重組細胞致死性擴張毒素CdtB、其表達載體及其製備方法

2023-05-28 19:52:26 2

專利名稱：：重組細胞致死性擴張毒素CdtB、其表達載體及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程領域，具體地說涉及一種重組cdtB新序列原核表達載體構建及其蛋白純化、復性方法。
背景技術：
：CdtB是細胞致死性擴張毒素(cytolethaldistendingtoxin，CDT)家族的一個成員，細胞致死性擴張毒素是一種新近發現的、由伴放線放線桿菌(Jc"'wo6ad〃wsa"/womycefewco/n/tora，^4fl)產生的細胞毒'f生因子之一。伴放線放線桿菌04a)是侵襲性牙周炎的主要致病菌之一，在各型牙周炎中尤以侵襲性牙周炎為最重，此型牙周炎具有發病年齡早、病變進展快、易造成牙周組織迅速破壞而導致牙齒鬆動脫落等特點，而且有明顯的家族聚集性，對於牙周炎病因學的研究確認細菌是牙周炎發生的始動因子，而伴放線放線桿菌"fl)作為局限型4旻襲'f生牙周炎(Localizedaggressiveperiodontitis,LAgP)的主要致病菌，可產生一系列毒力因子使其易於定植、破壞宿主組織、抑制組織修復和幹擾宿主免疫防禦功能，對疾病的發生發展意義重大。細胞致死性擴張毒素(CDT)是新近被發現的由G-致病菌產生的一種毒素，該毒素能使中國倉鼠卵巢細胞(chinahamsterovarycell,CHO)停留在G2/M期而不能進入分裂期，從而導致細胞膨脹、死亡，故命名為細胞致死性擴張毒素，而A是迄今被發現的可產生CDT的唯一的牙周可疑致病菌。細胞致死性擴張毒素是一種熱不穩定蛋白，經研究證實由三個相鄰基因編碼cdtA，cdtB,cdtC,對應的蛋白質為CdtA，CdtB,CdtC，分子量近似為28，32，20A:Da組成異源三聚體全毒素。目前已經確認CdtB為毒力亞基。純化的重組Cd但蛋白在體外與超螺旋DNA共同作用，可使DNA超螺旋鬆解或形成DNA切口。重組Cd但顯孩i注射入細胞內，引起宿主細胞DNA破壞、細胞死亡。CdtB由CdtA和CdtC轉運入細胞內。一旦進入細胞內，CdtB進入細胞核，即可通過激活DNA損傷依賴的檢查點現象，導致DNA破壞和細胞周期停滯。包涵體由於沒有完全正確的天然態結構，不具有生物學活性，必須經體外分離、純化、復性等工藝才能變成有生物學活性的產品，據不完全統計顯示，體外表達的蛋白60%以包涵體形式存在，這就使得從包涵體中提取、純化及復性重組蛋白的工藝引起高度重視，且直接關係到經濟效益。現有的國內純化蛋白的工藝存在諸多問題如採用變性劑致使蛋白粘稠度大、操作難度大，效率低，而國外一般採用昂貴的蛋白表達純化儀器，如RTS500SYSTEM。因此，目前本領域還缺少一條工藝簡便、成本低廉、活性好，僅僅依靠純手工即可完成的蛋白純化復性工藝。
發明內容技術問題本發明的目的是提供一種能原核表達cdtB基因的原核表達質粒pET-15b-cdtB構建方法，並經轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10和BL21(DE3)，IPTG誘導，體外誘導表達蛋白CdtB，該蛋白有望作為蛋白藥物應用於腫瘤等疾病的治療。並且本發明是克服現有的包涵體蛋白純化過程中存在的問題，提供一種無需昂貴儀器，只需純手工即可完成，且方法簡便、耗時少、成本低、活性好，產品復性率可達80%以上。技術方案重組細胞致死性擴張毒素cdtB,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所述。重組細胞致死性擴張毒素cdtB,其胺基酸序列如SEQIDN0.2所述。重組細胞致死性擴張毒素cdtB、的表達載體pET-15b-cdtB。