-28之載體的已知序列。測定質粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124中相同的2184個鹼基對區。應注意，為了討論這些質粒的突變glmS基因(表5)，用SEQ ID NO:13作為參考描述含突變glmS的質粒的核苷酸序列中突變的具體核苷酸位置。
SEQ ID NOs:13和14含有編碼glmS基因產物(即Glc6P合酶)的開放閱讀框架，其是本文稱為nglmS-281830的核酸分子，其核酸序列由SEQ ID NO:15表示。SEQ ID NO:15跨SEQ ID NO:13的核苷酸1253-3082，並包括跨苷酸1253-1255的起始密碼子和跨核苷酸3080-3082的終止密碼子。SEQ IDNO:15編碼本文稱為GlcN6P-S-28的609個胺基酸的蛋白質，其推導的胺基酸序列由SEQ ID NO:16表示。應注意為了討論本文所述突變菌株產生的突變glmS基因產物，用SEQ ID NO:16作為參考描述在突變glmS基因產物之胺基酸序列中的具體突變。
上述引物對應於SEQ ID NO:13的下列核苷酸位置PK-1(SEQ ID NO:5):SEQ ID NO:13的位置1087-1104；PK-2(SEQ ID NO:6):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置3378-3359；PK-3(SEQ ID NO:7):SEQ ID NO:13的位置1707-1723；PK-4(SEQ ID NO:8):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置2772-2755；PK-5A(SEQ ID NO:9):SEQ ID NO:13的位置2667-2683；PK-6A(SEQ ID NO:10):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置1798-1782；PK-7(SEQ ID NO:11):SEQ ID NO:13的位置2177-2194；PK-8(SEQ ID NO:12):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置2364-2347。
來自pKLN23-28的核酸分子nglmS-281830(SEQ ID NO:15，或者SEQ IDNO:13的位置1253-3082)的核酸序列在位置2509和2510(參照SEQ IDNO:13)不同於公開的序列(Walker,J.E.，等，1984，大腸桿菌unc操縱子鄰近的DNA序列，生物化學雜誌(Biochem.J.)224:799-815)。在本實施例中pKLN23-28在這些位置上的核苷酸分別是G和C，而在公開的序列中報導是C和G。除此之外，glmS基因的公開序列和測定序列是相同的。經測定glmS基因上遊和下遊序列是根據用於構建pKLN23-28的載體的已知序列和用於構建該質粒的方法預測的那些。
按照上述用於pKLN23-28的所述方法，確定質粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124的突變glmS基因的核苷酸序列。在每個質粒中均發現了突變。在表5中總結了與在pKLN23-28上測定的野生型序列(SEQID NO:13)相比，在相應突變glmS基因產物中的突變和預測的胺基酸改變。
表5在葡糖胺過量生產菌株的glmS基因中的突變
*參照在pKLN23-28序列(SEQ ID NO:13)中表示的核酸位置**glmS基因(nglmS-281830；SEQ ID NO:15)編碼長度為609個胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO:16)；由水解酶除去在位置1的甲硫氨酸殘基。
pKLN23-49含有本文稱為nglmS-492184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-492184的核酸序列由本文SEQ IDNO:17表示。本文稱為nglmS-491830的跨SEQ ID NO:17中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:17的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:17的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-491830的核酸序列是SEQ ID NO:18。SEQID NO:18編碼本文稱為GlcN6P-S-49的609個胺基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，在本文其推導的胺基酸序列是SEQ ID NO:19。SEQ ID NO:17含有與SEQ ID NO:13中1130-3313位(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5對質粒pKLN23-49所標明的突變。SEQ ID NO:18含有與SEQ ID NO:13中1253-3082位(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5所標明的有關質粒pKLN23-49的突變。
質粒pKLN23-54含有本文稱為nglmS-542184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-542184的核酸序列由本文SEQ IDNO:20表示。本文稱為nglmS-541830的跨SEQ ID NO:20中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:20的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ IDNO:20的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-541830的核酸序列是SEQ IDNO:21。SEQID NO:21編碼本文稱為GlcN6P-S-54的609個胺基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，在本文其推導的胺基酸序列是SEQ ID NO:22。SEQ ID NO:20含有與SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5所標明的有關質粒pKLN23-54的突變。SEQ ID NO:21含有與SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5所標明的有關質粒pKLN23-54的突變。
質粒pKLN23-124含有本文稱為nglmS-1242184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-1242184的核酸序列由本文SEQID NO:23表示。本丈稱為nglmS-1241830的跨SEQ ID NO:23中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:23的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ IDNO:23的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1241830的核酸序列是SEQ IDNO:24。SEQ ID NO:24編碼本文稱為G1cN6P-S-124的609個胺基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，在本文其推導的胺基酸序列是SEQ ID NO:25。SEQ ID NO:23含有與SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5所標明的有關質粒pKLN23-124的突變。SEQ ID NO:24含有與SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ IDNO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在於如表5所標明的有關質粒pKLN23-124的突變。
為了證實在染色體中已整合了突變的glmS基因的菌株中存在相同的突變，從菌株2123-49、2123-54和2123-124分離的基因組DNA產生PCR產物。為了進行PCR擴增，使用實施例3中所列的用於誘變基因的引物(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)。在含20mM TrisHCl(pH8.8),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,20mMgSO4,0.1％Triton X-100,0.1mg/mL無核酸酶牛血清白蛋白，脫氧核苷三磷酸各0.05mM，每種引物各2μM，克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)1.25U和160ng基因組DNA的反應液50微升中完成PCR反應。將整個反應體系放在RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler(Stratagene)上。在94℃3分鐘後，將下列三個步驟重複30個循環(1)94℃,30秒；(2)47℃,30秒和(3)72℃,2分鐘。此後在72℃保溫7分鐘。
所得的DNA除無關產物外還含有預期的擴增產物。用QIAquickPCR純化試劑盒純化含glmS基因的產物，然後在瓊脂糖凝膠上對純化的產物實施電泳，用QIAquick凝膠提取試劑盒分離正確的帶，用該分離的DNA作為模板再進行擴增。按照與上述初步擴增相同的方案擴增含該分離DNA的反應液，不同的是用40ng DNA作為模板，並且僅實施20個循環的擴增。按上述回收這第二次擴增的產物。
用引物檢驗基因組DNA中突變的存在，所述引物特異於含有質粒中所鑑定的突變的DNA區。對於2123-49，這些包括引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7),PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5A(SEQ ID NO:9)。對於2123-124，使用引物PK-1(SEQ ID NO:5)；PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5(SEQ IDNO:9)。對於2123-54，用前述所有8個引物(SEQ ID NOs:5-12)測定完整PCR產物的序列。對PCR產物的測序證實從質粒中鑑定並列於表5的突變的存在。
實施例9本實施例描述從菌株2123-54構建含突變glmS基因的菌株，所述突變glmS基因編碼的產物僅在位置472(SEQ ID NO:22)含有甘氨酸取代絲氨酸的改變。
如表5中所列，在菌株2123-124的GlcN6P合酶(GlcN6P-S-124)中，唯一的胺基酸改變是在位置469(SEQ ID NO:25)的脯氨酸變成亮氨酸，清楚地限定該突變引起菌株2123-124過量生產葡糖胺。這提示在菌株2123-54中GlcN6P-S-54的位置472上，絲氨酸變為甘氨酸(gly取代Ser472；SEQ IDNO:22)的可能性同樣是導致該菌株過量生產葡糖胺的原因。在嘗試說明這一點的過程中，用EcoRⅠ和HinDⅢ消化質粒pKLN23-54，將所述改變與2123-54菌株中GlcN6P-S-54胺基酸序列(SEQ ID NO:22)中的其它兩個胺基酸改變(即Ala取代Thr39和Arg取代Cys250)分開。這些酶在質粒上各有其唯一的裂解位點，分別在位置2241和3305(相對於pKLN23-28之SEQ ID NO:13的等價位置)切割，產生1064個鹼基對和6344個鹼基對的片段。該較小片段所含突變中唯一的胺基酸改變是pKLN23-54中472位ser變為gly。將該較小的片段與pKLN23-28中含野生型glmS基因的相應較大片段相連。
從該連接產生的兩個質粒稱為pKLN23-149和pKLN23-151。用引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7)和PK-4(SEQ ID NO:8)測定來自這些質粒的DNA序列證實，這些質粒在質粒pKLN23-54的位置2666含有突變，但在位置1367和2000沒有突變(表5，參照SEQ ID NO:13)。
本文將質粒pKLN23-149之位置1130-3313間的2184個鹼基對的核酸序列(這些位置經測定對應於SEQ ID NO:13的等價位置)稱為nglmS-1492184，其核酸序列由SEQ ID NO:26代表。SEQ ID NO:26含有本文稱為nglmS-1491830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，該核酸序列代表編碼本發明突變葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:26的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:26的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1491830的核酸序列是SEQ ID NO:27。SEQ ID NO:27編碼本文稱為GlcN6P-S-149的609個胺基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，在本文其推導的胺基酸序列是SEQ ID NO:28。
本文將質粒pKLN23-151之位置1130-3313間的2184個鹼基對的核酸序列(這些位置經測定對應於SEQ ID NO:13的等價位置)稱為nglmS-1512184，其核酸序列由SEQ ID NO:29代表。SEQ ID NO:29含有本文稱為nglmS-1511830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，該核酸序列代表編碼本發明突變葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:29的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:29的核苷酸1951-1953。在本文ng1mS-1511830的核酸序列是SEQ ID NO:30。SEQ ID NO:30編碼本文稱為GlcN6P-S-151的609個胺基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質，在本文其推導的胺基酸序列是SEQ ID NO:31。
用圖7所示的方案構建與菌株2123-12基因型相同，但含有使gly取代ser472之突變的菌株。分別從質粒pKLN23-149和pKLN23-151產生菌株2123-149和2123-151。用實施例8所述的方法，對這些菌株之基因組DNA的PCR產物測序證實，在位置2666(SEQ ID NO:13)存在突變，而在位置1367和2000沒有突變。
實施例10
本實施例比較來自2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151菌株的GlcN6P合酶的特性。
使在上述實施例中所述的菌株2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151在37℃LB肉湯中生長過夜，然後轉移到新鮮LB肉湯中。培養物生長到在600nm的吸收值為0.8-0.9，然後通過加入1mMIPTG誘導GlcN6P合酶生產。在37℃，使培養物再生長3小時，然後收集。按實施例2所述，從那些培養物中收集的細胞製備提取物，然後按實施例2所述，用分光光度檢測法檢測葡糖胺-6-磷酸合酶，不同的是果糖-6-磷酸濃度為20mM。存在和不存在加入的葡糖胺-6-磷酸的條件下檢測該酶。不存在葡糖胺-6-磷酸的條件下，這些酶的比活性相似，只有菌株2123-124不同。表6的數據提示後者編碼該酶的較低活性的變體。
表6來自葡糖胺生產菌株的GlcN6P合酶的比活性
圖10表明菌株2123-49,2123-54和2123-124的GlcN6P合酶與菌株2123-12的酶相比明顯不太受GlcN6P的抑制。相比，菌株2123-149和2123-151的酶受GlcN6P抑制的程度比菌株2123-12的酶稍微。
這些酶的熱穩定性也用這些提取物進行了檢測。將提取物在45℃(圖11A)或50℃(圖11B)保溫不同的時間，然後用分光光度檢測法檢測。圖11A和11B顯示菌株2123-49和菌株2123-54的酶的穩定性遠不及菌株2123-12的酶的。菌株2123-124的酶的穩定性與野生型酶的相當，而菌株2123-149和菌株2123-151的酶在所述保溫條件下穩定性略遜。
實施例11
下列實施例說明異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)濃度和溫度對葡糖胺生產的影響。
在37℃，在添加了20g/L葡萄糖，1mM MgSO4,0.1mM CaCl2和各種量的IPTG的M9A培養基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)上使菌株2123-54和2123-124的培養物生長20小時。在生長期結束時，取樣品，用實施例2所述的Elson-Morgan檢測法檢測培養上清液中的葡糖胺濃度。圖12所示的結果表明用於生產的最佳IPTG濃度為約0.2mM。
隨後，在含0.2或1mM IPTG的振蕩燒瓶中，在30或37℃，在與上述相同的培養基中使菌株2123-54生長。按實施例4所述向這些燒瓶培養物中添加葡萄糖和硫酸銨。間隔不同時間取樣，用實施例2所述的Elson-Morgan檢測法檢測培養上清液中的葡糖胺濃度。圖13表明在該試驗條件下，不同濃度的IPTG下葡糖胺的生產幾乎沒有差別。但是，在30℃生長時比在37℃生長有更高的葡糖胺生產。圖14A和14B的結果進一步說明，在30℃(圖14A)，生長停止後葡糖胺生產繼續，而在37℃(圖14B)，生長和葡糖胺生產同時停止。
在30℃含0.2mM IPTG的條件下使菌株2123-49和2123-124生長時，生長停止後，葡糖胺生產還在繼續，如圖15A(2123-49)和15B(2123-124)所示。如在37℃觀察的，用菌株2123-54得到最高濃度的葡糖胺，其次是2123-124再次是2123-49。還檢測了菌株2123-149和2123-151，它們並不比2123-12產生更高濃度的葡糖胺(表7)。
表730℃時的葡糖胺生產
實施例12下列實施例說明菌株2123-54的發酵罐培養比振蕩燒瓶培養產生更高濃度的葡糖胺。本實施例還說明在發酵罐中，菌株2123-54在30℃比在37℃產生更多葡糖胺。
菌株2123-54的發酵培養物在表8所示的培養基中培養。發酵時用NaOH將pH控制在pH6.7，用33％葡萄糖，8％硫酸銨的混合物補料。調整通氣和攪拌以使溶解氧的濃度大於20％空氣飽和度。
表8發酵培養基
*痕量金屬組分是0.7mg/L CoCl2,1.7mg/L H3BO3,0.6mg/LCuCl2·2H2O,10.5mg/L FeCl3·6H2O,12mg/L MnCl2·4H2O,1.5mg/LNa2MO4·2H2O,1.5mg/L ZnCl2。