重組細胞致死性擴張毒素cdtB的製備方法，製備步驟為目的基因cdtB的合成設計上遊引物5,-CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT-3，，帶限制性內切酶XhoI酶切位點，下遊引物5，-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性內切酶BamHI酶+刀^f立點；分另'J以4半方欠線》欠線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)ATCC29522、29523為模板，PCR擴增cdtB基因，PCR條件是94°C30s,55。C30s，72'Clminx30個循環，72°C延伸8min,PCR產物長度為852bp;雙酶切cdtB基因與帶有6xHis標籤的載體pET-15b，連接構建重組載體pET-15b-cdtB,轉化宿主菌，構建cdtB基因工程菌，所述雙酶切採用的是BamHI和XhoI,所述宿主菌為大腸桿菌；培養cdtB基因工程菌，體外誘導表達CdtB蛋白，以包涵體形式存在，清洗、溶解包涵體得到包涵體溶解液所述培養cdtB基因工程菌為LB培養基，培養溫度為37。C;所述體外誘導Cd但蛋白表達使用大腸桿菌BL21(DE3),終濃度為0.1M的IPTG,誘導4h,溫度為37°C;5所述清洗、溶解包涵體是將工程菌超聲破碎，離心收集沉澱，用溶液1、2清洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-100,所述溶液2為2M尿素，所述溶液3為8M尿素、0.1M(3ME,所述溶液4為PBS緩衝液；純化包涵體所述純化包涵體是使用Ni-HisTrapHP預裝柱純化，純化過程中使用吸附緩沖液和洗脫緩衝液，利用Ni離子良好的螯合性能，吸附帶6xHis標籤的CdtB蛋白，吸附條件為pH7.4;所述吸附緩衝液含有8M尿素、20mM磷酸鈉和0.5M氯化鈉，所述洗脫緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉和500mM咪唑；復性所述復性採用透析法，形成濃度梯度降低變性劑尿素的濃度由原始濃度8M降至OM,透析液含有pH8.0-9.020mMTris-HCl、5g精氨酸和lg還原型穀胱甘肽，採用半透膜透析；超濾得到體外重組的CdtB活性蛋白所述超濾為採用孔徑0.2uM—次性濾膜超濾，-80°C凍存。有益效果本發明運用原核表達載體pET-15b在C端含有6個胺基酸6xHis標籤序列，便於蛋白的純化和分離，大腸桿菌表達的CdtB蛋白以包涵體形式存在，對其進行體外復性比較困難，本發明在通過大腸桿菌高效表達CdtB的基礎上，對影響包涵體純化復性的一系列因素的進行大量比較研究的基礎上，確定了重組CdtB體外純化、復性的較為合適的方法，使其復性效率達80%左右，復性後CdtB濃度為0.19pg4U。本發明方法簡便、耗時少、成本低、活性好，產品復性率可達80%以上，且該蛋白有望作為蛋白藥物應用於腫瘤等疾病的治療，用此方法在產業化生產也具有優勢。圖1:目的基因cdtB合成；圖2:pET-15b-cdtB質粒構建圖；圖3:CdtB表達及純化後非還原SDS-PAGE圖；圖4:westernblot鑑定CdtB蛋白；圖5:CdtB蛋白體外酶活性檢測；圖6:CDT全毒素作用於Hela細胞形態學觀察；圖7:目的蛋白與CHO細胞孵育後CFU觀察；圖8:流式細胞儀觀察不同濃度CdtAB作用Hela細胞後細胞周期情況；圖9:pET-15b-CdtB質粒圖譜；圖10:pET-15b-CdtB克隆表達區。圖1中，1為DL2000Marker,2為PCR擴增的cdtB基因片段；圖2中，1為DL2000Marker,2為pET-15b-cdtB;圖3為CdtB純化後非還原SDS-PAGE圖。(各項代表含義見表3)表3tableseeoriginaldocumentpage7圖6為CDT全毒素作用於Hela細胞形態學觀察其中(a)DMEM培養液中培養72h的正常Hela細胞；(b)DMEM培養液中培養的加入CDT全毒素後孵育72h的Hela細胞；圖7為目的蛋白與CHO細胞孵育後CFU觀察，各項代表含義見表6;圖8為流式細胞儀觀察不同濃度CdtAB作用Hela細胞後細胞周期情況，ED5o表示細胞半數停留G2期時，蛋白濃度為12.6ng/ml。