在下列試驗中，在含一升容器中以600mL培養基開始進行三個發酵。變量檢測如下。
發酵罐#1補充33％葡萄糖和8％硫酸銨的混合物，其速度將保證發酵罐中沒有葡萄糖的積累。培養溫度為37℃。
發酵罐#2基本同發酵#1，但培養溫度為30℃。
發酵罐#3基本同發酵#2，但提高了補料速率以使發酵罐中的葡萄糖濃度穩定在5-10g/L。
在圖16A,16B和16C中列出了這些發酵的結果。比較發酵罐1(圖16A)和2(圖16B)的結果發現正如在振蕩燒瓶中所觀察到的，在30℃的葡糖胺滴度明顯高於在37℃的。觀察到的最大葡糖胺濃度是在30℃葡萄糖過量的發酵罐3中(圖16C)，為10.9g/L。在30℃，生長與葡糖胺濃度變化平行，似乎在葡萄糖過量條件下生長稍微有利。在隨後的發酵試驗中，在與發酵罐#3相似的條件下發酵，得到超過12g/L的葡糖胺濃度(數據未列出)。
總之，本發明人在本文描述了利用代謝工程產生第一個大腸桿菌的葡糖胺過量生產菌株。本文所證明的概念總體上適用於具有氨基糖生產途徑的任何微生物或者已導入氨基糖生產途徑的任何重組微生物。除本發明用於產生葡糖胺-生產菌的方法外(即減少葡糖胺降解和攝入並提高glmS基因的表達)，本發明還確立了減弱葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-產物抑制作用可提高葡糖胺生產。
儘管已詳細描述了本發明的各種實施方案，但是顯然本領域技術人員可以對那些實施方案進行修飾和改變。但是，應清楚地理解所述修飾和改變在本發明下列權利要求的範圍內。
序列表110Berry.AlanBurlingame.Richard P.Millis,James R.120生產葡糖胺的方法和材料1303161-18-C1-PCT140PCT/US99/159761411999-07-15150PCT/US98/00801511998-01-1415060/035,4941511997-01-1416031170PatentIn Ver.2.0210121129212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4001cggtctccca tgtgtggaat tgtt ggcgc 29210221134212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4002ctctagagcg ttgatattca gtcaattaca aaca 34210321120212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4003atggatgagc agacgatggt 20210421119212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4004cctcgaggtc gacggtatc 19210521118212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4005tggatgagca gacgatgg18210621120212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4006tccgtcacag gtatttattc 20210721117212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4007agctgcgtgg tgcgtac 17210821118212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4008ggaccgtgtt tcagttcg18210921117212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4009gccgtggcga tcagtac 172101021117212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40010gccaatcacc agcggac 172101121118212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40011atggtttccc gctactgg182101221118212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40012gaaccaaggt aacccagc18210132117408212DNA213大腸桿菌220221RBS222(1240)..(1245)220221啟動子222(1165)..(1181)220221衝突222(2509)..(2510)40013gaattgatcc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 60atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 120atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg 180caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg 240tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtaacct 300atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc 360tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg 420gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac ggccaggaca 480gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg 540cggtgatggt gctgcgttgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat atgtggcgga 600tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa atcagcgatt 660tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag gctgaagttc 720agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg cagggtgaaa 780cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag cgtggtggtt 840atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg agcgccgaaa 900tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg ctgattgaag 960cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg ctgctgctga 1020acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc 1080aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atctccaccg cggtggcggc cgctctagaa 1140ctagtggatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 1200aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgtgtgg 1260aattgttggc gcgatcgcgc aacgtgatgt agcagaaatc cttcttgaag gtttacgtcg 1320tctggaatac cgcggatatg actctgccgg tctggccgtt gttgatgcag aaggtcatat 1380gacccgcctg cgtcgcctcg gtaaagtcca gatgctggca caggcagcgg aagaacatcc 1440tctgcatggc ggcactggta ttgctcacac tcgctgggcg acccacggtg aaccttcaga 1500agtgaatgcg catccgcatg tttctgaaca cattgtggtg gtgcataacg gcatcatcga 1560aaaccatgaa ccgctgcgtg aagagctaaa agcgcgtggc tataccttcg tttctgaaac 1620cgacaccgaa gtgattgccc atctggtgaa ctgggagctg aaacaaggcg ggactctgcg 1680tgaggccgtt ctgcgtgcta tcccgcagct gcgtggtgcg tacggtacag tgatcatgga 1740ctcccgtcac ccggataccc tgctggcggc acgttctggt agtccgctgg tgattggcct 1800ggggatgggc gaaaacttta tcgcttctga ccagctggcg ctgttgccgg tgacccgtcg 1860ctttatcttc cttgaagagg gcgatattgc