具體實施例方式實施例1:(1H殳計上遊引物5'國CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT-3',帶XhoI限制性內切酶酶切位點，下遊引物5'-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性內切酶BamHI酶切4立,泉；分另'J以4半》文線力文線4幹菌(爿c""oftad〃M51""/wcw^c"e附co附/to"51，爿")ATCC29522、29523DNA為模板，PCR擴增cdtB基因，PCR條件是(94。C30s,55°C30s，72°Clmin)x30循環，72°C延伸8min,lwt。/。瓊脂糖凝膠電泳,在852bp處見一明顯條帶，與預計產物大小吻合。(圖1)(2)PCR產物回收經PCR擴增後的cdtB基因，經BamHI和XhoI雙酶切後，連接原核表達栽體pET-15b，按常規方法連接，大小為1118bp。並轉化到大腸桿菌TOPIO感受態細胞。LB平板上隨機挑幾個單克隆，PCR及測序鑑定，序列表見附表。(圖2、序列表)(3)以1:100的比例轉接到5mlLB培養液中，培養至OD600=0.5-0.6,加入IPTG至終濃度為O.IM，37。C誘導4h,8000轉/分，離心10min,收集菌體沉澱，bindingbuffer重懸，-80°C過夜。(4)室溫溶解包涵體液，使用溶液1振蕩清洗3-4遍，12000轉/分，離心10min,收集沉澱，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-100;使用溶液2振蕩清洗3遍，12000轉/分，離心10min,收集沉澱，溶液2為2M尿素；使用溶液3溶解沉澱，並經超聲碎菌lmin,13000轉/分，離心2min，收集上清，所述溶液3為8M尿素、O.lMpME;使用溶液4，13000轉/分，離心2min析出蛋白沉澱，溶液4為PBS緩沖液；再次使用溶液3溶解沉澱，超聲碎菌lmin，13000轉/分，離心2min,收集上清，此時可溶性蛋白上清為澄清、透明的乳白色。調節pH7.4,準備純化。(5)使用GeneQuant公司的Ni-HisTrapHP預裝柱，用bindingbuffer(pH7.4)平衡柱子，將待純化蛋白上清上柱，上樣完成後，用加入5mM咪唑的bindingbuffer沖洗柱子，再用elutionbuffer洗脫柱子，收集蛋白，測OD260和OD280,測算洗脫峰，SDS-PAGE驗證，取純化較好的蛋白留待覆性。(圖3)(6)將上述洗脫後較純的蛋白收集液，通過透析法復性。其原理是利用小分子物質在溶液中可通過半透膜，而大分子物質不能通過半透膜的性質，達到分離的方法。包涵體蛋白通過添加尿素、TritonX-100等使得包涵體得以溶解，通過梯度透析使變性劑成分尿素、TritonX-100等小分子物質通過半透膜(濃度梯度跨度過大，易使蛋白變性析出)，逐漸降低其在蛋白中含量，最終達到分離的效果。且在鹼性緩衝液及精氨酸、還原型穀胱甘肽存在的情況下，可促進蛋白二疏鍵重新結合、促進蛋白恢復活性。梯度透析液組分見表5表5tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9透析液均調至pH8.0-9.0,透析時間為48h-72h。(7)透析後的蛋白測算OD值估算濃度，並經westernblot鑑定。(使用抗His抗體作為一抗，羊抗小鼠IgG作為二抗)(圖4)(8)體外酶活性驗證復性成功與否。將復性後蛋白液分成6個濃度梯度，在緩衝液的作用下，與超螺旋質粒pET-32a,37。C孵育lh,lwt%瓊脂糖凝膠電泳觀察。緩沖液為25mMHepes(pH7.0),10mMMgCl2,5mMCaCl2。(圖5)(9)經測算純化復性後蛋白濃度為0.19pg4U。卿0.2nM—次性濾膜過濾蛋白CdtA,CdtB,CdtC，體外重構CDT全毒素，重構液為10mMTris-HCl(pH7.0),100mMNaCl2，5mMCaCl2，4'C孵育lh。與人宮頸癌上皮細胞(Hela細胞)孵育72h，觀察細胞形態，正常細胞作為對照。(圖6)可見加入CDT全毒素後的Hela細胞體積明顯膨大，一些細胞可見核碎裂。