ggaaatcact cgccgttcgg taaacatctt 1920cgataaaact ggcgcggaag taaaacgtca ggatatcgaa tccaatctgc aatatgacgc 1980gggcgataaa ggcatttacc gtcactacat gcagaaagag atctacgaac agccgaacgc 2040gatcaaaaac acccttaccg gacgcatcag ccacggtcag gttgatttaa gcgagctggg 2100accgaacgcc gacgaactgc tgtcgaaggt tgagcatatt cagatcctcg cctgtggtac 2160ttcttataac tccggtatgg tttcccgcta ctggtttgaa tcgctagcag gtattccgtg 2220cgacgtcgaa atcgcctctg aattccgcta tcgcaaatct gccgtgcgtc gtaacagcct 2280gatgatcacc ttgtcacagt ctggcgaaac cgcggatacc ctggctggcc tgcgtctgtc 2340gaaagagctg ggttaccttg gttcactggc aatctgtaac gttccgggtt cttctctggt 2400gcgcgaatcc gatctggcgc taatgaccaa cgcgggtaca gaaatcggcg tggcatccac 2460taaagcattc accactcagt taactgtgct gttgatgctg gtggcgaagc tgtctcgcct 2520gaaaggtctg gatgcctcca ttgaacatga catcgtgcat ggtctgcagg cgctgccgag 2580ccgtattgag cagatgctgt ctcaggacaa acgcattgaa gcgctggcag aagatttctc 2640tgacaaacat cacgcgctgt tcctgggccg tggcgatcag tacccaatcg cgctggaagg 2700cgcattgaag ttgaaagaga tctcttacat tcacgctgaa gcctacgctg ctggcgaact 2760gaaacacggt ccgctggcgc taattgatgc cgatatgccg gttattgttg ttgcaccgaa 2820caacgaattg ctggaaaaac tgaaatccaa cattgaagaa gttcgcgcgc gtggcggtca 2880gttgtatgtc ttcgccgatc aggatgcggg ttttgtaagt agcgataaca tgcacatcat 2940cgagatgccg catgtggaag aggtgattgc accgatcttc tacaccgttc cgctgcagct 3000gctggcttac catgtcgcgc tgatcaaagg caccgacgtt gaccagccgc gtaacctggc 3060aaaatcggtt acggttgagt aataaatgga tgccctgcgt aagcggggca tttttcttcc 3120tgttatgttt ttaatcaaac atcctgccaa ctccatgtga caaaccgtca tcttcggcta 3180ctttttctct gtcacagaat gaaaattttt ctgtcatctc ttcgttatta atgtttgtaa 3240ttgactgaat atcaacgctc tagaggggct agagcggccg ccaccgcggt ggagctccgt 3300cgacaagctt atcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccgagg acgcgttcga 3360ataaatacct gtgacggaag atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga 3420taccgggaag ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg 3480ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag 3540attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga 3600tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac 3660ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa 3720gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgaa 3780attccgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta 3840caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga 3900tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc 3960ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag 4020tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac 4080catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca 4140tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg 4200cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc 4260tggtgctacg cctgaataag tgataataag cggatgaatg gcagaaattc ggacgcgtca 4320attcgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag ccgctggcaa gcggtgaagt 4380gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa ctgcctgaac taccgcagcc 4440ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg caaccgaacg cgaccgcatg 4500gtcagaagcc gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt ctggcggaaa acctcagtgt 4560gacgctcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc accagcgaaa tggatttttg 4620catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag tcaggctttc tttcacagat 4680gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc gatcagttca cccgtgcacc 4740gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt gaccctaacg cctgggtcga 4800acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga 4860tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac 4920cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt 4980tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct 5040ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga 5100ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc 5160gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc 5220acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat 5280ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg 5340tttccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 5400ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 5460atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 5520gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 5580gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 5640gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 5700gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 5760aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 5820ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 5880taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 5940tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 6000gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 6060taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 6120tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 6180tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 6240ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 6300taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 6360tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 6420cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 6480gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 6540cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 6600ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 6660aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 6720atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 6780tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 6840gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 6900aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 6960acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 7020ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 7080tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 7140aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 7200catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 7260atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 7320aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 7380gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaa7408210142112184212DNA213大腸桿菌40014ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgggcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctagaggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc2184210152111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)40015atg tgt gga att gtt ggc gcg arc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15crt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag arc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac get gaa 1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Set Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cae ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Set Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu6102101621l609212PRT213大腸桿菌40016Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu210172112184212DNA213大腸桿菌40017ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaactgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcacca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg cctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgggcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctagaggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc2184210182111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)40018atg tgt gga act gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr G1y Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Ash Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc acc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Thr260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg cct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Pro Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa 1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu lle Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atcttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu61021019211609212PRT213大腸桿菌40019Met Cys Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile G1u Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Thr260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Pro Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn lle Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu210202112184212DNA213大腸桿菌40020ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgataca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac tgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctcc gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc2184210212111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)40021atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Ile Va1 Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Va1 Ala Glu Ile1 5 10 15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat aca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac tgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tcc gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Ash Val Pro Gly Ser Ser Leu ValArg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa 1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu61021022211609212PRT213大腸桿菌40022Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205G1u Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu 6ly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu210232112184212DNA213大腸桿菌40023ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttccgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgccg ttcctgggcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctagaggggc tagagcggcc accaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc 2184210242111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)40024atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tcc gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Set Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile GIy Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460aaa cat cac gcg ccg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa 1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu61021025211609212PRT213大腸桿菌40025Met Cys Gly lle Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 l0 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile GGly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val lle Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu210262112184212DNA213大腸桿菌40026ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc2184210272111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)40027atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa 1488Leu Glu GIy Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu61021028211609212PRT213大腸桿菌40028Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu ValIle115 120 125Ala His Leu Va1 ASn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser lle Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu210292112184212DNA213大腸桿菌40029ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc2184210302111830212DNA213大腸桿菌220221CDS222(1)..(1830)400 30atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cra 336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct 576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa 624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat 672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa 720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag 768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc 816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa 864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960Tyr Asn Set Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056Ala Val Arg Arg Asn Set Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg 1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat 1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg 1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac 1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg 1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag ate tct tac att cac gct gaa 1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg 1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605gag taa 1830Glu61021031211609212PRT213大腸桿菌40031Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala20 25 30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg35 40 45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu50 55 60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val85 90 95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile115 120 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu130 135 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly165 170 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser180 185 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu195 200 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp210 215 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu245 250 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile260 265 