(ll)將CdtA,CdtB,CdtC任意組合成不同組分及濃度，與中國倉鼠卵巢上皮細胞(CHO細胞)孵育6天，觀察細胞集落形成單位情況(CFU)。細胞接種到6孔板中，每孔240個細胞，細胞貼壁後加入目的蛋白，蛋白組分見表6表6tableseeoriginaldocumentpage9觀察可見CDT全毒素可以導致細胞膨脹最終死亡，單獨的CdtA,CdtB，CdtC蛋白無細胞毒性作用，且CdtB為主要毒力基團，其濃度最小l嗎即可表現出細胞毒性，3嗎時細胞毒性作用即達到最大。(1》將Hela細胞與不同濃度的CdtAB反應，流式細胞儀觀察細胞周期情況，CdtAB濃度範圍為0.6-10嗎/ml。可見隨著濃度的增加，細胞停留在G2期的比重增大，濃度為10ng/ml時，有40。/。細胞停留在G2期，試驗表明，本發明通過純手工的工藝，能夠純化到純度較高，且活性好的蛋白，且省時、省錢、省力，復性率達80%,在產業化生產上具有優勢。且CdtB蛋白具有導致腫瘤細胞(如Hela細胞)DNA裂解、細胞周期停滯、細胞體積膨脹、最後死亡的特殊細胞毒性作用，因此該蛋白的研究，對於基因治療以及蛋白藥物治療腫瘤具有廣闊的前景，意義重大。序列表南京醫科大學附屬口腔醫院<120〉重組細胞致死性擴張毒素CdtB、其表達載體及其製備方法2009-08-124Patentlnversion3.3<210〉1852<212〉DNACytolethaldistendingtoxin<400〉11ATGCAATGGGTAAAGCAATTAAATGTGGTT61TATGCTAACTTGAGTGATTTTAAAGTAGCA121AATGAAAGTAAATGGAATATTAATGTACGC181ATTTTGATGGTACAAGAAGCGGGTTCATTA241ATTCAACATGGGGGAACGCCAATTGAGGAA301CCAAATATGGTCTATATTTATTATTCCCGT361GCTATCGTGTCACGTCGTCAAGCCGATGAA421CTTCAATCTCGCCCGGCAGTAGGTATCCGC481GCTTTGGCCACAGGTGGTTCTGATGCGGTA541ACCTCATCACCATCATCACCGGAAAGACGA601AATCGTGCGCCGGTTAATCTGGAAGCTGCA661ACAATTATTATTGCGCCAACAGAACCGACT721ATTTTACATGACGCACATTTACCACGTCGA781TTAATGTTAAATCAGTTACGCTCACAAATT841CATGATCGCTAA2<211〉283PRTCytolethaldistendingtoxinTTCTGTACGAACTTGGAATCCAATTATTATCCAAGTTCGGTATACCTGGATTAGATGTTGGCTTTTATCGATTGGTACTGAGTTTAATTCGGATATAGCTTTAAGACAGGCATCGGTCCGGAGCAAGCACACATCCGATCTGTTATTTAGTGCAAGGTTCCGGGAGAACACAGTAAGAACATTTAGGTACGGGCAAACCGTACATTCTGAATGTATTTTTGTAATATCTTGGATGGTTGTAACCCGCCGTGTAATATTTTGTGAACGTATATTTTCCTGTCTTTTCAAGTTTCAGCAGTAAGGTGCAGATCTCACGAGTATCGCTCCCGTAGTGAACTTATTCTTCTGTGTACAGTGCATCACTACTTTTTGGTGATTTCGAGTGAAAATAGATTATGCGCGGCGCAAGTTAGTTTTGTT21MQWVKQ]jNWFCTMIiFSFSSYANLSDFKVATW肌QGSSAVNESKWN工NVRQIiSGEQGAD61ILMVQEAGSLPSSAVRTSRVIQHGGTPIEEYTWNLGTRSRP腿VYIYYSRLDVGANRVNL121AIVSRRQADEAFIVHSDSSVLQSRPAVGIRIGTDVFETVHALATGGSDAVSL工RNIFTTF181TSSPSSPERRGYSWMWGDFNRAPVNLEAALRQEPAVSENTIIIAPTEPTHRSGNILDYA241ILHDAHLPRREQARERIGASLMLNQLRSQITSDHFPVSFVHDR329DNA人工序列3ccgctcgagatgcaatgggtaaagcaatt29430DNA人工序列4cgcggatccttagcgatcatgaacaaaact30權利要求1.