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu275 280 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser290 295 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser325 330 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu340 345 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg370 375 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His420 425 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met435 440 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp450 455 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu485 490 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510Ala Asp Met Pro Val lle Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu515 520 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu530 535 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe565 570 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys580 585 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605Glu
權利要求
1．通過發酵生產葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培養基中培養在氨基糖代謝途徑中有遺傳修飾的微生物，所述氨基糖代謝途徑選自將葡糖胺-6-磷酸轉變成另一種化合物的途徑、用於合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸轉運出所述微生物的途徑、將葡糖胺轉運到所述微生物中的途徑以及競爭葡糖胺-6-磷酸生產的有關底物的途徑；其中所述培養步驟從所述微生物中產生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物；(b)回收所述產物。
2．權利要求1的方法，其中所述葡糖胺-6-磷酸是細胞內的，所述葡糖胺細胞外的，其中所述回收步驟包括選自從所述微生物中回收所述葡糖胺-6-磷酸、從所述發酵培養基中回收所述葡糖胺以及其組合的回收步驟。
3．權利要求1的方法，其中所述產物是通過所述微生物分泌到所述發酵培養基中的葡糖胺，且所述回收步驟包括從所述發酵培養基中純化所述葡糖胺。
4．權利要求1的方法，其中所述產物是細胞內葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步驟包括從所述微生物中分離所述葡糖胺-6-磷酸。
5．權利要求1的方法，其中所述產物是細胞內葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步驟還包括將所述葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以產生葡糖胺。
6．權利要求1的方法，其中所述培養步驟包括將所述發酵培養基中的碳源濃度保持在約0.5％至約5％。
7．權利要求1的方法，其中所述培養步驟是在約28℃至約37℃完成的。
8．權利要求1的方法，其中所述培養步驟是在發酵罐中完成的。
9．權利要求1的方法，其中回收至少約1g/L的所述產物。
10．權利要求1的方法，其中所述遺傳修飾是在編碼選自下列蛋白質的核酸分子中的修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和磷酸酶。
11．權利要求1的方法，其中所述微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。
12．權利要求11的方法，其中所述遺傳修飾導致所述微生物過量表達葡糖胺-6-磷酸合酶。
13．權利要求11的方法，其中所述遺傳修飾包括用編碼具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性之葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化所述微生物，其中所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連。
14．權利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。
15．權利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼胺基酸序列SEQ ID NO:16的核酸序列。
16．權利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列。
17．權利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有選自pKLN23-28,nglmS-282184和nglmS-281830的核酸分子。
18．權利要求13的方法，其中所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
19．權利要求13的方法，其中所述編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。
20．權利要求19的方法，其中所述編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子含有含有減弱所述葡糖胺-6-磷酸合酶之葡糖胺-6-磷酸產物抑制作用的遺傳修飾。
21．權利要求19的方法，其中所述遺傳修飾導致至少一個選自下列的胺基酸修飾所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一個胺基酸殘基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一個胺基酸修飾導致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
22．權利要求21的方法，其中所述至少一個胺基酸修飾是在一個胺基酸序列位置，其對應於胺基酸序列SEQ ID NO:16，選自Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),GIy(472),Leu(469)和其組合。
23．權利要求22的方法，其中所述胺基酸修飾是選自下列的取代(a)帶有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(4)；(b)帶有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ile(272)；(c)帶有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Ser(450)；(d)帶有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫側基團的胺基酸殘基取代Arg(250)；(f)帶有一個脂肪族羥基側基團的胺基酸殘基取代Gly(472)；(g)帶有一個脂肪族側基團的胺基酸殘基取代Leu(469)；(h)(a)-(g)的組合。
24．權利要求22的方法，其中所述胺基酸修飾是選自下列的取代Ile(4)被Thr取代、Ile(272)被Thr取代、Ser(450)被Pro取代、Ala(39)被Thr取代、Arg(250)被Cys取代、Gly(472)被Ser取代、Leu(469)被Pro取代以及其組合。
25．權利要求22的方法，其中所述胺基酸修飾是在胺基酸序列位置Leu(469)由脯氨酸殘基取代亮氨酸殘基。
26．權利要求22的方法，其中所述胺基酸修飾是選自下列的胺基酸殘基的取代(a)蘇氨酸殘基取代Ala(39)位的丙氨酸殘基；(b)半胱氨酸殘基取代Arg(250)位的精氨酸殘基；(c)絲氨酸殘基取代Gly(472)位的甘氨酸殘基；以及(d)(a)、(b)或(c)的任意組合。
27．權利要求22的方法，其中所述胺基酸修飾是選自下列的取代(a)蘇氨酸殘基取代Ile(4)位的異亮氨酸殘基；(b)蘇氨酸殘基取代Ile(272)位的異亮氨酸殘基；(c)脯氨酸殘基取代Ser(450)位的絲氨酸殘基；以及(d)(a)、(b)或(c)的任意組合。
28．權利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的胺基酸序列。
29．權利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。
30．權利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有選自pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830的核酸分子。
31．權利要求19的方法，其中所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
32．權利要求11的方法，其中所述微生物在編碼選自下列蛋白質的基因中還含有至少一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用。
33．權利要求11的方法，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高所述磷酸酶的作用。
34．權利要求11的方法，其中所述微生物在編碼下列蛋白質的基因中還含有修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用。
35．權利要求34的方法，其中所述遺傳修飾是缺失所述基因的至少一部分。
36．權利要求1的方法，其中所述微生物選自細菌和酵母。
37．權利要求1的方法，其中所述微生物是埃希菌屬的細菌。
38．權利要求1的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
39．權利要求38的方法，其中所述遺傳修飾是在選自下列的大腸桿菌基因中的突變nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
40．通過發酵生產葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培養基中培養用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化的大腸桿菌，其中所述重組核酸分子提高了所述大腸桿菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用，其中所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連；其中所述培養步驟從所述大腸桿菌中產生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物；以及(b)回收所述產物。
41．權利要求40的方法，其中所述大腸桿菌在選自下列的至少一個基因中還含有至少一個遺傳修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
42．權利要求40的方法，其中所述至少一個另外的遺傳修飾包括nagA、nagB、nagC、nagD和nagE的一個缺失，manXYZ中的突變，所述修飾導致N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的作用降低。
43．用於通過生物合成方法生產葡糖胺的微生物，所述微生物用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉化，所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連並含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾；其中所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺生產。
44．權利要求43的微生物，其中其中所述微生物在編碼選自下列蛋白質的基因中還含有至少一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用。
45．權利要求43的微生物，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高了所述磷酸酶的作用。
46．權利要求43的微生物，其中所述微生物是在選自下列的基因中還含有至少一個遺傳修飾的大腸桿菌nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU和ptsG基因，其中所述遺傳修飾降低了由所述基因編碼之蛋白質的作用。
47．權利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag調節子基因之缺失的大腸桿菌。
48．權利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag調節子基因之缺失以及在manXYZ基因中含有遺傳修飾以使所述manXYZ基因編碼之蛋白質作用降低的大腸桿菌。
49．權利要求43的微生物，其中在含14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,20g/L葡萄糖，10mM MgSO4,1mMCaCl2和約0.2-約1mM IPTG的pH7.0培養基上，當在約28-約37℃培養約10-約60小時，使細胞密度按細胞乾重計算為至少約8g/L時，所述微生物產生至少約lg/L葡糖胺。
50．用於通過生物合成方法生產葡糖胺的微生物，所述微生物含有(a)編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子，所述重組核酸分子與轉錄控制序列有效相連，其中所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺-6-合酶的作用；和(b)在選自編碼下列蛋白質的基因中至少一個遺傳修飾N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙醯-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶-N-乙醯葡糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質的作用。
51．權利要求50的微生物，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高了所述磷酸酶的作用。
52．含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，其含有導致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高的遺傳修飾。
53．權利要求52的重組核酸分子，其中所述遺傳修飾導致至少一個選自下列的胺基酸修飾所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一個胺基酸殘基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一個胺基酸修飾導致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
54．權利要求52的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有選自SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的胺基酸序列。
55．權利要求52的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子含有選自SEQID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30的核酸序列。
56．具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由含有導致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遺傳修飾的核酸序列編碼。
57．權利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有選自至少一個胺基酸殘基之缺失、插入、倒置、取代和衍生的至少一個胺基酸修飾。
58．權利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶由選自SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列編碼。
59．權利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有選自SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的胺基酸序列。
60．通過發酵生產葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發酵培養基中培養具有使葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遺傳修飾的微生物，其中所述遺傳修飾的微生物由包含下列步驟的方法產生(1)從含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的分離的核酸分子中產生修飾以產生多個修飾的核酸序列；(2)用所述修飾的核酸序列轉化微生物以產生遺傳修飾的微生物；(3)根據葡糖胺-6-磷酸合酶作用篩選所述遺傳修飾的微生物；和(4)篩選具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的所述遺傳修飾微生物；其中所述培養步驟從所述微生物中產生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產物；(b)回收所述產物。
全文摘要
本發明涉及通過發酵遺傳修飾的微生物生產葡糖胺的方法和材料。本發明包括用於本發明生產葡糖胺之方法的遺傳修飾的微生物,以及重組核酸分子和由所述重組核酸分子產生的蛋白質。
文檔編號C12N15/70GK1314951SQ99810087
公開日2001年9月26日 申請日期1999年7月15日 優先權日1998年7月15日
發明者艾倫·貝裡, 理察·P·伯林蓋姆, 詹姆斯·R·米利斯 申請人:以生物技術資源的名義經營的Dcv公司