重組細胞致死性擴張毒素cdtB，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。2.重組細胞致死性擴張毒素cdtB，其胺基酸序列如SEQIDN0.2所迷。3.重組細胞致死性擴張毒素cdtB的表達載體pET-15b-cdtB。4.重組細胞致死性擴張毒素cdtB的製備方法，其特徵在於製備步驟為a.目的基因cdtB的合成設計上遊引物5，陽CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT陽3，，帶限制性內切酶XhoI酶切位點，下遊引物5'-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性內切酶BamHI酶切位點；分別以伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)ATCC29522、29523為模板，PCR擴增cdtB基因，PCR條件是94°C30s，55°C30s,72°Clminx30個循環，72°C延伸8min,PCR產物長度為852bp;b.雙酶切cdtB基因與帶有6xffis標籤的載體pET-15b,連接構建重組載體pET-15b-cdtB，轉化宿主菌，構建cdtB基因工程菌，所述雙酶切採用的是BamHI和XhoI，所述宿主菌為大腸桿菌；c.培養cdtB基因工程菌，體外誘導表達CdtB蛋白，以包涵體形式存在，清洗、溶解包涵體得到包涵體溶解液所述培養cdtB基因工程菌為LB培養基，培養溫度為37°C;所述體外誘導CdtB蛋白表達使用大腸桿菌BL21(DE3),終濃度為0.1M的IPTG,謙導4h,溫度為37°C;所述清洗、溶解包涵體是將工程菌超聲破碎，離心收集沉澱，用溶液1、2清洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-IOO，所述溶液2為2M尿素，所迷溶液3為8M尿素、,0.1MPME,所述溶液4為PBS緩沖液；d.純化包涵體所述純化包涵體是使用Ni-HisTrapHP預裝柱純化，純化過程中使用吸附緩衝液和洗脫緩衝液，利用Ni離子良好的螯合性能，吸附帶6xffis標籤的CdtB蛋白，吸附條件為pH7.4;所述吸附緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉和0.5M氯化鈉，所述洗脫緩衝液含有8M尿素、20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉和500mM咪唑；e.復性所述復性釆用透析法，形成濃度梯度降低變性劑尿素的濃度由原始濃度8M降至0M,透析液含有pH8.0-9.020mMTris-HCl、5g精氨酸和lg還原型穀胱甘肽，採用半透膜透析；f.超濾得到體外重組的CdtB活性蛋白所述超濾為採用孔徑0.2iuM一次性濾膜超濾，-80°C凍存。全文摘要本發明提供一種能原核表達cdtB基因的原核表達質粒pET-15b-cdtB構建方法，並經轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10和BL21(DE3)，IPTG誘導，體外誘導表達蛋白CdtB，該蛋白有望作為蛋白藥物應用於腫瘤等疾病的治療。並且本發明是克服現有的包涵體蛋白純化過程中存在的問題，提供一種無需昂貴儀器，只需純手工即可完成，且方法簡便、耗時少、成本低、活性好，產品復性率可達80％以上。文檔編號C12N15/31GK101629177SQ20091018433公開日2010年1月20日申請日期2009年8月18日優先權日2009年8月18日發明者豔徐,璐李,楊迷芳,段君蘭,王曉茜申請人:南京醫科大學附屬口腔醫院